用于微粒递送锌原卟啉的制剂的制作方法

用于微粒递送锌原卟啉的制剂的制作方法
【专利摘要】本发明提供了涉及生物相容递送锌原卟啉(ZnPP)的制剂及其使用方法。在一些实施方案中，将所述ZnPP配制用于口服递送。制剂可包含ZnPP微粒，其中将所述ZnPP活性剂与药学上可接受的稳定剂混合或用药学上可接受的稳定剂涂布，以提供对酸性条件增加的稳定性和在中性pH增加的溶解性。
【专利说明】用于微粒递送锌原卟啉的制剂
[0001] 相关申请
[0002] 本申请请求保护于2014年2月3日提交的美国临时专利申请序列号61/935,200的 优先权权益，将其全部内容引入本文作为参考。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明是基于美国国立卫生研究院授予的契约TW008781在政府支持下完成的。美 国政府具有本发明一定的权利。
【背景技术】
[0005] 金属卟啉是血红素的结构类似物且对它们在处理新生儿高胆红素血症和其他病 症中的潜在用途已经进行了大量研究，持续超过三十年。使用这类化合物来控制胆红素水 平的药理学基础是通过竞争性抑制血红素加氧酶(H0)靶向阻止胆红素生成，所述血红素加 氧酶是胆红素生成途径中的限速酶。目前的研究继续通过限定用于治疗过度新生儿高胆红 素血症的治疗窗和靶向干预来寻求鉴定安全且有效的金属卟啉。
[0006] H0酶以组成型(H0-2)和诱导型(H0-1)亚型存在。血红素加氧酶是代谢性酶，其利 用NADPH和氧来分裂血红素部分，从而释放胆绿素、一氧化碳(C0)和铁。胆绿素(BV)和胆红 素(分别是胆绿素还原酶的底物和产物)是有效的抗氧化剂。H0-1在细胞内环境稳定中的作 用包括充当细胞应激的重要"感受器"和限制或预防组织损伤的直接贡献者的特征;参与产 生在对应激的细胞适应中的H0活性。H0-1路径及其产物的药理学处理可用于提供针对以氧 化应激和炎症为特征的各种病症的保护。
[0007] 锌原卟啉(ZnPP)是在血红素生物合成中以痕量形成的正常代谢产物。血红素的生 物合成途径中的最终反应是铁与原卟啉的螯合。在铁不足或所用铁被削弱期间，锌成为亚 铁螯合酶的另一金属底物，从而增加 ZnPP的形成。证据表明，这一金属取代是对铁衰竭的第 一生物化学响应中的一种，导致增加的ZnPP出现在循环的红细胞中。因为这一锌-对-铁的 替代主要发生在骨髓中，因此红细胞中ZnPP/血红素的比率反映出骨髓中铁的状态。此外， ZnPP可通过H0的竞争性抑制来调节血红素的分解代谢，所述H0是产生胆红素和C0的血红素 降解途径中的限速酶。在临床上，ZnPP量化作为用于评估铁营养和代谢的灵敏且特异性的 工具是有价值的。诊断测定适用于各种临床情况，包括儿科、产科和血库。
[0008] ZnPP具有用于治疗新生儿黄疸和其他病症的一些所需特性：其是高度有效的；其 无需穿过血脑屏障(BBB);其对光活化是相对惰性的并因此在体内没有光敏化/光毒效应； 且其不会被H0降解。但是，该化合物的递送是困难的。本发明解决了这个问题。

【发明内容】

[0009] 本发明提供了涉及生物相容的递送有效剂量的锌原卟啉(ZnPP)的制剂及其使用 方法。在一些实施方案中，将所述ZnPP配制用于口服递送。这些制剂提供了ZnPP微粒，其中 所述ZnPP活性剂涂覆有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，提供了治疗组合物，其 包含含有ZnPP的包衣微粒和药学上可接受的赋形剂。所述治疗组合物可配制用于口服给 药，包括但不限于通过胃管等例如作为液体给药至新生儿和婴儿。
[0010]本文所述微粒包含所述ZnPP活性剂和药学上可接受的稳定剂，例如，其中所述活 性剂可以是总微粒重量的至少约5%，且优选不超过总微粒重量的约50%。所述稳定剂可防 止所述活性剂在低pH下（例如，存在于胃中的酸性条件)不稳定。所述稳定剂还可以增加所 述活性剂在中性pH的溶解度，例如，提高在存在于肠的中性条件下的吸收。
[0011] 可将所述微粒混悬于药学上可接受的载体中，以提供充分浓缩的制剂来递送在合 理的制剂体积中的所需剂量的活性剂。载体包括药学上可接受的赋形剂，包括水性赋形剂。 这种组合物可以单位剂量制剂提供，例如，包含一定剂量的微粒ZnPP以用于给药至患者。所 述单位剂量通常还将进一步包含赋形剂，例如，提供用于增强稳定性和溶解性的赋形剂。在 某些实施方案中，有效剂量的活性剂是指当提供给患者时，有效抑制诱导型血红素加氧酶 (H0-1)、但比其抑制组成型血红素加氧酶(H0-2)的程度要高、优选基本上不抑制组成型血 红素加氧酶(H0-2)的剂量。在某些实施方案中，相对于不存在用本文所述组合物或方法进 行治疗的对照而言，有效剂量刺激在婴儿或新生儿中增加了胆红素降解。
[0012] 也提供了用本文所述的制剂和组合物进行治疗的方法。在一些实施方案中，提供 了用ZnPP治疗高胆红素血症的方法，其包括向有此需要的个体给药有效剂量的本文所述 ZnPP的微粒制剂的步骤。
[0013] 更具体地，所公开的实施方案包括在婴儿中治疗高胆红素血症或其症状的方法。 在一些实施方案中，所述婴儿是约35周至约43周的胎龄。在其他实施方案中，所述婴儿的年 龄不超过30天。在一些实施方案中，所述婴儿具有约2,500g的最小出生体重。在一些实施方 案中，所述婴儿具有约1，700g至约4，000g的出生体重。在一些实施方案中，所述婴儿具有至 少一种危险因素，例如，溶血性疾病、ΑΒ0血型不相容、抗-C Rh不相容、抗-c Rh不相容、抗-D Rh不相容、抗-E Rh不相容、抗-e Rh不相容、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏，或其任意组 合。在一些实施方案中，本文所述的ZnPP制剂在选自以下的时间进行给药：出生约6小时内、 出生约12小时内、出生约24小时内和出生约48小时内。在一些实施方案中，所述ZnPP制剂通 过口服给药。
[0014] 一些实施方案还包括在给药所述ZnPP制剂后测定治疗后总胆红素水平。在一些实 施方案中，治疗后总胆红素水平在向所述婴儿给药治疗量的ZnPP制剂后24小时为基线总胆 红素(TB)水平以下至少5%。在一些实施方案中，治疗后TB水平在向所述婴儿给药治疗量的 ZnPP制剂后48小时为基线TB水平以下至少10%。在一些实施方案中，治疗后TB水平在向所 述婴儿给药治疗量的ZnPP制剂后72小时为基线TB水平以下至少20%。在一些实施方案中， 治疗后TB水平在向所述婴儿给药治疗量的ZnPP制剂后48小时为超过基线TB水平不到3mg/ dL〇
[0015] 还发现本文所述制剂用于其他方法，其中需要递送有效剂量的ZnPP。在一些实施 方案中，提供了治疗癌症的方法。H0-1已经显示出涉及促癌活性。通过抑制H0,本文所述 ZnPP制剂在单独或与化学疗法或放射疗法组合时可在例如治疗实体瘤(如癌等）中发挥抗 肿瘤活性。
[0016] 其他方法包括，但不限于，在各种需要选择性抑制H0的病症中治疗年龄相关性黄 斑变性、治疗感染等。还发现，本文所述的组合物能用作NMR成像的造影增强剂。
【附图说明】
[0017] 图1提供了血红素降解途径的示意图。胆红素生成的减少可通过抑制血红素加氧 酶(H0)(其为血红素降解途径中的限速酶)而被靶向。血红素被H0降解以产生等摩尔量的一 氧化碳(C0)和胆绿素，然后将所述胆绿素立即用胆绿素还原酶降解以形成胆红素。
[0018] 图2包括三组（(A)、（B)和(C))，其显示了光毒性研究的实验装置。以3.75-30μπι〇1/ kg体重(BW)范围内的剂量向3日龄的幼鼠（在组(Α)中放大)腹腔给药载剂或Μρ，并然后将其 暴露于荧光3小时，所述荧光由2个冷白光和1个蓝光管组成（如组(Β)所示），其发射35.0 ± 1.0yW/cm2/nm的福照，由BiliBlanket II Meter测量（如组(C)所示）。
[0019 ]图3描述了总结ZnBG的安全性和有效性的数据。向暴露于光的3日龄幼鼠给药3.7 5 μπιο? ZnBG/kg BW，其显示出无光毒性，正如100%的存活率（空心栏)和高达75%的抑制H0 活性(实心栏)所示。
[0020] 图4描述了在与各种锌制剂接触后H0活性的体外抑制。使用从3日龄幼鼠中采集的 肝、脾和脑的超声处理物评估30μΜ的ZnPP制剂的体外H0抑制效力。
[0021] 图5包括显示了胃内注射ZnPP制剂的两个组。向3日龄小鼠幼鼠直接胃内（IG)注射 30ymol/kg BW剂量的ZnPP制剂。图5还包括显示了给药如下制剂后3小时的胃内容物的四个 组：水性ZnPP磷酸盐（ZnPP-P〇4); ZnPP-壳聚糖（ZnPP-A和ZnPP-Β); ZnPPEUDRAG丨T? (ZnPP-Poly);和ZnPP磷脂（ZnPP脂质）。
[0022] 图6(A)描述了H0活性的体内抑制。将制剂或VEH胃内注射到3日龄新生的FVB小鼠 幼鼠中。给药后3小时，采集肝、脾和脑并通过气相色谱(GC)测定H0活性。抑制表示为对照值 的％。
[0023]图7描述了两个组（（A)和(B))，其显示了具有以下成分的喷雾干燥的颗粒的SEM图 像：（A)75%w/wEUDRAG丨T?;和⑶38%EUDRAGmi^褶皱的形态表明在颗粒形成期 间的早期聚合物沉淀确保了有效的药物包封。
[0024]图8描述了两个组（（A)和(B))。组(A)显示了给药在磷酸钠缓冲液中的ΖηΡΡ-Ρ04的 幼鼠胃内容物；原卟啉在胃中沉淀。组(B)显示了给药ZnPP喷雾干燥微粒的幼鼠的胃内容 物;所述喷雾干燥的微粒不沉淀。
[0025]实施方案详述
[0026] 在描述本发明方法之前，应理解本发明并不限于所述的具体方法，因此当然可能 变化。还应理解，本文所用术语仅用于描述具体实施方案且不旨在继续限制，因为本发明的 范围仅在所附权利要求中进行限定。
[0027] 当提供数值范围时，应理解每个在该范围的上限和下限之间的中间值(除非本文 另有明确提及，否则为下限单位的十分位）以及在所述范围内的任意其他提及的或中间值 均包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在本发明所涵盖的较小的范 围内，以所述范围内具体排除的限定为准。
[0028] 除非另外提及，本文所述所有技术和科学术语与本发明所属技术领域一般技术人 员通常所理解的具有相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任意方 法和材料也可用于实施或测试本发明，但目前所描述的是优选的方法和材料。本文所提及 的所有出版物通过引用的方式并入本文中以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/ 或材料。
[0029]需要注意的是：除非上下文中另有明确提及，否则本文和在所附权利要求中所用 的单数形式"一"、"该"和"所述"包括复数对象。因此，例如，针对"微球"的提及，其包括多个 这样的微球且对于"所述支架"的提及，其包括一个或多个支架及本领域技术人员已知的它 的等价物，等等。
[0030] 本文所用术语"治疗（treating和treatment)"通常是指获得所需的药理学和/或 生理学效果。该效果就预防或部分预防疾病、症状或其病症而言可以是预防性的，和/或就 部分或完全治愈病症、症状或由该病症引起的不良反应而言可以是治疗性的。本文所用术 语"治疗"具体包括施用包含微粒形式的ZnPP活性剂的组合物，包括口服给药。本文所用术 语"预防"是指用于预防或部分预防疾病或病症所采取的一种或多种措施。
[0031] 术语"预防"是本领域公认的，且当用于病症时是本领域熟知的且包括给药组合 物，该组合物相对于未接受该组合物的受试者而言在受试者中降低该病症的可能性或延迟 其发作。因此，高胆红素血症的预防包括，例如，相对于未接受所述组合物的受试者而言，降 低接受所述组合物的受试者出现高胆红素血症的可能性，和/或相比于未治疗的对照人群， 在治疗人群中（平均而言)例如以统计学和/或临床上显著的量推迟高胆红素血症的发作。
[0032] 术语"受试者"包括哺乳动物，例如，猫、狗、马、猪、牛、绵羊、嗤齿类动物、兔、松鼠、 熊和灵长类动物，例如黑猩猩、大猩猩和人。
[0033]生理性黄疸在过渡时期（出生后1周）是常见的且在60%_70%的足月婴儿中观察 到。该病症是由以下导致的:胎盘对胆红素清除的突然停止和在肝脏胆红素摄取、胞内运输 和葡糖醛酸基转移酶(UGT1A1)共辄活性方面的瞬间缺乏。一个主要的致病因素是在新生儿 中胆红素产生的速率相比于成人中的速率增加2-3倍。所述血红素降解过程产生等摩尔量 的C0和胆红素。患有同族免疫性溶血性疾病(例如，Rhesus和ΑΒ0不相容)或其他溶血性病症 (例如，G6H)缺乏）的新生儿通常具有升高的胆红素产生速率，其与升高的TB水平相关。在经 验上，在溶血性疾病的情况下，升高的TB浓度已与神经毒性和脑损伤(核黄疸）相关且已促 使使用攻击性且相对高风险的干预，例如换血疗法。
[0034](在成年期)低智商分数的风险可在患有严重非溶血性黄疸的男婴中显著增加。此 外，已经在表面健康的长期和短期母乳喂养的婴儿中或患有未鉴定的溶血性疾病的婴儿中 报道了越来越多的核黄疸病例。此外，近期的随机对照试验结果显示，积极的光疗显著降低 神经发育损伤(NDI)的速度，但其被极轻出生体重(ELBW)婴儿(重501-750g)中增加的死亡 率所抵消，这进一步强调了对预防性方法的需求，包括调节胆红素的产生并因此降低危险 性高胆红素水平在这一高风险群体中的可能性的药理学方法。
[0035]目前批准的且常用于高胆红素血症的治疗包括光疗和换血疗法。光疗涉及用430-490nm范围的光（蓝光）照射新生儿。该光将胆红素转变成光红素和光胆红素 (photobilirubin)，其为低毒性的水溶性光致同分异构体，其更容易被婴儿排出并由此可 导致胆红素水平的降低。
[0036] 本文所用术语"药学上可接受的"是指化合物或化合物的组合，其不会将人或动物 接受者的生理损伤到会危害该接受者的生存力的程度。优选地，所给药的化合物或化合物 组合最多是引起对人或动物接受者的健康暂时的有害影响。
[0037] 本文所用术语"载体"是指任意药学上可接受的赋形剂、稀释剂或其他分散试剂， 其将使得治疗组合物通过所需途径进行给药，例如，通过口服给药。因此，本文所用的"载 体"包括本领域技术人员已知的这种赋形剂和化合物，其对人或动物接受者是药学上和生 理学上可接受的。
[0038]本文所述制剂包括上文所述的稳定化ZnPP微粒，其中相对于未包衣的ZnPP，所述 微粒在酸性条件下具有增加的稳定性，和/或在中性pH下具有提高的溶解性。在酸性条件 下，例如在不超过4.5、不超过4.3、不超过4、不超过3.5的pH下，ZnPP沉淀并降解成无活性成 分。在一些实施方案中，所述微粒对酸性条件至少10%更稳定、至少20%更稳定、至少30% 更稳定、至少40 %更稳定、至少50 %更稳定、至少75 %更稳定，且可至少2倍更稳定、至少5倍 更稳定、至少10倍更稳定或更多倍更稳定。稳定性可通过观察在体外实验条件下的沉淀和 降解进行实验性确定。
[0039]本发明的稳定化微粒制剂还能够提高ZnPP在中性pH的吸收，例如，在大于5.5但小 于8.5的pH，包括大于约6.0、大于约6.5、大于约7.0和小于约8.5、小于约8.0的pH。在一些实 施方案中，所述微粒在中性pH下至少10%更可溶、至少20%更可溶、至少30%更可溶、至少 40 %更可溶、至少50 %更可溶或至少75 %更可溶，且可至少2倍更可溶、至少5倍更可溶、至 少10倍更可溶或更多倍更可溶。溶解性可通过常规方法进行实验性确定。
[0040] 所述微粒可包含活性剂和稳定剂或基本上由活性剂和稳定剂组成。在一些实施方 案中，所述活性剂在该微粒中的浓度为总重的至多约5 %、至多约10 %、至多约15 %、至多约 20%、至多约25%、至多约30%、至多约35%、至多约40%、至多约45%、至多约50%，等等， 且可为约5%重量至约50%重量、约10%重量至约40%重量、约15%重量至约35%重量、约 20%重量至约30%重量，优选约5%重量、约6%重量、约7%重量、约8%重量、约9%重量、约 10%重量、约11 %重量、约12%重量、约13%重量、约14%重量、约15%重量、约16%重量、约 17%重量、约18%重量、约19%重量、约20%重量、约21 %重量、约22%重量、约23%重量、约 24%重量、约25%重量、约26%重量、约27%重量、约28%重量、约29%重量或约30%重量。
[0041] 所述微粒重量的余量通常由稳定剂提供，即，所述稳定剂为总重的至多约95%、至 多约90%、至多约85%、至多约80%、至多约75%、至多约70%、至多约65%、至多约60%、至 多约55%、至多约50%、至多约45%、至多约40%。在一些实施方案中，在该微粒中的稳定剂 的浓度优选为约95 %重量、约94 %重量、约93 %重量、约92 %重量、约91 %重量、约90 %重 量、约89%重量、约88%重量、约87%重量、约86%重量、约85%重量、约84%重量、约83%重 量、约82%重量、约81 %重量、约80%重量、约79%重量、约78%重量、约77%重量、约76%重 量、约75%重量、约74%重量、约73%重量、约72%重量、约71 %重量或约70%重量。所述稳 定剂在酸性条件下提供增加的稳定性，并在中性pH条件下提供增加的溶解性。
[0042] 所述微粒可具有控制的尺寸，以适用于最优化的药物递送。通常，所述颗粒将具有 至多约l〇nm、至多约50nm、至多约100nm、至多约250nm、至多约500nm、至多约Ιμπι、至多约2 · 5 μπι、至多约5μηι和不超过约ΙΟμπι的直径。在一些实施方案中，所述微粒尺寸为直径约lOOnm至 约5μηι，例如约100至约500nm、约500nm至约Ιμπι等。多个微粒任选地具有确定的平均尺寸范 围，其可以是基本均匀的，其中该差异可不超过直径的100 %、50 %或10 %。微粒的直径可例 如使用扫描电子显微镜检查(SEM)进行测量。
[0043] 微粒可通过各种方法形成，包括，在一些实施方案中，本文所列举的方法。感兴趣 的方法可包括，但不限于，控制的阳离子诱导的微乳液;和喷雾干燥。多聚微粒制造方法可 包括聚合电解质络合物的形成、复乳剂/溶剂蒸发技术、乳液聚合技术等。喷雾干燥是一种 方法，其使用在水性或其他液体相中溶解或悬浮的药物的射流，其通过高压喷嘴加压以产 生细雾。通常，也将增量剂加至该液体中。所述雾的水性或其他液体内容物蒸发，留下细粉 末。喷雾干燥的修饰方法，称为空气雾化的喷雾干燥，使用两个楔形喷嘴，压缩的空气通过 该喷嘴且液体溶液以高速通过。所述楔形喷嘴充当液体加速区，其中四股流以高速碰撞，产 生冲击波，该冲击波产生细小的液滴。然后将该液滴沉降到柱上并在收集前被热空气干燥 成固体粉末。
[0044] 感兴趣的稳定剂包括，但不限于，海藻酸盐、壳聚糖、卵磷脂，其是与磷酸的胆碱酯 相连的硬脂酸、棕榈酸和油酸的甘油二酯的天然存在的混合物;三偏磷酸钠;泊洛沙姆，即， 由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷））的中央疏水链以及侧面的聚氧乙烯(聚(环氧乙烷））的两个亲 水链组成的非离子型三嵌段共聚物，包括各种尺寸，例如，泊洛沙姆188、泊洛沙姆407等；阳 离子脂质，尤其是磷脂；油，例如椰子油等。壳聚糖是由无规分布的_(1，4)D-葡糖胺和N-乙 酰基-D-葡糖胺组成的线性多糖。其他感兴趣的稳定剂包括，例如蛋白质，例如白蛋白（例如 牛血清白蛋白、人血清白蛋白等）和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(N-乙烯基吡咯烷酮的水溶性支 链聚合物）。用于本文所述组合物和方法的PVP可具有约10K或更高的分子量，例如，约20K至 50K〇
[0045] 术语"阳离子脂质"旨在包括在生理学pH带正电荷的分子，且更具体地，组成型正 电荷分子，其例如包含季铵盐基团。用于本发明方法中的阳离子脂质通常由亲水性极性头 基和亲脂性脂肪链组成。参见，例如，Farhood等人（1992)Biochim.Biophys .Acta 1111: 239-246;Vigneron等人（1996)Proc.Natl .Acad. Sci.(USA)93:9682-9686。
[0046] 感兴趣的阳离子脂质包括，例如，咪唑啉衍生物(WO 95/14380)、胍衍生物(WO 95/ 14381)、磷酯酰胆碱衍生物(W0 95/35301)和哌嗪衍生物(W0 95/14651)。可用于本发明的 阳离子脂质的实例包括1，2_二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC); 1，2_二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DPPC) ;D0TIM(也称为B0DAI)(Solodin等人，（1995)Biochem.34: 13537-13544)、DDAB(Rose等人，（1991 )BioTechniques 10(4) :520-525)、D0TMA(美国专利 No.5,550,289)、D0TAP(EibMPWooley(1979)Biophys.Chem.l0:261-271)、DMRIE(Felgner 等人，（1994)J. Biol. Chem. 269(4) :2550-2561 )、EDMPC(可商购自 Avanti Polar Lipid， Alabaster，Alabama)、DCChol(Gau和Huang(1991)Biochem.Biophys·Res·Comm.179:280-285)、D0GS(Behr等人，（1989)Proc.Natl .Acad. Sci.USA，86 : 6982-6986)、MB0P(也称为 MeBOP) (W0 95/14651)和描述于W0 97/00241 中的那些。
[0047] 在一些实施方案中，所述ZnPP用一种或多种阳离子脂质稳定于微粒制剂中。感兴 趣的脂质包括任意上文所列的那些，例如，包括DSPC、DPPC、D0TIM、DDAB、D0TMA、DMRIE、 EDMPC、DCCho 1、DOGS、ΜΒ0Ρ等，其可单独使用或可作为不同脂质的混合剂，例如，比例为10: 1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10等的两种脂质。所述脂质可占以重量计至多所述微粒的约 90%、至多所述微粒的约85 %、至多所述微粒的约80 %、至多所述微粒的约75 %、至多所述 微粒的约70%、至多所述微粒的约65%或至多所述微粒的约50%，其中余量可为活性剂，或 可与以下组合，例如，EUDRAGIT?L 30D-55,其是具有甲基丙烯酸作为官能团的的阴离 子聚合物的水性分散体，其浓度为所述制剂重量的约35%至约75%。但是，在一些实施方案 中，所述微粒不含有EUDRAGFT?。在某些实施方案中，所述微粒包含约10%至约25%重 量的ZnPP，且余量是上述比例的DSPC和DPPC的混合物。
[0048]在一些实施方案中，将所述ZnPP用包含卵磷脂、泊洛沙姆、中性油载体(例如，椰子 油)和海藻酸盐、三偏磷酸钠和壳聚糖中的一种或多种的混合物稳定于微粒制剂中。在某些 实施方案中，所述微粒包含按重量计约5%至约25%的ZnPP、约10%至约20%的ZnPP。在这 样一些实施方案中，所述卵磷脂以微粒重量的约10%至不超过约40%、约20 %至不超过约 30%的浓度存在。在这样一些实施方案中，所述泊洛沙姆以微粒重量的约10 %至不超过约 40 %、约15 %至不超过约25%的浓度存在。该制剂的余量包含中性油载体和所述稳定剂、基 本上由中性油载体和所述稳定剂组成、或由中性油载体和所述稳定剂组成。
[0049] 在这样一些实施方案中，所述稳定剂是海藻酸盐，其以微粒重量的约3%至约6%、 约4%至约5%和可为约4.5%的量存在。
[0050] 在这样一些实施方案中，所述稳定剂是壳聚糖，其以微粒重量的约3%至约6%、约 4%至约5%和可为约4.5%至5%的量存在。
[0051] 在这样一些实施方案中，所述稳定剂是三偏磷酸钠，其以微粒重量的约3%至约 6%、约4%至约5%和可为约4.5%至5%的量存在。
[0052] 优选的药物组合物被配制用于口服递送。在一些实施方案中，本发明的微粒例如， 以单位剂量提供，例如在给药前立即重构的干粉。根据所需的制剂，药物组合物可包含药学 上可接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制成用于人或动物给药的药物组合 物的载剂。选择所述稀释剂以便不影响该组合的生物学活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水、 缓冲水、生理盐水、PBS、林格氏溶液、右旋糖溶液和Hank溶液。此外，所述药物组合物或制剂 可包含其他载体，或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂、赋形剂等。所述组合物也可包含 额外的物质以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、湿润剂和洗涤剂。
[0053]在其他实施方案中，口服递送制剂作为薄膜提供，例如其中将微粒的干燥粉末制 剂分散于含有膜形成聚合物的溶剂中，其可被铸造于薄膜中并包装成例如单位剂量。
[0054]其他口服制剂包括，但不限于，片剂、锭剂、胶囊、喷洒剂(sprinkles)、囊剂、支装 (s t i ck-pack)等本领域已知的并适用于本发明的微粒。
[0055] 如上所述，本领域技术人员将理解，可使用多种不同的治疗和给药方法以治疗单 个患者。
[0056] 每日的总剂量优选每日给药至少一次，但可分成每日两或更多个剂量。一些患者 可从以下周期获益:在数天或数周的时间中用更高剂量或更高频率的给药"加载"至所述患 者，然后给药减少的剂量或维持剂量。
[0057] 针对可与气雾递送装置连接使用的制剂的具体信息描述于Remington ' s Pharmaceutical Sciences,A.R.Gennaro editor(最新版）Mack Publishing Company。对 于药物递送方法的简述，参见，Langer，Science249:1527-1533(1990)。
[0058] 可给药所述药物组合物以用于预防性和/或治疗性治疗。活性成分的毒性和治疗 效果可根据细胞培养和/或实验动物的标准药物规程确定，包括，例如，测定LD 5Q(50%群体 致死的剂量)和ED5Q(50%群体治疗有效的剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数 且其可表达为比率LD 5Q/ED5Q。优选呈现大治疗指数的化合物。
[0059] 从细胞培养和/或动物研究中获得的数据可用于配制一系列的用于人的剂量。所 述活性成分的剂量通常位于循环浓度的范围内，其包括了具有低毒性的ED 5Q。所述剂量可根 据所采用的剂型和所用给药途径在此范围内变化。
[0060] 用于配制所述药物组合物的成分优选是高纯度的且基本上不含可能有毒的污染 物（例如，至少是国家食品（NF)级的，通常至少是分析级的，且更通常至少是药用级的）。此 外，旨在体内使用的组合物通常是无菌的。如果给定的化合物必须在使用前合成，那么所得 产物通常基本上不含任何可能有毒的试剂，特别是任何内毒素，其可存在于合成或纯化过 程中。用于胃肠外给药的组合物也是无菌的、基本上等渗的以及在GMP条件下制成的。
[0061] 本发明的组合物可以使用任意医学上合适的操作进行给药。给药至具体患者的治 疗组合物的有效量将取决于各种因素，其中的一些将因患者的不同而有所不同。有能力的 临床医生将能够确定治疗剂的有效量。所述组合物可以多于一次给药的系列给药方式给药 至所述受试者。
[0062] 本领域技术人员将容易地了解，剂量水平可根据具体化合物、症状的严重性以及 受试者对副作用的敏感性而变化。一些药物比其他药物更有效。给定试剂的优选剂量由本 领域技术人员通过各种方式容易地确定。优选的方法是测量给定化合物的生理学效力。 [0063] 试剂盒和包装
[0064]在一些实施方案中，提供了用于本发明方法中的制剂。这种制剂可包含稳定化的 ZnPP微粒等，其可提供于适于临床使用的包装中，包括作为冻干、无菌粉末的包装;例如微 粒在载体中的稳定混悬液的包装;适用于使用前混合的微粒和载体的单独包装;等等。该包 装可为单个的单位剂量，在制备用于提高患有高胆红素血症的患者功能的药物中提供有效 剂量的微粒形式的ZnPP活性剂。
[0065]治疗方法
[0066] 本文所述的方法包括以有效抑制H0酶的剂量给药(优选口服给药)包含本文所述 的含有ZnPP的微粒的药物组合物。口服给药利用"首过效应"得以靶向递送，从而定位至肝 和脾。所述ZnPP也可在口服递送后为全身性的。所述有效剂量可根据个体的年龄、所治疗的 病症等而变化。
[0067] 实施方案包括在婴儿中治疗高胆红素血症或其症状的方法。在一些实施方案中， 所述婴儿的胎龄是约35至约43周。在其他实施方案中，所述婴儿的年龄不超过30天。在一些 实施方案中，所述婴儿具有约2,500g的最小BW。在一些实施方案中，所述婴儿具有约l，700g 至约4,000g的BW。在一些实施方案中，所述婴儿具有至少一个危险因素，例如，溶血性疾病、 ΑΒ0血型不相容、抗-C Rh不相容、抗-c Rh不相容、抗-D Rh不相容、抗-E Rh不相容、抗-e Rh 不相容、G6H)缺乏及其组合。在一些实施方案中，在选自以下的时间进行治疗量ZnPP制剂的 给药：出生约6小时内、出生约12小时内、出生约24小时内和出生约48小时内。在一些实施方 案中，所述ZnPP制剂通过口服给药。
[0068]金属卟啉表现为在给药后大约6-12小时起效。给药本文所公开的ZnPP可降低发病 率或降低对光疗或换血疗法的需求。在一些实施方案中，给药本文所公开的ZnPP可缩短光 疗的持续时间。在一些实施方案中，给药本文所公开的ZnPP可降低光疗的光强度。在一些实 施方案中，给药本文所公开的ZnPP避免了对光疗的需要。
[0069] 在作为治疗高胆红素血症的药物的治疗用途中，ZnPP可以约O.lmg至约20mg ZnPP/kg BW(n〇的初始剂量进行给药。在某些实施方案中，用金属卟啉的治疗是一次性单 次剂量的治疗。在一些实施方案中，ZnPP以约0.5至约6mg/kg ZnPP/kgaM)的剂量进行给 药。在一些实施方案中，ZnPP以约0.5mg/kg至约4mg/kg、约0.5mg/kg至约2mg/kg、约0.75mg/ kg至约1 · 5mg/kg、约1 · 5mg/kg至约4 · 5mg/kg或约3 · Omg/kg至约4 · 5mg/kg的剂量进行给药， 包括约1.5mg/kg、约3. Omg/kg和约4.5mg/kg。但是，该剂量可根据患者的需要、待治疗病症 的严重性和所用的化合物而变化。针对特定情况的确定合适剂量属于本领域技术范围内。 例如，治疗可用较小的剂量起始，该剂量低于所述化合物的最佳剂量。此后，该剂量可以小 的增量递增直至达到该情况下的最佳效果。
[0070] -些实施方案还包括确定入选条件和筛选评估。在一些实施方案中，确定入选条 件和筛选评估包括，但不限于，经皮胆红素(TcB)监测、听力检查(包括听性脑干反应(ABR) (也称为自动化听性脑干反应[A-ABR]或脑干听觉诱发电位[BAEP]))、12-导联ECG、孕产妇 和受试者人口数据的检查、受试者医疗史的检查、入选和排除因素的检查、受试者伴随药物 的检查、生命体征评估、体检(包括体重、身高、头围和眼）、皮肤检查、Amiel-Tison神经病学 检查、用于以下分析的采血样:临床化学、血液学(包括血涂片）、药代动力学及其组合。
[0071] -些实施方案还包括对所述受试者在治疗前、治疗中、治疗后或其组合的持续评 估。在一些实施方案中，持续评估包括，但不限于，cB监测、包括ABR(也称为A-ABR或BAEP)的 听力检查、三个12-导联ECG、孕产妇和受试者人口统计数据的检查、受试者医疗史的检查、 入选和排除因素的检查、受试者伴随药物的检查、生命体征评估、体检(包括体重、身高、头 围和眼）、皮肤检查、Amiel-Tison神经病学检查、用于以下分析的采血样:临床化学、血液学 (包括血涂片）、药代动力学及其组合。在一些实施方案中，生命体征包括测量体温(腋下）、 血压（用对于年龄和尺寸合适的设备进行测量）、脉率、呼吸速率及其组合。
[0072]本文所述制剂还发现用于其他方法中，其中需要递送有效剂量的ZnPP。在一些实 施方案中，提供了治疗癌症的方法。已显示，H0-1参与促肿瘤活性。通过抑制H0,在本文所述 制剂中的ZnPP(单独或与化学疗法或放射疗法组合)可提供抗-肿瘤活性，例如，在治疗实体 瘤例如癌等中。
[0073]其他方法包括，但不限于，在各种需要选择性抑制H0的病症中治疗年龄相关性黄 斑变性、治疗感染等。本文所述组合物还发现可用作用于NMR成像的造影增强剂。
[0074]虽然本发明已参考一些优选的实施方案相当详尽地进行了描述，但其他形式也是 可能的。因此，所附权利要求的精神和范围不应限于该说明书和说明书中所含的优选版本。 [0075] 实施例1
[0076] 光对金属卟啉-治疗的新生小鼠的影响
[0077] 新生儿高胆红素血症源于胆红素生成及其清除之间的失衡。针对在极低出生体重 (ELBM)婴儿中积极和保守光疗的研究表明用积极的光疗仅显著降低神经发育损伤(NDI)的 速率，但是这种降低被在<501_750g的婴儿中增加的死亡率所抵消。此外，已经在动物中显 示了光(包括蓝光）的光氧化作用。此外，也建议在ELBW婴儿中较低的血红蛋白水平可使他 们处于较高风险的光毒性中，因为较少的光被血液循环中的血红蛋白吸收。金属卟啉(Mp) 是用于治疗高胆红素血症的有希望的药物，但是其中大部分是光敏化的，且进而潜在会有 光毒性。锌原卟啉(ZnPP)是一种有希望的Mp，其具有足够的效力，但具有较差的溶解性且无 法经口吸收。我们已使用了各种FDA批准的可生物降解的聚合物和磷脂类来设计并研发 ZnPP微粒制剂，其提高了生物利用度并增强胃通道。我们发现，向3日龄小鼠灌胃给药30μ mol/kg的ZnPP微粒引起的疗效是30-μπιο1 ZnPP/kg在磷酸盐缓冲液中的2倍，且没有显示光 毒性的迹象。我们的结论是，使用多聚物颗粒递送系统(微米颗粒或纳米颗粒)可提高ZnPP 的稳定性并提高其肠吸收，同时保留HO的抑制能力而没有光敏效应，并因此可用于治疗新 生儿高胆红素血症。
[0078]已经研究了血红素加氧酶(H0)在特定生物过程中的功能;评估在成人和新生儿动 物模型中的血红素周转(turnover)，目的是通过给药作为治疗性化合物的金属卟啉(Mp)来 调节酶活性。没有发现Mp具有使得我们能够预测最有效的化合物的具体的化学结构特征。 希望的药物性质包括低IC 5Q;没有光敏剂活性；口服吸收;不应穿过血脑屏障;应是短效的； 应该基本上不会上调HO-lmRNA、蛋白质或活性;且不应被螯合金属离子的随后释放所降解。 [0079]光暴露对用金属卟啉治疗的新生小鼠的影响。我们证明了用于预防新生儿黄疸的 两种有希望的Mp(铬中卟啉(CrMP)和二甘醇锌卟啉(ZnBG))的可能的光敏效应。我们选择了 这两种化合物，因为它们均是口服吸收的、相对有效、同时在所需剂量范围内光反应性最小 且最低限度地上调恥-1转录。在这项研究中，我们以3.75-30.(^111 〇1/1^81的剂量范围向3 日龄的小鼠幼鼠腹膜内（IP)给药CrMP或ZnBG。将幼鼠置于黑暗中（对照)或暴露于由两个冷 白光管(F20T12cW)和一个蓝光(TL20W/52)管组成的荧光下，持续3小时（图2)。在用CrMP治 疗的幼鼠中，我们发现，置于黑暗中和暴露于光下的幼鼠分别具有LD 5Q(50%致死剂量)为 21.5和23. Oymol/kg的剂量依赖性死亡率。
[0080] 这两组的存活率之间没有显著差异。相比于CrMP，被给药30ymol/kg ZnBG并置于 黑暗中的幼鼠并没有显示出任何化学毒性。但是，暴露于光下之后，我们发现了 19.5μπι〇1/ kg的LD5Q且幼鼠出现显著的体重降低、肝脏抗氧化能力下降以及肌酸激酶(CK-MB)和天冬氨 酸氨基转氨酶(AST)水平的升高。此外，在光暴露后6天，用ZnBG处理的幼鼠在>7.5ymol/kg BW的剂量出现明显的（gross)组织学皮肤的变化。有趣的是，在用30-μπιο 1 ZnBG/kg BW治疗 和并暴露于发射蓝光二极管(LED)光下的小鼠中未观察到致死。综上所述，我们发现，CrMP 具有化学毒性，但是没有光毒性。ZnBG表现为不具有化学毒性，但其光毒性取决于光源。最 重要的是，低剂量的21^6(〈3.75以111 〇1/1^81)保留最大!10抑制效力而没有光敏效应(图3)。 [0081 ]使用锌原卟啉(ZnPP)的决定。我们专注于对天然存在的ZnPP的研究，即在积极和 消极特征之间存在平衡的另一种有利化合物。它是一种具有足够的效力的Mp，其在大鼠和 小鼠中对脾和脑的抑制50%酶活性的剂量（即IC 5Q)分别为约6.0和3. ΟμΜ;测量不到其跨越 血脑屏障;其不具有光化学活性;最低限度地上调细胞培养或新生小鼠中的Η0-1;具有快速 起效时间；短效；且不被Η0降解。此外，该化合物可以主要影响Η0-1、但不对一氧化氮合酶 (N0S)或基底可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)活性具有任何显著程度的影响的低剂量进行给药。 [0082]但是，ZnPP难以维持在溶液中且无法口服吸收，需要胃肠外给药。在用热损伤的红 细胞处理的新生恒河猴的溶血性黄疸模型中，我们发现，皮下（SC)给药40ymol/kg BW剂量 的ZnPP在24小时内有效将碳氧血红蛋白和总胆红素水平降低至基线水平。H0抑制靶向肝和 脾，而不影响肾或脑。
[0083]因此，该化合物在用于治疗新生儿黄疸中是非常有希望的。尽管其本身在口服给 药后并不有效，但使用多聚颗粒递送系统的制剂提供口服生物利用度并增强胃通道。我们 之前已显示，将Mp掺入脂质体中可显著增加对脾的递送并因此提高其疗效。对于口服递送 的需求也是重要的，因为不是所有的婴儿都有用于胃肠外给药的静脉内（IV)通路，例如因 高胆红素血症再入院的晚期早产儿和足月婴儿。此外，口服给药利用"首过效应"将H0抑制 剂靶向递送至肝和脾(靶器官）；而IV给药引起全身性分布。因此，我们使用药物递送系统设 计和研发制剂，所述药物递送系统提高口服生物利用度并增强胃通道从而能够将Mp靶向递 送至肝和脾。这种多聚颗粒药物递送系统(微米颗粒或纳米颗粒)提高药物稳定性并增强胃 通道，以用于人类新生儿。
[0084]使用该方法，我们评估了很多制剂，其已成功地改善ZnPP的口服生物利用度和有 效性。使用多聚颗粒递送系统(微米颗粒和纳米颗粒)提供递送方法，其可提高抵抗降解的 稳定性并增强肠吸收。在我们的研究中，ZnPP/脂质微粒是通过受控的阳离子诱导的微乳液 或喷雾干燥制备的。具体地，DPSS (1，2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)和DPSC(二硬脂 酰-sn-甘油基磷酸胆碱)是由FDA批准作为表面活性剂用于早产儿的可生物降解的磷脂。 [0085]锌制剂。我们使用多聚颗粒递送系统（微米颗粒或纳米颗粒）设计了 5种不同的 ZnPP制剂以提高其稳定性并增强其肠吸收。肠溶包衣的微粒被设计为不仅保护ZnPP抵御胃 的酸性环境(我们发现所述酸性环境会导致ZnPP失活），而且在运输至小肠的过程中在>5.5 的pH值使其释放最大化。甲基丙烯酸共聚物（&^耶_儿100-55，在?!1〈5.5不溶）与0??〇 和/或DSPC组合使用，或仅使用磷脂。这些磷脂是FDA-批准的赋形剂，且是内源性磷脂，其用 作人工肺表面活性剂的主要成分，此前被批准以高浓度用于早产儿。所述微粒是由乳液或 喷雾干燥技术形成的。
[0086]制备并测试的ZnPP制剂如表1所示。将使用乳剂制备的制剂冷冻储存并冻干以获 得最终的基于壳聚糖的微粒(ZnPP-A和ZnPP-B)。使用喷雾干燥制成的制剂作为干粉储存并 冷冻。尽管海藻酸盐和壳聚糖是FDA批准用于成人的可生物降解的聚合物，但是它们并没有 被批准用于早产婴儿。进一步考虑批准供人类使用的乳剂，使得我们利用丙烯酸珠子(例 如，EUDRAGIT? )合成ZnPP-Poly。此外，制成ZnPP脂质制品，其由FDA批准的磷脂（即 DPPC和DSPC)所组成。
[0087] 表 1
[0088]
[0089] ZnPP制剂的评估。我们测试了 ZnPP制剂（ZnPP-A、ZnPP-B和ZnPP-Poly)相对于我们 之前的制备于〇.4M Na3P〇4、生理盐水和蒸馏水中的磷酸钠水溶液(ZnPP-P〇4)在从3日龄小 鼠幼鼠中采集的肝、脾和脑的组织超声处理物中的体外H0抑制效力。我们发现，ZnPP-Poly 最有效地抑制肝H0活性，然后是我们的ΖηΡΡ-Ρ04溶液（图4)。基于壳聚糖/海藻酸盐的制剂 效力最差。所有制剂在脾和脑组织中具有类似的效力。基于这些有希望的发现以及ZnPP-月旨 质的设计，随后我们评估了这些ZnPP制剂相比于ZnPP-P〇4溶液的体内H0抑制效力。通过直 接胃内（IG)注射向3日龄小鼠给药载剂(VEH)或30ymol/kg BW的五种ZnPP制剂之一或仅给 药VEH(图5)。311后，将幼鼠处死并采集肝、脾和脑以用于测量H0抑制效力。H0活性按pmol C0/h/mg鲜重(FW)计算，然后表示为对照值的平均值土 SD %。
[0090] 为了评估毒性，对幼鼠进行类似处理，然后立即置于萤光管（2冷白/1蓝TL52)下3 小时以测试光毒性，或置于黑暗中以测试化学毒性。然后监测幼鼠的整体存活最多1周。尽 管发现ΖηΡΡ-Ρ0 4在体外是最有效的（80%)(图4)，但是其效力在IG给药后显著降低（图6A)， 可能是由于其较差的胃通道(图5)。正如所预料的，它没有显示光毒性或化学毒性（图6B)。
[0091] ZnPP基于壳聚糖/海藻酸盐的制剂在体内是有效的，但是由于壳聚糖/海藻酸盐未 经FDA批准用于早产儿，因此并未对这些制剂的毒性进行进一步评估。ZnPP-Poly在肝和脾 中是最有效的（图6A)，但它是光毒性的，从而在光暴露后48小时导致90%的死亡率（图6B)， 这可能是由于所述聚合物本身，因为仅用Poly处理的幼鼠在光暴露和避光暴露后分别具有 100%和70%的死亡率。重要的是，我们观察到，ZnPP-脂质制剂也是有效的，但没有表现出 光-或化学毒性。因为所述ZnPP-脂质制剂在IG给药后有效抑制肝H0活性且没有毒性，我们 由此得出结论，它在用于治疗新生儿黄疸中是最为有效的。
[0092]这些数据显示，天然存在的ZnPP是有效的且能快速起效而不具有长效抑制作用， 使得其在旨在用于过渡期间治疗新生儿的抗-高胆红素血症药物中是高度有用的。将ZnPP 设计为口服生物可用的，同时保持这些疗效和安全性的特点，这为儿科医生在用它们对靶 向新生儿的胆红素水平进行控制中提供了信心，所述新生儿具有溶血或其他造成胆红素生 成增加的原因。
[0093] 实施例2
[0094] 制剂
[0095] ZnPP的一个缺点是它不是口服生物可用的且其需要胃肠外给药。ZnPP的低口服生 物利用度是由于其低溶解性以及在低pH环境下化学不稳定，例如在胃中所见，以及在中性 pH的低水溶性，其限制了 ZnPP的溶解和随后在肠道中的吸收。ZnPP在低pH水溶液中反应以 形成原卟啉IX游离酸，其无法抑制H0。
[0096]需要一种制剂，其通过保护所述分子避免与胃中所发现的酸性环境相互作用以及 提高其在中性pH的水溶性以促进小肠上部的吸收从而提高ZnPP的口服生物利用度和有效 性。理论上，所述制剂是粉末形式的固体状态，用以提高最终药物剂型的贮存期限及其可制 造性。
[0097]微粒是通过喷雾干燥形成的，所述喷雾干燥保证了在GMP环境下的直接扩增路径， 所述GMP环境对于GMP制造最终剂型而言是必需的。
[0098]喷雾干燥粉末制剂;制剂成分：
[0099] ZnPP；20%w/w
[0100] DPPC；5%w/w
[0101] EUDRAGIT?L100-55;75%w/w
[0102] 用于喷雾干燥的1 %固体(w/v)原料溶液的制备:将ZnPP通过超声溶解于1M氢氧化 铵中（构成总溶剂体积的12.5% )。加入溶于乙醇的DPPC(总溶剂体积的12.5% )。加入溶于 乙醇的EUDRA.GlT?L100-55(剩余的75%溶剂体积）。
[0103] Biichi-290喷雾干燥条件：
[0104]入 口温度：70 Γ
[0105]出 口温度：50Γ
[0106]吸气器:75%
[0107] 氮:30mm测量仪高度
[0108] 栗：8%
[0109] 在该过程中将进样溶液容器和喷雾干燥器避光。将所述干粉冷冻避光储存。
[0110] 观察该制剂，如图7A所示:20 %的ZnPP含量通过LCMS证实。在0.1 N HC1介质中有明 显受限的ZnPP释放，洗涤并将酸暴露的颗粒重新混悬于PBS pH 7.4缓冲液中导致ZnPP的大 量释放，其通过HPLC/MS测量。SEM图像为含有75 % w/w EUDRAGIT?的喷雾干燥颗粒。褶 皱形态表明在颗粒形成过程中早期的聚合物沉淀，从而确保有效的药物包封。
[0111]实施例3
[0112]具有更高ZnPP含量的喷雾干燥粉末的制备
[0113] 具有更低EUDRAGIT?含量的ZnPP制剂;制剂成分：
[0114] ZnPP；20%w/w
[0115] DPPC；42%w/w
[0116] EUDRAGIT? LI 00-55 ； 38%w/w
[0117] 用于喷雾干燥的1%固体(w/v)原料溶液的制备：将ZnPP用超声溶于1M氢氧化铵 (构成总溶剂体积的12.5% )。加入溶于乙醇中的DPPC(总溶剂体积的50% )。加入溶于乙醇 中的EUDRAGrT?L100-55(剩余37.5 %溶剂体积）。喷雾干燥条件:与上文所述相同。
[0118] 观察该制剂，如图7B所示:20%的ZnPP含量通过LCMS证实。尽管在0.1N HC1介质中 有一些ZnPP释放，但洗涤并将酸暴露的颗粒重新混悬于PBS pH 7.4缓冲液中导致ZnPP的大 量释放，其通过HPLC/MS测量。SEM图像显示，这些38%w/wFJJDRAGrr?颗粒相比于之前 测定的制剂(75%w/w EUDRAGIT?)具有相似的形态。褶皱形态表明在颗粒形成过程中 早期的聚合物沉淀，从而确保有效的药物包封。
[0119] 实施例4
[0120] 含有粉末的小瓶或注射器，其将被合适的稀释剂重构以通过饲管口服递送
[0121] 给婴儿
[0122] 可将所需剂量的ZnPP包含在少量的喷雾干燥粉末中或者更少量的所述粉末中，这 取决于最终的ZnPP含量和目标受试者（例如新生小鼠或大鼠、猴或通过饲管给药的患儿）。 喷雾干燥粉末通常尺寸小且往往比颗粒粉末更粘。可使用增量剂以掺合该喷雾干燥粉末以 帮助填充至小瓶中，然后在给药至测试受试者(新生小鼠或大鼠、猴等)或通过饲管给药的 患儿前用合适的稀释剂再混悬。这个可通过下文所述实现。
[0123] 将ZnPP-DPPC-EUDRAGIT?喷雾干燥的粉末与作为增量剂的D-葡萄糖混合以 获得含有目标量的喷雾干燥粉末的均一混合物，所述目标量是基于ZnPP含量的量和所需剂 量计算的，然后可用适当量的D-葡萄糖(范围在10%-90%w/w的量)手动或用填充机将该粉 末掺合物填充至玻璃或塑料小瓶或注射器中。
[0124] 给药前，通过将适当量的含有0.25% (w/v)柠檬酸盐缓冲液的稀释剂(pH4.7)加至 含有所需剂量的目标量的粉末中形成混悬液。该稀释剂的pH是重要的，其使得该聚合物微 粒的溶解最小化，但pH不能过低而造成ZnPP的化学降解。将该混悬液搅拌并准备用于给药。
[0125] 图8A，在磷酸钠溶液中给药的ZnPP-P〇4显示了原卟啉的沉淀。图8B.给药ZnPP喷雾 干燥的微粒后3小时。在所治疗的3只3日龄小鼠幼鼠的两只中，沉淀被完全抑制。
[0126] 实施例5
[0127] ZnPP 口服薄膜剂型
[0128] 所述ZnPP喷雾干燥粉末制剂可分散于含有膜形成聚合物的有机溶剂的溶液中。然 后将所述含有混悬的喷雾干燥粉末的聚合物溶液制成薄膜，然后将其切割成适当的尺寸部 分，各部分含有一个剂量。所述薄膜预期即刻溶于患儿口中而无需任何额外的液体。
[0129] 实施例6
[0130] ZnPP 速溶片
[0131] 可将所述ZnPP喷雾干燥粉末制剂混悬于含有0.25% (w/v)柠檬酸盐缓冲液的稀释 剂(pH 4.7)中，可向其中加入适当量的甘露醇。然后将该混悬液转移到片剂大小的模具中， 然后将其在液氮流中冷冻。然后将该冷冻混悬液冻干并可将含有所得片剂的模具用保护罩 密封。冻干的片剂预期即刻溶于患儿口中而无需任何额外的液体。
[0132] 实施例7
[0133] ZnPP/壳聚糖微粒的制备
[0134] 制剂含量(w/w):椰子油(40 % )、卵磷脂(30 % )、ZnPP(5 % )、泊洛沙姆-188 (20 % ) 和壳聚糖(Mff-15000)(5%)
[0135] 制备过程:通过在室温(RT)搅拌，将椰子油（40mg)和卵磷脂（30mg)溶于10mL乙醇 中。向该溶液中加入ZnPP(5mg)并加热至40 °C同时搅拌，获得澄清溶液。单独地，将泊洛沙 姆-188(20mg)溶于8mL蒸馏水中并然后加至上述乙醇溶液中同时在室温搅拌。将壳聚糖-15K (5mg)溶于lmL的0.01N盐酸水溶液中并然后加至上述混合物溶液，同时在室温搅拌。使 用旋转蒸发器，将该溶剂在真空下从该均一溶液中除去。通过超声处理20min，将该残余物 用1 OmL水重构。将溶液冷冻并冻干以获得最终的Zn-PP/壳聚糖微粒。
[0136] 实施例8
[0137] ZnPP/海藻酸盐微粒的制备
[0138] 制剂含量(w/w):椰子油（35 % )、卵磷脂（20 % )、ZnPP(20 % )、泊洛沙姆-188(20 % ) 和海藻酸钠(4.5%)氯化钙(0.5%)
[0139] 制备过程:通过在室温搅拌，将椰子油（35mg)和卵磷脂(20mg)溶于10mL乙醇中。向 该溶液中加入ZnPP (20mg)并加热至40 °C同时搅拌，获得澄清溶液。单独地，将泊洛沙姆-188 (20mg)和海藻酸钠(4.5mg)溶于8mL蒸馏水中并然后加至上述乙醇溶液中同时在室温搅拌。 将氯化钙(〇.5mg)溶于lmL水中，并然后加至上述混合物溶液中同时在室温搅拌。使用旋转 蒸发器，将该溶剂在真空下从该均一溶液中除去。通过超声处理20min，将该残余物用10mL 水重构。将溶液冷冻并冻干以获得最终的ZnPP/海藻酸盐微粒。
[0140] 实施例9
[0141] ZnPP/三偏磷酸钠(STMP)微粒的制备
[0142] 制剂含量(w/w):椰子油（35% )、卵磷脂（20% )、ZnPP(20% )、泊洛沙姆-188(20% ) 和三偏磷酸钠(STMP)(5%)
[0143] 制备过程:通过在室温搅拌，将椰子油（35mg)和卵磷脂(20mg)溶于10mL乙醇中。向 该溶液中加入ZnPP (20mg)并加热至40 °C同时搅拌，获得澄清溶液。单独地，将泊洛沙姆-188 (20mg)和STMP(5mg)溶于8mL蒸馏水中并然后加至上述乙醇溶液中同时在室温搅拌。使用旋 转蒸发器，将该溶剂在真空下从该均一溶液中除去。通过超声处理20min，将该残余物用 1 OmL水重构。将溶液冷冻并冻干以获得最终的ZnPP/STMP微粒。
[0144] 实施例10
[0145] ZnPP微粒制剂的制备
[0146] 制剂含量(w/w) :DSPC(45% )、DPPC(45% )、ZnPP(10% )。
[0147] 制备过程:通过超声处理，将ZnPP(lOmg)溶于lOmL的1M氢氧化铵溶液中。将溶于 45mL乙醇中的DPPC(45mg)加至其中。加入溶于45mL乙醇中的DSPC(45mg)并充分混合。使用 Buchi-290迷你喷雾干燥器将该溶液混合物喷雾干燥。该设定参数为:入口温度55°C、出口 温度50 °C、吸气器75 %、进液栗8 %和氮气流为30mm。所述进液容器和喷雾干燥隔间在该过 程中避光。将所述干粉避光冷冻储存。
[0148] 实施例11
[0149] 在负载有血红素的新生小鼠中，使用锌原卟啉的微粒制剂对血红素加氧酶
[0150] 活性的体内抑制
[0151] 血红素加氧酶(H0)(血红素降解中的限速酶)产生胆红素。因为溶血可导致增加的 胆红素生成并造成新生儿高胆红素血症，因此例如通过金属卟啉(Mp)抑制H0可能是理想的 策略。锌原卟啉(ZnPP)是一个有希望的Mp，因为它是天然存在的、有效的、无光毒性的且具 有最小限度的H0-1上调，但由于其无法口服吸收而限制了其使用。
[0152]我们设计了一种基于脂质的ZnPP制剂(ZL)，如实施例10所述且已显示，其在新生 小鼠模型口服给药后能有效且安全地抑制肝的H0活性。我们进一步拓展了这些研究以调查 ZL在负载有血红素的新生小鼠（与溶血婴儿类似的模型）中的有效性和安全性。所述ZL如实 施例10所述进行制备且以指定的浓度再混悬于PBS中。
[0153] 将3日龄FVB幼鼠通过SQ注射给药30ymol/kg的血红素(H)或载剂(V)。用血红素治 疗后24h，通过胃内注射向小鼠给药V(H-V)或ZLa.S-eOymol/kgJ-ZLI.S-H-ZLeOhSh后， 将幼鼠处死并采集肝和脑用于通过气相色谱测量H0活性。H0-1的上调是通过以下评估的： 分别通过RT-PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blot)测定肝ΗΟ-lmRNA和蛋白水平。数据表示 为对照的％。
[0154]血红素负载(H-V)后，肝H0活性显著升高1.6倍，正如所预期的（表2)。这一血红素 诱导的H0活性升高在用ZL治疗后以剂量依赖的方式被抑制，该H0活性在30ymol/kg的剂量 时恢复到对照水平。在给药30ym 〇l ZL/kg后，未发现显著的脑H0活性的抑制或肝H〇-lmRNA 和蛋白质水平的变化。
[0155] 30ymol/kg剂量的ZL在血红素负载后有效地抑制肝H0活性。此外，其并没有表现出 跨血脑屏障或诱导ΗΟ-lmRNA或蛋白水平。我们总结出：ZL是有效且安全的并因此在用于治 疗由于溶血造成的新生儿高胆红素血症中是有吸引力的化合物。
[0156] 表2-H0活性(对照的％，平均值土SD) … | 组 | Y-V H-V H-ZL1.8一 H-ZL3.8 H-ZL7.5 H-ZL.15 - H-ZL30-| H-ZL60
[0157] "?ρ 1〇?±14*^ l；64±28f^ 138±34t^ 1:22土nf 1忉±：1对^ 115±22f*. .105士 19* 91±1S*
[0158] ρ<0·05 VS fV-V或*H-V，n = 7-35/组
[0159] 等效替代
[0160] 本领域技术人员将理解，或使用不超过常规的试验能够确定，本文所述具体实施 方案和方法的许多等效替代。这种等效替代旨在包括在本发明的范围内。
[0161] 本文所引用的所有专利、专利申请和参考文献通过引用的方式清楚地并入本文 中。
【主权项】
1. 微粒，其包含： ZnPP和药学上可接受的稳定剂，其中ZnPP的浓度为微粒重量的至少约5 %。2. 权利要求1的微粒，其中ZnPP在该微粒中的浓度为微粒重量的约5 %至约50 %。3. 权利要求1或2的微粒，其中相比于仅有ZnPP，所述微粒在酸性条件下具有增加的稳 定性。4. 权利要求3的微粒，其中相比于仅有ZnPP，所述微粒对酸性条件更加稳定至少10%。5. 权利要求3的微粒，其中所述微粒对酸性条件的稳定性是仅有ZnPP时的2倍。6. 权利要求1 _5中任一项的微粒，其中相比于仅有ZnPP，所述微粒在中性pH具有增加的 溶解性。7. 权利要求6的微粒，其中相比于仅有ZnPP，所述微粒在中性pH的溶解性大至少10 %。8. 权利要求6的微粒，其中所述微粒在中性pH的溶解性是仅有ZnPP时的至少2倍。9. 权利要求1-8中任一项的微粒，其中所述微粒基本上由ZnPP和药学上可接受的稳定 剂组成。10. 权利要求1 -9中任一项的微粒，其中所述微粒具有约1 Onm至约1 Ομπι的直径。11. 权利要求1 -9中任一项的微粒，其中所述微粒具有约1 OOnm至约5μπι的直径。12. 权利要求1-11中任一项的微粒，其中所述稳定剂是海藻酸盐、壳聚糖、卵磷脂、泊洛 沙姆、三偏磷酸钠、阳离子脂质、蛋白质、油、聚乙烯吡咯烷酮或其组合。13. 权利要求1-11中任一项的微粒，其中所述稳定剂是阳离子脂质或阳离子脂质的混 合物。14. 权利要求13的微粒，其中所述阳离子脂质是DSPC、DPPC、DOIIM、DDAB、D0TMA、DMRIE、 EDMPC、DCCho 1、DOGS、MB0P，或其任意组合。15. 权利要求1-11中任一项的微粒，其中ZnPP的浓度为微粒重量的约10%至约25%，且 所述稳定剂是DSPC和DPPC的混合物。16. 权利要求15的微粒，其中DSPC与DPPC的重量比为约1:1。17. 权利要求1-11中任一项的微粒，其中所述稳定剂包括(i)卵磷脂，（ii)泊洛沙姆，和 (iii)海藻酸盐、三偏磷酸钠或壳聚糖。18. 权利要求17的微粒，其中ZnPP的浓度为微粒重量的约5 %至约25 %。19. 权利要求17或权利要求18的微粒，其中卵磷脂的浓度为微粒重量的约10 %至约 40%，且泊洛沙姆的浓度为微粒重量的约10%至约40%。20. 权利要求17-19中任一项的微粒，其中所述稳定剂还包括油。21. 权利要求17-20中任一项的微粒，其中所述稳定剂包括三偏磷酸钠。22. 权利要求21的微粒，其中三偏磷酸钠的浓度为微粒重量的约3 %至约6 %。23. 权利要求17-20中任一项的微粒，其中所述稳定剂包括海藻酸盐。24. 权利要求22的微粒，其中海藻酸盐的浓度为微粒重量的约3 %至约6 %。25. 权利要求17-20中任一项的微粒，其中所述稳定剂包括壳聚糖。26. 权利要求25的微粒，其中壳聚糖的浓度为微粒重量的约3 %至约6 %。27. 组合物，其包含权利要求1-26中任一项的多个微粒以及，任选地，药学上可接受的 载体。28. 权利要求27的组合物，其以用于口服给药的单位剂量。29. 权利要求27或权利要求28的组合物，其中将多个微粒混悬于药学上可接受的载体 中。30. 在有此需要的受试者中抑制诱导型血红素加氧酶(H0-1)的活性的方法，所述方法 包括： 向所述受试者给药有效量的权利要求27-29中任一项的组合物。31. 权利要求30的方法，其中所述给药为□服给药。32. 权利要求30或权利要求31的方法，其中所述受试者是患有高胆红素血症的人类婴 儿。33. 权利要求30-32中任一项的方法，其中诱导型HO-1的活性相比于在对照受试者中诱 导型HO-1的活性被抑制，或者诱导型HO-1的活性相比于给药所述微粒前诱导型HO-1的活性 被抑制。
【文档编号】A61K33/30GK106061487SQ201580012237
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月2日 公开号201580012237.4, CN 106061487 A, CN 106061487A, CN 201580012237, CN-A-106061487, CN106061487 A, CN106061487A, CN201580012237, CN201580012237.4, PCT/2015/14079, PCT/US/15/014079, PCT/US/15/14079, PCT/US/2015/014079, PCT/US/2015/14079, PCT/US15/014079, PCT/US15/14079, PCT/US15014079, PCT/US1514079, PCT/US2015/014079, PCT/US2015/14079, PCT/US2015014079, PCT/US201514079
【发明人】D.K.史蒂文森, J.拉贾达斯, C.埃斯帕达斯, R.J.黄, D.莱丘加
【申请人】里兰斯坦福初级大学理事会, D.K.史蒂文森, J.拉贾达斯, C.埃斯帕达斯, R.J.黄, D.莱丘加