脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用，本发明通过建立小鼠急性炎症性肠病模型、观察脱氢洛伐他汀对炎症性肠病的治疗作用等试验，首次揭示脱氢洛伐他汀对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠炎症性肠病的防治作用及作用机制。脱氢洛伐他汀通过抑制NF?κB信号通路，明显抑制促炎因子TNF?α、IL?6、IL?17的水平，提高抗炎因子IL?10的水平，而发挥对4％DSS诱导的小鼠炎症性肠病的保护作用。
【专利说明】
脱氢洛伐他订在制备抗炎症性肠病药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药物领域，具体是脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 他汀类药为轻甲基戊二酸单酰辅酶A (3-hydroxy-3-me thy I-glutary I CoA，HMG-CoA)还原酶的特异竞争性抑制剂，可减少胆固醇的生物合成，具有显著的降脂疗效，为降脂 药物中的首选药物。并通过改善内皮功能、抗血小板聚集、抑制动脉粥样硬化等作用降低心 血管病的发病率和病死率。近年来的研究发现他汀类药尚具有抗炎和免疫调节作用，在许 多风湿、类风湿性疾病及自身免疫性疾病中发挥一定疗效。
[0003] 脱氢洛伐他汀(dehydrolovastatin，DLVT)为近年获得的他汀类家族的新成员，是 洛伐他汀的脱氢衍生物，已获得国家发明专利授权。两药的结构式如下所示。我们前期对 DLVT的急性毒性实验研究表明，其小鼠灌胃给药最大耐受量为2000mg · kg^1，相当于洛伐他 汀临床上成人一天最大剂量的128倍，表明其毒性较低。前期研究表明DLVT除了具有和LVT 一样的的降脂作用外还对非特异性炎症及佐剂性关节炎有作用。
[0004] 洛伐他汀立体化学结构式如（1)所示：
[0005]
[0006] 脱氢洛伐他汀立体化学结构式如(2)所示：
[0007]
[0008] 炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD)是一种病因和发病机制都尚未 完全明确的非特异炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病 (Crohn's diseaSe，CD)，是一种遗传因素、环境因素和免疫因素共同参与的肠道持续性炎 症疾病。近年来，在世界范围内，IBD的发病率和死亡率逐年上升。该病病理变化复杂，临床 症状多样，若未及时得到缓解及治愈，引发为癌变的可能性极大。因此，被世界卫生组织列 为现代难治疾病之一。常用的治疗药物有氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和一 些中药，但至今尚无理想的药物，开发标本兼治、安全有效的药物有着重要的实际价值。
[0009] IBD病因尚未完全阐明，主要是侵及肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，以连续方式 逐渐进展可能与免疫异常、肠道菌群失调、遗传及精神状态等多种因素有关。目前认为肠黏 膜免疫功能失调，促炎性细胞因子分泌增多，导致炎症级联放大反应是其主要的发病机制。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用，以解决 上述【背景技术】中提出的问题。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0012] 脱氢洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用。
[0013] /七4古公昍进一生fth古安.日、次/4>-、'/丁的古伙化学结构式如下戶斤示：
[0014]
[0015] 作为本发明进一步的方案:脱氢洛伐他汀用于4%DSS诱导小鼠炎症性肠病的有效 剂量为33.6mg · kg-1 · d-1。
[0016] 作为本发明进一步的方案:所述抗炎症性肠病中促炎因子包括TNF-a、IL_6与IL-17,抗炎因子为IL-10。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0018] 本发明通过建立小鼠急性炎症性肠病模型、观察脱氢洛伐他汀对抗炎症性肠病的 治疗作用等试验，探讨脱氢洛伐他汀对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠抗炎症性肠病的防治作用 及作用机制，首次揭示脱氢洛伐他汀对IL-6、IL-10、IL-17、TNF-a及NF-kB的影响。脱氢洛伐 他汀通过抑制NF-kB信号通路，对TNF-a、IL-6、IL-17等促炎因子表现出明显的抑制作用，而 可以提高抗炎因子IL-10的水平而发挥抗炎症性肠病的作用，脱氢洛伐他汀治疗炎症性肠 病具有标本兼治、安全有效的功效。
【附图说明】
[0019 ]图1模型组和空白组小鼠体重的变化；
[0020] 图2 4%DSS诱导小鼠炎症性肠病活动指数；
[0021] 图3 DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠疾病活动指数的影响。
[0022] 图4 DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织病理学影响(HEX 100)图，（a)正常 对照，（b)模型对照，（c) SASP，（ d)DLVT，（ e) LVT;
[0023] 图5 DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织NF-κΒ表达的影响（SPX 200)图，（a) 空白对照组，（b)模型对照，（c) SASP，（ d)DLVT，（ e) LVT。
【具体实施方式】
[0024]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0025] 实施例1
[0026] -、实验性抗炎症性肠病动物模型的建立 [0027] 1材料和方法
[0028] 1.1实验动物：
[0029] 清洁级昆明小鼠（雄性），体重22-25克，由重庆医科大学实验动物中心提供。
[0030] 1.2主要试剂和药品：
[0031] 葡聚糖硫酸钠盐（Dextran sulfate sodium salt，DSS，Mff:36000-50000)(美国MP Biomedicals)
[0032] 大便隐血试剂盒(南京建成生物工程研究所）
[0033] 1.3主要仪器：
[0034] 电子天平
[0035] A2000S型电子分析天平（德国Sartorius)
[0036] Sigma_3k低温离心机(美国Sigma)
[0037] -80 °C超低温冰箱(德国）
[0038] UV-225紫外-可见分光光度计（日本）
[0039] BH-2型光学显微镜（日本Olympus)
[0040] 1.4溶液的配制：
[0041 ] 0.5%的羧甲基纤维素钠：
[0042] 4%DSS水溶液的配制:称取40gDSS溶解于双蒸水，并定容到1000ml。
[0043] 4%的中性甲醛（10 %中性福尔马林)溶液的配制：甲醛(40% ) 100mL，无水磷酸氢 二钠6 · 5g，磷酸二氢钠4 · Og，蒸馏水900ml。
[0044] 2 方法
[0045] 2.1小鼠炎症性肠病动物模型的建立：
[0046] 小鼠随机分组，适应性喂养7天，第8天自由饮用4%DSS水溶液，连续7d。在这期间， 每天定时称量小鼠体重，进行隐血试验和观察粪便性状。结肠组织取样:第8天，颈椎脱臼处 死小鼠，剪开腹腔，清理出结肠，剪下距离肛门处Icm剪下结肠2cm(直肠至升结肠），测量长 度。冰冷生理盐水反复冲洗干净，用清洁滤纸吸干水分。然后将结肠样本剪为两段:直肠端 段(约Icm)置入4°C4%甲醛溶液固定24h，常规石蜡包埋，切片，切片厚约6μπι，ΗΕ染色。余下 部分编号，称重，用铝箱包好，立即放入液氮(-196Γ)中速冻，转入低温冰箱(-80°C)存放。
[0047] 2.2观察指标：
[0048] 2.2.1临床症状观察评分/疾病活动指数，评分标准(表1)。
[0049] 表1DAI评分标准
[0051 ] 2.2.2形态学观测
[0052] 光镜下观察各组标本切片，每组15个视野（X 100, X 200)进行组织学损伤评分，求 其平均值，评分标准见表2。
[0053]表2组织学损伤评分标准
[0055] 2.2.3结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性的测定
[0056] 取结肠组织块在冰冷生理盐水中漂洗干净，干净滤纸吸干，准确称重后，立即用眼 科剪子剪碎，置于冰浴的玻璃匀浆器中，加入0.86%生理盐水后匀浆，按重量体积比为1:9 加匀浆介质制备成10%的组织匀浆。参照试剂盒方法测定结肠组织匀浆中MPO的活性。 [0057] 3统计学处理
[0058]实验数据用SPSS12.0统计软件处理，各组资料用（（X土s)表示，采用单因素方差分 析和非参数WiIcox on秩和检验，比较各组资料间的差异，P<0.05为差异有显著性。
[0059] 4结果
[0060] 4 · 1小鼠体重变化
[0061 ] 模型组和空白组小鼠体重的变化见图1模型组和空白组小鼠体重的变化。可看出 空白对照组小鼠体重增加比较平稳，而模型组小鼠从造模后第三天开始，小鼠体重不仅不 增加反而呈下降趋势。
[0062] 4.24 % DSS诱导小鼠炎症性肠病的临床症状
[0063]小鼠临床症状观察发现:正常对照组小鼠活动、毛色、大小便、生长均正常。模型组 小鼠，在饮用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出现隐血阳性，4-5d几乎所有小鼠粪便隐血阳 性，6-7d呈强阳性，甚至血便；同时伴有小鼠活动减少，体重明显减轻;粪便松软，或腹泻发 生，与人类IBD临床症状表现相似，表明4%DSS诱导小鼠炎症性肠病模型成功。如图2所示， 4%DSS模型组小鼠，3d后DAI开始出现持续显著增高。模型小鼠明显瘦弱，肛门周围毛色散 乱，有血样大便的痕迹。
[0064] 4.34%DSS诱导的小鼠炎症性肠病病理形态学改变
[0065]如附图3(b)所示，光镜下观察DSS模型组小鼠结肠上皮黏膜损伤明显:黏膜上皮糜 烂，腺体隐窝结构破坏;杯状细胞丢失，伴有中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等大量炎性细胞 浸润。正常对照组黏膜上皮完整，隐窝结构、杯状细胞正常，见图3(a)所示。
[0066] 4 · 44 % DSS诱导的小鼠结肠组织中MPO活性
[0067] 模型组的MPO明显升高，与正常组相比有显著差异，见表3:4%DSS诱导的炎症性肠 病小鼠 MPO的活性。
[0068] 表34%DSS诱导的炎症性肠病小鼠 MPO的活性（5土S:) Luu/u」 ''F<_u. U丄定」^normalgEt:!:牛父。
[0071 ] 5 讨论
[0072]据已有文献报道，DSS可诱导炎症性肠病。一种为急性期炎症性肠病模型，方法为 5%DSS水溶液给小鼠自由饮用，连续7天，国内外也有文献报道用3-5%DSS诱导结肠炎的； 我们在预实验的时候，曾尝试对该造模方式加以改进:采用给小鼠5%DSS溶液灌胃（0.8ml/ 只，bidX4d)，但实验动物并没有出现任何临床症状，提示出现这种情况有两种可能：一是 DSS摄入的量不够，二是这种造模给药方式，不能在肠腔内维持一定的浓度，产生对上皮组 织的毒性作用。所以，我们基于对预实验的观察，以及相关文献的报道，认为采用灌胃这种 方式给予小鼠 DSS溶液诱导肠炎是不太可能的，因为即使增加 DSS溶液的浓度，采取0.8ml/ 只，每天3次的给药方式，每天摄入的溶液体积也只有2.4ml，而正常小鼠一般饮水3-6ml/ 天。因此，我们根据预实验的情况和相关的文献报道，让小鼠自由饮用4%DSS溶液，连续7d 造模，诱导实验性肠炎;通过观察小鼠临床症状，肠黏膜损伤以及炎性细胞浸润情况，以疾 病活动指数(disease activity index,DAI)，结肠组织病理学评分和MPO活性评估4%DSS 诱导的小鼠 IBD模型是否成功。MPO是主要存在于中性粒细胞嗜天青颗粒中的一种酶，其活 性反映了中性粒细胞的浸润数目和活性，已被公认为评价组织炎症严重程度的一个指标。 [0073]预实验让小鼠自由饮用5%DSS溶液，第3天临床症状开始出现，如稀便、血便，第4 天开始陆续有小鼠死亡，说明5 % DSS浓度太高。前期研究用3.5 % DSS溶液效果不明显。 [0074] 实验结果显示，模型组小鼠饮用4%DSS溶液3d，开始有粪便出现隐血阳性;4-5d， 小鼠出现活动度明显减少、体毛凌乱;大便松软、稠状;体重减轻，粪便隐血阳性程度增强； 6-7d，可见肉眼血便，有腹泻发生，小鼠活动、进食及体重明显减少。光镜下观察结肠病理切 片显示，结肠黏膜上皮糜烂，几乎全部隐窝结构被破坏，杯状细胞丢失，部分病灶表面仅少 许上皮残留。炎症主要累及黏膜和黏膜下层，少数可达浆膜层;模型组小鼠结肠组织MPO活 性较正常小鼠显著增高，浸润的炎性细胞以中性粒细胞为主，伴有单核巨噬细胞，少量淋巴 细胞，单核细胞。在一些病变较轻的部位，可见到部分隐窝破坏、变形，排列紊乱，杯状细胞 减少。模型组MPO的活性明显增加。
[0075] 以上提示我们用4%DSS诱导小鼠结肠炎是可靠的，模型是成功的。
[0076] 二、脱氢洛伐他汀对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠实验性炎性肠病的防治作用研究
[0077] 1实验材料
[0078] 1.1实验动物：
[0079] 雄性昆明小鼠，体重22-25克，由重庆医科大学实验动物中心提供。
[0080] 1.2主要试剂和药品：
[00811葡聚糖硫酸钠(美国MP公司）
[0082]柳氮磺吡啶肠溶片(上海福达制药有限公司批准文号：国药准字H31020840)
[0083]大便隐血试剂盒(南京建成生物工程研究所）
[0084]髓过氧化物酶(MPO)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所）
[0085] 脱氢洛伐他汀(dehydrolovastatin，DLVT)，由重庆大新药业股份有限公司提供， 外观呈乳白色蓬松状粗粉末，微溶于水。批号：201401001。洛伐他汀（1〇抑5^ &^11，1^1')，由 重庆大新药业股份提供。批号:201401001。
[0086] IL-6、IL-10、IL-17、TNF-aELISA 试剂盒 R&D 公司
[0087] 1.3主要仪器：
[0088] 电子天平
[0089] A2000S型电子分析天平
[0090] XiangYiH165_W 离心机
[0091] -80 °C超低温冰箱(德国）
[0092] Rayto RT-6500酶标分析仪 [0093] BH-2型光学显微镜（日本Olympus)
[0094] 2 方法
[0095] 2 · 1实验动物分组：
[0096] 将50只昆明小鼠，雄性，随机分为5组，即正常对照组(normal )、炎症性肠病模型组 (model)、阳性药物（SASP，250mg · kg-1 · d-4、脱氢洛伐他汀(DLVT，33.6mg · kg-1 · d-〇和洛 伐他汀(LVT，33.6mg · kg< · cf1)，每组各10只。各药物处理组小鼠灌胃相应药物，正常组和 模型组给予等体积0.5 %的羧甲基纤维素钠，每日1次，连续给药IOd，第三天开始，除正常对 照组以外，其余各组自由饮用4%DSS水溶液，每天更换一次，直到实验结束，见表4动物分组 及给药方案。
[0097]表4动物分组及给药方案
[0100] 2.2小鼠炎症性肠病的评价
[0101]小鼠临床症状观察发现:正常对照组小鼠活动、毛色、大小便、生长均正常。模型组 小鼠，在饮用4%DSS溶液2d后，部分小鼠排便出现隐血阳性，4-5d几乎所有小鼠粪便隐血阳 性，6-7d呈强阳性，甚至血便；同时伴有小鼠活动减少，体重明显减轻;粪便松软，或腹泻发 生，与人类IBD临床症状表现相似，表明4 % DSS诱导小鼠 IBD模型成功。4 %DSS模型组小鼠， 3d后DAI开始出现持续显著增高。模型小鼠明显瘦弱，肛门周围毛色散乱，有血样大便的痕 迹。
[0102] 2.3小鼠血清中细胞因子的检测
[0103] 给药第10天，摘除眼球取血。离心取血清，按照ELISA(双抗体两步夹心酶联免疫吸 附法)试剂盒说明书操作，分别检测小鼠血清中IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α水平。
[0104] 具体操作如下：
[0105] (1)准备:标准品稀释和配制生物素抗体工作液和酶结合物工作液。将浓缩洗涤液 用双蒸水稀释（1:20)，加入标准品稀释液1.0 ml至冻干标准品中（浓度为10ng/ml)，再配成 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0pg/ml 浓度。
[0106] (2)取出冷冻血清解冻，12000\8,311^11。从11^-6、11^-10、11^-17、了呖-€[试剂盒取出 所需板条，除空白孔外，分别将标本和不同浓度标准品（100μΙ/孔)加入相应孔中，用封板封 住反应孔，37°C孵育90min。
[0107] (3)洗板:甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μ1，静置30sec，在厚迭吸水纸上拍干， 洗板5次。
[0108] (4)除空白孔外，加入生物素化抗体工作液（100μΙ/孔），用封板胶封住反应孔，37 °C 孵育 60min。
[0109] (5)洗板 4 次。
[0110] (6)除空白孔外，加入酶结合工作液（100μΙ/孔），用封板胶封住反应孔，37°C孵育 30min〇
[0川](7)洗板4次。
[0112] (8)加入显色剂100μΙ/孔，避光37°C孵育10_20min。
[0113] (9)加入终止液100μ 1 /孔，混匀后在450nm波长处测量OD值。
[0114] 2.4小鼠结肠组织病理形态学观察及小鼠结肠组织MPO活性检测
[0115] 结肠组织块在冰冷生理盐水中漂洗干净，干净滤纸吸干，准确称重后，立即用眼科 剪子剪碎，置于冰浴的玻璃匀浆器中，加入〇. 86%生理盐水后匀浆，按重量体积比为1:9加 匀浆介质制备成10%的组织匀浆。参照试剂盒方法测定结肠组织匀浆中MPO的活性。
[0116] 2.5小鼠结肠组织病理检查
[0117] 结肠组织10 %的甲醛溶液固定，石蜡包埋切片制作的标本，苏木精一伊红(HE)染 色，光镜下观察组织病理学变化。
[0118] 2.6NF-KB免疫组化染色
[0119] 将石蜡标本作结肠横截面连续切片，贴附于经多聚氨酸处理过的载玻片上，置入 60°C烘箱过夜。待样品收齐后，采用免疫组化SP法染色。具体操作步骤下：
[0120] (1)石蜡切片常规脱蜡至水：50°C左右二甲苯I30min，二甲苯Π 30π?η，100%、 95%、85%、70%酒精、蒸馏水各5min，再在蒸馏水中浸泡5min。
[0121] (2) 3 % H2O2室温孵育IOmin。（以消除内源性过氧化物酶的活性，3 % H2O2临时配 制。）
[0122] (3)蒸馏水洗 2minX3，PBS 浸泡 5min。
[0123] (4)抗原修复:采用热修复法。将切片置于盛有抗原修复液(0.0 lM枸橼酸缓冲液 P H 6.0)的玻璃容器中，放在电炉上加热，控制溶液温度维持在9 2 °C - 9 8 °C之间，持续10 -15min。停止加热后，自然冷却至室温（约需20-30min，勿将切片从缓冲液中取出），roS洗 5minX3〇
[0124] (5)滴加正常小鼠封闭血清工作液(试剂1)，室温孵育20min，倾去，勿洗。
[0125] (6)分别滴加一抗NF_kB(1 :100稀释），4°C过夜。阴性对照组加 PBS缓冲液作阴性对 照。
[0126] (7)PBS 冲洗 5minX3。
[0127] (8)滴加生物素化二抗工作液:生物素标记羊抗小鼠 IgG，37 °C孵育20min。
[0128] (9)PBS 冲洗 5minX3。
[0129] (10)滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液(试剂3)，37°C孵育20min。
[0130] (Il)PBS 冲洗 5minX3。
[0131] (12)DAB显色剂显色（用法:取Iml双蒸水，试剂盒中A、B、C试剂各加1滴，混均后滴 加至切片。显色剂应避光保存，即用即配），自来水洗3min。
[0132] (13)苏木素复染30秒(复染时间根据染色情况而定），自来水洗3min。
[0133] (14)浸入分化液3-4秒，自来水充分冲洗，60°C烘箱烤干。
[0134] (15)中性树胶封片。
[0135] 2.7免疫组化染色切片NF-kB蛋白表达的半定量分析
[0136] 显微镜下观察结肠组织各层的表达情况并摄影记录。阳性标准:NF-kB以胞质或胞 核部分被染成棕黄(褐)色为阳性；阴性对照:采用PBS缓冲液代替一抗，其余步骤完全相同。 采用GD-8型病理影像多媒体分析系统对各组免疫组化的切片随机采集，每组至少有3个以 上的动物组织切片，选取10个高倍视野(200 X 10)，测定面积积分光密度值(Area integral optical density，AI0D)显示被检测指标的染色强度，即表达量。 A〇D=_阳件积分光密度_ +管壁面积（即随机选定的视野面积)
[0138] 3统计学处理
[0139] 实验数据用SPSS12.0在统计软件处理，各组资料用（X土s)表示，采用单因素方差 分析，比较各组资料间的差异，P<〇.05为差异有显著性。
[0140] 4 结果
[0141] 4. IDLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠体重的变化
[0142] 模型组小鼠从饮用4%DSS第3天起，与空白组小鼠相比，体重明显下降；其余各给 药组小鼠体重的下降趋势均不及模型组。
[0143] 4.2DLVT和LVT对4 % DSS诱导的小鼠临床症状的影响
[0144] 小鼠临床症状观察发现:正常对照组小鼠行为活跃，生长正常。模型组小鼠，在饮 用4%DSS溶液2d后，部分小鼠粪便出现隐血阳性，4-5d几乎所有小鼠粪便隐血阳性，6-7d呈 强阳性，甚至血便；同时伴有小鼠活动减少，体重明显减轻;粪便松软，或腹泻发生，与人类 IBD临床症状表现相似，表明4 % DSS诱导小鼠 IBD模型成功。如图3所示，DSS模型组小鼠，3d 后DAI开始出现持续显著增高；SASP阻遏DAI增高，DLVT和LVT有相似的明显改善DSS诱导的 IBD小鼠临床症状的作用。
[0145] 4.3DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织病理形态学的影响
[0146] 光镜下观察DSS模型组小鼠结肠上皮黏膜损伤明显，黏膜上皮糜烂，腺体隐窝结构 破坏;杯状细胞丢失，伴有中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等大量炎性细胞浸润，见图4(b)。 SASP、DLVT和LVT组结肠黏膜损伤明显减轻，上皮结构较完整，腺体隐窝排列较整齐，炎性细 胞浸润减少，分别见图4(c)、图4(d)、图4(e)。光镜下观察各组标本切片，每组15个视野（X 100, X200)按照"表2组织学损伤评分标准"，进行组织学损伤评分，求其平均值，评分结果 见表5 :DLVT和LVT对4%DSS诱导小鼠结肠组织病理形态学的影响。
[0147] 表OTLVT和LVT对4%DSS诱导小鼠结肠组织病理形态学的影响
[0149] **Ρ<〇·〇1 是与 normal 组比较;##Ρ<0·01 是与 model 组比较。
[0150] 4.4DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠血清中11^-6、11^-10、几-17、了呖-〇等细胞因子 影响
[0151] 如表6所示，模型组小鼠血清IL-6、IL-17、TNF_a含量均显著高于正常对照组(p< 〇. 〇 1)，其余各给药组小鼠血清IL-6、IL-17、TNF-a含量均显著低于模型组。模型组小鼠血清 IL-10的含量显著低于正常对照组，其余各给药组IL-10的含量显著高于模型组。
[0152] 表6DLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠血清中IL-6、IL-17、TNF-a的含量的影响G 土 s?n = 10)
[0154] <0.01是与 Normal 组比较;##p<0.01是与 model组比较。
[0155] DLVT和LVT对TNF-α、IL-6、IL_17等促炎因子表现出明显的抑制作用，而可以提高 抗炎因子IL-10的水平。
[0156] 4. OTLVT和LVT对4%DSS诱导的小鼠结肠组织中MPO的活性
[0157] 小鼠结肠组织MPO活性检测结果见表7。可见DSS诱导小鼠结肠组织上皮和固有层 中中性粒细胞浸润显著增多，MPO活性2.19 ± 0.42U/g，较正常对照组0.92 ± 0.22U/g明显增 高。SASP明显抑制中性粒细胞的浸润和MPO增高(P〈0 · 01)。01^(33 · 6mg/kg)和LVT(33 · 6mg/ kg)亦明显抑制MPO活性(P〈0.01)。
[0158] 表7DLVT和LVT对4 % DSS诱导的小鼠结肠组织MPO活性的影响
[0161 ] **P〈0 · 01 与 normal组比较;##P〈0 · 01与model组比较。
[0162] 4.6NF-KB免疫组化染色
[0163] 小鼠结肠组织免疫组化染色显示，正常对照组结肠组织中NF-KB几乎没有表达，见 图5(a)，而DSS诱导模型组小鼠结肠组织中表达NF-kB的阳性细胞数明显增多，见图5(b)，呈 棕黄色。SASP组、DLVT组、LVT组小鼠结肠组织中NF-κΒ阳性细胞不仅数量和模型组相比明显 减少，分别见图5(c)、图5(d)、图5(e)。
[0164] 4.7免疫组化染色切片NF-κΒ蛋白表达的半定量分析
[0165] 显微镜下观察结肠组织各层的表达情况并摄影记录。采用⑶-8型病理影像多媒体 分析系统对各组免疫组化的切片随机采集，每组至少有3个以上的动物组织切片，选取10个 高倍视野(200 X 10)，测定面积积分光密度值(Area integral optical density，AI0D)显 示被检测指标的染色强度，即表达量。分析结果见表8DLVT和SASP对4%DSS诱导小鼠结肠组 织NF-κΒ表达的影响。 rmw ατ^τλ 阳性积分光密度
[0166] AJOD- ---- 管壁面积（即随机选定的视野面积） 「01671 丟8m ΛΓΓ和丨ΛΓΓ对4%DS；S；读导/1、鼠结賜铂钡NF-KR丟伏的影晌 LUiOYj . U 丄定·.U
丄·^ . no 定·^moae iaicii 牛乂。
[0170] 综上所述，4%的DSS诱导的急性结肠炎小鼠 DAI显著增加、结肠组织出现明显的炎 症损伤且组织中MPO活力显著增加，血清中促炎因子TNF-a、IL-6、IL-17的浓度显著增加而 抗炎因子IL-IO的浓度显著降低，结肠组织中NF-κΒ表达也显著增加。经脱氢洛伐他汀和洛 伐他汀治疗后可显著缓解DSS炎症性肠病小鼠的DAI、改善结肠的组织学损伤、降低结肠组 织中MPO活性，对TNF-α、IL-6、IL-17等促炎因子表现出明显的抑制作用，而可以提高抗炎因 子IL-10的水平，还NF-kB信号通路发挥抗炎症性肠病的作用。
[0171] 三、讨论
[0172]近年的基础和临床研究发现，他汀类药物抑制类异戊二稀（isoprenoid)中间体如 异戊二稀焦磷酸法尼酯（farnesy Ipyrophosphate，FPP)和类异戊二稀四异戊二稀焦磷酸 (geranylgeranyIpyrophosphate，GGPP)合成，进而抑制细胞内类异戊二稀依赖的蛋白，发 挥抗心血管重构、抗肿瘤、预防痴呆、抗炎和免疫调节等多种作用，因而对身患代谢性疾病 兼有风湿、类风湿性关节炎和炎症性肠病具有良好临床疗效。
[0173] 在炎症性肠病整个病理过程中都有细胞因子参与，它们构成了一个细胞因子网 络，可以互相调控其产生，其中TNF-a、IL-6、IL-17等为促炎因子，而IL-IO则为抗炎因子。 NF-kB是一类具有多向活性的转录调控因子，参与多种基因的表达和调控，在炎症及免疫反 应、细胞增殖、凋亡和感染等方面起着重要的作用。NF-kB/IkB复合物可被细胞因子(TNF-a， IL-Ιβ)、氧化剂、病毒抗原等多种因素激活，NF-κΒ移位进入胞核，启动相关基因转录。
[0174] 本发明中涉及到的英文缩写的具体名称如表9所示。
[0175] 表9
[0178] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。
[0179] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包 含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当 将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员 可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1. 脱氨洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的脱氨洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用，其特征在 于，脱氨洛伐他汀的立体化学结构式如下所示：3. 根据权利要求1所述的脱氨洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用，其特征在 于，脱氨洛伐他汀用于4%DSS诱导小鼠炎症性肠病的有效剂量为33.6mg · kg-i · cfi。4. 根据权利要求1所述的脱氨洛伐他汀在制备抗炎症性肠病药物中的应用，其特征在 于，所述抗炎症性肠病中促炎因子包括TNF-a、比-6与IL-17,抗炎因子为IL-10。
【文档编号】A61P1/00GK106074500SQ201610536669
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】邓庆华, 杨元娟, 杨治国, 唐倩, 夏瀛, 胡清伟
【申请人】重庆医药高等专科学校