热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用

文档序号:10671341阅读:1300来源:国知局
热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用
【专利摘要】本发明公开了热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用。本发明所提供的热休克蛋白gp96为a1)或a2)或a3)或a4):a1)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质;a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;a3)在a1)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质;a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。实验证明,热休克蛋白gp96对治疗类风湿性关节炎和/或缓解类风湿性关节炎的症状有重要的应用价值。
【专利说明】
热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药领域,具体涉及热休克蛋白gp96在治疗类风湿性关节炎中的 应用。
【背景技术】
[0002] 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎性、系统性的自身免 疫性疾病,以关节和关节组织非化脓性炎症为主要特征,主要表现为关节滑膜炎,终致关节 的软骨、韧带、肌腱等各种组织以及多脏器损害。80%的RA患者的发病年龄在20~45岁之 间,人群发病率为1%~2%,其中女性是男性的3倍。RA的基本病理改变是滑膜炎,急性期滑 膜肿胀、渗出,粒细胞浸润;慢性期滑膜增生肥厚,形成血管豁,后者是造成关节破坏、关节 畸形、障碍、使疾病进入不可逆阶段的病理基础。RA患者同时伴有发热、贫血、巩膜炎、心包 炎、血管炎及淋巴肿大等关节外表现,血清中可以查到多种自身抗体,故称类风湿性关节 炎。RA多侵犯肢体小关节,如手、足及腕关节等,常为对称性,可有暂时性缓解。未经系统治 疗的类风湿性关节炎可反复迀延多年,最终导致关节畸形、功能丧失,给RA患者身心带来极 大影响。
[0003] 目前,类风湿性关节炎不论采用中医还是西医治疗均不可能根治,只能通过药物 缓解病情,给RA患者及其家属带来巨大的经济和精神负担。因此,开发治疗或预防RA的药物 具有重要的社会和经济意义。
[0004] 热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存 在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、 邯卩70、!^?60、!^?40、小分子!^?和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(!^3〖811〇^^口1〇丨6111, HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员,该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何治疗类风湿性关节炎。
[0006] 为解决上述技术问题,本发明首先提供了热休克蛋白gp96在制备产品中的应用; 所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少一种:
[0007] A1)治疗类风湿性关节炎;
[0008] A2)缓解类风湿性关节炎的症状;
[0009] A3)诱导调节性T细胞的产生;
[0010] A4)降低抗Π型胶原抗体滴度;
[0011] A5)降低 TNF-α 浓度;
[0012] A6)降低 IL-Ιβ 浓度;
[0013] A7)降低 IL-6 浓度;
[0014] A8)降低 IL-17 浓度;
[0015] A9)降低细胞增殖能力;
[0016] A10)预防类风湿性关节炎。
[0017] 上述应用中,所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)、所 述A8)、所述A9)和所述A10)中,所述热休克蛋白gp96的剂量可为向哺乳动物注射100yg~ 500yg所述热休克蛋白gp96 (如100yg所述热休克蛋白gp96或500yg所述热休克蛋白gp96)。 [0018]上述应用中,所述A9)中,所述降低细胞增殖指数具体可为降低小鼠脾脏淋巴细胞 在鸡Π 型胶原刺激下的增殖能力。
[0019]所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。
[0020] 上述应用中,所述热休克蛋白gp96可为al)或a2)或a3)或a4):
[0021] al)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质;
[0022] a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
[0023 ] a3)在al)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质;
[0024] a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。 [0025]上述应用中,编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为dl)或d2)或d3)或d4): [0026] dl)核苷酸序列是序列表中序列1自5'端起第4位至2352位所示的DNA分子;
[0027] d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
[0028] d3)与dl)或d2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码所述热休 克蛋白gp96的DNA分子;
[0029] d4)在严格条件下与dl)或d2)限定的核苷酸序列杂交,且编码所述热休克蛋白 gp96的DNA分子。
[0030]上述应用中,所述热休克蛋白gp96的获得方式可为D1)或D2):
[0031 ] D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取;
[0032] D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中,培养,纯化。
[0033]所述D1)中,所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。
[0034]所述D2)中,所述"将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中"可通过向 受体中导入重组载体实现;所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发 质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBacl-gp96。所述重组质粒 pFastBacl-gp96具体可为在质粒pFastBacl的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分 子得到的重组质粒。
[0035] 所述重组质粒口?38七1^(31-8口96具体可为将质粒口?38七1^(3]^/^(3〇1?1和乂&31识别序 列间的片段(质粒pFastBacl被限制性核酸内切酶EcoRI和Xbal切成一个大片段和一个小片 段,该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
[0036] 所述D2)中,所述受体可为Sf9细胞。
[0037] 上述应用中,所述调节性T细胞可为⑶4+⑶25+F0XP3+调节性T细胞。
[0038]上述应用中,所述产品可为药物。
[0039]为解决上述技术问题,本发明还提供了一种产品。
[0040] 本发明所提供的产品,其活性成分为热休克蛋白gP96;所述产品的功能为如下A1) 至A10)中的至少一种:
[0041] A1)治疗类风湿性关节炎;
[0042] A2)缓解类风湿性关节炎的症状;
[0043] A3)诱导调节性T细胞的产生;
[0044] A4)降低抗Π 型胶原抗体滴度;
[0045] A5)降低 TNF-α 浓度;
[0046] A6)降低 IL-Ιβ 浓度;
[0047] A7)降低 IL-6 浓度;
[0048] A8)降低 IL-17 浓度;
[0049] A9)降低细胞增殖能力;
[0050] A10)预防类风湿性关节炎。
[0051 ] 上述产品中,所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)、所述A7)、所 述A8)、所述A9)和所述A10)中,所述热休克蛋白gp96的剂量可为向哺乳动物注射100yg~ 500yg所述热休克蛋白gp96 (如100yg所述热休克蛋白gp96或500yg所述热休克蛋白gp96)。 [0052]上述产品中,所述A9)中,所述降低细胞增殖指数具体可为降低小鼠脾脏淋巴细胞 在鸡Π 型胶原刺激下的增殖能力。
[0053]所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。
[0054] 上述产品中,所述热休克蛋白gp96可为al)或a2)或a3)或a4):
[0055] al)氨基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所示的蛋白质;
[0056] a2)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
[0057] a3)在al)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质;
[0058] a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。 [0059]上述产品中,编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子可为dl)或d2)或d3)或d4):
[0060] dl)核苷酸序列是序列表中序列1自5'端起第4位至2352位所示的DNA分子;
[0061] d2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
[0062] d3)与dl)或d2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性,且编码所述热休 克蛋白gp96的DNA分子;
[0063] d4)在严格条件下与dl)或d2)限定的核苷酸序列杂交,且编码所述热休克蛋白 gp96的DNA分子。
[0064]上述产品中,所述热休克蛋白gp96的获得方式可为D1)或D2):
[0065] D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取;
[0066] D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中,培养,纯化。
[0067]所述D1)中,所述哺乳动物可为人、鼠。所述鼠具体可为雌性DBA/1小鼠。
[0068]所述D2)中,所述"将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中"可通过向 受体中导入重组载体实现;所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发 质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBacl-gp96。所述重组质粒 pFastBacl-gp96具体可为在质粒pFastBacl的多克隆位点插入序列表中序列1所示的DNA分 子得到的重组质粒。
[0069] 所述重组质粒口?38七1^(31-8口96具体可为将质粒口?38七1^(3]^/^(3〇1?1和乂&31识别序 列间的片段(质粒pFastBacl被限制性核酸内切酶EcoRI和Xbal切成一个大片段和一个小片 段,该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
[0070] 所述D2)中,所述受体可为Sf9细胞。
[0071] 上述产品中,所述调节性T细胞可为⑶4+⑶25+F0XP3+调节性T细胞。
[0072]上述产品中,所述产品可为药物。
[0073]实验证明,所述热休克蛋白gp96具有治疗类风湿性关节炎、缓解类风湿性关节炎 的症状、诱导调节性T细胞的产生、降低抗Π 型胶原抗体滴度、降低小鼠脾脏淋巴细胞在鸡 Π 型胶原刺激下的增殖能力、降低血清中的TNF-α、IL-Ιβ、IL-6和IL-17A等炎性细胞因子水 平以及预防类风湿性关节炎的功能。因此,热休克蛋白gp96对治疗类风湿性关节炎和/或缓 解类风湿性关节炎的症状具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0074] 图 1 为pgp96的Western blot鉴定结果。
[0075] 图2为rgp96的SDS-PAGE和Western Blot的鉴定结果。
[0076] 图3为用pgp96或rgp96免疫的小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+F0XP3+调节性T细 胞的频率。
[0077]图4为用pgp96或rgp96免疫小鼠的小鼠类风湿关节炎的评分数值的实验结果。 [0078]图5为用pgp96或rgp96免疫小鼠的抗II型胶原抗体滴度的检测结果。
[0079]图6为用pgp96或rgp96免疫小鼠的细胞增殖指数。
[0080]图7为用pgp96或rgp96免疫小鼠的细胞因子检测结果。
【具体实施方式】
[0081]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[0082]下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0083]下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0084]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐 明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
[0085] 下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0086] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0087] 以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
[0088]雌性DBA/1小鼠为北京维通利华实验动物有限责任公司产品;雌性DBA/1小鼠在下 文中简称小鼠。
[0089] 获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考如下文献:Zhen Liu,Xinghui Li,Lipeng Qiu,et al.Treg suppress CTL responses upon immunization with HSP gp96.Eur.J.mmunol,2009,39(11):3110-3120·
[0090] HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品,产品目录号为HB-8065T'Sf9细胞为 Invitrogen公司产品,产品目录号为 11496_015DCellfectin II reagent为Life technologies公司产品,产品目录号为10362-100。质粒pFastBac?l为Invitrogen公司产 品,产品目录号为10359-016WP96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品,产品目录号为sc- 56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公 司产品,产品目录号为ZB-2307。HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品,产品 目录号为17-5053-01 Auperdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品,产品目录号为 17517501。大肠杆菌DHlOBac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品,产品目录号 为CL108-01 AITC-anti-CDS、PE-anti-CD4、Percp-Cy5 · 5-anti-CD25、固定/破膜剂和 APC-anti-Foxp3均为eBioscience公司产品,产品目录号分别为 11-0031-63、12-0041-81、45-0251-80、00-5521-00和n-STTS-SOdnsect-XPRESS? Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine为LONZA公司产品,产品目录号为 皿11(:12、〇3(:12、恥(:1、1^8和甲基€[-0-吡喃甘露糖苷均为3丨811^-41(^(*公司产品,产品目录 号分别为 ¥900933、?7626、792519、¥900197、793639、746398、11378和]\16882。辣根过氧化物 酶羊抗鼠抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品,产品目录号为ZB-2305。TMB底物溶 液为eBioscience公司产品,产品目录号为00-4201JPMI 1640培养液为Invitrogen公司产 品,产品目录号为11875093<XonA琼脂糖凝胶柱为GE公司产品,产品目录号为17-0440-01, 该柱的规格为l·6X2·5cm,填充介质为ConA-Sepharose4B。HitrapQ阴离子交换柱为GE公 司产品,产品目录号为17-1153-01,该柱的规格为0.7 X 2.5cm。HRP标记的I gG抗体为 SER0TEC公司产品,产品目录号为STAR117P。1 X洗涤液为含0.1 % (体积百分比)Tr i ton-父100的?!17.4、0.01111〇1/1?83缓冲液。鸡11型胶原、11'1'、?骱和弗氏完全佐剂均为318111 & Aldrich公司产品,产品目录号分别为09301、]\15655、1^9017和?5881。96孔酶标板为美国灿1^ 公司产品。超滤管为Merck Millipore公司产品,产品目录号为UFC905096。
[0091] 溶液4:溶质及其浓度为?10^1禮和他!10)33〇1111;溶剂为蒸馏水;?!1值为7.4。
[0092] 溶液B:溶质及其浓度为2mM MnCl2、2mM CaCl2、500mM NaCl和PMSF ImM;溶剂为 pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。
[0093] 溶液C:溶质及其浓度为10%(10g/100mL)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mM NaCl和 ImM PMSF;溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。
[0094] 清洗液:用蒸馏水将溶液B稀释至10倍体积。
[0095]实施例l、pgp96的提取
[0096] 组织中热休克蛋白gp96(以下简称pgp96)的提取步骤如下:
[0097] (1)分离分娩前的小鼠的胎盘组织,得到小鼠离体胎盘组织。取小鼠离体胎盘组织 或人离体胎盘组织,剪碎,按质量体积比lg: 4mL加入溶液A,然后用玻璃匀浆器磨碎。
[0098] (2)完成步骤(1)后,16500g离心lh,得到上清液甲。
[0099] (3)完成步骤(2)后,取上清液甲,16500g离心50min,得到上清液乙。
[0100] (4)完成步骤(3)后,取上清液乙,按体积比9:1加入溶液B,混匀后得到上样液。
[0101] (5)完成步骤(4)后,将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。
[0102] (6)完成步骤(5)后,用清洗液洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱,洗脱过程中实时监测 紫外吸收值,检测波长为280nm,直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。
[0103] (7)完成步骤(6)后,用溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱,弃去首先流出的过柱后 溶液0.5个柱体积,然后收集之后流出的过柱后溶液1个柱体积;将所述ConA琼脂糖凝胶柱 孵育50min后,再收集过柱后溶液1.5个柱体积。将两次收集的过柱后溶液合并,即为ConA洗 脱液。
[0104] (8)完成步骤(7)后,将ConA洗脱液上样至Hitrap Q阴离子交换柱。
[0105] (9)完成步骤⑶后,用含NaCl的pH7 · 4、12mM的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱,流速 为lmL/min。梯度洗脱程序:在pH7.4、12mM的PBS缓冲液中使NaCl含量由300mM匀速增至 800mM,线性梯度洗脱20个柱体积。收集合并NaCl含量为400~450mM的洗脱液,即为洗脱液 甲。
[0106] (10)完成步骤(9)后,取洗脱液甲,用超滤管进行超滤浓缩,得到pgp96的溶液。 pgp96的溶液中,pgp96浓度为5mg/mL。
[0107] 将pgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot(以gp96单克隆抗体作为 一抗,HRP标记的IgG抗体作为二抗),实验结果见图1(箭头所指为pgp96)。结果表明,pgp96 的溶液显示单一分子量条带,对应的分子量为96kDa。
[0108] 实施例2、重组热休克蛋白gp96的制备
[0109] 一、重组质粒 pFastBac?l_gp96 的构建
[0110] 1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA,然后进行反转录获得cDNA。
[0111] 2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列,人工合成引物Fl:5'_ GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3 '(下划线为限制性内切酶EcoRI识别序列)和R1: 5 ' -GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3 '(下划线为限制性内切酶Xbal识别序列)。
[0112] 3、完成步骤1和2后,以步骤1获得的cDNA为模板,以步骤2合成的F1和R1为引物进 行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
[0113] 4、用限制性内切酶EcoRI和Xbal双酶切PCR扩增产物,回收酶切产物。
[0114] 5、用限制性内切酶EcoRI和Xbal酶切质粒pFastBac?l,回收约4700bp的载体骨架。
[0115] 6、将酶切产物与载体骨架连接,得到连接产物。
[0116] 7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞,得到重组大肠杆 菌,然后提取该重组大肠杆菌的质粒,获得重组质粒pFastBacl_gp96。
[0117] 根据测序结果,对重组质粒pFastBacl_gp96进行结构描述如下:将质粒pFastBacl 的EcoRI和Xbal识别序列间的片段(质粒pFastBacl被限制性核酸内切酶EcoRI和Xbal切成 一个大片段和一个小片段,该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1所不的双链DNA分子。 重组质粒pFastBac l-gp96表达重组热休克蛋白gp96(以下简称rgp96),rgp96的氨基酸序 列如序列表中序列2所示。
[0118] 二、rgp96 的表达
[0119] 1、将步骤一构建的重组质粒pFastBacl_gp96共转染Sf9细胞(每1X106个Sf9细胞 约转染4yg重组质粒pFastBacl-gp96;共转染过程中,转染试剂为Cellfectin II reagent, 培养基为Insect-XPRESS? Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine,27°C 孵育72h,离心,上清液即为PI代病毒。
[0120] 2、将Sf9细胞悬浮液1(含1\108个3丨9细胞)27°(:培养8~1()11,得到培养细胞;然后 向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05~0.1M0I),27°C孵育72h,4000rpm离心5min, 上清液即为P2代病毒。
[0121] 3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6X108个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05~ 0 · 1M0I),27°C、100~120rpm培养72h,4000rpm离心5min,上清液即为P3代病毒。
[0122] 以gp96单克隆抗体作为一抗,辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为 二抗,对P3代病毒进行western杂交,western杂交具体步骤参考如下文献:张悦鸣,段跃强, 罗德炎,姚惠娟,王希良,李志奎.小鼠可溶性IL_5a受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴 定[J ].中国生物制品学杂志,2013,26:5.
[0123] western杂交实验结果表明,rgp96在Sf9细胞中表达。
[0124] 三、rgp96的纯化
[0125] 1、向300ml的Sf 9细胞悬浮液3 (含4.5 X 108个Sf 9细胞)中加入P3代病毒(剂量为 5M0I),27°C、100~120rpm培养72h,得到悬浮液。
[0126] 2、取所述悬浮液,7000rpm离心20min,获得上清液1。
[0127] 3、取所述上清液1,经0.22mm滤膜过滤,获得上样液。
[0128] 4、将所述上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为lmL/min), 然后先用5mL的pH7.5、200mM的roS缓冲液冲洗(流速为lmL/min);再用10mL的pH7.5、300mM 的PBS缓冲液冲洗(流速为lmL/min);最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为 lmL/min),收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩,得到lmL左右 的浓缩液。所述浓缩液即含有rgp96。
[0129] 5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为 0 · 25mL/min),然后用pH7 · 5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0 · 25mL/min),收集为9~12mL 处的穿透液,进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩,得到rgp96的溶液。采 用BCA法测定rgp96的溶液中的蛋白浓度,最后分装,存于-80°C。
[0130]将步骤5得到的rgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析,实验结果见图2中左图(泳道 1为高分子量标准蛋白质,泳道2为rgp96,箭头为rgp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白 gp96的溶液进行Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗,辣根过氧化酶标记的山羊抗 大鼠的单克隆抗体作为二抗),实验结果见图2中右图。结果表明,rgp96的溶液显示单一分 子量条带,对应的分子量与预期一致。
[0131]实施例3、pgp96或rgp96在活化调节性T细胞中剂量的确定
[0132] 一、小鼠分组免疫
[0133] 将90只九周龄体重为18~22g的小鼠随机分成pgp96处理组l、pgp96处理组2、 pgp96处理组3、pgp96处理组4、rgp96处理组1、rgp96处理组2、rgp96处理组3、rgp96处理组4 和对照组(每组10只),分别进行如下处理:
[0134] PgP96处理组1:实验第1天,腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液;实验第8天,再 次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液;实验第22天,再次腹腔注射实施例1制备的pgp96 的溶液。每次注射剂量均为l〇yg pgp96/只。
[0135] pgp96处理组2:按照pgp96处理组1的操作步骤进行,仅将注射剂量10yg pgp96/只 替换为50yg pgp96/只。
[0136] pgp96处理组3:按照pgp96处理组1的操作步骤进行,仅将注射剂量10yg pgp96/只 替换为l〇〇yg pgp96/只。
[0137] pgp96处理组4:按照pgp96处理组1的操作步骤进行,仅将注射剂量10yg pgp96/只 替换为l〇〇yg pgp96/只。
[0138] rgP96处理组1:实验第1天,腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液;实验第8天,再 次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液;实验第22天,再次腹腔注射实施例2制备的rgp96 的溶液。每次注射剂量均为10ygrgp96/只。
[0139] rgp96处理组2:按照rgp96处理组1的操作步骤进行,仅将注射剂量10ygrgp96/只 替换为50ygrgp96/只。
[OHO] rgp96处理组3:按照rgp96处理组1的操作步骤进行,仅将注射剂量10ygrgp96/只 替换为100ygrgp96/只。
[0141 ] rgp96处理组4:按照rgp96处理组1的操作步骤进行,仅将注射剂量10ygrgp96/只 替换为500ygrgp96/只。
[0142] 对照组:实验第1天腹腔注射pH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液,实验第8天,再次腹腔 注射pH7.4、0.Olmol/L PBS缓冲液;实验第22天,再次腹腔注射pH7.4、0.Olmol/L PBS缓冲 液。每次注射剂量均为1〇〇μL7只。
[0143] 二、小鼠淋巴细胞分离
[0144] 取完成步骤一后第8天的小鼠,获取小鼠脾脏淋巴细胞(每只小鼠取3 Χ106个脾脏 淋巴细胞)。
[0145] 三、pgp96或rgp96在活化调节性Τ细胞中剂量的确定
[0146] 1、取步骤二获取的小鼠脾脏淋巴细胞(少于1X106个),1000rpm离心10min,收集 小鼠脾脏淋巴细胞。
[0147] 2、完成步骤1后,取所述小鼠脾脏淋巴细胞,加入10(^1^含5%(质量体积比沾5八的 pH7·4、0·Olmol/L PBS缓冲液重悬,4°C封闭20min;然后lOOOrpm离心 10min,用 100yL上清液 重悬沉淀,得到混合液甲。
[0148] 3、完成步骤2后,取所述混合液甲,加入FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4和Percp-Cy5.5-anti-CD25,4°C 避光孵育 20min。
[0149] 4、完成步骤3后,取所述混合液甲,加入lmL pH7.4、0.Olmol/L PBS缓冲液,震荡混 匀,lOOOrpm离心10min,收集小鼠脾脏淋巴细胞,然后用400yL pH7.4、0.Olmol/L PBS缓冲 液重悬,得到混合液乙。
[0150] 5、完成步骤4后,取所述混合液乙,加入600yL固定/破膜剂,4°C破膜30min(实际操 作过程中不超过lh即可);然后lOOOrpm离心10min,收集沉淀,得到沉淀1。
[0151 ] 6、完成步骤5后,取所述沉淀1,加入lmL 1 X洗涤液重悬,lOOOrpm离心10min,得到 沉淀2和上清液丙。取100yL上清液丙重悬沉淀2,得到混合液丙;向混合液丙中加入APC-anti-Foxp3,4°C 避光孵育 30min。
[0152] 7、完成步骤6后,取所述混合液丙,加入lmL 1 X洗涤液重悬,lOOOrpm离心10min, 收集沉淀,得到沉淀3。取400yL含4 % (质量体积比)多聚甲醛的pH7.4、0.01 mo 1/L PBS缓冲 液重悬沉淀3,然后用流式细胞仪分析小鼠脾脏淋巴细胞中⑶4+⑶25+F0XP3+调节性T细胞的 频率。
[0153] 实验结果见图3(小鼠脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+F0XP3 +调节性Τ细胞的频率即 F0XP3+细胞在CD4+细胞中比例)。结果表明,pgp96处理组l、pgp96处理组2、pgp96处理组3、 pgp96处理组4、rgp96处理组1、rgp96处理组2、rgp96处理组3和rgp96处理组4中小鼠的脾脏 淋巴细胞中CD4+CD25+F0XP3+调节性T细胞的频率均高于对照组,尤其是pgp96处理组3、 pgp96处理组4、rgp96处理组3和rgp96处理组4中小鼠的脾脏淋巴细胞中CD4+CD25+F0XP3+调 节性T细胞的频率均显著高于对照组。因此,100ygrgp96、500ygrgp96、100ygpgp96或500μ gpgp96均可以显著诱导⑶4+⑶25+F0XP3+调节性T细胞的产生。
[01 Μ]实施例4、pgp96或rgp96在治疗类风湿性关节炎中的应用
[0155] 一、小鼠分组免疫
[0156] 1、发病小鼠的获得
[0157] (1)鸡Π 型胶原混合液的制备
[0158] 将鸡Π 型胶原溶于浓度为0 . lmol/L的醋酸水溶液中,4°C条件下搅拌使之充分溶 解,得到鸡Π 型胶原混合液;鸡Π 型胶原混合液中,鸡Π 型胶原的浓度为2g/L。
[0159] (2)鸡Π 型胶原乳剂的制备
[0160] 将鸡Π 型胶原混合液和弗氏完全佐剂等体积混合,得到鸡Π 型胶原乳剂。
[0161] (3)发病小鼠的获得
[0162] 取九周龄体重为18~22g的小鼠,于背部皮下注射O.lmL鸡Π 型胶原乳剂,24天后, 关节肿胀的小鼠即为发病小鼠。
[0163] 2、小鼠分组免疫
[0164] 选取50只九周龄的体重为18~22g的关节肿胀程度相似的发病小鼠(即根据下述 步骤二中小鼠类风湿关节炎评分标准计算得出的类风湿关节炎的评分数值基本相同的发 病小鼠),随机分成pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5、rgp96处理组6和对照组 (每组10只),分别进行如下处理:
[0165] PgP96处理组5:实验第0天,腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液;实验第7天,再 次腹腔注射实施例1制备的pgp96的溶液;实验第21天,再次腹腔注射实施例1制备的pgp96 的溶液。每次注射剂量均为l〇〇yg pgp96/只。
[0166] pgp96处理组6:按照pgp96处理组5的操作步骤进行,仅将注射剂量100yg pgp96/ 只替换为500yg pgp96/只。
[0167] rgP96处理组5:实验第0天,腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液;实验第7天,再 次腹腔注射实施例2制备的rgp96的溶液;实验第21天,再次腹腔注射实施例2制备的rgp96 的溶液。每次注射剂量均为l〇〇yg pgp96/只。
[0168] rgp96处理组6:按照rgp96处理组5的操作步骤进行,仅将注射剂量100yg pgp96/ 只替换为500yg pgp96/只。
[0169] 对照组:实验第0天腹腔注射pH7.4、0.01 mol/L PBS缓冲液,实验第7天,再次腹腔 注射pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液;实验第21天,再次腹腔注射pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲 液。每次注射剂量均为1〇〇μL7只。
[0170] 二、小鼠类风湿关节炎的评分数值
[0171] 进行步骤一中2的实验过程中,分别于实验的第0天、第4天、第8天、第12天、第16 天、第20天、第24天、第28天和第32天观察各小鼠足部的基本情况,并根据小鼠类风湿关节 炎评分标准计算类风湿关节炎的评分数值(每只小鼠的类风湿关节炎的评分数值为每只小 鼠所有病变关节评分的总和,每只小鼠有四个关节,所以最大分数为16分),然后根据各组 小鼠的类风湿关节炎的评分数值取平均值,得到各组的类风湿关节炎的评分平均值(简称 分值)。以免疫天数为横坐标,以分值为纵坐标,绘制曲线。
[0172] 小鼠类风湿关节炎评分标准具体如下:
[0173] 0分:无明显改变;
[0174] 1分:一个趾头明显肿胀和发红;
[0175] 2分:轻度的肿胀和肢体的红斑或两个趾头的肿胀;
[0176] 3分:三个趾头出现明显的肿胀和肢体的红斑;
[0177] 4分:整个关节出现肿胀和发红,甚至关节僵直,严重功能障碍。
[0178]三、抗Π 型胶原抗体的滴度的测定
[0179]小鼠血清中抗Π 型胶原抗体的滴度采用间接ELISA方法测定。
[0180] 设置试验孔,进行三次重复试验,每次重复试验的步骤如下:
[0181] 1、取鸡Π 型胶原,用pH7.4、0.0 lmol/L PBS缓冲液溶解,得到包被液;包被液中,鸡 Π 型胶原的浓度为10yg/mL。
[0182] 2、完成步骤1后,取96孔酶标板,加入100yL包被液,用封板膜封好,4°C过夜,然后 弃上清,拍干。
[0183] 3、完成步骤2后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复该步骤三次。
[0184] 4、完成步骤3后,取所述96孔酶标板,每孔加入200yL含5% (体积百分比)BSA的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,用封口膜封好微孔板,封闭lh,然后弃上清,拍干。
[0185] 5、取完成步骤一中2后第22天的小鼠,通过眼眶摘眼球取血200yL,然后室温静置 30min,3000rpm离心20min,得到血清;将血清用含0.05% (体积百分比)吐温-20的pH7.4、 0.01m〇l/L PBS缓冲液稀释至32000倍体积,得到上清稀释液。
[0186] 6、完成步骤4和5后,取所述96孔酶标板,每孔加入100yL上清稀释液,37 °C孵育lh。
[0187] 7、完成步骤6后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复该步骤三次。
[0188] 8、完成步骤7后,取所述96孔酶标板,每孔加入100yL辣根过氧化物酶羊抗鼠抗体 稀释液(工作浓度为1:2000,用含0.05% (体积百分比)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L PBS缓 冲液稀释辣根过氧化物酶羊抗鼠抗体得到),37 °C孵育lh。
[0189] 9、完成步骤8后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复该步骤三次。
[0190] 10、完成步骤9后,取所述96孔酶标板,每孔加入lOOyLTMB底物溶液,轻轻震荡混 匀,室温下避光放置l〇min显色;然后每孔加入50yL浓度为2M的硫酸水溶液终止反应。用自 动酶标仪于450nm波长下读取每孔的0D值。
[0191] 设置空白对照孔:按照上述步骤,将步骤5和6替换为步骤A,其它步骤均不变,得到 空白对照孔的0D值。步骤A为:取96孔酶标板,每孔加入100yLpH7.4、0.01mol/L PBS缓冲液, 37°C 孵育 lh。
[0192] 四、细胞增殖指数的测定
[0193] 设置试验孔,进行三次重复试验,每次重复试验的步骤均如下:
[0194] 1、取完成步骤一中2后第22天的小鼠,分别获取小鼠脾脏淋巴细胞。
[0195] 2、完成步骤1后,取所述小鼠脾脏淋巴细胞,用含10% (体积百分比)胎牛血清的 RPMI 1640培养液稀释,得到细胞浓度为4 X 106个/mL的细胞悬液。
[0196] 3、完成步骤2后,取96孔酶标板,每孔先加入100yL细胞悬液,再加入PHA和鸡Π 型 胶原,使PHA在体系中的浓度为20yg/mL,鸡Π 型胶原在体系中的浓度为100yg/mL。置于37°C 培养72h。
[0197] 4、完成步骤3后,取96孔酶标板,每孔加入20yL的浓度为5yg/mL的MTT水溶液,37 °C 培养4h;然后弃上清,每孔加入150yL DMS0,震荡lOmin,在酶标仪上读取570nm下的0D值。
[0198] 设置空白对照孔:按照上述步骤,将步骤3替换为步骤a,其它步骤均不变,得到空 白对照孔的0D值。步骤a为:完成步骤2后,取96孔酶标板,每孔加入lOOyL所述细胞悬液,然 后置于37°C培养72h。
[0199] 根据下述公式计算细胞增殖指数(SI):
[0200] 细胞增殖指数(SI)=(实验孔的0D值-空白对照孔的0D值)/空白对照孔的0D值。 [0201 ]五、小鼠血清中细胞因子含量的测定
[0202] 小鼠 IL-lffiLI SA试剂盒、小鼠 IL-6ELISA试剂盒、小鼠 TNF-aELI SA试剂盒、小鼠 IL-17A ELISA试剂盒均为eBioscience公司产品,产品目录号分别为88-7013、88-7064、88-7324和88-7371;每个试剂盒内均含有相应的细胞因子标准品、捕获抗体、生物素标记的检 测抗体、亲和素标记的辣根过氧化物酶、稀释液以及TMB底物溶液等组件。
[0203] 一、小鼠血清中TNF-a含量的测定
[0204]设置试验孔,进行三次重复试验,每次重复试验的步骤均如下:
[0205] 1、用pH7.4、0.Olmol/L PBS缓冲液溶解捕获抗体,得到工作浓度为1:250的捕获抗 体稀释液。
[0206] 2、完成步骤1后,取96孔酶标板,加入100yL捕获抗体稀释液,用封板膜封好,4°C过 夜,然后弃上清,拍干。
[0207] 3、完成步骤2后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复三次。
[0208] 4、完成步骤3后,取所述96孔酶标板,每孔加入200yL含5% (体积百分比)BSA的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,用封口膜封好微孔板,封闭lh,然后弃上清,拍干。
[0209] 5、取完成步骤一中2后第22天的小鼠,通过眼眶摘眼球取血200yL,然后室温静置 30min,3000rpm 离心 20min,得到血清。
[0210] 6、完成步骤4和5后,取所述96孔酶标板,每孔加入50yL血清,25 °C孵育2h 〇
[0211] 7、完成步骤6后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复三次。
[0212] 8、完成步骤7后,取所述96孔酶标板,每孔加入100yL生物素标记的检测抗体稀释 液(工作浓度为1:250,用稀释液稀释生物素标记的检测抗体),37°C孵育lh。
[0213] 9、完成步骤8后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复三次。
[0214] 10、完成步骤9后,取所述96孔酶标板,每孔加入100yL亲和素标记的辣根过氧化物 酶稀释液(工作浓度为1:250,用稀释液稀释亲和素标记的辣根过氧化物酶),37°C孵育 0.5h〇
[0215] 11、完成步骤10后,取所述96孔酶标板,加入含0.05 % (体积百分比)吐温-20的 pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复三次。
[0216] 12、完成步骤11后,取所述96孔酶标板,37°C孵育0.5h,然后加入含0.05 % (体积百 分比)吐温-20的pH7.4、0.01m〇l/L PBS缓冲液,静置30s,然后弃上清,拍干。重复五次。
[0217] 13、完成步骤12后,取所述96孔酶标板,每孔加入100yL TMB底物溶液,轻轻震荡混 匀,37 °C避光放置lOmin显色;然后每孔加入50yL的浓度为2M的硫酸水溶液终止反应。用自 动酶标仪于450nm波长下读取每孔的0D值。
[0218] 设置空白对照孔:按照上述步骤,将步骤6中的血清替换为pH7.4、0.Olmol/L roS 缓冲液,其它步骤均不变,得到空白对照孔的0D值。
[0219] 设置标准样品孔:按照上述步骤,将步骤6中的血清分别替换为浓度分别为500pg/ mL、250pg/mL、125pg/mL、62·5pg/mL、31·25pg/mL、15·625pg/mL、7·8125pg/mL或3·91pg/mL 的TNF-α标准品稀释液(用稀释液稀释),其它步骤均不变,得到各TNF-α标准品稀释液的0D 值。以TNF-α标准品稀释液的浓度为横坐标,0D值为纵坐标,绘制标准曲线。
[0220]根据标准曲线,得到小鼠血清中的TNF-a的含量。
[0221] 二、小鼠血清中IL-Ιβ含量的测定
[0222] 按照上述步骤一的方法,将TNF-a替换为IL-Ιβ,其它步骤均不变,得到小鼠血清中 IL-Ιβ的含量。
[0223] 三、小鼠血清中IL-6含量的测定
[0224] 按照上述步骤一的方法,将TNF-a替换为IL-6,其它步骤均不变,得到小鼠血清中 IL-6的含量。
[0225] 四、小鼠血清中E-17A含量的测定
[0226] 按照上述步骤一的方法,将TNF-a替换为IL-17A,其它步骤均不变,得到小鼠血清 中IL-17A的含量。
[0227] 小鼠类风湿关节炎的评分数值的实验结果见图4。结果表明,实验前15天,pgp96处 理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5、rgp96处理组6和对照组中的小鼠类风湿关节炎的评 分数值均无显著差异。从实验第16天开始,pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和 rgp96处理组6中的小鼠类风湿关节炎的评分数值显著小于对照组(P〈0.001),而pgp96处理 组5和rgp96处理组5中的小鼠类风湿关节炎的评分数值无显著差异,pgp96处理组6和rgp96 处理组6中的小鼠类风湿关节炎的评分数值也无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5 中的小鼠类风湿关节炎的评分数值均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6,因此,最佳免疫 剂量为l〇〇yg pgp96/只或 100yg rgp96/只。
[0228] 小鼠血清中抗II型胶原抗体滴度的检测结果见图5。结果表明,pgp96处理组5、 pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠血清中抗II型胶原抗体滴度显著小于 对照组(?〈0.001)<^8口96处理组5和找?96处理组5中小鼠血清中抗11型胶原抗体滴度无显 著差异。pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠抗II型胶原抗体滴度无显著差异。pgp96处理 组5和rgp96处理组5中小鼠血清中抗II型胶原滴度均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6, 因此,最佳免疫剂量为l〇〇yg pgp96/只或100yg rgp96/只。
[0229] 细胞增殖指数的实验结果见图6。结果表明,pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96 处理组5和rgp96处理组6中细胞增殖指数显著小于对照组(P〈0.001),pgp96处理组5和 rgp96处理组5中细胞增殖指数无显著差异,pgp96处理组6和rgp96处理组6中细胞增殖指数 无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中细胞增殖指数均小于pgp96处理组6和rgp96 处理组6,因此,最佳免疫剂量为100yg pgp96/只或100yg rgp96/只。
[0230] 小鼠血清中各细胞因子检测结果见图7(A为IL-lf3,B为IL-17A,C为IL-6,D为TNF- α)。结果表明,pgp96处理组5、pgp96处理组6、rgp96处理组5和rgp96处理组6中小鼠血清中 的细胞因子(TNF-a、IL-10、IL-6或IL-17A)含量显著小于对照组(?〈0.05),?8?96处理组5和 rgp96处理组5中小鼠血清中细胞因子〇册-€1、几-1|3、11^6或几-174)的含量无显著差异, pgp96处理组6和rgp96处理组6中小鼠血清细胞因子(TNF-a、IL-10、IL-6或IL-17A)的含量 无显著差异。pgp96处理组5和rgp96处理组5中小鼠血清细胞因子(TNF-a、IL-10、IL-6或IL-17A)含量均小于pgp96处理组6和rgp96处理组6,因此,最佳免疫剂量为lOOyg pgp96/只或 lOOyg rgp96/只。
[0231]上述结果表明,用pgp96或rgp96免疫发病小鼠,能够有效的治疗或减轻类风湿性 关节炎的发病症状。
【主权项】
1. 热休克蛋白g P 9 6在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至少 一种: A1)治疗类风湿性关节炎; A2)缓解类风湿性关节炎的症状; A3)诱导调节性T细胞的产生; A4)降低抗Π 型胶原抗体滴度; A5)降低TNF-α浓度; A6)降低IL-Ιβ浓度; A7)降低IL-6浓度; A8)降低IL-17浓度; A9)降低细胞增殖能力; A10)预防类风湿性关节炎。2. 如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述热休克蛋白gp96为al)或a2)或a3)或 a4): al)氣基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所不的蛋白质; a2)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质; a3)在al)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质; a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。3. 如权利要求1所述的应用,其特征在于: 所述热休克蛋白gp96的获得方式为D1)或D2): D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取; D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中,培养,纯化。4. 如权利要求1至3任一所述的应用,其特征在于:所述调节性T细胞为⑶4+⑶25+FOXP3+ 调节性T细胞。5. 如权利要求1至4任一所述的应用,其特征在于:所述产品为药物。6. -种产品,其活性成分为热休克蛋白gp96;所述产品的功能为如下A1)至A10)中的至 少一种: A1)治疗类风湿性关节炎; A2)缓解类风湿性关节炎的症状; A3)诱导调节性T细胞的产生; A4)降低抗Π 型胶原抗体滴度; A5)降低TNF-α浓度; A6)降低IL-Ιβ浓度; A7)降低IL-6浓度; A8)降低IL-17浓度; A9)降低细胞增殖能力; A10)预防类风湿性关节炎。7. 如权利要求6所述的产品,其特征在于:所述热休克蛋白gp96为al)或a2)或a3)或 a4): al)氣基酸序列是序列表中序列2自N末端起第2位至783位所不的蛋白质; a2)氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白质; a3)在al)或a2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质; a4)将序列表中序列2自N末端起第2位至783位或序列表中序列2所示的氨基酸序列经 过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。8. 如权利要求6所述的产品,其特征在于: 所述热休克蛋白gp96的获得方式为D1)或D2): D1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取; D2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中,培养,纯化。9. 如权利要求6至8任一所述的产品,其特征在于:所述调节性T细胞为⑶4+⑶25+F0XP3+ 调节性T细胞。10. 如权利要求6至9任一所述的产品,其特征在于:所述产品为药物。
【文档编号】A61P19/02GK106039287SQ201610486258
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】孟颂东, 郑华国
【申请人】中国科学院微生物研究所
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