通用疫苗冻干保护剂及其应用
【专利摘要】本发明提供了一种通用疫苗冻干保护剂，所述保护剂为单一成分的蔗糖，且作为疫苗的冻干骨架。与现有技术相比，本发明的优势在于：获得了在盐水条件下以蔗糖为唯一冻干支架的通用疫苗冻干保护剂配方，该保护剂外型稳定、易溶性良好、成本低廉、制备容易、保存方便；采用本发明提供的保护剂获得冻干后疫苗在效价、水分、外观等均达到药典要求；所述保护剂获得冻干后疫苗的稳定性、复溶性均明显优于现有技术同类产品，且该保护剂成分可控，完全排除过敏源性。此外，该保护剂可在三种不同冻干机型上运用，通用于各种需冻干疫苗；因此其应用前景十分广阔。
【专利说明】
通用疫苗冻干保护剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及疫苗保护剂，具体说，是涉及一种冻干疫苗骨架，尤其是通用疫苗冻干 保护剂。
【背景技术】
[0002] 疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减 毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防或治疗传染病的自动免疫制剂，是生物制剂 中的最为常见的一类。疫苗的常见剂型主要为口服和注射剂，由于疫苗的分子活性要求，目 前的疫苗剂型研究主要集中在注射剂中，常见的疫苗注射剂型为小水针剂或冻干粉针剂两 种，而冻干制剂因其高稳定性已成为生物制品的基本剂型。
[0003] 冻干及冷冻干燥技术，是在一定的真空条件下，将制品溶液预先冻结成固体，然后 在低温低压条件下，从冻结状态不经过液态而直接升华除去水分的一种干燥方法，此过程 即称为冷冻干燥，是冷冻和干燥的结合。该方法是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白 质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法。
[0004] 在真空冷冻干燥过程中，冷冻和干燥不可避免地均会造成部分微生物细胞的损伤 及死亡，导致蛋白质变性。为提高和保证冻干活疫苗的存活率与生物活性，人们进行了大量 的研究，其中包括冻干过程中蛋白质的空间结构变化、各种保护剂对蛋白质的影响。
[0005] 蛋白质的折叠与展开状态的平衡受周围物理环境(例如pH值、温度、溶剂成分、水 合水平等）的影响很大。从二十世纪六、七十年代开始，国外一些学者对冻干蛋白质的变性 机理进行研究并认为变性主要发生在冷冻过程。从二十世纪八、九十年代至今，普遍认为在 冷冻干燥过程中，冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。其中，冷冻变性机理是冷冻过程中结晶 引起水的状态和结构的变化，是蛋白质变性的主要原因，并且蛋白质变性的程度依赖于冷 冻的程度，冷冻温度越低，蛋白质变性越剧烈。在低温下有序的水的结构引起蛋白质分子中 疏水键的破坏是导致蛋白质变性的主要原因。蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温 过程中，蛋白质分子周围的水分子不断冻结，但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻 结，蛋白质就不会变性，反之亦然。干燥变性机理是干燥过程的变性，主要是发生在二次干 燥阶段即移去结合水的阶段。蛋白质在水溶液中是水化的，表面有一层水分子包围，构成一 个单层分子，这就是水化层。这层水分子通过氢键和蛋白质相互作用连接。干燥过程要移去 一部分水化层的水，破坏蛋白质表面的氢键结构，引起天然结构的变性。
[0006] 针对上述问题，保护剂成为了冻干活疫苗中不可或缺的组成部分。保护剂的作用 主要有：1、具有保护病毒及细菌活力、抗原稳定性、耐干燥和冷冻的低分子物质和形成冻干 疫苗耐热性结构的有机高分子物质；2、具有高度抗氧化作用的抗氧化剂，能够最大限度地 消耗溶液中溶解的氧，减少病毒或细菌与氧的接触，降低病毒或细菌的代谢活力和能量损 耗，防止其在冷冻干燥及储运过程中死亡;3、根据保护剂中的每一种物质的共融点进行大 量反复冻干试验，科学地确定每一种疫苗的冻干曲线，使病毒或细菌在冻干过程中的失活 率降到最低，也使得疫苗形成良好的物理性状。
[0007] 冻干活疫苗的整个冻干过程存在着各种各样的应力，通常包括低温应力、冻结应 力(包括枝状冰晶的形成、离子强度的增加、pH值的改变、相分离等）、干燥应力(移去蛋白质 表面单层水分子)等，这些应力常常是直接或间接导致生物制品不稳定的因素。保护剂可以 改变疫苗冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能 保持生物样品原有的各种理化特性和生物活性，同时对产品贮藏期内蛋白质变性起到抑制 作用。
[0008] 常用在冻干活疫苗中的保护剂种类有：多羟基化合物、糖、蛋白质、聚合物、氨基 酸、盐、表面活性剂等。
[0009] 1、多羟基化合物
[0010]多羟基化合物是保护剂中重要成分之一，常见的有甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二 醇、侧金盏花醇等。多羟基化合物的保护机理：由于疫苗蛋白质分子中存在大量的氢键，结 合水通过氢键与蛋白质分子连接，当冻干过程中脱水后，多羟基化合物的羟基能替代蛋白 质表面的水分子的羟基，与蛋白质表面形成一层假定的水化膜，从而保护氢键的连接位点 不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的尚级结构，防止蛋白质因冻干而变性。
[0011] 2、糖
[0012] 糖是冻干活疫苗中最常见的保护剂，使用最广的一类必要成分，为蛋白质的非特 异性稳定剂。在冻干及保存各阶段均能对生物制品起到一定的保护作用。糖的保护作用与 其及蛋白质的种类有关。常见的有庶糖、乳糖、海澡糖、姻糖、糊精等。对阻止蛋白质^级结 构的改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质多肽链的伸展和聚集起着显著作用。二糖中 的蔗糖和海藻糖是研究最多、也是公认最有效的保护剂。
[0013] 3、蛋白质
[0014] 蛋白质保护剂是保护剂的重要组分。蛋白质类保护剂根据来源可分为两种:动物 源性蛋白质和外来蛋白质。血清白蛋白是一个经典-优良的蛋白质稳定剂，人血清白蛋白则 在更低浓度(〈0.05%~0.1%)时能有效阻止蛋白质表面的吸附，对冻干过程中多数蛋白都 具有保护作用。目前，也有报道称重组人白蛋白推荐为血清白蛋白的替代品。
[0015] 4、聚合物
[0016] 聚合物作为大分子物质保护剂，要与小分子物质联合使用，常见的有聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、聚乙烯亚胺、海藻酸、果胶、阿拉伯胶、葡聚糖、聚乙烯 吡咯烷酮(PVP)、羧甲基纤维素(CMC)及藻类。通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重 性质，如优先从蛋白质表面析出、表面活性、使蛋白质溶液浓度升高从而阻止其他小分子 (如糖及多羟基化合物）的结晶、抑制冷冻过程中pH值的剧烈变化等。尽管大分子物质对疫 苗稳定性及有限期有很好的效果，但会减低品种本身的安全性系数。
[0017] 5、氨基酸
[0018] 氨基酸是蛋白质保护剂常见的一种，常用的氨基酸类保护剂有精氨酸、脯氨酸、色 氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸盐酸盐、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸等。在 冷冻过程中的主要作用是能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起蛋白质结构的破坏。
[0019] 表a为现有技术中的常用保护剂对比。
[0020] 表 a
[0022] 由表a不难看出，要想获得稳定的活疫苗冻干制品，保护剂的选用至关重要。表a中 提到，明胶、海藻酸盐用作冻干疫苗成型骨架时，由于明胶为动物源性物质，海藻酸盐中含 不明、不可控成分，为主要的过敏源，患者将具有潜在的过敏反应。一个优良的保护剂要对 保持疫苗的玻璃化有利，因为玻璃化的疫苗不仅复溶速率高，物理性状好，而且质量稳定性 尚。
[0023] 综上，为避免现有冻干剂型疫苗中含明胶、海藻酸盐、等动物源性、食源性高分子 组分保护剂在注射时引起的过敏反应，研制一种无动物源性、食源性等高分子组分，低敏的 通用疫苗保护剂，仍是一个亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0024] 针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种通用疫苗用保护剂，以 获得不含有动物源性、食源性等高分子组分的通用疫苗保护剂，且外型稳定、易溶性良好， 从而具备极佳的经济效益和环境效益。
[0025] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0026] -种通用疫苗冻干保护剂，为单一成分的蔗糖，且作为疫苗的冻干骨架，换言之， 该保护剂中不含有明胶和/或海藻酸盐。
[0027]优选地，蔗糖的初始浓度不小于60%，优选为大于70%。
[0028]优选地，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为不大于20 % ;较佳地，为4~ 20% ;作为一种较佳的实施方式，根据所需制备的疫苗的不同为7~10%、8~10%、10~ 15%或 12~15%;最佳为7%、8%、10%或 12%。
[0029] 优选地，蔗糖选用工业级分析纯或药用级。
[0030] 作为本发明的另一目的，是提供上述保护剂的制备方法，以获得性能稳定的保护 剂，配置浓度不小于60 %的蔗糖母液，经高温灭菌处理。
[0031] 优选地，经12rc灭菌处理15min。
[0032] 作为本发明的另一目的，是提供一种冻干疫苗的制备方法，以克服传统冻干工艺 中无法采用单一成分的保护剂，即为唯一冻干骨架的料液进行疫苗冻干特需的成型冻干。 一种冻干疫苗的制备方法，在冻干过程中仅采用蔗糖作为冻干保护剂。
[0033] 优选地，上述冻干疫苗的制备方法包括如下步骤：
[0034] 步骤a)配制病毒原液半成品；
[0035] 步骤b)将步骤a所得半成品进行预冻；
[0036]步骤c)将步骤b所得预冻后半成品进行干燥，即得冻干疫苗。
[0037]更优选地，步骤a的具体操作为:无菌环境下，配制高温灭菌处理的蔗糖母液，将蔗 糖母液加入病毒原液中，混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品。
[0038] 更优选地，步骤b中预冻时快速降温至-55°C~_50°C，维持4h~8h或15h~20h。
[0039] 更优选地，步骤c包括第一阶段干燥和第二阶段干燥。
[0040] 进一步，步骤c中第一阶段干燥时升温至-45°C~_33°C维持40h~96h和/或升温 至-40 °C ~-30 °C 维持 12h ~22h。
[0041]相应地，作为一种较佳实施方式，根据所需制备的疫苗的不同，步骤c中第一阶段 干燥时升温至-45°C~-40°C，维持50h，再升温至-40°C~-33°C，维持22h;或升温至-42°C ~-33°C，维持96h;或升温至-42°C~_38°C，维持42h，再升温至-35°C~_33°C，维持16h;或 升温至-40 °C~-38 °C，维持44h，再升温至-35 °C~-30 °C，维持14h;亦或升温至-40 °C~-38 。(：，维持40h，再升温至-35°C~_30°C，维持12h。
[0042] 更优选地，步骤c中第二阶段干燥时设定不同时间内升温至0°C~30°C，不同升温 阶段继续维持18h~32h(根据水的三相性:压强，沸点或熔点，温度是一个相互作用的过程， 不同的升温速率下，热辐射速率不同，最后所得到的剂品外观及水分含量也不相同；同时结 合蔗糖跟不同病毒会产生不同的玻璃化转化温度;通过调节审问速率来实现最优值；因此 此处可根据现有技术中的方法进行调节，下同）。
[0043] 值得一提的是，本发明的进一步优势还体现在，本发明的另一目的是提供一种轮 状病毒冻干疫苗，其中：所述轮状病毒冻干疫苗在冻干过程中米用单一成分的鹿糖作为冻 干骨架。
[0044] -种轮状病毒冻干疫苗的制备方法，其特征在于:通过以蔗糖为单一骨架的冻干 配方结合不同冻干曲线完成冻干的过程中，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为7% ~10%，优选为7%。
[0045] 需要注意的是，制备轮状病毒冻干疫苗过程中，预冻时快速降温至_55°C，维持15h ~20h;第一阶段干燥时升温至-45 °C~-40°C，维持50h，再升温至-40°C~-33°C，维持22h; 第二阶段干燥时设定不同时间内升温至〇°C~30°C，不同升温阶段继续维持28h。
[0046] 本发明的另一目的是提供一种麻疹病毒冻干疫苗，其中：所述麻疹病毒冻干疫苗 在冻干过程中采用单一成分的蔗糖作为冻干骨架。
[0047] -种麻疹病毒冻干疫苗的制备方法，其特征在于:通过以蔗糖为单一骨架的冻干 配方结合不同冻干曲线完成冻干的过程中，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为12% ~15%，优选为12%。
[0048] 需要注意的是，制备麻疹病毒冻干疫苗过程中，预冻时快速降温至-50°C，维持 4.5h~8h;第一阶段干燥时升温至-42°C~-33°C，维持96h;第二阶段干燥时设定不同时间 内升温至〇°C~30°C，不同升温阶段继续维持32h。
[0049] 本发明的另一目的是提供一种风疹病毒冻干疫苗，其中：所述风疹病毒冻干疫苗 在冻干过程中采用单一成分的蔗糖作为冻干骨架。
[0050] -种风疹病毒冻干疫苗的制备方法，其特征在于:通过以蔗糖为单一骨架的冻干 配方结合不同冻干曲线完成冻干的过程中，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为8% ~10%，优选为8%。
[0051] 需要注意的是，制备风疹病毒冻干疫苗过程中，预冻时快速降温至-50°C，维持4h ~5h;第一阶段干燥时升温至-42°C~-38°C，维持42h，再升温至-35°C~-33°C，维持16h;第 二阶段干燥时设定不同时间内升温至〇°C~30°C，不同升温阶段继续维持18h。
[0052] 本发明的另一目的是提供一种麻疹风疹病毒冻干二联疫苗，其中：所述麻疹风疹 病毒冻干二联疫苗在冻干过程中采用单一成分的蔗糖作为冻干骨架。
[0053] 一种麻疹风疹病毒冻干二联疫苗的制备方法，其特征在于:通过以蔗糖为单一骨 架的冻干配方结合不同冻干曲线完成冻干的过程中，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含 量为10%~15%，优选为10%。
[0054]需要注意的是，制备麻疹风疹病毒冻干二联疫苗过程中，预冻时快速降温至-55 。(：，维持4.5h~8h;第一阶段干燥时升温至-40 °C~-38°C，维持44h，再升温至-35 °C~-30 °C，维持14h;第二阶段干燥时设定不同时间内升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持 Mlo
[0055] 本发明的另一目的是提供一种水痘病毒冻干疫苗，其中：所述水痘病毒冻干疫苗 在冻干过程中采用单一成分的蔗糖作为冻干骨架。
[0056] -种水痘病毒冻干疫苗的制备方法，其特征在于:通过以蔗糖为单一骨架的冻干 配方结合不同冻干曲线完成冻干的过程中，蔗糖在冻干原液中的初始质量百分含量为10% ~15%，优选为12%。
[0057]需要注意的是，制备水痘病毒冻干疫苗过程中，预冻时快速降温至-50°C，维持 4.5h~8h;第一阶段干燥时升温至-40 °C~-38 °C，维持40h，再升温至-35 °C~-30 °C，维持 12h;第二阶段干燥时设定不同时间内升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持24h。
[0058] 此外，本发明还提供了上述保护剂用于制备冻干疫苗的用途。
[0059] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0060] 1、本发明提供了一种外型稳定、易溶性良好、成本低廉、制备容易、保存方便的通 用疫苗保护剂，获得在盐水条件下以蔗糖为唯一冻干支架的通用疫苗冻干保护剂配方； [0061 ] 2、本发明提供的技术方案避免冻干剂型疫苗中含动物源性明胶高分子、食源性海 藻酸盐组分保护剂免疫接种引发过敏反应；
[0062] 3、以蔗糖为疫苗冻干制剂唯一保护剂和成型剂骨架，可利用工业级分析纯或药用 级蔗糖残留杂质，成分可控，完全排除过敏源性；
[0063] 4、该疫苗冻干保护剂通用于各种可作为冻干剂的疫苗；
[0064] 5、该通用疫苗保护剂的冻干工艺适用于各种需冻干疫苗，成功建立了无高分子成 分通用疫苗保护液冷冻干燥工艺，且可在三种不同冻干机型上运用；
[0065] 6、采用本发明提供的保护剂获得冻干后疫苗在效价、水分、外观等均达到药典要 求；
[0066] 7、采用本发明提供的保护剂获得冻干后疫苗的稳定性、复溶性均明显优于现有技 术同类产品。
[0067] 综上，本发明提供的通用疫苗保护剂安全可靠，稳定性好，且来源廉价易得，生产 工艺环境友好，其应用前景十分广阔。
【附图说明】
[0068] 图la为本发明实施例1提供的四价轮状病毒半成品冻干曲线；
[0069] 图lb为本发明实施例1-4和对比例1提供的四价轮状病毒半成品冻干曲线；
[0070] 图2a为本发明实施例2提供的麻疹病毒半成品冻干曲线；
[0071] 图2b为本发明实施例2-6和对比例2提供的麻疹病毒半成品冻干曲线；
[0072 ]图3a为本发明实施例3提供的风疹病毒半成品冻干曲线；
[0073]图3b为本发明实施例3-4和对比例3提供的风疹病毒半成品冻干曲线；
[0074] 图4a为本发明实施例4提供的麻疹风疹病毒二联疫苗半成品冻干曲线；
[0075] 图4b为本发明实施例4-5和对比例4提供的麻疹风疹病毒二联疫苗半成品冻干曲 线；
[0076] 图5a为本发明实施例5提供的水痘病毒半成品冻干曲线；
[0077]图5b为本发明实施例5-6和对比例5提供的水痘病毒半成品冻干曲线。
【具体实施方式】
[0078] 下面结合实施例和对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。实施例中出现的 试剂或仪器在【具体实施方式】中无如特殊说明，均为市售，且按照其说明书进行操作，在此不 作赘述。
[0079] -、仪器：
[0080] I型冻干机，氟利昂制冷，电加热，双层隔板，高真空度维持〈15pa，冷阱温度维持-65°C，隔板样品温差〈10°C，购自宁波新芝生物科技有限公司；（前期工艺开发使用）
[0081] Π 型冻干机，硅油制冷，双层隔板，高真空度维持<25pa，冷阱温度维持-65°C，隔板 样品温差<4°C，购自上海东富龙科技有限公司；（前期工艺开发使用）
[0082] m型冻干机，硅油制冷，双层隔板，超高真空度维持<10pa，冷阱温度维持-75°C，隔 板样品温差<4°C，购自上海拓领医药科技有限公司；（后期工艺验证，实施例及对比例使用） [0083] 二、制剂瓶：
[0084] 中硼西林瓶，规格为7ml和5ml;
[0085] 溴化丁基胶塞，直径20mm;
[0086] 铝塑盖，直径20mm;
[0087] 三、试剂：
[0088] G1血清型轮状病毒单价原液（即含有G1血清型轮状病毒的基础培养基溶液），使用 FRHL-2细胞接种G1血清型轮状病毒后在MEM基础培养基中制备而得，FRHL-2细胞购自美国 惠氏公司；
[0089] G2血清型轮状病毒单价原液（即含有G2血清型轮状病毒的基础培养基溶液），使用 FRHL-2细胞接种G2血清型轮状病毒后在MEM基础培养基中制备而得；
[0090] G3血清型轮状病毒单价原液（即含有G3血清型轮状病毒的基础培养基溶液），使用 FRHL-2细胞接种G3血清型轮状病毒后在MEM基础培养基中制备而得；
[0091 ] G4血清型轮状病毒单价原液（即含有G4血清型轮状病毒的基础培养基溶液），使用 FRHL-2细胞接种G4血清型轮状病毒后在MEM基础培养基中制备而得；
[0092] 麻疹病毒原液(即含有麻疹病毒的基础培养基溶液），使用鸡胚原代细胞接种麻疹 病毒后在MEM基础培养基中制备而得，鸡胚原代细胞培养参照现有技术制得；
[0093] 风疹病毒原液（即含有风疹病毒的基础培养基溶液），使用MRC-5细胞接种风疹病 毒后在MEM基础培养基中制备而得，MRC-5细胞由武汉病毒所提供实验用细胞株；
[0094] 水痘病毒原液（即含有水痘病毒的基础培养基溶液），使用MRC-5细胞接种水痘病 毒后在MEM基础培养基中制备而得；
[0095] 蔗糖，分析纯；
[0096] 明胶，药用级；
[0097]右旋糖酐，药用级。
[0098] 实施例1制备冻干轮状病毒四价疫苗
[0099] 发明人为了进一步获得蔗糖作为保护剂在冻干原液中的百分浓度对疫苗指标的 影响，在相同的条件下，分别制备表1-2所示冻干原液中蔗糖浓度（即：1%、3%、5%、7%、 10%、12%、15%、20%)的八种冻干轮状病毒四价疫苗，其制备方法均如下：
[0100]以制备冻干原液中蔗糖浓度为7%的轮状病毒四价疫苗为例，在无菌环境下，进行 如下步骤：
[0101] 步骤1、配制浓度为70%、经121°C灭菌处理15min的蔗糖母液；
[0102] 步骤2、将G1血清型轮状病毒单价原液、G2血清型轮状病毒单价原液、G3血清型轮 状病毒单价原液和G4血清型轮状病毒单价原液混合制备成轮状病毒多价原液；
[0103] 步骤3、将步骤2所得轮状病毒多价原液置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖 母液，使蔗糖浓度至7%，得混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以 1.0ml/瓶的规格灌装于西林瓶内以进行后续的冻干工艺；
[0104] 步骤4、将步骤3所得半成品进行预冻:预冻时快速降温至-55°C，维持15h-20h;
[0105] 步骤5、将步骤4所得预冻后半成品进行第一阶段干燥:升温至_45°C~_40°C维持 50h，升温至-40 °C~-33 °C维持22h;
[0106] 步骤6、将步骤5所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥:设定不同时间内 升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持28h;即获得冻干原液中蔗糖浓度为7%的冻干轮 状病毒四价疫苗。
[0107] 其中，本实施例进行冻干步骤的各项参数如表1-1所示，所得各冻干轮状病毒四价 疫苗的具体评价指标结果如表1-2所示，实施例1的冻干曲线如图la所示。本发明中各实施 例与对比例中所有操作步骤严格按照药典规定，如配置蔗糖母液的百分比系指溶液l〇〇ml 中含有的溶质若干克;此外，冻干疫苗的制备方法可参考现有技术制备，在此均不做赘述。
[0108] 表1-1
[0112]由图la和表1-2数据可知，1 %~5 %浓度的蔗糖冻干效果差，在此范围内的蔗糖浓 度无固定骨架形成，无法完成冻干，故使用浓度不适合作为保护剂使用；7%~10%浓度的 蔗糖冻干效果正常，在此浓度范围内，水分含量低，蔗糖可形成稳定的骨架结构支撑冻干完 成，符合药典中对疫苗水分的规定，满足冻干使用；12 %~20 %浓度的蔗糖其外观冻干效果 较好，在此浓度范围内，蔗糖虽可形成稳定的骨架结构支撑冻干完成，但是水分含量偏高， 不符合药典中对疫苗水分的规定，无法满足冻干使用；结合冻干曲线可知冻干原液中较佳 蔗糖浓度范围为7%~10%，最佳为7%。
[0113] 对比例1制备冻干轮状病毒四价疫苗
[0114] 根据表1-4所示的其他常用保护剂及相应含量制备冻干轮状病毒四价疫苗作为对 比例1-1、1-2和1-3,用于评价实施例1(实施例1-4)所得冻干疫苗的效价。其中，本对比例进 行冻干步骤的各项参数如表1-3所示，实施例1-4和对比例1的冻干曲线如图lb所示。
[0115] 表1-3
[0117] 复溶性、稳定性以及过敏性实验
[0118] 根据药典对表1-4所示疫苗在相同实验参数和条件下同时进行疫苗指标实验，实 验结果如表1-4所示：
[0119] 表1-4
[0120]
[0121] 由图lb和表1-4数据可知：明胶加蔗糖的冻干效果最好，但是其具有过敏源性;右 旋糖酐过敏源性较明胶为好，但是复溶性较慢及效价损失较大;综合可知实施例1-4所得疫 苗中的单成分鹿糖为最理想保护剂。
[0122] 实施例2制备冻干麻疹病毒减毒活疫苗
[0123] 发明人为了进一步获得蔗糖作为保护剂在冻干原液中的百分浓度对疫苗指标的 影响，在相同的条件下，分别制备表2-2所示冻干原液中蔗糖浓度（即：1%、3%、5%、8%、 10%、12%、15%)的七种冻干麻疹病毒减毒活疫苗，其制备方法均如下：
[0124] 以制备冻干原液中蔗糖浓度为12%的冻干麻疹病毒减毒活疫苗为例，步骤如下：
[0125] 步骤1、配制浓度为70%、经121°C灭菌处理15min的蔗糖母液；
[0126] 步骤2、将麻疹病毒原液置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖母液，使蔗糖浓 度至12%，混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以1.0ml/瓶的规格灌装 于西林瓶内以进行后续的冻干工艺；
[0127] 步骤3、将步骤2所得半成品进行预冻:预冻时快速降温至_50°C，维持4.5h_8h;
[0128] 步骤4、将步骤3所得预冻后半成品进行第一阶段干燥:升温至_42°C~_33°C维持 96h；
[0129] 步骤5、将步骤4所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥:设定不同时间内 升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持32h;即获得冻干原液中蔗糖浓度为12%的冻干 麻疹病毒减毒活疫苗。
[0130]其中，本实施例进行冻干步骤的各项参数如表2-1所示，所得各冻干麻疹病毒减毒 活疫苗的具体评价指标结果如表2-2所示，实施例2的冻干曲线如图2a所示。
[0135]由图2a和表2-2数据可知，1 %~10 %浓度的蔗糖冻干效果差，在此范围内的蔗糖 浓度无固定骨架形成，无法完成冻干，故使用浓度不适合作为保护剂使用；12 %~15 %浓度 的蔗糖冻干效果正常，在此浓度范围内，水分含量低，蔗糖可形成稳定的骨架结构支撑冻干 完成，符合药典中对疫苗水分的规定，满足冻干使用;结合冻干曲线可知冻干原液中较佳蔗 糖浓度范围为12%~15%，最佳为12%。
[0136] 对比例2制备冻干麻疹病毒减毒活疫苗
[0137] 根据表2-4所示的其他常用保护剂及相应含量制备冻干麻疹病毒减毒活疫苗作为 对比例2-1、2-2和2-3，用于评价实施例2(实施例2-6)所得冻干疫苗的效价。其中，本对比例 进行冻干步骤的各项参数如表2-3所示，实施例2-6和对比例2的冻干曲线如图2b所示。
[0138] 表2-3
[0140] 复溶性、稳定性以及过敏性实验
[0141] 根据药典对表2-4所示疫苗在相同实验参数和条件下同时进行疫苗指标实验，实 验结果如表2-4所示：
[0142] 表2-4
[0143]
[0144] 由图2b和表2-4数据可知：明胶加蔗糖的冻干效果最好，但是其具有过敏源性;右 旋糖酐过敏源性较明胶为好，但是复溶性较慢及效价损失较大;综合可知本发明提供的单 成分蔗糖为最理想保护剂。
[0145] 实施例3制备冻干风疹病毒减毒活疫苗
[0146] 发明人为了进一步获得蔗糖作为保护剂在冻干原液中的百分浓度对疫苗指标的 影响，在相同的条件下，分别制备表3-2所示冻干原液中蔗糖浓度（即：1%、3%、5%、8%、 10%、12%、15%、20%)的八种冻干风疹病毒减毒活疫苗，其制备方法均如下：
[0147] 以制备冻干原液中蔗糖浓度为8%的冻干风疹病毒减毒活疫苗为例，步骤如下：
[0148] 步骤1、配制浓度为70%、经121°C灭菌处理15min的蔗糖母液；
[0149] 步骤2、将风疹病毒原液置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖母液，使蔗糖浓 度至8%，混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以1.0ml/瓶的规格灌装于 西林瓶内以进行后续的冻干工艺；
[0150] 步骤3、将步骤2所得半成品进行预冻:预冻时快速降温至_50°C，维持4h_5h;
[0151] 步骤4、将步骤3所得预冻后半成品进行第一阶段干燥:升温至-42°C~_38°C维持 4211，升温至-35°(：~-33°(：维持1611 ;
[0152] 步骤5、将步骤4所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥:设定不同时间内 升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持18h;即获得冻干原液中蔗糖浓度为8%的冻干风 疹病毒减毒活疫苗。
[0153]其中，本实施例进行冻干步骤的各项参数如表3-1所示，所得各冻干风疹病毒减毒 活疫苗的具体评价指标结果如表3-2所示，实施例3的冻干曲线如图3a所示。
[0158] 由图3a和表3-2数据可知，1%~5%浓度的蔗糖冻干效果差，在此范围内的蔗糖浓 度无固定骨架形成，无法完成冻干，故使用浓度不适合作为保护剂使用；8%~10%浓度的 蔗糖冻干效果正常，在此浓度范围内，水分含量低，蔗糖可形成稳定的骨架结构支撑冻干完 成，符合药典中对疫苗水分的规定，满足冻干使用；12 %~20 %浓度的蔗糖其外观冻干效果 较好，在此浓度范围内，蔗糖虽可形成稳定的骨架结构支撑冻干完成，但是水分含量偏高， 不符合药典中对疫苗水分的规定，无法满足冻干使用；结合冻干曲线可知冻干原液中较佳 蔗糖浓度范围为8%~10%，最佳为8%。
[0159] 对比例3制备冻干风疹病毒减毒活疫苗
[0160] 根据表3-4所示的其他常用保护剂及相应含量制备冻干风疹病毒减毒活疫苗作为 对比例3-1、3-2和3-3，用于评价实施例3(实施例3-4)所得冻干疫苗的效价。其中，本对比例 进行冻干步骤的各项参数如表3-3所示，实施例3-4和对比例3的冻干曲线如图3b所示。
[0161] 表3-3
[0163] 复溶性、稳定性以及过敏性实验
[0164] 根据药典对表3-4所示疫苗在相同实验参数和条件下同时进行疫苗指标实验，实 验结果如表3-4所示：
[0165] 表3-4
[0166]
[0167] 由图3b和表3-4数据可知：明胶加蔗糖的冻干效果最好，但是其具有过敏源性;右 旋糖酐过敏源性较明胶为好，但是复溶性较慢及效价损失较大;综合可知本发明提供的单 成分蔗糖为最理想保护剂。
[0168] 实施例4制备冻干麻疹风疹病毒二联疫苗
[0169] 发明人为了进一步获得蔗糖作为保护剂在冻干原液中的百分浓度对疫苗指标的 影响，在相同的条件下，分别制备表4-2所示冻干原液中蔗糖浓度（即：1%、3%、5%、7%、 10%、12%、15%)的七种冻干麻疹风疹病毒二联疫苗，其制备方法均如下：
[0170] 以制备冻干原液中蔗糖浓度为10%的冻干麻疹风疹病毒二联疫苗为例，步骤如 下：
[0171] 步骤1、配制浓度为70%、经121°C灭菌处理15min的蔗糖母液；
[0172] 步骤2、将麻疹病毒原液和风疹病毒原液混合制备成麻疹风疹病毒原液；
[0173] 步骤3、将步骤2所得麻疹风疹病毒原液置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖 母液，使蔗糖浓度至10%，混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以1.0ml/ 瓶的规格灌装于西林瓶内以进行后续的冻干工艺；
[0174] 步骤4、将步骤3所得半成品进行预冻:预冻时快速降温至_55°C，维持4.5h_8h;
[0175] 步骤5、将步骤4所得预冻后半成品进行第一阶段干燥:升温至-40°C~_38°C维持 44h，升温至-35 °C~-30 °C维持14h;
[0176] 步骤6、将步骤5所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥:设定不同时间内 升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持24h;即获得冻干原液中蔗糖浓度为10%的冻干 麻疹风疹病毒二联疫苗。
[0177]其中，本实施例进行冻干步骤的各项参数如表4-1所示，所得各麻疹风疹病毒二联 疫苗的具体评价指标结果如表4-2所示。实施例4的冻干曲线如图4a所示。
[0182] 由图4a和表4-2数据可知，1%~7%浓度的蔗糖冻干效果差，在此范围内的蔗糖浓 度无固定骨架形成，无法完成冻干，故使用浓度不适合作为保护剂使用；10%~15%浓度的 蔗糖冻干效果正常，在此浓度范围内，水分含量低，蔗糖可形成稳定的骨架结构支撑冻干完 成，符合药典中对疫苗水分的规定，满足冻干使用;结合冻干曲线可知冻干原液中较佳蔗糖 浓度范围为10%~15%，最佳为10%。
[0183] 对比例4制备冻干麻疹风疹病毒二联疫苗
[0184] 根据表4-4所示的其他常用保护剂及相应含量制备冻干麻疹风疹病毒二联疫苗作 为对比例4-1、4-2和4-3,用于评价实施例4(实施例4-5)所得冻干疫苗的效价。具体冻干疫 苗的制备方法参考现有技术制备，在此不做赘述。其中，本对比例进行冻干步骤的各项参数 如表4-3所示，实施例4-5和对比例4的冻干曲线如图4b所示。
[0185] 表4-3
[0187] 复溶性、稳定性以及过敏性实验
[0188] 根据药典对表4-4所示疫苗在相同实验参数和条件下同时进行疫苗指标实验，实 验结果如表4-4所示：
[0189] 表4-4
[0190]
[0191 ]由图4b和表4-4数据可知：明胶加蔗糖的冻干效果最好，但是其具有过敏源性;右 旋糖酐过敏源性较明胶为好，但是复溶性较慢;综合可知本发明提供的单成分蔗糖为最理 想保护剂。
[0192] 实施例5制备冻干水痘病毒减毒活疫苗
[0193] 发明人为了进一步获得蔗糖作为保护剂在冻干原液中的百分浓度对疫苗指标的 影响，在相同的条件下，分别制备表5-2所示冻干原液中蔗糖浓度（即：1%、3%、5%、8%、 10%、12%、15%)的七种冻干水痘病毒减毒活疫苗，其制备方法均如下：
[0194] 以制备冻干原液中蔗糖浓度为12%的冻干水痘病毒减毒活疫苗为例，步骤如下：
[0195] 步骤1、配制浓度为70%、经121°C灭菌处理15min的蔗糖母液；
[0196] 步骤2、将水痘病毒原液置于无菌容器内，加入步骤1配制成的蔗糖母液，使蔗糖浓 度至12%，混匀制备成含有蔗糖保护剂的病毒原液半成品，再分别以1.0ml/瓶的规格灌装 于西林瓶内以进行后续的冻干工艺；
[0197] 步骤3、将步骤2所得半成品进行预冻:预冻时快速降温至_50°C，维持4.5h_8h;
[0198] 步骤4、将步骤3所得预冻后半成品进行第一阶段干燥:升温至-40°C~_38°C维持 40h，升温至-35 °C~-30 °C维持12h;
[0199] 步骤5、将步骤4所得第一阶段干燥后半成品进行第二阶段干燥:设定不同时间内 升温至0°C~30°C，不同升温阶段继续维持24h;即获得冻干原液中蔗糖浓度为12%的冻干 水痘病毒减毒活疫苗。
[0200]其中，本实施例进行冻干步骤的各项参数如表5-1所示，所得各水痘减毒活疫苗的 具体评价指标结果如表5-2所示，实施例5的冻干曲线如图5a所示。
[0205]由图5a和表5-2数据可知，1 %~10%浓度的蔗糖冻干效果差，在此范围内的蔗糖 浓度无固定骨架形成，无法完成冻干，故使用浓度不适合作为保护剂使用；12 %~15 %浓度 的蔗糖冻干效果正常，在此浓度范围内，水分含量低，蔗糖可形成稳定的骨架结构支撑冻干 完成，符合药典中对疫苗水分的规定，满足冻干使用;结合冻干曲线可知冻干原液中较佳蔗 糖浓度范围为12%~15%，最佳为12%。
[0206] 对比例5制备冻干水痘病毒减毒活疫苗
[0207] 根据表5-4所示的其他常用保护剂及相应含量制备冻干水痘病毒减毒活疫苗作为 对比例5-1、5-2和5-3，用于评价实施例5(实施例5-6)所得冻干疫苗的效价。其中，本对比例 进行冻干步骤的各项参数如表5-3所示，实施例5-6和对比例5的冻干曲线如图5b所示。
[0208] 表5-3
[0210] 复溶性、稳定性以及过敏性实验
[0211] 根据药典对表5-4所示疫苗在相同实验参数和条件下同时进行疫苗指标实验，实 验结果如表5-4所示：
[0212] 表5-4
[0213]
[0214] 由图5b和表5-4数据可知，明胶加蔗糖的冻干效果最好，但是其具有过敏源性;右 旋糖酐过敏源性较明胶为好，但是复溶性较慢及效价损失较大;综合可知本发明提供的单 成分蔗糖为最理想保护剂。
[0215] 由上述所有实验结果可知，本发明提供的疫苗冻干保护剂可适用于各种不同疫 苗，尤其是病毒型疫苗的通用疫苗保护剂。具体如上述实验结果所示，本发明提供的冻干疫 苗保护剂不仅适用于一般温感型病毒类的麻疹风疹病毒疫苗，也适用于热敏感型病毒类的 水痘病毒疫苗，同样适用于耐热型病毒类的轮状病毒疫苗。综上，该通用疫苗冻干保护剂适 应性广，通过调整不同疫苗的不同冻干曲线即可制备相应疫苗，对疫苗的具体生产工艺无 特殊要求，适合工业化生产所需。
【主权项】
1. 一种通用疫苗冻干保护剂，其特征在于:所述保护剂为单一成分的蔗糖，且作为疫苗 的冻干骨架。2. 权利要求1所述的保护剂，其特征在于:蔗糖在冻干原液中的初始浓度不大于20%。3. -种冻干疫苗的制备方法，其特征在于：在冻干过程中采用权利要求1所述的保护 剂。4. 权利要求11或12所述的制备方法，其特征在于，包括下列步骤： 步骤a)配制病毒原液半成品； 步骤b)将步骤a所得半成品进行预冻； 步骤c)将步骤b所得预冻后半成品进行干燥，即得冻干疫苗。5. -种轮状病毒冻干疫苗，其特征在于:所述轮状病毒冻干疫苗在冻干过程中采用单 一成分的蔗糖作为冻干骨架。6. -种麻疹病毒冻干疫苗，其特征在于:所述麻疹病毒冻干疫苗在冻干过程中采用单 一成分的蔗糖作为冻干骨架。7. -种风疹病毒冻干疫苗，其特征在于:所述风疹病毒冻干疫苗在冻干过程中采用单 一成分的蔗糖作为冻干骨架。8. -种麻疹风疹病毒冻干二联疫苗，其特征在于:所述麻疹风疹病毒冻干二联疫苗在 冻干过程中采用单一成分的蔗糖作为冻干骨架。9. 一种水痘病毒冻干疫苗，其特征在于:所述水痘病毒冻干疫苗在冻干过程中采用单 一成分的蔗糖作为冻干骨架。10. 权利要求1至10任一所述的保护剂用于制备疫苗冻干制剂的用途。
【文档编号】A61K39/165GK106063933SQ201610046092
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年1月25日 公开号201610046092.6, CN 106063933 A, CN 106063933A, CN 201610046092, CN-A-106063933, CN106063933 A, CN106063933A, CN201610046092, CN201610046092.6
【发明人】王伟成, 祝洪敢, 鲍路伟, 李津
【申请人】武汉博沃生物科技有限公司