用于治疗和预防炎症相关疾病的涉及p62/sqstm1的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于促炎细胞因子、成骨转录因子、骨吸收因子以及内源性p62表达调节的新型p62组合物。因而，这样的p62组合物适用于炎症性疾病的预防和治疗，并且本发明还提供了相关方法。在某些实施例中，炎症性疾病与癌症不相关。在一些实施方式中，炎症性疾病包括，但不限于，骨质疏松症、肥胖症、代谢综合征、2型糖尿病、脂肪肝、炎症性肠道疾病、慢性胰腺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎、多发性硬化症(MS)、银屑病、充血性心力衰竭(CHF)、动脉粥样硬化、神经退行性疾病(ALS，帕金森症、阿尔兹海默症、亨廷顿病)、抑郁症、精神分裂症、痛风、石棉肺以及矽肺。
【专利说明】用于治疗和预防炎症相关疾病的涉及P62/SQSTM1的方法和组 合物
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年12月29日提交的代理案卷号151-00104.PRV0指定的题目为 "SQSTM1基因作为用于骨质疏松症的治疗和预防药物的载体，编码产品的使用方法(Method of Use of Vectors,Encoding Products of the SQSTMIGene as Therapeutic and Preventive Agents for Osteoporosis)"的美国临时专利申请第61/921,504号的优先权 权益，以及于2014年3月7日提交的代理案卷号151-00104.PRV0指定的题目为"用于治疗和 预防炎症相关疾病的涉及p62的方法和组合物(Methods and Compositions Relating to p62 for the Treatment and Prevention of Inflammation-Associated Disease)''的美 国临时专利申请第61/949，597号的优先权权益。所述临时专利申请的全部内容通过引用并 入本文，包括所有的文字，表格和附图。
技术领域
[0003] 本发明一般地涉及炎症性疾病的预防及治疗。更为具体地，本发明涉及通过给药 P62组合物而预防及治疗炎症性疾病。
【背景技术】
[0004] 炎症是基本的免疫反应，其使得在感染或是创伤中能够生存，且能够在各种有害 环境下维持组织的动态平衡。它可分为急性炎症和慢性炎症。急性炎症是对病原体，例如细 菌和病毒，或是对组织损伤的保护反应。在对感染或组织损伤的反应中，巨噬细胞诱导炎性 细胞因子(如TNF、IL-l、IL-6)和趋化因子(如CCL2和CXCL8)以及前列腺素的产生。
[0005] 这些炎症介质然后作用于目标组织，包括局部血管，以引发血管舒张、中性粒细胞 的溢出以及血浆渗漏进入被感染的组织。此外，当分泌足够的量时，IL-1、TNF和IL-6可以具 有系统性的影响。它们诱导肝脏细胞(肝细胞)产生诸如C-反应蛋白的急性期蛋白以及凝血 因子，并且它们激活大脑内皮细胞产生前列腺素，包括主要的促炎前列腺素 PGE2。局部所生 的PGE2然后引发特定人群中枢神经系统神经元增加的所谓患病行为:发烧、厌食、疲劳、嗜 睡以及社交退缩（Pecchi 等著，2009，Prostaglandins and sickness behavior:old story，new insights .Physiol Behav 97:279-292)。在没有感染的无菌组织损伤情况下， 急性炎症促进组织修复并且有助于预防条件致病菌对受损组织的定植。急性炎症的结果通 常是防止感染扩散，其次解决一受损组织的恢复，以恢复至它们的正常结构以及功能状态。 参与炎症反应的主要转录因子为NF-kappa-B以及Stat-3。
[0006] 如果炎症触发没有被急性炎症反应消除或者因任何其他原因而持续，那么可能会 被不适当地引起消退期并且可能发生慢性炎症状态。这种状态可能是由慢性感染、未修复 的组织损伤、持续性过敏原、难消化的异物颗粒、或诸如尿酸单钠晶体的内源性晶体所引起 的（Majino著，2004,Cell,Tissues,and Disease;Kumar 2003.Robbins Basic Pathology)。在这些情况下的慢性炎症反应通常位于局部，其中存在炎症诱导因子并且往 往会导致不同类型的局部组织的重塑。
[0007] 此外，越来越多的慢性炎症性疾病已被描述为其中初始诱发因子并没有被很好地 定义，但似乎并没有涉及感染或组织损伤。对于这些炎症性疾病具有特别的兴趣，因为他们 往往伴随着许多工业化国家的疾病，包括肥胖症和2型糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性 疾病以及癌症。在这些慢性炎症的情况下，似乎是将炎症和其所伴随的病变相联系的恶性 循环。
[0008] 因此，肥胖症可导致炎症，而慢性炎症可以通过引发胰岛素抗性而部分地促进与 肥胖症相关的糖尿病的发生（Hotamisligil著，Inflammation and metabolic disorders ·Nature 444:860-867)。类似的正反馈循环存在于动脉粥样硬化、癌症和其他慢 性炎症性疾病中。过度的炎症反应是有害的，因为其对组织功能的负作用，并且在极端情况 下，导致明显的组织损伤。通常，急性和慢性炎症长期共存，这意味着不断的重新起始。例证 在类风湿性关节炎、哮喘、慢性阻塞性肺病(C0PD)、多发性硬化症、克罗恩氏病、溃疡性结肠 炎以及基质被巨噬细胞和未成熟的骨髓细胞浸润的癌症中均有发现(Mantovani等著， 2008，Cancer-related inflammation · Nature 454:436-444)。在工业化社会中没有哪个单 一现象相比慢性炎症造成更大的医疗负担。慢性炎症显著地影响动脉粥样硬化、肥胖症、癌 症、慢性阻塞性肺病、哮喘、炎症性肠道疾病、神经退行性疾病、多发性硬化症或者类风湿性 关节炎以及其他疾病的发病机理。骨质疏松症是与骨质流失相关的最常见的骨骼的疾病， 并且其主要影响绝经的女性。绝经导致雌激素水平下降，因此啮齿类动物的卵巢切除术导 致雌激素生成的停止是骨质疏松症最常见的模型。绝经后期的特点为诸如IL-6、TNF_a以及 IL-Ιβ的细胞因子的升高，并且在卵巢切除的情况下相同的细胞因子升高。TNF和IL-1在0C 细胞中具有强有力的抗凋亡效果，延长0C的寿命，加速骨质吸收以及抑制骨形成，TNF-alpha和IL-lbeta的阻断防止由于雌激素缺乏导致的骨质疏松症（Mundy著，2007， Osteoporosis and Inflammation.Nutrition Reviews 65:S147-S151;Lencel and Magne 201Llnflammaging: The driving force in osteoporosis?Medical Hypotheses76:317-321)〇
[0009] 肌萎缩侧索硬化症(ALS)或卢伽雷氏病，是一种渐进性的致命的神经退行性疾病， 影响脑干、脊髓和运动皮层的运动神经元。ALS通常是致命的，其发病的平均年龄为55岁并 且症状发作后生存2~5年。显著的神经性炎症能够轻易地在来自该病的人类ALS患者以及 小鼠模型的的CNS以及脊髓的病变影响区域被观察到（Smi th等著，2012，Ro 1 e of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases.Brain Res Bull 87:10-20)。通常情况下，ALS的炎症反应的特征是胶质细胞增 生和大量活化的小胶质细胞和星形胶质细胞的积累。ALS中的胶质细胞的活化已被广泛地 表征并被标识为提高的潜在的细胞毒性分子，如R0S，炎症介质，如C0X-2,以及促炎症反应 因子，如 IL-lbeta、TNF_alpha 以及 IL-6 的产量（Smith 等著，2012，Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases.Brain Res Bull 87:10-20)^1^小鼠模型中最常见的是转基因小鼠，表达超氧 化物歧化酶的突变形式，在很多ALS患者中也可以观察到同样的突变形式。
[0010] 多发性硬化症(MS)是一种异质性且复杂的自身免疫性疾病，其特征为CNS中的炎 症、脱髓鞘和轴突变性。该病理结果是由于免疫系统将髓鞘成分作为免疫目标的原发性缺 陷，导致神经元的继发效应。MS被认为是一种以在CNS中存在炎性脱髓鞘病变为特征的免疫 介导性疾病。由细菌或病毒或其他环境刺激的感染在多发性硬化症(MS)中触发小胶质细胞 和星形胶质细胞的活化，通过转录因子NF-kappa-B和AP-1的激活导致促炎细胞因子的产生 (Luessi等著，2012，Neurodegeneration in multiple sclerosis : novel treatment strategies.Expert Rev Neurother 12:1061-1076)。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE)， 其中用髓鞘衍生的抗原和佐剂免疫啮齿类动物，是MS最为常见的动物模型。通过改变遗传 背景和免疫方案，EAE可以重现人类MS主要形式的症状。
[0011]主要有两类抗炎药物、化学药品和生物制品。第一类包括如阿司匹林、糖皮质激素 类、非留体类抗炎药(塞来考昔）以及其他制剂(如氨甲喋呤、环孢素、雷帕霉素等)等众所周 知的药物。第二类包括降低特定细胞因子或其载体活性的药剂，如TNF抗体(见以下方案）。 尽管有各种各样的药物，尚没有治疗慢性炎症的治疗方法。在许多情况下，现有的药物不太 有效，非常昂贵，并且具有许多副作用。例如，抗细胞因子治疗的主要缺点是宿主对感染减 小的免疫防御以及费用。
[0012] p62是一种结合泛素并调节自的多功能蛋白，核因子kappa-B以及一些其他的信 号转导通路的活性。作为与TNF载体相关因子6(TRF6)相关的支架蛋白/衔接蛋白的蛋白功 能为调节响应上游信号的NF-kappa-B的活化。选择性剪接转录变异体编码已被鉴定为该基 因的相同或不同的亚型。
[0013] p62被确定为是在非磷酸化方式中结合酪氨酸激酶lckp56的src同源2(SH2)结构 域的62-kDa蛋白（Moscat等著，2007,Signal integration and diversification through the p62scaffold protein.Trends Biochem Sci32:95_100)。已知该p62的主要序列，并且 p62显不为结合泛素（Moscat等著，2007，Signal integration and diversification through the p62scaffold protein.Trends Biochem Sci 32:95-100)。图 1 展不了该cDNA 的核酸序列，并且图2展示了氨基酸序列。
【发明内容】
[0014] 本发明提供了通过施用药剂给受试者调节促炎细胞因子在所述受试者中表达的 方法，该药剂包括：（a)p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸；或者（b)编码p62/ SQSTM1的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个 氨基酸。所述促炎细胞因子可以是 TNFa、IL-6、IL-lb、RANTES、IL-17、IL-23、CCL-l、MCP-5S CXCL2。
[0015] 本发明还提供了通过施用药剂给受试者而调节成骨转录因子在所述受试者中表 达的方法，该药剂包括：（a)p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者(b)编码p62/ SQSTM1的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个 氨基酸。所述成骨转录因子可以是osterix或runx2。
[0016] 本发明还提供了通过施用药剂给受试者而调节骨吸收因子在所述受试者中表达 的方法，该药剂包括：（a)p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸；或者（b)编码p62/ SQSTM1的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个 氨基酸。所述骨吸收因子可以是TNFa或RANKL。
[0017] 本发明还提供了通过施用药剂给受试者而调节内源性P62/SQSTM1在所述受试者 中表达的方法，该制剂包括：（a)p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者(b)编码 P62/SQSTM1的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其变体的至少 30个氨基酸。
[0018]本发明提供了通过施用药剂给受试者而对所述受试者的与癌症无关的慢性炎症 性疾病的一个或多个症状进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生、抑制发展、降低严重性或 降低发病率的发生率的方法，该制剂包括：（a)p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基 酸;或者(b)编码P62/SQSTM1的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽 或其变体的至少30个氨基酸。
[0019]上述任一方法均可以包括给药变体p62/SQSTMl，其中，所述变体具有与选自由 SEQ. ID.N0.2~35 10组成的组中的任一序列至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至 少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一 性。所述变体与选自由SEQ.ID.N0.2~35组成的组中的任一序列具有至少80%、至少85%、 至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98 %或至少99 %的序列同一性，或相同。
[0020] 上述任一方法可以包括给药编码P62的核酸，所述编码P62的核酸包括SEQ ID N0: 1的序列。
[0021] 上述任一方法可以包括给药具有至少一个结构域缺失的p62多肽或变体的。所述 缺失的结构域可以为 PB1、ZZ、NLS2、TB、NLS1、NES、LIR、KIR&&UBA。
[0022] 上述任一方法可以包括给药含有编码p62的核酸制剂，其中所述编码p62的核酸编 码多肽，该多肽与SEQ ID N0.2具有至少95%的同一性，并且其中所述编码p62的核酸进一 步包括质粒、RNA或病毒载体。
[0023] 上述任一方法可以包含P62/SQSTM1多肽或者编码p62/SQSTMl的核酸，其分别进一 步包括融合多肽或编码融合多肽的核酸。
[0024] 上述任一方法可以包含疫苗形式的P62/SQSTM1多肽或者编码p62/SQSTMl的核酸， 并且进一步包括施用佐剂给所述受试者。所述佐剂可以为凝胶型佐剂、微生物佐剂、颗粒物 佐剂、油乳剂佐剂、表面活性剂类佐剂和合成佐剂。
[0025] 所述与癌症无关的慢性炎症性疾病可以为肥胖症、代谢综合征、2型糖尿病、脂肪 肝、克罗恩氏病、胰腺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、关节炎、骨质疏松、骨关节炎、多发性硬化 症，银肩病、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化，神经退行性疾病、痛风、石棉肺以及矽肺。所述 神经退行性疾病可以为肌萎缩侧索硬化症、帕金森症、亨廷顿病或阿尔茨海默氏症。
[0026] 对受试者中与癌症无关的慢性炎症性疾病的一个或多个症状进行治疗、减轻、改 善、缓解、延缓发生、抑制发展、降低严重性或降低发病率的方法可以进一步包括对所述受 试者进行抗炎治疗。
[0027] 上述任一方法可以应用到患有炎症性疾病的受试者、之前接受过炎症性疾病治疗 的受试者、有炎症性疾病家族病史的受试者或者易患炎症性疾病的受试者。
[0028] 对受试者中与癌症无关的慢性炎症性疾病的一个或多个症状进行治疗、减轻、改 善、缓解、延缓发生、抑制发展、降低严重性或降低发病率的方法可以进一步包括用于提高 受试者中基于核酸的P62表达效率的策略。所述策略可以包括自我复制的病毒复制、密码子 优化、活体电穿孔法、CpG刺激基序的插入，包括靶向对内吞作用或泛素加工通路靶向序列， 包括马立克氏病病毒1型VP22蛋白序列、免疫加强方案、粘膜递送载体以及核酸递送系统。 所述核酸递送系统可为聚合物基因载体系统、脂质体输送系统以及细胞穿透肽基因传递系 统。
[0029] 上述任一方法可以进一步包含施用抗炎化疗制剂或生物制剂。所述化疗制剂可以 为非留体类抗炎药、糖皮质激素、甲氨蝶呤、环孢素或雷帕霉素。所述抗炎生物制剂可以为 抗-TNF抗体、抗-IL1抗体、抗-IL6抗体、抗-IL6受体抗体、抗-IL12/23抗体、抗-IL17抗体、 抗-IL1R抗体、抗-IL1受体拮抗剂以及可溶性IL-1受体。
[0030] 在以下说明书、实例、权利要求以及附图中作进一步的说明某些方面以及实施例。
【附图说明】
【附图说明】 [0031] 了该技术的实施方式而并非限制。
[0032] 图1显示了人的p62野生型核酸序列（SEQ ID N0:1);
[0033] 图2显示了由核酸序列（SEQ ID N0:2)编码的人的p62/SQSTMl的野生型氨基酸序 列；
[0034]图3显示了人的p62/SQSTMl的域结构的示意图；
[0035]图4显示了在用于骨质疏松症的小鼠模型中导入p62/SQSTMl DNA对骨质疏松症预 防的效果；
[0036] 图5显示了导入p62/SQSTMl DNA对成骨细胞标志物的影响；
[0037] 图6显示了导入p62/SQSTMl DNA对骨密度(BMD)和含量(BMC)的影响；
[0038] 图7:A显示了导入p62/SQSTMl DNA对成骨因子表达的影响；B显示了p62/SQSTMl DNA导入对骨吸收因子以及NF-kappa-B表达的影响；
[0039]图8:六显示了外源?62对?62表达的影响；8显示了在?62-0￥乂小鼠的股骨骨骺部分 提高p62-免疫标记;C免疫印迹表明提高的p62水平来自外源p62。
[0040] 图9显示了导入P62/SQSTM1 DNA对ALS小鼠模型的影响；
[0041 ] 图10显示了导入p62/SQSTMl DNA对MS的小鼠模型的影响；
[0042] 图11显示了导入p62/SQSTMl DNA对S37肉瘤的生长的影响；
[0043] 图12显示了导入p62/SQSTMl DNA对乳腺癌小鼠的存活率的影响；
[0044] 图13显示了导入p62/SQSTMl DNA对LLC转移的影响；以及
[0045] 图14显示了导入p62/SQSTMl DNA对B16黑色素瘤转移的影响。
【具体实施方式】
[0046]本发明提供了用于治疗慢性炎症的p62组合物及方法。发明人发现施用p62给受试 者，如编码P62的核酸，可以抑制炎症细胞因子的产生。因此，施用编码的p62多肽的多核苷 酸或P62多肽给受试者能够用于预防和/或减轻炎症相关疾病的发展(这样疾病的列表包括 但不限于骨质疏松症、肥胖症、代谢综合征、2型糖尿病、脂肪肝、炎症性肠病、胃炎、慢性胰 腺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病（C0PD)、类风湿性关节炎（RA)、骨性关节炎、多发性硬化症 (MS)、银肩病、慢性充血性心力衰竭(CHF)、动脉粥样硬化、神经退行性疾病(ALS、帕金森、阿 尔茨海默症、亨廷顿病）、痛风、石棉肺以及矽肺。
[0047]在这里所使用的，"p62多肽"是指相应于全长p62/SQSTMl蛋白的多肽。该术语也包 括所述P62/SQSTM1蛋白的所有的同系物、类似物、片段或衍生物。在一个实施方式中，分离 的P62多肽具有如图2所示的氨基酸序列（SEQ ID勵:2)。"编码p62的核酸"是指编码p62多 肽或变体的至少一部分DNA或RNA。
[0048] 在一些实施例中，所述受试者是人。在其他实施例中，所述受试者为非人的哺乳动 物，包括但不限于马、牛、羊、猪、鹿、狗、猫、大鼠或小鼠。
[0049] 表 1
[0050] 各种物种的 p62/SQSTMl
[0051]
[0052]
[0053] 如这里所述，除了全长氨基酸序列或编码其多肽的核酸，本发明的多肽还可以包 括P62的多肽及其截断的片段或截短物、类似物和同系物。片段可以包括所述全长多肽的至 少5个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少100个、至少200个或至少300个氨基 酸残基的肽(或编码肽）。
[0054]还包括从所述P62/SQSTM1蛋白的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失，或者 不连续的部分。缺失的氨基酸可连续或不连续。缺失突变得到的类似物的下限长度为约10 个、约20个、约50个或约100个氨基酸。
[0055]在一些实施方式中，所述p62多肽(或编码所述多肽的核酸)具有一个或多个缺失 的结构域。尽管不希望被理论所缚，发明人认为P62多肽的一个或多个域的缺失提供了一个 更紧凑的和可操作的免疫应答的多肽。例如，通过破坏或去除p62多肽的一个或多个结构 域，能在更紧凑的分子中保留抗炎作用(或改进，如果已缺失或破坏的结构域不会对这种效 果作出贡献），并以每单位重量基础潜在地提高。
[0056]所述p62多肽具有如下表2及图3所示的域结构：
[0057] 表2·ρ62多肽域结构
[0058]
[0059]
[0060]
[0061 ] p62NCBI参考序列:NP_003891(死骨片-1同种型1 [人源])。
[0062]在一些实施例中，如下所示，上述的结构域的一个或多个从人的p62多肽在p62核 酸的核酸区的相应密码子处缺失(框内缺失）。
[0063] 表3·ρ62中的缺失
[0064]
[0065]
[0066] 核酸编号参见p62NCBI核苷酸数参考序列:NP_003891(死骨片-1同种型1 [人源])。 [0067] 例如，开始于核苷酸102至核苷酸122且终止于167至183的任何编码核酸序列的缺 失均被认为是ZZ缺失。因此，例如核苷酸110~175的缺失为ZZ缺失。本领域技术人员熟知产 生框内缺失的技术。
[0068] 如在此所使用，"生物活性"是指根据本发明的多肽具有与各个野生型多肽类似的 结构功能(但不必是相同的程度），和/或类似的调控功能(但不必是相同的程度），和/或类 似的生化功能(但不必是相同的程度）。
[0069] 如在此所使用，定义"缺失"为核苷酸或氨基酸序列的变化，其中，与野生型多核苷 酸或多肽相比，分别缺少一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
[0070]如在此所使用，"插入"或"添加"是指核苷酸或氨基酸序列的变化，其导致与野生 型多核苷酸或多肽相比，分别增加一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
[0071]如在此所使用，"取代"是与野生型多核苷酸或多肽相比，分别由不同的核苷酸或 氨基酸替换一个或多个核苷酸或氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸置换突变为C145R或 Q418R。
[0072]如在此所使用，所述术语"变体"是指与野生型多肽相比，具有所述序列或对所述 序列进行取代、缺失或增加一个(或多个)氨基酸(或这些的任一组合）的任何多肽(包括由 相应的核酸编码的多肽），包括等位基因变体。在一些实施例中，与本发明所使用的野生型 多肽相比，所得的多肽保留至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或更大的生物活性。？62 多肽的变体(包括由相应的核酸编码的多肽）与表1所列的任一氨基酸序列可以具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98 %或者至少99 %的序列同一性。
[0073]可以采用现有技术已知的标准技术来确定序列的同一性或同源性，如Devereux等 在Nucl. Acid Res .12:387-395( 1984)中所描述的最佳拟合(Best Fit)序列程序或BLASTX 程序(Altschul等，J M01.Biol.215:403-410)。序列排比可以包括在要对齐的序列中引入 缺口。此外，对于相比此处所公开的蛋白包含更多或更少氨基酸的序列，可以理解的是将会 基于与氨基酸总数相关的同源氨基酸的数量确定同一性的百分比。因此，P62多肽的变体 (包括由相应的核酸编码的多肽）与表1所列的任一氨基酸序列可以具有至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、 至少98 %或者至少99 %序列同一性。
[0074]在一些实施方式中，本发明的多肽的变体或衍生物保持了氨基酸序列的疏水性/ 亲水性。保守的氨基酸取代物已为本领域众所周知，并可由例如1、2或3至10、20或30个取代 物构成。氨基酸取代物可以包括使用非天然存在的类似物，例如为了增加血浆半衰期。
[0075] 此处所使用的与所述氨基酸序列相关的所述术语"衍生物"是指本发明的多肽的 化学变异。
[0076] 这样一种修正的非限定示例可以包括但不限于羧基端酰胺或含有羧基侧链残基 的脂肪酸酯或酰胺，含羟基的残基的〇-酰基衍生物，以及氨基末端氨基酸或含氨基酸残基 的N-酰基衍生物，例如，赖氨酸和精氨酸。
[0077]其他的修正可以包括，例如，生产与聚合物（如聚乙二醇(PEG))相偶联的多肽，或 在化学合成本发明的多肽的过程中加入PEG。
[0078]多肽或其部分的修正还可以包括还原作用/烷基化作用、化学偶联到合适的载体、 或适度的福尔马林处理。
[0079]术语"翻译后修正"或"修正"是指将氨基酸插入多肽链后的任何修正。所述术语包 括，但不限于，体内的共翻译修正、体内翻译后修正、以及体外翻译后修正。
[0080]本发明的多肽的其他衍生物包括非天然氨基酸残基的插入、或如磷酸酪氨酸、磷 酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的磷酸化氨基酸残基。其他可能的修正包括磺化、生物素化、或 其他部分的添加，特别是那些有类似的磷酸基团的分子形状。
[0081 ]衍生物还包括糖基化修正的多肽。这些多肽可以通过在各种可选择的真核宿主表 达系统合成和加工过程、或是在进一步的处理步骤中通过修正糖基化方式形成。产生糖基 化修正的方法包括暴露融合蛋白于通常进行这样的处理的细胞产生的糖基化酶，如哺乳动 物的糖基化酶。或者，使用去糖基化酶去除在真核表达系统生产中所连接的碳水化合物。另 外，也可以修改编码序列，使得糖基化部位被添加或糖基化部位被缺失或丧失功能。此外， 如果不需要糖基化，那么在原核宿主表达系统中生产所述蛋白质。
[0082] 可以通过化学合成或使用定点诱变(Gillman等，Gene 8:81(1979) ;Roberts等， Nature 328:731(1987)or Innis(Ed.),1990,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications ,Academic Press ,New York,N.Y.)或者或聚合酶链反应（PCR)方法（Saiki 等，Science 239:487( 1988))制备本发明所述多肽的变体和/或衍生物，如Daugherty等在 (Nucleic Acids Res. 19: 2471 (1991))中举例说明的方法修正编码本发明所述p63多肽的 核酸。
[0083] 在另一实施方式中，本发明的多肽可以在其N末端包含的外源信号序列。在一些宿 主细胞(如哺乳动物宿主细胞）中，通过使用外源信号序列的提高融合蛋白的表达和/或分 泌。信号序列的代表特征为疏水性氨基酸的核心，其通常在一个或多个裂解事件的分泌期 间由成熟的蛋白裂解。这样的信号肽包含处理位点，其允许当成熟蛋白通过分泌途径时信 号序列从所述成熟蛋白裂解。因此，本发明适合具有信号序列的上述多肽以及信号序列从 所述多肽蛋白水解裂解的多肽（即裂解产物）。为了提高稳定性和/或反应性，也可修正本发 明的多肽，以在由天然等位基因变异产生的氨基酸序列中插入一个或多个多态性。此外，D 氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸类似物可以被取代或添加，以产生在本发明的范围内的 修正的p62的多肽。
[0084] 可通过在合适的表达系统中表达编码多肽的核苷酸序列而制备本发明的多肽。
[0085] 此外，或者可选择地，可使用化学方法合成所述多肽，以整体或部分地合成所需要 的的氨基酸序列。例如，可以通过固相技术合成多肽，从树脂裂解，并通过制备高效液相色 谱法纯化（例如，Creighton( 1983)，Proteins Structures And Molecular Principles，WH Freeman and Co,New York N.Y.)。可以通过氨基酸分析或测序(如埃德曼降解法)验证合 成多肽的组成。此外，P62多肽的氨基酸序列，或其任一部分，可以在直接合成中被改变，和/ 或使用化学方法与其他亚基的序列或其任一部分结合，以产生变体多肽。
[0086] 如在此所使用的，所述术语"融合蛋白"是指包含两个或更多个不同蛋白质的氨基 酸序列的嵌合蛋白。通常，通过本领域所公知的体外重组技术获得融合蛋白。
[0087] 在另外的实施方式中，本发明所述的融合蛋白可以进一步包括一个或多个另外的 多肽结构域以促进蛋白纯化，增加重组蛋白的表达，或提高重组蛋白的溶解度。这样的纯 化/表达/溶解促进结构域包括，但不限于，可在固定化金属上纯化的诸如组氨酸-色氨酸模 块的金属螯合肽(Porath J，（1992)，Protein Expr Purif，3-.26328 1)，可在固定化免疫 球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，以及用在FLAGS扩展/亲和纯化系统中的结构域(英姆纳克 斯公司，西雅图，华盛顿州）中。在纯化结构域和蛋白质之间的包含诸如Xa因子或肠激酶 (Invitrogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚）的可切割连接序列用于促进纯化。
[0088]另外的融合表达载体包括PGEX(法玛西亚，皮斯卡塔韦，新泽西州）、pMAL(新英格 兰生物，贝弗利，马萨诸塞州）以及pRITS(GE医疗生物科学，皮斯卡塔韦，新泽西州），其分别 将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖B结合蛋白或蛋白质A与靶重组蛋白融合。也可以使用 EBV、BKV以及其他附加型表达载体（Invigrogen，Thermof isher科技）。
[0089] 在本发明的另一方面，p62的多肽可以非共价连接到一个运输部分或转染试剂。非 共价连接的肽转染剂的一个例子是查里厄特蛋白输送系统（参见美国专利No. 6，841，535; Morris等（1999) J. Biol .Chem. 274(35) : 24941-24946 ;以及Morris等（2001 )Nature Biotech.l9:1173-1176)。
[0090] 在某些实施方式中，使用编码p62多肽的核酸分子。所述核酸分子可以包括或由以 下元件组成:一个编码一个或多个P62多肽或其片段(包括编码任意顺序的结构域或一个或 多个结构域被删除或破坏的多肽的片段)或其衍生物的核苷酸序列组成，如包含在一插入 在ATCC沉淀的DNA中。所述编码p62多肽的p62核酸分子的变体与SEQ IDN0:1具有至少80%、 至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98 %或者至少99 %的序列同一性。
[0091] 所述术语"核酸序列"或"核酸分子"是指DNA或RNA序列。所述术语包括由任何已知 的DNA和RNA的碱基类似物形成的分子，例如，但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺 苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧 甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、 1- 甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2_二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺 嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基 氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基-Q核苷、5 '甲氧羰基甲基尿 嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基N 6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、奥昔布宁（oxybutoxosine)、假尿啼啶、Q核苷(queosine)、2_硫代胞啼啶、5-甲基- 2- 硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、 以及2,6-二氨基嘌呤、等等。
[0092] 在本发明的某些实施方式中，载体用于将编码多肽的多核苷酸输送至细胞。载体 是用于将核酸序列转移到宿主细胞的任何分子。在某些情况下，使用表达载体。表达载体是 适于导入宿主细胞和/或在宿主细胞中增殖且包含指引和/或调控被转移的核酸序列的表 达的核酸分子。表达包括，但不限于，诸如转录、翻译、和剪接(如果存在内含子）的过程。表 达载体通常包括一个或多个可操作地连接到编码多肽的异源核酸序列的侧翼序列。侧翼序 列可以是，例如同源的（即来自于和宿主细胞相同的物种和/或菌株）、异源的（即来自于宿 主细胞种或菌株之外的种）、混合的（即来自于一个以上的来源的侧翼序列的组合)或者合 成的。
[0093] 侧翼序列能够影响编码序列的复制、转录和/或翻译，并且可操作地连接编码序 列。如在此所使用的，术语可操作地连接是指多核苷酸元件以功能关系可操作地连接。例 如，如果启动子和增强子影响的编码序列的转录，那么启动子和增强子可操作地连接到编 码序列，。然而，一个侧翼序列不必与编码序列相邻，只要它正确地发挥功能。因此，例如，介 入的未翻译但已转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且仍然可认为启动 子序列与编码序列可操作地连接。类似地，增强子序列可以位于所述编码序列的上游或下 游，并且影响所述序列的转录。在某些实施方式中，所述侧翼序列是驱动基因在靶细胞中高 水平表达的转录调控区。所述转录调控区可以包括例如启动子、增强子、沉默子，阻遏元件， 或它们的组合。所述转录调控区可以是组成型的，组织特异性、细胞类型特异性（即与另一 类组织或细胞相比，该区域在一类组织或细胞中驱动转录的更高水平）、或是可调的（即响 应与分子的相互作用）。所述转录调控区的来源可以是任何原核或真核生物，任何脊椎动物 或无脊椎动物，或任何植物，前提是所述侧翼序列通过在细胞内引发核酸的转录以在细胞 内作用。可以使用各种各样的转录调控区。
[0094] 合适的转录调控区包括，例如，CMV启动子(即CMV即时早期启动子）；来从真核基因 的启动子(即雌激素诱导的鸡卵清蛋白基因，干扰素基因，糖皮质激素诱导的酪氨酸氨基转 移酶基因，以及胸苷激酶基因）；以及主要的早期和晚期的腺病毒基因的启动子；SV40早期 启动子区（Bernoist and Chambon，1981,Nature 290:304-10);劳氏肉瘤病毒（RSV)的3'长 末端重复(LTR)中包含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22:787-97);单纯疱疹病毒胸苷 激酶(HSV-TK)启动子(Wagner等，1981，Proc · Natl .Acad .Sc i.U.S.A.78:1444-45);金属硫 蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，Nature，296:39-42);原核表达载体如β-内酰胺酶 启动子（VIIIa-Kamaroff等，1978，Proc .Natl .Acad. Sci.U.S.A.，75:3727-31);或tac启动 子(DeBoer 等，1983，Proc. Natl. AcacL Sci.U.S. A.，80:21-25)。组织和 / 或细胞类型的特异 性转录调控区包括，例如，在胰腺腺泡细胞中活跃的弹力蛋白酶I基因调控区（Swift等， 1984，Cell，38:639_46;0rnitz等，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，50:399-409(1986)，MacDonald，1987，Hepalology ,7:425-515);在胰腺β细胞中活跃的胰岛素基因 调控区（Hanahan，1985，Nature，315:115-22);在淋巴细胞中活跃的免疫球蛋白基因调控区 (Grosschedl等，1984，Cell，38:647-58;Adames等，1985，Nature，318: 533-38;Alexander 等，1987，Mol.Cell.Biol.，7:1436-44);在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴细胞和肥大细胞中的 小鼠乳腺肿瘤病毒调控区（Leder等，1986，Cel 1，45:485-95);在肝脏中的白蛋白基因调控 区（Pinkert等，1987，Genes and Devel.，1: 268-76);肝脏中的甲胎蛋白基因的调控区 (Krumlauf等，1985，Mol · Cel 1 ·Biol ·，5:1639-48;Hammer等，1987，Science，235:53-58);肝 脏中的al-抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.，1:161-71);骨髓细 胞中的β珠蛋白基因调控区（Mogram等，1985，Nature，315:338-40 ;Kollias等，1986，Cell， 46:89-94);在脑的少突胶质细胞中的髓鞘碱性蛋白基因调控区（此&(111册(1等，1987，(^11， 48:703-12);骨骼肌中的肌球蛋白轻链-2基因的调控区（Sani，1985，Nature，314: 283-86); 下丘脑中的促性腺激素释放激素基因调控区(Mason等，1986，Science，234:1372-78)，以及 黑色素瘤细胞中的酪氨酸酶启动子(Hart，Semin Oncol，1996 2月；23(1): 154-8; Siders 等，Cancer Gene Ther，1998 9月-10月；5(5) :281-91)等等。也可以使用在特定的分子或条 件(例如光，热，辐射，四环素，或热休克蛋白）存在时的被激活诱导性启动子例如，也可以使 用(参见，例如，W000/10612)。本领域已知中其他合适的启动子。
[0095]如上所述，增强子也可是合适的侧翼序列。增强子为DNA的顺式作用元件，通常长 约10~300bp，其作用于启动子以增加转录。增强子通常是方向与位置独立性的，其已被确 定同时5'和3'控制的编码序列为。已知几种可从哺乳动物基因获得的增强子序列（即球蛋 白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白及胰岛素）。类似地，SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子 增强子、多瘤病毒增强子、及腺病毒增强子均对真核启动子序列有效。而增强子可以在核酸 编码序列的5'或3位置'拼接到载体中，其通常位于启动子5'。本领域已知其他合适的增强 子，并适用于本发明。
[0096]在本发明的一些实施方式中，此处提供了包括p62多核苷酸或p62多肽的疫苗。这 样的疫苗可以进一步包括佐剂。任何一种佐剂可用于本发明疫苗来增强免疫反应。大多数 佐剂含有可以保护抗原以防止其快速分解的物质，如氢氧化铝或矿物油，以及免疫反应的 非特异性刺激物。市场上销售的合适的佐剂包括，例如，不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂 (Difco实验室）以及默克佐剂65(默克公司，拉威，新泽西州）。合适的佐剂类型包括，但不限 于，凝胶型佐剂、微生物佐剂、微粒佐剂、乳化油佐剂、表面活性剂类佐剂及合成佐剂。
[0097]在某些实施例中，在本发明所述组合物中将p62多肽或编码p62多肽的多核苷酸或 其衍生物与一个或多个共刺激成分，如细胞表面蛋白，细胞因子，趋化因子或信号分子，进 行结合是有利的。共刺激成分例如可以作为多肽或编码所述多肽的核酸包括在所述组合物 中。合适的共刺激分子包括，例如，结合⑶28族成员的多肽（即，⑶28，I⑶S ;Hutloff等， Nature，1999，397:263-265;Peach等，J Exp Med，1994，180:2049-2058)，如CD28结合多肽 B7 · 1 (CD80; Schwartz，1992;Chen等，1992;Ellis等，J ImmunolJ. Immunol .,156(8): 2700-9)以及 B7.2(CD86;Ellis等，J. Immunol .J Immunol ,156(8): 2700-9);结合整合素家族成员 的多肽（即，LFA-l(CDlla/CD18);Sedwick，等，J. Immunol .J Immunoll999,162:1367-1375; Wulfing等，Science，1998，282: 2266-2269; Lub等，J Immunol Immunol Today，1995，16: 479-483)包括ICAM家族成员（8卩，ICAM-1，-2或-3);结合CD2家族成员的多肽（即，CD2，信号 淋巴细胞活化分子（cdw 150或 "SLAM" ；Aversa等，J ImmunolJ· Immunol .1997，158:4036-4044));结合耐热抗原的多肽（HAS或⑶24;Zhou等，Eur J ImmunolJ Immunol，1997,27: 2524-2528);与TNF受体（TNFR)家族成员结合的多肽（即4-lBB(CD137;Vinay等，Semin Imunol 1998，10:481-489)，0X40(CD134;Weinberg等，Semin Imunoll998，10:471 480; Higgins 等，J.Immunol.J Immunoll999，162:486 493)，以及 CD27(Len s 等，Semin Imunol 1998，10:491-499)，如4-lBBL(4-lBB配体；Vinay等，Semin Imunol，1998，10 :481- 48 ;DeBenedette等，J· Immunol · J Immunol，1997，158:551-559)，TNFR相关因子-1 (TRAF-1; 4-1BB 配体；Saoulli等，实验医学杂志，1998,187:1849-1862, Arch 等，Mol Cell Biol， 1998,18:558-565)，TRAF-2(4_1BB及0X40配体；Saoulli等，J Exp Med，1998,187 :1849-1862;0shima 等，J Immunollnt Immunol，1998,10:517-526，Kawamata等，J Biol ChemJ Biol Chem，1998,273:5808-5814)，TRAF-3(4-lBB即0X40配体；Arch等，Mol Cell BiolMol Cell Biol，1998，18:558_565;Jang等，Biochem Biophys Res Commun，1998,242:613_620; Kawamata等，J Biol Chem，1998，273 : 5808-5814)，0X40L(0X40配体；Gramaglia等，J Immunol，1998,161:6510-6517)，TRAF-5(0X40配体；Arch等，Mol Cell Biol，1998,18:558-565;Kawamata等，J Biol Chem，1998,273:5808-5814)，以及CD70(CD27配体；Couderc等， Cancer Gene Ther.，5(3) : 163-75)。CD 154( CD40 配体或"CD40L"; Guruna than等，J ImmunolJ.Immunol·，1998，161:4563-4571;Sine等，Hum.Gene Ther·，2001,12:1091-1102) 也同样适用。
[0098]用于提高核酸免疫效率的其它策略还可以包括，例如，使用自我复制的病毒复制 子（Caley等，1999.Vaccine，17:3124-2135 ;Dubensky等，Mol .Med·，6:723-732;Leitner等， 2000, Cancer Res.，60:51-55)，密码子优化（Liu 等，2000, Mol .Ther.，1:497-500; Dubensky，同上；Huang 等，2001 · J. Virol .J. Immunol ·，75:4947-4951)，体内电穿孔（widera 等，2000 年，J Immunol，164 335_3640)，CpG 刺激基序的插入（Gurunathan 等， Ann. Rev. Immunol ·，2000，18:927-974 ;Leitner，同上；Cho等，J Immunol，168( 10): 4907-13)，革巴向内吞作用或泛素化过程途径的序列（Thomson等，1998 .J. Immunol.，72 : 2246-2252; Velders等，2001，J Immunol，166:5366-5373)，马立克氏病病毒1型VP22序列 (J · Immuno 1 ·，76(6) :2676-82,2002)，初免-加强方案（prime-boost regimens) (Gurunathan，同上；Sullivan等，2000，Nature，408:605-609 ;Hanke等，1998，Vaccine，16: 439-445 ;Amara等，2001，Science，292:69-74)，以及如沙门氏菌的粘膜载体的使用(Darji 等，1997，Cell，91:765-775 ;Woo等，2001，Vaccine，19:2945-2954)。本领域公知其他方法， 其中的一些在下文中描述。
[0099]可通过几种可用的技术施用编码p62多肽的核酸给受试者。已成功地用于引入核 酸到宿主的各种病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒和痘病毒 等等。本领域中可以理解的是很多这样的病毒载体可用于本领域。可利用本领域普通技术 人员普遍可获得的标准重组技术构建所述载体。分子克隆公开了很多这样的技术:实验室 手册（Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，基因表达技术 (Methods in Enzymology，Vol.l85，edited by D.Goeddel，1991.Academic Press)，以及 PCR方案:指导方法与应用（Innis等，1990，Academic Press，，圣地亚哥，加州）。
[0100]合适的逆转录病毒载体包括慢病毒衍生物以及鼠类或禽类逆转录病毒的衍生物。 合适的逆转录病毒载体的示例包括，例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维小鼠肉瘤病 毒(HaMuSV)、鼠类乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、31￥31￥、!11￥以及劳氏肉瘤病毒(1?￥)。许多逆转 录病毒载体可以包含多个外源核酸序列。由于重组逆转录病毒是有缺陷的，他们需要协助 才能产生感染性病毒粒子。例如，编码逆转录病毒结构基因的辅助细胞系可提供这种协助。 合适的辅助细胞系包括PSI.2、PA317以及PA12等。使用这种细胞系产生的载体病毒可用于 感染组织细胞系，如NIH 3T3细胞，以产生大量的嵌合逆转录病毒。逆转录病毒载体可以由 传统的方法给入（即注射)或者通过植入邻近靶细胞群的"生产者细胞系"来施用(Culvert 等，1994，Hum.Gene Ther.，5(3):343-79;Culver，K 等，Cold Sprig Harb.Symp; Quant.Biol.，59:685-90);01dfield，E.，1993，Hum.Gene Ther.，4(1):39-69)。设计所述生 产者细胞系产生病毒载体，并在靶细胞的附近释放病毒颗粒。释放的病毒颗粒的一部分接 触靶细胞并感染这些细胞，从而将本发明的核酸递送到靶细胞。感染靶细胞后，发生载体核 酸的表达。
[0101] 腺病毒载体用于转移基因至真核细胞（Rosenf eld, Μ等，1991，Science，252 (5004) :431-4;Crystal，R等，1994，Nat .Genet ·，8(1) :42-51)。用于将重组腺病毒在体内施 加到不同的组织的途径包括气管内灌注(R〇senfeld，M等，1992，Cell，68(l ):143-55)注入 肌肉（Quantin，B等，1992，Proc.Natl .Acad. Sci.U.S.A.，美国，89(7): 2581-4)、外周静脉注 射(Herz，J.和Gerard,R.，1993，Proc.Natl .Acad. Sci.U.S.A.，美国，90(7) :2812-6)以及脑 立体定向接种（Le Gal La Salle,G.等，1993，Science，259(5097) :988-90)等等。
[0102] 腺病毒伴随病毒(AAV)显示了高水平易感性，广谱宿主范围以及在整合到宿主细 胞基因组中的特异性（Hermonat，P ·等，1984，Proc .Natl .Acad .Sci.U.S.A.，美国，81(20): 6466-70)。单纯疱疹病毒I型(HSV-1)是另一个有吸引力的载体系统，特别是用于神经系统， 因为其亲神经性质（Geller,等，1991，Trends Neurosic，14( 10): 428-32 ;Glorioso等， 1995，Mol.Biotechnol·，4(1):87_99;Glorioso等，1995,Annu.Re.Microbiol·，49:675-710)〇
[0103] 痘病毒是另一种有用的表达载体（Smith等，1983，Gene，25(l):21-8;Moss等， 1992，Biotechnology，20:345-62;Moss等，1992，Curr·Top.Microbiol·Immunol·，158:25-38;Moss等，1991，Science ,252:1662-1667)。显示有用的痘病毒包括牛痘、NYVAC、禽痘、鸡 痘、金丝雀痘痘、ALVAC以及ALVAC(2)等病毒。
[0104] NYVAC(vP866)通过编码已知或潜在的毒力因子的基因组缺失六个复制非必需区 而从牛痘病毒的哥本哈根毒株衍生而来(参见，例如，美国专利5,364,773和5,494,807)。还 设计缺失基因座为外源基因插入的受体位点。NYVAC( VP866)、vP994、VCP205、vCP1433、 placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3以及pC3H6FHVB同样根据布达佩斯条约的条约在ATCC保 藏，保藏号分别为 VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912&&ATCC-97914。
[0105] 以ALVAC为基础的重组病毒（即ALVAC-1和ALVAC-2)同样是合适的载体（参见，例 如，美国专利号5,756，103)<^1^4(：(2)与41^40(1)相同，除了41^^(：(2)基因组包括在牛痘启 动子控制下的牛痘E3L和K3L基因（美国专利号6，130,066 ;Beattie等，1995a，1995b，1991; Chang等，1992; Davies等，1993) ALVAC根据布达佩斯条约的条款存放于美国模式培养物保 藏中心（ATCC)，10801大学大道，马纳萨斯，弗吉尼亚，20110-2209,美国，ATCC保藏号VR-2547。
[0106] 另一个有用的痘病毒载体为TR0VACJR0VAC是指减毒禽痘，它是由被许可用于1日 龄雏鸡接种禽痘病毒的FP-1疫苗株所衍生的噬斑分离克隆。TR0VAC同样根据布达佩斯条约 的条款存放于ATCC，ATCC保藏号2553。
[0107] "非病毒"质粒载体也可适用于本发明。合适的质粒载体与细菌、昆虫、和/或哺乳 动物宿主细胞是相容的。这样的载体包括，例如PCR-II、pCR3和pcDNA3.1 (ThermoFisher)、 pBSII(Agilent Technology，圣克拉拉，CApETl5(EMD Millipore，比尔里卡，马萨诸塞州） pGEX(GE Healthcare Bioscience,皮斯卡塔韦，新泽西州）、pEGFP-N2(Clontech，帕罗奥 图，加利福尼亚州）、pETL(BlueBacII，Thermofisher)、pDSR-alpha(PCT公开号TO90/14363) 和pFastBacDual (Thermof isher)以及BluescHpt?质粒衍生物（高拷贝数的基于C0LE1的 噬菌粒，安捷伦科技，圣克拉拉，加利福尼亚州），用于克隆Taq酶扩增PCR产物的PCR克隆质 粒(例如，TOPO TA克隆?，试剂盒，PCR2.1?质粒衍生物，Thermofisher细菌载体也可用 于本发明。这些载体包括，例如，志贺氏菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌卡介苗 衍生物（BCG)，以及链球菌（参见例如W088/6626、W090/0594、W091/13157、W092/1796和 TO92/21376)。许多其他的非病毒质粒表达载体和系统在现有技术中是已知的，并且可以用 于本发明。
[0108] 合适的核酸递送技术包括DNA配体复合物、腺病毒DNA复合配合物、直接注射DNA、 CaP04沉淀、基因枪技术、电穿孔聚合基因传递系统、细胞穿透肽基因传递系统，以及胶体分 散系统等。聚合物基因传递系统包括基于聚醚酰亚胺以及聚醚的传递系统。细胞穿透肽为 基础的系统包括9~35个聚阳离子和/或能够调节DNA跨质膜转运的两亲性肽。胶体分散系 统包括高分子复合物、纳米微囊、微球、小珠，以及包括水乳化油、微胶粒、混合胶束以及脂 质体的以脂质为基础的系统。脂质体为在体外和体内用作递送载体的人工膜囊泡。RNA、DNA 以及完整的病毒颗粒可以被封装在水内，并以生物活性的形式传递到细胞(Fraley，R.等， 1981，Trends Biochem Sci .，6:77)。脂质体的成分通常是磷脂的组合，特别是高相变温度 磷脂，通常与类固醇，尤其是胆固醇相结合。其他磷脂或其他脂质也可以使用。脂质体的物 理特性取决于pH值、离子强度以及二价阳离子的存在。用于脂质体生产的脂质例子包括磷 脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、神经鞘磷脂、脑苷 脂以及神经节苷脂。脂质可以为二酰基磷脂酰甘油。二酰基磷脂酰甘油的脂质部分可以具 有14~18个碳原子。二酰基磷脂酰甘油的脂质部分可以具有16~18个碳原子。二酰基磷脂 酰甘油的脂质部分可以为饱和的。说明性地，磷脂包括卵磷脂、脑磷脂、鞘磷脂、脑苷脂以及 神经节苷脂。
[0109] 在实施方式中，提供了一种治疗炎症性疾病的方法。在各种实施方式中，提供了用 于治疗与癌症无关的炎症性疾病的方法。在一些实施例中，治疗炎症性疾病包括以必需的 数量以及时间向受试者施用其所需要的治疗有效量的P62多肽或编码p62的核酸，以达到预 期的效果。在本发明的某些实施例中，靶向微粒的"治疗有效量"是指用于对炎症性疾病的 一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生、抑制发展、降低严重性和/或 降低发病率的有效量。
[0110] 本发明的一个方面，提供了一种向患有炎症性疾病或复发的受试者施用P62多肽 或编码P62的核酸的方法。在一些实施例中，以达到预期的效果（即炎症性疾病的治疗)所需 的数量以及时间施用P62多肽或编码p62的核酸给受试者。在本发明的某些实施方式中，p62 多肽或编码P62核酸的"治疗有效量"是指对于炎症性疾病的一个或多个症状或特征治疗、 减轻、改善、缓解、延缓发生、抑制发展、降低严重性和/或降低发病率的有效量。在一些实施 方式中，施用本发明的P62多肽或编码p62的核酸给之前进行了炎症性疾病治疗的受试者。 在一些实施方式中，施用本发明的P62多肽或编码p62的核酸给具有炎症性疾病家族病史的 受试者。在一些实施例中，施用本发明的P62多肽或编码p62的核酸给具有炎症性疾病易感 性的受试者。例如，有炎症性疾病遗传倾向的受试者(ALS、帕金森症、亨廷顿病），或受环境 因素引起炎症性疾病的受试者(例如烟草烟雾、石棉、石英颗粒）。对ALS的遗传易感性与过 氧化物歧化酶或TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的基因突变有关。帕金森症遗传易感性与 parkin以及突触核蛋白基因有关。亨廷顿病遗传易感性与亨廷顿基因突变有关(Glass， C.K.，K.Saijo等，（2010)."Mechanisms Underlying Inflammation in Neurodegeneration· "Cell，140(6) :918-934)。烟草烟雾、石棉、石英颗粒都是众所周知的 慢性炎症的诱导物，如同持续的过敏原以及粗大的外源性颗粒;它们会导致慢性阻塞性肺 疾病，石棉肺以及??夕肺（Medzhitov 2010，Inflammation 2010:New Adventures of an Old Flame.Celia40:771-776)〇
[0111]在一些实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对炎症性疾病、 失调和/或状况的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑 制发展、降低严重性和/或降低发病率。在一些实施方式中，所述炎症性疾病、失调和/或状 况与癌症无关。这样的疾病包括，但不限于，骨质疏松症、肥胖症、代谢综合征、2型糖尿病、 脂肪肝、炎症性肠病、胃炎、慢性胰腺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病（⑶PD)、类风湿性关节炎 (RA)、骨性关节炎、多发性硬化症(MS)、银肩病、充血性心力衰竭(CHF)、动脉粥样硬化、神经 退行性疾病(ALS、帕金森、阿尔兹海默症、亨廷顿病）、痛风、石棉肺以及矽肺。
[0112]在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对骨质疏松症的一个 或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/ 或降低发病率。骨质疏松症是与骨质流失相关的最常见的骨的疾病，并且其主要影响绝经 的女性。绝经导致雌激素水平下降，因此对啮齿类动物的卵巢切除导致雌激素生成的停止 是骨质疏松症最常见的模型。绝经后期的特点为诸如IL-6、TNF_a以及IL-1邱勺细胞因子的 升高，并且在卵巢切除的情况下相同的细胞因子升高。TNF和IL-1在破骨细胞中具有强有力 的抗凋亡效果，延长0C的寿命，加速骨质吸收，并抑制骨形成，TNF-alpha和IL-lbeta的阻断 防止由于雌激素缺乏导致的骨质疏松症（Mundy著，2007，Osteoporosis and Inflammation.Nutrition Reviews 65:S147-S151;Lence1与Magne著，2011， Inflammaging:The driving force in osteoporosis?Medical Hypotheses 76:317- 321)〇
[0113]在实施方式中，根据本发明的P62多肽或编码p62的核酸可以对肥胖症、2型糖尿病 以及脂肪肝的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发 展、降低严重性和/或降低发病率。肥胖症在人群中越来越普遍并且与胰岛素耐受性的发展 密切相关，胰岛素耐受性是2型糖尿病(T2D)与代谢综合征的基本特征。胰岛素耐受性被认 为是代谢综合征的整体特征，其包括糖耐量异常、胰岛素耐受性、肥胖、高甘油三酯血症、低 HDL胆固醇、高血压以及加速性动脉粥样硬化。越来越多的证据表明慢性、亚急性炎症状态 与肥胖的发展以及胰岛素耐受性、T2D以及代谢综合征之间的联系。作为许多啮齿类动物肥 胖模型的结果，促炎细胞因子TNF-α已被证明能够调解胰岛素耐受性。在小鼠和人类的肥胖 实验模型中，除了TNF-α，各种其他的炎症介质和细胞因子也在脂肪和其他组织中过表达。 促炎细胞因子可能会导致胰岛素耐受性，并且抗炎药剂可能会逆转，这表明炎症可能直接 参与其中（Hotamisligil，2006，Inflammation and metabolic disorders. Nature, 444: 860-867)〇
[0114] 非酒精性脂肪肝(NAFLD)是公认的肝脏代谢综合征的表现，其特点是脂肪浸润积 累影响>5%的肝脏。NAFLD的临床意义是由其潜在发展为脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝 硬化，并在一些情况下发展为肝细胞癌所衍生。NAFLD的患病率与肥胖率一并呈上升趋势， 该全球性行趋势归因为西方生活方式的饮食。NAFLD的发病机制尚不明确，但被认为是一个 "二次打击"过程。第一次"打击"导致脂质积累和脂肪变性。这种脂质蓄积的机制尚不清楚， 但可能涉及脂质代谢失调，其包括β氧化、极低密度脂蛋白的分泌，脂肪重新生成以及脂质 转运和储存。肝性脂肪变性使得肝脏被"第二次打击"，导致导致炎症、脂肪肝的重要病理生 理特征以及肝脏疾病发展（Renaud等，Effect of Diet on Expression of Genes Involved in Lipid Metabolism,Oxidative Stress, and Inflammation in Mouse Liver-Insights into Mechanisms of Hepatic Steatosis.PLoS 0NE，9:e88584)〇
[0115] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对IBD(包括但不限于 溃疡性结肠炎与克罗恩氏病)的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发 生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或降低发病率。炎症性肠病(IBD)是一种慢性炎症性胃 肠道疾病。IBD的例子包括溃疡性结肠炎以及克罗恩氏病。大量来自人类遗传研究和临床 IBD模型的证据表明，粘膜上皮层或免疫系统不能与管腔微生物群落适当地相互作用的缺 陷可能构成致病过程的基础。IBD也是结肠癌发展的重要危险因素，其中炎性细胞因子 TNFa、白细胞介素 1、IL-6 起着重要的作用（Danese and Mantovani，2010，Inflammatory bowel disease and intestinal cancer:a paradigm of the Yin-Yang interplay between inflammation and cancer.Oncogene，29:3313-3323)〇
[0116] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对哮喘的一个或多个 症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或降低 发病率。炎症性肠病（IBD)是一种慢性炎症性胃肠道疾病。哮喘是气道炎症性疾病，导致气 道的高反应性、阻塞、产生粘液过多以及气道壁重塑。一般认为哮喘是典型Th2疾病，伴随着 增加 IgE和气道中嗜酸性粒细胞性炎症。新产生的Th2细胞因子调节气道炎症，导致气道重 塑。然而，在临床试验中，因为意识到设计用于抑制Th2功能的策略在临床试验中不能对所 有患者都有效，所以已怀疑相对简单的范例（（K u d 〇等，2 0 1 3，P a t h ο 1 〇 g y 〇 f asthma.Frontiers in Microbiology 4:263)。
[0117] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对C0PD(慢性阻塞性 肺病)的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降 低严重性和/或降低发病率。C0PD与主要影响肺实质与外周气道的慢性炎症相关，并且在很 大程度上导致不可逆且进行性的气流限制。这种炎症的特点是增加从循环系统中吸收肺泡 巨噬细胞、嗜中性粒细胞以及T淋巴细胞的数量。氧化应激在引发这种炎症中起着关键的作 用。肺部炎症可能促进肺癌的发生和发展。外周炎症延伸至血液循环，导致具有相同炎症蛋 白的全身炎症反应。全身性炎症可能会加重病情。因此，肺部炎症的治疗可能具有有益的作 用（Barnes 2014,Cellular and Molecular Mechanisms of Chronic Obstructive Pulmonary Disease.Clinics in Chest Medicine，35:71_86)〇
[0118] 在实施方式中，根据本发明的P62多肽或编码p62的核酸可以对类风湿性关节炎 (RA)的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降 低严重性和/或降低发病率。RA是一种慢性、炎症性、全身性自身免疫性疾病，其影响西方国 家总人口的约1 %，并且女性比男性常见两到三倍。虽然类风湿性关节炎的病因和发病机制 尚不完全清楚，这种疾病的特点是侵略性的滑膜增生(血管翳形成）以及炎症(滑膜炎），如 果不及时治疗，会导致关节软骨和骨的渐进性破坏。破坏性病变来于免疫反应以及非抗原 特异性先天炎性过程。
[0119]在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对骨关节炎(0A)的一 个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性 和/或降低发病率，骨关节炎是一种在全世界范围内影响数百万人的关节疾病。主要涉及活 动关节的该疾病是慢性的并且几十年间发展缓慢。已广泛接受滑膜炎症在骨性关节炎病理 生理学中的作用。一直认为滑膜炎继发于软骨变化，而研究表明滑膜炎症可为导致0A的临 床阶段的早期事件的一部分。滑膜炎导致促炎细胞因子和其他几种炎症介质的产生和释 放。其中的一些因子，包括促炎细胞因子，通过滑膜液扩散到软骨，其中，它们通过自动以及 旁分泌机制激活软骨细胞的代谢因子的生产。
[0120]在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对多发性硬化症(MS) 的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严 重性和/或降低发病率。MS的特点为CNS中的炎症、脱髓鞘以及轴突变性。患者常被MS相关并 发症所困扰，如慢性疼痛、疲劳、抑郁、睡眠障碍、痉挛、步态协调失衡、偏头痛、感觉器官功 能障碍以及整体认知功能损害（Damal等，2013,0ptimizing therapeutics in the management of patients with multiple sclerosis:a review of drug efficacy, dosing，and mechanisms of action.Biologies药剂，7:247-258)。这种病理来自于免疫系 统中的一个主要缺陷，其以髓鞘的组件为目标，导致对神经元的二次影响。认为MS是一种以 CNS中的炎性脱髓鞘病变的存在为特征的免疫介导性疾病。由细菌或病毒感染或其他环境 刺激所引发的多发性硬化症(MS)中的小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，导致通过转录因 子NF-kappa-B和AP-1生产促炎细胞因子（Luessi等，2012,Neurodegeneration in multiple sclerosis:novel treatment strategies.Expert Rev Neurother,12:1061-1076) 〇
[0121] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对动脉粥样硬化的一 个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性 和/或降低发病率。动脉粥样硬化与包括类风湿关节炎的传统的炎症性疾病具有相同特征。 动脉粥样硬化是引起冠状动脉及脑血管疾病的主要原因，是世界范围内死亡的主要原因。 认为动脉粥样硬化起始于血管内皮功能障碍的发展，该障碍是由系统性危险因素和局部血 流动力学的血管壁暴露所引发。随后的内皮细胞活化促进了血管壁的炎性细胞的积累。作 为动脉粥样硬化的进展，炎症细胞产生细胞因子和生长因子，其引发平滑肌细胞迀移到内 膜。内膜结构的深刻变化导致两个室病变、纤维帽以及坏死核心的形成。炎性细胞也可产生 基质降解酶，破坏完整的纤维帽或凝血分子如组织因子，最终导致斑块破裂和血栓形成 (Cole等，2011，Toll_like receptors in atherosclerosis:a^Pandora's box〃advances and controversies.Trends in Pharmacological Sciences，34:629-636)〇
[0122] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对胃炎的一个或多个 症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或降低 发病率。胃炎的原因是幽门螺杆菌定殖胃黏膜而引起的慢性炎症，其特征为多种炎症基因 的增强表达。
[0123] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对慢性胰腺炎(CP)的 一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重 性和/或降低发病率。慢性胰腺炎(CP)是涉及胰腺实质纤维组织的炎性疾病，其中胰腺实质 逐渐被破坏且被纤维组织所取代。在组织结构上，可以观察到腺泡细胞损伤、单核细胞浸润 以及纤维化。有各种原因可能导致CP，但仍然不清楚确切的病理生理学。
[0124] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对银肩病的一个或多 个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或降 低发病率。银肩病是一种慢性炎症性皮肤病，其通常导致红色和银色的鳞片状斑块的发生； 其大约影响2~3%的总人口。尽管尚不完全清楚其发病机制，在众多的免疫效应细胞和异 常增生以及表皮角质形成细胞分化之间存在潜在的相互作用。它是由TH1促炎细胞因子如 TNF-a、IFN-y、IL-6以及IL-12介导的免疫失调的原型（Goldminz等，2012，NF-kappB:An essential transcription factor in psoriasis.Journal of Dermatological Science，69:89-94)〇
[0125] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对充血性心力衰竭 (CHF)的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降 低严重性和/或降低发病率。在西方国家，CHF是导致住院和死亡的主要原因。其患病率随着 规范化的以证据为基础的心力衰竭治疗方法的广泛实施而大幅提高。心脏衰竭综合征的特 征是收缩压和/或舒张功能以及各种临床症状如疲劳、呼吸困难、受损的液体潴留以及恶病 质。已经长期认识到CHF患者的炎症性激活。事实上，免疫机制调节间质纤维化、心肌细胞凋 亡及肥大，所有这一切都是中枢调节导致的应对各种刺激适应不良的重塑。特别是对于大 心肌梗死后心力衰竭的发展，对于早期免疫在疾病过程中的贡献具有确切的证据。在多个 临床试验中已经监测到系统性细胞因子。已收集到肿瘤坏死因子a(TNF-a)最广泛的数据， 其证明与不同的临床和实验室参数良好的相关性，如运动能力和CHF患者神经内分泌激活。
[0126] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对神经退行性疾病的 一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重 性和/或降低发病率。在实施方式中，根据本发明的P62多肽或编码p62的核酸可以对于阿尔 茨海默症(AD)的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制 发展、降低严重性和/或降低发病率。AD是老年人最常见的一种痴呆形式，导致了一系列认 知功能，包括短期记忆的逐渐下降。AD的特征是两种特征性病变的形成:细胞外β淀粉样蛋 白沉积形成的老年斑以及由微管相关蛋白τ形成的细胞内神经原纤维缠结。与炎症之间强 大的联系，主要是介导的促炎细胞因子，且AD已建立在临床数据和实验室研究的基础上。最 近的研究结果还表明，AD可以与更广泛的炎症状态有关，炎症的特点是增加外周血中IL-1、 IL_6、TNF-a、TNF-0 以及 IL-18 的水平（Smith等，2012, Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Res Bull，87:10-20)〇
[0127] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对帕金森症(PD)的一 个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性 和/或降低发病率。ro是最常见的神经退行性运动障碍，并且它是由于多巴胺能神经元从通 常支配纹状体的黑质致密部中逐渐丧失而引起。PD的病理特征为α突触核蛋白的细胞内积 累，导致路易氏小体的形成。ro可能导致许多不同的症状包括静止性震颤、运动迟缓和姿势 不稳以及齿轮样强直。一些研究的流行病学调查结果表明，炎症可能参与了帕金森症的发 病机制。这也被一部分ro患者的脑脊液事后分析以及促炎细胞因子的脑显示蛋白水平升高 所支持（Smith 等，2012，Role of pro inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases.Brain Res Bull，87:10-20)〇
[0128] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码的p62核酸可以对肌萎缩侧索硬化症 (ALS)或卢伽雷氏病的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生（预 防）、抑制发展、降低严重性和/或降低发病率。ALS是一种渐进的致命的神经退行性疾病，影 响脑干、脊髓和运动皮层的运动神经元。ALS普遍是致命的，其发病的平均年龄为55岁并且 症状发作后生存2~5年。显著的神经性炎症能够轻易地在来自该病的人类ALS患者以及小 鼠模型的CNS以及脊髓的病变影响区域被观察到。通常情况下，ALS的炎症反应的特点是胶 质细胞增生和大量活化的小胶质细胞和星形胶质细胞的积累。ALS中的胶质细胞的活化已 被广泛地特征化，并被标识为诸如R0S的细胞毒性分子，诸如C0X-2的炎症介质以及诸如IL-lbeta、TNF-alpha以及IL-6的促炎症细胞因子的潜在地增加的产生（Smith等，2012，Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases.Brain Res Bull，87:10-20)。
[0129] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对亨廷顿病的一个或 多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或 降低发病率。亨廷顿病(HD)的特点是在首次病症出现直至死亡15~20年的一个渐进的病 程，并且其由在亨廷顿(htt)蛋白中的扩大的CAG重复序列突变引起。在纹状体中的突变htt (mhtt)是神经退行性疾病的主要原因。无论是先天免疫还是适应性免疫系统均可在HD中发 挥重要的作用。小胶质细胞的激活与促炎细胞因子的表达、受损的巨噬细胞的迀移、和沉积 在纹状体的补体因子表明先天免疫系统的激活(Ellrichmann等，2013.The Role of the Immune System in Huntington's Disease.Clinical and Developmental Immunology, 2013:11) JFkB介导的星形胶质细胞炎症反应的增强有助于HD的发病机理(Hsiao等，2013， A critical role of astrocyte-mediated nuclear factor-kB-dependent inflammation in Huntington's disease.Human Molecular Genetics，22:1826-1842)〇
[0130] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对抑郁症或精神分裂 症的一个或多个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低 严重性和/或降低发病率。抑郁症与慢性低级别炎症反应、细胞介导的免疫激活以及代偿性 抗炎反射系统(CIRS)的激活有关，其特征为负向免疫调节过程。超过100项研究的荟萃分析 提供了在体内的证据表明，精神分裂症可以部分解释为一种炎症性失衡。
[0131]在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对石棉肺的一个或多 个症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或降 低发病率。石棉肺是一种慢性炎症，并且是由于石棉纤维的吸入和保留而引起的影响肺实 质组织的纤维化病情。它通常发生在高强度和/或长期暴露于石棉(特别是对那些工作在生 产或最终使用含有石棉的产品）后，因此被视为一种职业性肺部疾病。患者可能会遇到严重 的呼吸困难(呼吸急促），并对包括肺癌的某些恶性肿瘤的风险增加，特别是间皮瘤。石棉肺 具体指由于石棉引起的间质（实质)纤维化，而非胸膜纤维化或蚀斑。石棉肺的主要症状一 般是呼吸困难起病缓慢，特别是在出力时。临床上石棉肺晚期病例可能会导致呼吸衰竭。发 现于石棉肺的肺功能特点为限制性通气障碍。更严重的情况下，由于肺部的硬化和减少的 TLC导致的肺功能的急剧减少可能引起右侧心力衰竭(肺心病）。除了限制性缺陷，石棉可能 引起扩散能力减少以及低氧血症。
[0132] 在实施方式中，根据本发明的p62多肽或编码p62的核酸可以对矽肺的一个或多个 症状或特征进行治疗、减轻、改善、缓解、延缓发生(预防）、抑制发展、降低严重性和/或降低 发病率。矽肺（以前为矿工的肺结核、研磨工的哮喘、陶工的腐烂以及其他职业相关的名称） 是由吸入结晶二氧化硅粉尘所引起的职业性肺部疾病，并且其特点为在肺的上肺叶部结节 性病变形式的炎症和瘢痕。其是一种尘肺病。矽肺病(尤其是急性型）的特点是气短、咳嗽、 发热、发绀(蓝皮）。迹象和症状包括：呼吸困难、咳嗽、疲劳、呼吸急促、食欲减退和体重下 降、胸痛以及发热。在晚期的情况下，症状可能包括发绀、肺心病以及呼吸功能不全。矽肺患 者特别容易受到结核病(TB)的感染，被称为矽肺结核。矽肺的肺并发症还包括慢性支气管 炎和气流受限(与由吸烟引起没什么区别）、非结核分枝杆菌感染、真菌感染、代偿性肺气肿 以及气胸。有一些数据揭示矽肺和某些自身免疫性疾病之间的关联，这些疾病包括肾炎、硬 皮病、系统性红斑狼疮，尤其是对于急性或急进型矽肺。
[0133] 本发明的方法还包括对受试者施用一种或多种抗炎疗法。抗炎化疗药剂是任何减 少炎症的化学实体或药剂。抗炎药剂化学治疗剂包括，但不限于，非留体类抗炎药(NSAID)、 糖皮质激素、甲氨蝶呤、环孢素、雷帕霉素。NSAID为环氧化酶抑制剂。NSAID的例子包括阿司 匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、恶丙嗪。糖皮质激素是一 类与糖皮质激素受体结合的类固醇激素。甲氨蝶呤是一种抑制叶酸代谢的化学模拟物。环 孢霉素及雷帕霉素，它是抗排斥药剂，具有抗发炎的特性。
[0134] 抗炎生物制剂为任何一种减轻炎症的天然存在的生物实体。抗炎生物制剂包括， 但不限于，抗TNF抗体、抗IL1抗体、抗IL6抗体、抗IL6受体抗体、抗IL12/23抗体、抗IL17抗 体、抗IL1R抗体、抗IL1受体拮抗剂以及可溶性IL -1受体。
[0135] 此处所描述的化合物和组合物可以作为药剂或与药学上可接受的载体配制的药 剂而进行给药。因此，该化合物和组合物可用于制备药剂或药剂组合物。本发明的药剂组合 物可以配制成用于肠胃外给药的溶液或冻干粉。粉可通过在使用前加入适当的稀释剂或其 他药学上可接受的载体而再构成。液体制剂可以为缓冲的、等渗的水溶液。粉末也可以以干 燥的形式被喷雾。合适的稀释剂的例子是普通的等渗盐水、5%标准葡萄糖水、缓冲醋酸钠 或醋酸铵溶液。这样的制剂特别适合胃肠外给药，但也可以用于口服或包含在计量吸入器 或吹入法的喷雾器中。其可能需要添加赋形剂，如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉 伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、柠檬酸钠等。
[0136] 另外，化合物可以被封装，压片或制备为乳液或糖浆口服。可以添加药用可接受固 体或液体载体以增强或稳定组合物，或方便组合物的制备。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸 钙、石膏粉、硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、果胶、树胶、琼脂或明胶。液体载体包括糖浆、花生 油、橄榄油、盐水和水。载体还包括缓释材料如单硬脂酸甘油酯或甘油硬脂酸，单独或与蜡 混合。固体载体的量可变化，但是优选为每剂量单位约20mg至约lg。根据药业常规技术制备 药剂，对于片剂形式，包括研磨、混合、制粒以及需要时压缩;或者对于硬明胶胶囊的形式， 研磨、混合并填充。当采用液体载体时，制剂可为糖浆、酏剂、乳剂、水性或非水性悬浮液的 形式。对于直肠给药，本发明的化合物可结合赋形剂，如可可脂、甘油、明胶、聚乙二醇，并且 模压成栓剂。
[0137] 化合物或组合物可配制为包括其他药剂的医疗有用的药剂或生物制剂。所述化合 物或组合物也可以与用于本发明的化合物或组合物针对的疾病或症状的其他药剂或生物 制剂的药剂的联合用药。
[0138] 如此处所使用的，短语"有效的量"是指剂量足以提供足够高的浓度，以给予其接 受者有利效果。对于任何特定受试者的具体的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括 被治疗的疾病、疾病的严重程度、具体化合物或组合物的活性、给药途径、化合物或组合物 的清除率、治疗持续时间、与化合物或组合物联合或一同使用的药剂、年龄、体重、性别、饮 食以及受试者的一般健康情况，以及在医学和科学领域上公知的因素。本领域技术人员所 公知在确定"治疗有效量时通常考虑的各种事项，并且描述于，例如，在Gilman等著， Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics ,8th ed., Pergamon Press ,1990；and Remington's Pharmaceutical Sciences ,17th ed.,Mack Publishing Co. ,Easton,Pa.。剂量水平通常在约0.001mg/kg/天至100mg/kg/天的范围内 下降;通常使用约〇. 〇 5mg/kg/天至1 Omg/kg/天的范围的水平。化合物可胃肠外给药，如血管 内、静脉、动脉内、肌肉注射、皮下注射等。给药也可以通过口服、经鼻、直肠施用、经皮、经阴 道或通过雾化吸入。化合物或组合物可以施用于炎症相关的病变。化合物或组合物可采用 大丸药，或缓慢注入施用，或是作为一种皮内，皮下或肌肉注射或腹腔注射给药。
[0139] 可以通过测定引入编码p62的DNA或RNA到细胞中时p62表达水平而由细胞培养实 验初步估计治疗有效剂量。然后，可以在动物模型中验证剂量，以实现抑制炎性细胞因子的 产生和/或减轻炎症。这样的信息可以用来更准确地确定对于人类有效的初始剂量。医学专 业人员可以依据受试者的表现选择精确的配方、给药途径以及剂量。
[0140] 实施例
[0141] 实施例1
[0142] 材料与方法
[0143] 构建载体
[0144] 作为编码p62的cDNA的来源，从HeLa细胞中提取总RNAJCI^HotStar Hifidelity 聚合酶试剂盒试剂盒)扩增编码P62的较长亚型（转录变异体l，GenBank编号NP_003891)的 全长cDNA，该PCR使用下列引物：FW: 5-CCCGCTAGCATGGCGTCGCTCACCGTG-3及REV : 5 ' -CCCAAGCTTTCACAACGGCGGGGGATGCTTTG-3'。纯化PCR产物，具有相应于pcDNA3.1 的核酸序列 的Nhe I-Hind III酶切片段克隆到DNA载体中，生成p62质粒。全长卵清蛋白基因（pOVA)克 隆到PCDNA3.1作为对照。通过常规碱性裂解进行无内毒素质粒的大规模制备，使用无内毒 素质粒提取试剂盒（Qiagen)或Gen Elute HPSelect Plasmid Giga Prep柱（SIGMA# NA0800)。测序确定所述DNA结构。
[0145] 动物及处理
[0146] 使用三月龄雌性FVB和BALB/c小鼠 （Harlan Italy SrL，Correzzana Milano，意大 利）。小鼠保持在标准化的环境条件下的层流架内。在预防试验中小鼠被随机分为三组(G1 ~G3)，并且在第0、1、2周肌内注射生理盐水(61，11=12)、？〇0嫩3.1(62，11=12)或者1^620嫩 (G3，n=12)。在第四十五天的最后一次注射后，将每组小鼠随机分为两个亚组，分别进行假 手术(S0;n = 6)或去卵巢(OVX n = 6)。两个月后根据意大利伦理委员会的建议，用C02麻醉 处死小鼠。治疗去卵巢(OVX)的实验小鼠并且放置未治疗的2个月。随后，将小鼠随机分为4 个亚组，并注入上述的质粒。2个月后处死小鼠进行分析。
[0147] 骨组织学分析和免疫莹光分析
[0148] 剥离粘连组织的股骨固定于4%多聚甲醛(PFA)中24h，在14%EDTA中脱钙3天，然 后过夜浸泡在30%鹿糖中。通过旋转-30°C切片机的低温恒温器(Ames Cryostat Miles)切 片Tissue-Tek OCT化合物包埋的样本(8μπι厚的部分），并用甲苯胺蓝染色。用以l:800(Enzo Life Science;Vinci_Biochem s.r. 1.，佛罗伦萨、意大利)稀释的兔抗-P62以1:400稀释培 养用0.3 % Triton X-100渗透的其他部分。冲洗后，切片，与以1:100稀释的鸡抗兔IgG Alexa Fluor 488共同孵化(分子探针；Invitrogen，米兰，意大利）。通过省略合适的一抗或 者通过用相对阻断肽络合一抗体进行对照实验。使用徕卡的DM2500荧光显微镜拍摄的幻灯 片。采用焚光计Tecan Infinite[29]进行焚光分析。
[0149] 体外双能X线吸收测量(DXA)分析
[0150] 如上述，解剖和固定股骨。使用piximus DEXA测定骨密度（BMD)和骨矿物含量 (BMC)〇
[0151] 骨髓干细胞(BMSC)的制备
[0152] 解剖来自小鼠组的长骨(股骨、胫骨和肱骨），去除附着组织。去除两端，冲洗骨髓 腔并在DMEM中培养。
[0153] 细胞因子和趋化因子分析
[0154] 根据生产商的说明，使用Mouse Cytokine Array Panel A试剂盒（R&D Systems， 米兰，意大利），通过基于酶联免疫吸附的细胞因子阵列测定BMSC上清液的概况。通过使用 LiteAblot Turbo鲁米诺试剂（Euroclone，米兰，意大利）以及Hyperfi lm-ECL胶片 (Euroclone，米兰，意大利)和定量密度可视化免疫反应性。
[0155] 免疫印迹
[0156] 在冲洗骨髓腔后，立即在细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Euroclone，米兰，意 大利）中提取总骨髓细胞群的蛋白，并且通过BCA蛋白浓度测定试剂(Pierce，Euroclone，米 兰，意大利)测定浓度。用标准方法进行免疫印迹分析。
[0157] 统计分析
[0158] 所有在体外和体内实验重复至少三次。t检验用于检验在两组之间的显著性差异， 并认为*P〈〇. 05为显著性差异。
[0159] 实施例2
[0160] p62疫苗在小鼠模型中预防骨质疏松症
[0161]评估p62疫苗是否能够预防骨质疏松症，每组小鼠首先注射p62DNA或对照质粒 (pcDNA 3.1，p0VA)，之后去卵巢(0VX)。每一个试验包括假手术(S0)对照组小鼠。术后2个月 处死小鼠，组织学检查收集的长骨。来自PCDNA3.1-0VX(对照）组小鼠的股骨远端干骺端区 域表现出具有显著的骨丢失和稀疏的断开的小梁结构为特征的骨质疏松性特征。另一方 面，P62-0VX骨(处理过的小鼠）相比S0小鼠在微架构的表现上本质上是没有区别的。此外， 来自P62DNA-0VX小鼠的股骨骨干中段横截面检验显示(与那些获得自对照质粒处理的小鼠 不一致)增强成骨细胞活性，如新的皮层骨沉积表明P62处理的合成代谢作用所证明。
[0162] 从骨腔中冲洗BMC，并培养3天。之后，分别收集和分析上清和细胞，用于炎症性细 胞因子的释放或用于表达成骨细胞标记物。如图4所示，与S0处理的小鼠相比，0VX的BMC对 促炎细胞因子的明显上调以及释放被P62-DNA预处理显著抑制。p62DNA的抑制效应扩展到 细胞因子的阵列，如TNFa、IL-6、IL-lb、IL-17，已知这些是炎症性疾病与骨流失的必要的诱 导物。至于P62DNA能够诱导新骨形成方面，p62-0VX BMC提取物的免疫印迹分析表明成骨细 胞标记的强大的和有选择性的增加，如Runx2和Osterix转录因子。Runx2和Osterix的增加 虽然较弱，也同样在P62S0小鼠中发现（图5)。
[0163] 因此，P62质粒给药在小鼠模型中可预防骨质疏松症。
[0164] 实施例3
[0165] p62疫苗在小鼠模型中逆转骨质疏松症
[0166] 在这些试验中，小鼠被去卵巢，两个月后，注射p62-DNA或对照质粒(详见M&M)。在 最后一次质粒注射后两个月，对骨骼进行收集和组织学评价。〇VX-p62处理组小鼠（相比于 对照组)表现出在股骨远端的干骺端区域恢复了小梁微结构区域以及皮质骨的孔隙率下 降。此外，如通过DXA分析判断，证明了p62-DNA治疗提高了骨密度(BMD)和含量(BMC)(图6)。 最后，伴随破骨Runx2和Osterix的明显上调（图7A)，同样在0VX-p62小鼠的BMC中观察到两 种主要的骨吸收的因子如TNFa和RANKL的强抑制作用。RANKL是炎症的重要的调节子，通过 结合破骨细胞前体细胞的受体RANK，促进破骨细胞通过细胞内NF-κΒ发出信号。也观察到 0VX-P62 BMC中NF-kappa-B的下调（图7B)。因此，p62给药在小鼠模型中逆转了骨质疏松症。
[0167] 实施例4
[0168] p62疫苗在小鼠模型中上调内源性p62
[0169] 去卵巢前，测定从注射质粒的小鼠中获得的BMC中的p62的表达水平。令人惊讶的 是，虽然P62由于去卵巢在BMC中的表达下调，但是来自预注射p62DNA的小鼠显示p62的上调 (图8A)。一致地，在p62-0VX小鼠股骨骨骺部位观察到p62免疫标记的增加（图8B)。
[0170] 免疫印迹分析可以区分人类(外源性)和鼠（内源性）的p62。如图8C所示，p62DNA给 药上调了骨髓细胞中内源性P62蛋白。因此，p62质粒给药提高了小鼠模型的内源性p62水 平。
[0171] 实施例5
[0172] P62给药减少了小鼠模型中的肌萎缩侧索硬化症(ALS)的症状
[0173] 图9展示了p62对ALS小鼠模型的影响。炎症反应是ALS患者脊髓突出的病理特征， 其特点是胶质细胞的活化和T细胞浸润。类似的炎症反应存在于ALS小鼠脊髓中。这是S0D的 ALS表达G93A突变形式的最常用的小鼠模型，这是产生于一个人类ALS患者的相同突变，该 模型被广泛用于对ALS的药剂测试。小鼠自出生75天后（每组6只小鼠）开始用p62质粒或 pcDNA 3.1质粒治疗(每周6次150微克/小鼠皮下注射)，并且应用ALS标准测试(下肢伸展反 射）。当动物被尾吊时这种反射评价后肢完全伸展的能力。没有ALS，对照和p62治疗的小鼠 表现出很强的反射，60天龄后其开始在ALS小鼠中下降，并在100天从100 %下降至0。然而， P62治疗则明显延缓反射的下降。因此，p62质粒给药在小鼠模型中减少与ALS相关的症状。
[0174] 实施例6
[0175] p62给药在小鼠模型中降低多发性硬化症(MS)的症状
[0176] MS是一种慢性炎症性疾病，其导致在整个中枢神经系统(CNS)中脱髓鞘和轴突损 失，由于起因不明且只有有限的治疗选择(Noseworthy，J.H.，C.Lucchinetti等，（2000)〃 Multiple sclerosis."N Engl J Med 343(13):938-52.;Lassmann等，2001" Heterogeneity of multiple sclerosis pathogenesis: implications for diagnosis and therapy. "Trends Mol Med，7(3):115-21)。对于MS研究最常用的动物模型为小鼠实验 性变应性脑脊髓炎(EAE )，其由给药M0G多肽引起。这种模式在炎症阶段（即自身反应性髓鞘 特异T细胞的生成）以及疾病的神经退行性阶段(即轴突周围髓鞘的破坏以及其随后轴突的 损失）类似，如在人类疾病中所观察到（Steinman, 2001，"Multiple sclerosis : a two-stage disease · 〃Nat Immunol，2(9): 762-4.)。图10显不了rMOG诱导EAE症状的平均临床评 分。每天检查小鼠（每组4只）的EAE临床症状并评分如下:0、无病；1、尾巴柔软;2、后肢无力； 3、后肢完全瘫痪;4、后肢加前肢瘫痪麻痹;5、垂死或死亡。在第0天M0G免疫。在M0G免疫后的 第16和22天注入p62DNA(10〇 yg/5〇yl)，如红色箭头所示。可以看到，直至观察结束(第31天） 对照小鼠反而具有更高的EAE分数，接收p62质粒治疗的小鼠的这一分数逐渐下降（至31天 时约为0.5)。因此，p62质粒给药缓解了MS小鼠模型中MS类似症状。
[0177] 实施例7
[0178] p 62给药对肿瘤生长以及小鼠的存活
[0179]慢性炎症参与肉瘤的发病机制，特别是卡波西肉瘤(Douglas JL，2010，〃Kap〇si Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection,Oncogenesis and Chronic Inflammation. "Transl Biomed，1 (2)。小鼠中的可移植性肉瘤37用于研究p62疫苗对肿瘤 生长的影响。在肿瘤接种14、7天前，1、8、14天后，小鼠（每组6只）分别肌肉注射p62质粒和空 载体(每只250yg)，并且用游标尺监测肿瘤接种和生长。p 62质粒注射几乎可以完全阻止肉 瘤37的生长。因此，p62质粒给药减缓小鼠 S37肉瘤生长。
[0180] 慢性炎症伴随乳腺癌，并且IL-6提高的水平是不良的预后因素，Lippitz，B.E. (2013)〇〃Cytokine patterns in patients with cancer:a systematic review.^The Lancet Oncology 14(6) :e218-e228。乳腺癌的具体形式，IBC(炎性乳腺癌)是最具侵略性 且具有较差的预后（Fernandez，Robertson等，2013，''Inflammatory breast cancer(IBC): clues for targeted therapies·''Breast Cancer Research and Treatment，140(1):23-33)。为了研究P62接种对ca755乳腺癌小鼠存活的影响，用p62多核苷酸处理小鼠并对他们 的生存进行了监测。无论是在快速生长和缓慢生长的肿瘤中，P62治疗提高了小鼠的平均存 活率56% (从25至39天）（图12)。
[0181] 实施例8
[0182] P62多核苷酸给药对肿瘤转移的影响
[0183] LLC是广泛使用的转移性肺癌模型:在小鼠的侧腹部进行肿瘤细胞的皮下接种后， 它们在3周内即可形成轻易数出的肺部的转移瘤。p62多核苷酸治疗的小鼠显著抑制了小的 和大的转移的形成，从而有效阻断转移过程（图13)。因此，在小鼠模型中给药p62质粒可抑 制肺癌。
[0184] 静脉注射(尾静脉)B16黑色素瘤细胞，从而模仿临床情况，其中诊断癌时肿瘤细胞 已经在血流中存在。肿瘤细胞形成可以被检测并计数的肺部的转移。在肿瘤细胞接种后的 1、8、15天注入p62多核苷酸。如图14所示，p62多核苷酸治疗显著降低了转移性肿瘤的数量 和大小，从而显示出抗转移效果。
[0185] 实施例9
[0186] 肥胖症与代谢综合征
[0?87]三组新出生的雄性小鼠每天接受皮下注射i)无效对照剂或i i)及i i i) 3mg/kg的谷 氨酸钠(MSG)共10天。然后组3接受5周的200ug的p62编码质粒的肌肉注射。测量并比较全部 3组动物的体重。相比对照组，MSG在各组中显著增加了体重(p〈0.01和p〈0.05)。然而，接受 P62质粒组的体重增加明显小于仅接受MSG组。因此，编码p62的质粒给药在小鼠模型中减少 了肥胖症。
[0188] 实施例10
[0189] 2型糖尿病
[0190] 两组朱克糖尿病性脂肪(ZDF)大鼠，其为2型糖尿病的标准模型，饲喂含6.5%脂肪 的饮食。一组接受每周5次的200ug/注射的p62质粒注射，而另一组作为对照组。在对照组中 在8周到10周龄时观察到高血糖，而质粒治疗组平均延迟高血糖三周。因此，在大鼠模型中 给药P62质粒延迟了2型糖尿病的发病。
[0191] 实施例11
[0192] 脂肪肝
[0193] 饲喂两组小鼠 MCD饮食（10%脂肪，40%蔗糖，无胆碱，无蛋氨酸）。每一组包含15只 小鼠。接受此饮食的第10周开始监控丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清浓度水平。实验组接受 每周5次200ug/注射的p62编码质粒肌肉注射。无效对照剂组接收无质粒干预的MCD饮食。对 照组在整个研究期内接受正常饮食且无质粒。接受Μ⑶饮食的两组相比于对照组均显示出 ALT的高水平(对于每组ρ〈0.01)。然而，相比于无效对照剂组，ρ62治疗降低了 ALT水平(ρ〈 0.05)。因此，在小鼠模型中ρ62给药降低了脂肪肝的发病率。
[0194] 实施例12
[0195] 克罗恩氏病
[0196] 小鼠接受含8%葡聚糖硫酸钠（DSS)的饮用水2周。同时，一组小鼠每周5次接受 200ug的编码ρ62质粒的注射，而另一组为对照组(每组10只）。？62治疗的动物表现出血便及 腹泻的减少。此外，每周单独监测一次每一个动物的体重。虽然未能完全地停止，Ρ62抑制了 体重的减少(ρ〈〇.05)。因此，ρ62的给药在小鼠模型中减轻了与克罗恩氏病有关的症状。
[0197] 实施例13
[0198] 胰腺炎
[0199] 以4mg/只LPS以及lmg每只雨蛙肽治疗小鼠10周，每周两次，以诱发胰腺炎。3只小 鼠为对照组，并且这3只每周5次接受200ug/注射的p62疫苗的皮下注射。15周后处死小鼠， 进行组织学分析。P62质粒治疗降低了观察到的慢性胰腺炎的程度。因此，p62质粒给药在小 鼠模型中减轻了胰腺炎。
[0200] 实施例14
[0201] 哮喘
[0202] 对小鼠进行三次1%的卵清蛋白溶液的腹腔注射。每隔14天进行注射。在第3次注 射后的一周，将动物暴露于1%的卵清蛋白气溶胶3天，每天30分钟以诱发类似哮喘的疾病。 在5周期间，一组小鼠接受每周5次的200ug的p62质粒的肌内注射，而另一组保持原状作为 对照。在最后一次暴露后的两天，测量对照组和治疗组测量出气道高反应性(AHR)并对比。 AHR通过冷空气或换气被引发。AHR在p62治疗组中表现显著降低。因此，p62质粒给药在小鼠 模型中减轻了哮喘症状。
[0203] 实施例15
[0204] 关节炎、骨关节炎
[0205] 两组小鼠（每组10只）被注射具有完全佛洛尹德佐剂的II型胶原(CII)以诱发胶原 诱导性关节炎。动物为6周龄以避免能在老年动物中观察到的自发性关节炎。实验组还接受 每周5次200uf的编码p62质粒的注射。在CII攻击后，对照组在30~33周显现出第一个关节 炎的迹象。P62治疗组在CII注射后的38~43周显示出胶原诱导性关节炎。因此，p62质粒给 药在小鼠模型中延缓了胶原诱导性关节炎。
[0206] 实施例16
[0207] 动脉粥样硬化
[0208] ApoE(-/_)小鼠保持高脂饮食8周。对照组不接种疫苗，而实验组接受每周5次 200ug的p62编码质粒注射。质粒治疗降低了动脉粥样硬化斑块面积以及斑块新生血管密 度。其提高了斑块的胶原和弹性蛋白含量，并降低了血浆血管紧张素 II水平和斑块巨噬细 胞浸润和组织蛋白酶S(CatS)蛋白。p62给药还降低了主动脉根部的ATlR、gp91ph〇x、TLR2、 单核细胞趋化蛋白-1的水平。因此，P62质粒给药在小鼠模型中减轻了动脉粥样硬化。
[0209] 实施例17
[0210]帕金森症
[0211]雄性大白鼠通过每周5次200ug/注射的p62编码质粒的注射进行预处理，或者用作 对照组。接下来，通过单侧纹状体注射对实验组和对照组注入6羟基多巴胺，6-OHDA(正常生 理盐水的0.1 %抗坏血酸中的10毫克）以模拟帕金森症。6-OHDA灌注后三周，测试大鼠神经 行为活动(旷场试验和旋转肌协调测试）。使用既未接受质粒也未接受6-OHDA的对照组进行 6-OHDA的效果评估。在大鼠模型中接受p62质粒预治疗显著减轻了由6-OHDA引起的帕金森 类似的表现。
[0212] 实施例18
[0213] 亨廷顿及阿尔茨海默症
[0214] 在小鼠中，去卵巢诱导类似于亨廷顿及阿尔茨海默症的神经退行性变化。对小鼠 进行假手术或去卵巢。将所有手术组分为2个亚组:一个亚组接受p62质粒疫苗接种，另一组 不接受。进行以下一些列行为测试。在每一项测试中我们观察到P62疫苗接种明显减轻了去 卵巢的神经退行性影响，这表明其在阿尔茨海默及亨廷顿病的治疗和/或预防中可以具有 很强的潜力。
[0215]行为测试
[0216] 所有的实验均是按照欧洲共同体对实验动物护理和使用理事会的指令(86/609/ EEC)在光照期进行的。
[0217] 连续四天进行行为测试。在第一天，动物进行整个电池(battery)的感觉测试。在 第二天，进行旷场试验。在第三天，对动物进行Porsolt测试。最终，在最后一天进行迷宫测 试或光/暗测试。
[0218] 测试序列基于不同作者的以前的报告（J 〇 h a n s s ο η等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，美国，2001 7月31;98(16):9407-12以及6加61162-1^〇^等， Eur J Neurosic，2002 8月；16(3): 547-50;Baeza等，J Neuroimmunol 201 0 2月26;219(1_ 2) :90-9)。行为由三个独立的观察员进行评价。进行测试之前对小鼠进行称重，以确保所有 的实验都是以同样的方式进行的。每次测试后，通过清洗仪器的表面去除嗅迹。
[0219] 感觉运动能力
[0220] 视觉定位反射
[0221] 对视觉定位反射进行测试，以评价视觉系统的功能。为了进行定位反应实验，小鼠 的尾部被悬起，并降低到一个坚实的黑色表面。认为完全的前肢扩展被是一个积极的相应。 由三个实验来评价平均反应(Baeza等，2010)。
[0222]后肢伸肌反射
[0223] 之前的试验中评价该反射为在当动物的尾部被悬起进行后肢完全伸展的能力。认 为这种反应是积极的。由三个实验来评价平均反应(Baeza等，2010)。
[0224] 紧绳实验
[0225] 该方法用于评价老龄小鼠的活力缺失，通过测试它们的肌肉活力、运动协调以及 在5s训练实验和60s检测实验的两种实验中的牵引力（Miquel and Blasco，Ex p Gerontol.，1978; 13(6) :389-96以及Baeza等，2010)。小鼠的前肢被悬起在升高的水平钢丝 中间（高40厘米，长60厘米，分为10厘米的段）。以小鼠掉落绳子以及延迟下降（秒）的百分比 评估肌肉活力。运动协调包括小鼠爬行至少1分段的百分比（标准1)以及小鼠完成测试的百 分比(标准2)。通过分析小鼠用于保持悬起的不同的身体部位(前肢、后肢以及尾部)来评价 牵引力，并且随后，在每一组中评估小鼠表现最大(前肢、后肢以及尾部)及最小(仅前肢)牵 引力的百分比。
[0226] 探索性和焦虑状行为试验
[0227] 该组包括用于研究动物抑郁状及焦虑状行为的不同测试:FST、旷场、光/暗以及 EPM测试。
[0228] 强迫游泳测试(FST)
[0229] 强迫游泳实验是公认的用于评估啮齿类动物中抗抑郁活性的最好的药理模型 (Porsolt等，1977a Arch Int Pharmacodyn Ther 229:327-336，Porsolt等，1977b Nature 266:730-732;Willner，1990Pharmacol Ther，45:425_455;Al-Rahbi等，Biomed Res Int·， 2013;2013:493643.doi :10.1155/2013/493643)。习得性无助综合征的发展，当小鼠被放置 在一个充满水的缸体中且它们无法逃出时，表现为持续逃逸行为的停止，可见到静止期的 增加(Lucki，1997Behav Pharmacol，8:523-532)。认为静止的减少是与类抗抑郁作用一致 的行为情况（Cryan 等，2002Trends Pharmacol Sci，23:238_245;Walf and Frye·, 2010Physiol Behav.，2010 2月9;99(2): 169-74;A1-Rahbi等，2013)。简而言之，小鼠被单 独地放置在盛有15cm深水(23 ± 1°C )的玻璃缸(高20厘米，直径14厘米）中。在此水深，老鼠 可以用尾巴触摸缸的底部，而它们不能用它们的后肢支撑自己。每只小鼠被施加6min的游 泳测试，并在测试的最后4min间隔记录下不动的持续时间，由于前2min可以被用来使得动 物熟悉它们的周围环境。所有的游泳测试时间均被位于缸体正上方的摄像机记录。两位经 验丰富的观察者(他们并不清楚治疗条件)对录像带进行评分。静止期被认为是小鼠浮在水 中不进行挣扎而只有非常轻微的运动，以保持它的头露出水面所需要花费的时间。在这些 游泳实验之后，小鼠们被用毛巾擦干，放回圈舍。每只动物只测试一次。
[0230] 旷场测试
[0231] 自发运动通过由具备两行16个光电池的正方形场地组成的旷场装置进行测试以 测量水平和垂直运动。该场地被一盏红色的灯(25W)照亮，并由在房间中的噪声产生器制造 出一种~70dB的环境背景噪声。所有数据均被位于相邻控制室内的个人电脑(MED-PC旷场 活动软件)记录。将小鼠放在装置的中心，并进行5分钟的测试。其间收集一些常规和行为学 参数（Choleris等，2001Neurosci Biobehav Rev，25:353_360;Perfumi and Mattioli, Phytother Res ·，2007Jan; 21 (1): 37-43)。水平运动（即行进距离、移动时间、休息时间）和 垂直运动（即抬起)在中央和外周区进行自动记录。花费在中央区的时间、在该区移动时间 及垂直活动、以及离开起始中心点的延迟并到达外围（"冻结行为"）作为衡量小鼠的情绪反 应的指标(Baeza等，2010)。此外，老化涉及排便行为的减少以及尿失禁的增加。因此，在不 同的年龄组(在试图研究是否对成熟动物去卵巢使这些行为更相似于老年动物中所观察到 的那些）中也考虑粪便数量以及尿的存在。
[0232]光/暗测试
[0233] 检测小鼠焦虑相关行为的相关的测试系统为光/暗探索测试，其利用啮齿动物对 明亮大空间的厌恶（Hascoet等，2001，Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 25: 141_166;Bourin and Hascoet，2003Eur J Pharmacol，463:55_65)。光暗的装置包括顶部 开放的矩形树脂玻璃盒(45X30 X 30厘米;lXbXh)，其分为小（18 X 30cm)区域以及具有位 于底板水平分区中心的开放门（7.5X7.5cm)的大(27X30cm)区域。小的隔间被涂成黑色并 保持黑暗，而大的隔间被漆成白色，用60W(4001X)的光源明亮照明。简而言之，每个动物被 放置在照射室的中心，面对一个黑暗的地方。第一次由明亮隔间移动至黑暗隔间的等待时 间、进入每个隔间的次数、在照明区域花费的时间、以及小鼠在明亮空间内抬起后爪的次数 (抬起)均进行5分钟的记录(Waif and Frye. ,2010)。
[0234] 高架十字迷宫试验(ΕΡΜ)
[0235] 高架十字迷宫评价焦虑状行为，并且其由具有两个开臂（30X3.5cm)的黑色树脂 玻璃以及两个相同尺寸（14厘米高墙）的封闭的臂构成。四个臂由中央广场(6X6cm平方)连 接并从地面升高约74cm。简而言之，小鼠被放置在中央广场，面对一个封闭的臂并且对其行 为评分5分钟。进入臂内全部四个爪子的次数以及在臂内所花费的时间分别以开臂和封闭 的臂进行评分。更多的原始时间以及更大比例的时间（％)花费在高架十字迷宫的开臂中被 认为是焦虑状行为的指标(Kolosova等，Aging(Albany NY)，2013 6月；5(6) :474-84;Walf and Frye.,2010)〇
[0236] 此处引用的每一项专利、专利申请、公开以及参考文件的全部内容通过引用被引 入。以上专利、专利申请、公开以及文件的引用并非承认任何上述为相关的现有技术，也不 构成对任何这些出版物或文件的内容或日期的承认。
[0237] 在不偏离技术的基本方面的基础上，可以对上述内容进行修改。虽然已经参考一 个或多个具体的实施方式相当详细地描述了该技术，但是其他本领域技术人员将意识到可 以对本发明具体公开的实施例进行更改，而这些修改和改进是在本发明的范围及精神内 的。
[0238] 本技术在此说明性的描述，适当地当此处未特别公开的任一元素缺失时也可以有 效。因此，例如，在每一个实例中，这里的任何术语"包括"、"基本上由…组成的"以及"组成 的"中任意一个可以替换为其他两个术语。已被采用的术语和表达式作为说明书的术语而 适用且并非限制，并且这样的术语及表达式的使用并不排除任一表述特征以及描述或其部 分的对应的词，在技术要求的范围内，各种各样的修改是可能的。术语"一"或"一个"可以指 一个或多个其修正的元素(例如，"一种试剂"可指一种或多种试剂），除非在上下文中清楚 地描述了两个元素中的一个或一个以上的元件。如本文所用的术语"约"是指值的基本参数 的10%之内（即，加或减10%)，以及术语"约"使用在一串数值的开头则以修正每个值（即 "约1、2和3"指的是约1、约2和约3)。例如，"约100克"的重量可以包括90克和110克之间的重 量。此外，在本文中描述的值的列表(例如，约50%，60%，70%，80%，85%或86%)的列表中 包括所有的中间及分数值(例如，54%，85.4%)。因此，应当理解，虽然本技术已经通过代表 性实施方式和任选的特征而具体地公开，但是本领域的技术人员可以凭借本文中所公开的 概念而进行修改和变化，并且应认为这样的修改和变化在该技术的范围内。
[0239 ]该技术的某些实施例在以下权利要求中阐述。
【主权项】
1. 一种调节促炎细胞因子在受试者中表达的方法，包括施用药剂给所述受试者，所述 药剂包括： a、 p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者 b、 编码p62/SQSTMl的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其 变体的至少30个氨基酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述促炎细胞因子选自由TNFa、IL-6、IL-lb、 RANTES、IL-17、IL-23、CCL-l、MCP-5 以及 CXCL2 组成的组中。3. -种调节成骨转录因子在受试者中表达的方法，包括施用药剂给所述受试者，所述 药剂包括： a、 p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者 b、 编码p62/SQSTMl的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其 变体的至少30个氨基酸。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述成骨转录因子选自osterix和runx2的组中。5. -种调节骨吸收因子在受试者中表达的方法，包括施用药剂给所述受试者，所述药 剂包括： a、 p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者 b、 编码p62/SQSTMl的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其 变体的至少30个氨基酸。6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述骨吸收因子选自TNFa和RANKL的组中。7. -种调节内源性P62/SQSTM1在所述受试者中表达的方法，包括施用药剂给所述受试 者，所述药剂包括： a、 p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者 b、 编码p62/SQSTMl的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其 变体的至少30个氨基酸。8. -种对受试者的与癌症无关的慢性炎症性疾病的一个或多个症状进行治疗、减轻、 改善、缓解、延迟发生、抑制发展、降低严重性或降低发病率的方法，包括施用药剂给所述受 试者，所述药剂包括： a、 p62/SQSTMl多肽或其变体的至少30个氨基酸;或者 b、 编码p62/SQSTMl的核酸，其中所述编码p62/SQSTMl的核酸编码p62/SQSTMl多肽或其 变体的至少30个氨基酸。9. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，其中，所述变体与SEQ. ID.NO. 2具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97%、至少98%或至少99%的同一性。10. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，其中，所述变体与SEQ. ID. NO. 2具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、 至少97 %、至少98 %或至少99 %的序列同一性。11. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，其中，所述编码p 6 2的核酸包括S E Q ID NO :1的序列。12. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，其中，所述p62多肽或其变体具有至少一 个结构域缺失。13. 根据权利要求12所述的方法，其中，所述结构域缺失选自由1? 1、ZZ、NLS2、TB、NLS1、 NES、LIR、KIR以及UBA组成的组中。14. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，其中，所述药剂包括编码p62的核酸，其 中，所述编码P62的核酸编码多肽，所述多肽与SEQ ID NO.2有95%的同一性，并且其中，所 述编码p62的核酸还包括质粒、RNA或病毒载体。15. 根据权利要求1~14的任一项所述的方法，其中，所述p62/SQSTMl多肽或编码p62/ SQSTM1的核酸还分别包括融合多肽或编码融合多肽的核酸。16. 根据权利要求1~14的任一项所述的方法，其中，所述p62/SQSTMl多肽或编码p62/ SQSTM1的核酸包括疫苗，并且所述方法进一步包括施用佐剂给所述受试者。17. 根据权利要求17所述的方法，其中，所述佐剂选自由凝胶型佐剂、微生物佐剂、颗粒 佐剂、油乳液佐剂、表面活性剂类以及合成佐剂组成的组中。18. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述非癌症慢性炎症性疾病选自由肥胖症、代谢 综合征、2型糖尿病、脂肪肝、克罗恩氏病、胰腺炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、关节炎、骨质疏 松、骨关节炎、多发性硬化症、银肩病、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、抑 郁症、精神分裂症、痛风、石棉肺以及矽肺组成的组中。19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述神经退行性疾病选自由肌萎缩侧索硬化 症、帕金森症、亨廷顿病以及阿尔茨海默症组成的组中。20. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，进一步包括对所述受试者给予抗炎治疗。21. 根据权利要求1~8的任一项所述的方法，其中，所述受试者选自由患有炎症性疾病 的受试者、之前接受过炎症性疾病治疗的受试者、有炎症性疾病家族病史的受试者或者易 患炎症性疾病的受试者组成的组中。22. 根据权利要求1~8的任一所述的方法，其中，所述药剂为编码p62的核酸，并且进一 步包括用于提高受试者中基于核酸的P62表达效率的策略。23. 根据权利要求22所述的方法，其中，所述策略选自由包括自我复制的病毒复制子、 密码子优化、体内电穿孔法、CpG刺激基序的插入、包括靶向对内吞作用或泛素加工通路序 列，包括马立克氏病病毒1型VP22蛋白序列、免疫加强方案、粘膜递送载体以及核酸递送系 统组成的组中。24. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述核酸递送系统选自由聚合物基因递送系 统、脂质体输送系统以及细胞穿透肽基因传递系统组成的组中。25. 根据权利要求1~8的任一所述的方法，其中，还包括施用抗炎化疗或生物制剂。26. 根据权利要求25所述的方法，其中，所述化疗制剂选自由非留体类抗炎药、糖皮质 激素、甲氨蝶呤、环孢素以及雷帕霉素组成的组中。27. 根据权利要求26所述的方法，其中，所述抗炎生物制剂选自由抗TNF抗体、抗IL1抗 体、抗IL6抗体、抗IL6受体抗体、抗IL12/2 3抗体、抗IL17抗体、抗IL1R抗体、抗IL1受体拮抗 剂以及可溶性IL-1受体组成的组中。
【文档编号】A61K38/00GK106061501SQ201480076576
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年12月29日
【发明人】弗兰科·韦纳兹, 安东尼奥·孔塞蒂, 玛丽亚·乔凡娜·萨比蒂, 迪米特里奥斯·阿加斯, 弗拉基米尔·加拜, 维克多·谢弗林, 迈克·谢尔曼, 亚历山大·施耐德
【申请人】Cl昂科莱吉有限公司