一种2?取代芳乙烯基?n?甲基化喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用
【专利摘要】本发明提供了一种2?取代芳乙烯基?N?甲基化喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述衍生物结构式如式I所示；其中，R为氢、五元或六元含氮杂环基；所述R中任意一个或多个氢被取代，取代基选自烷基、羟基、胺基。本发明所述2?取代芳乙烯基?N?甲基化喹啉衍生物是一种新型的Top II催化型抑制剂，具有更低的毒副作用，其对抗肿瘤具有普适性。本发明所述衍生物对多种癌细胞株，具有显著的抑制作用，抑制活性在0.2?16μM，绝大部分化合物的活性优于阳性对照VP?16，在制备新型的抗肿瘤药物方面具有良好的应用前景。式I。
【专利说明】
一种2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在制备抗肿瘤药 物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明属于药物与有机合成技术领域，更具体地，涉及一种2-取代芳乙烯基-N-甲 基化喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 拓扑异构酶(Topisomerase，Top)II是一类在细胞内普遍存在，解决DNA在复制、转 录、和染色体分离中产生的拓扑问题的酶，其作为一个重要的药物靶点在抗肿瘤药物研发 中被广泛关注。
[0003] 据研究，喹啉类生物碱具有多种生理活性。包括抗微生物、抗肿瘤、抗氧化等。二苯 乙烯类化合物也同样具有良好的生物活性和低毒性，例如白藜芦醇就是这样一个例子，有 鉴于此，我们喹啉环的2-位引入芳乙烯基，并在4-位引入不同的胺链考察对抗肿瘤活性的 影响，研究他们在抗肿瘤方面的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明根据现有技术中的不足，提供了一种2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生 物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005] 本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
[0006] 本发明提供了一种2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在制备抗肿瘤药物中的 应用，所述衍生物结构式如式I所示，
[0007]
式I;
[0008] 其中，R为氢、五元或六元含氮杂环基；
[0009]所述R中任意一个或多个氢被取代，取代基选自烷基、羟基、胺基。
[0010] 本发明在喹啉环的2-位引入芳乙烯基，并在4-位引入不同的胺链，同时发现当2-位引入N-乙基咔唑基，喹啉N季铵化后抗肿瘤活性得到大幅提高，因此作为一类活性较高的 抗肿瘤物质。
[0011] 优选地，R为氢、六元含氮杂环基或六元含氮氧杂环基;所述R中任意一个或多个氢 被取代，取代基选自Cp5烷基、羟基、胺基。
[0012] 优选地，R为氢、甲基哌嗪基、哌啶基、吗啉基、羟乙基哌嗪基、二甲氨基乙基哌嗪基 或二甲氨基丙基哌嗪基。
[0013] 优选地，所述抗肿瘤药物为抗宫颈癌、乳腺癌、肝癌或淋巴癌的药物。
[0014] 优选地，所述药物剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮剂或乳剂。
[0015]本发明同时提供一种2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在制备抑制拓扑异构 酶II活性的药物中的应用，所述衍生物结构式如式I所示，
[0016]
式I;
[0017]其中，R为氢、五元或六元含氮杂环基；
[0018] 所述R中任意一个或多个氢被取代，取代基选自烷基、羟基、胺基。
[0019] 优选地，R为氢、六元含氮杂环基或六元含氮氧杂环基；
[0020] 所述R中任意一个或多个氢被取代，取代基选自烷基、羟基、胺基。
[0021] 优选地，R为氢、甲基哌嗪基、哌啶基、吗啉基、羟乙基哌嗪基、二甲氨基乙基哌嗪基 或二甲氨基丙基哌嗪基。
[0022]本发明在喹啉环的2-位引入芳乙烯基，并在4-位引入不同的胺链，同时发现当2-位引入咔唑基是必不可少的，当咔唑基换成苯基或取代苯基，对Top II的抑制活性将降低。 [0023]本发明所述化合物对多种细胞株，具有显著的抑制作用，抑制活性在0.2_16μΜ，绝 大部分化合物的活性优于阳性对照VP-16。
[0024] Top II抑制剂分为Top II毒剂和催化型抑制剂，前者抑制酶的活性通过与酶形成 酶-药物-DNA三元复合物，促进DNA往形成断裂中间体的方向进行，由于断裂DNA会诱导机体 对DNA进行修复和重组，可能会产生耐药性和基因毒性，因此Top II毒剂往往具有较大的毒 性和副作用，代表性药物如VP-16。而Top II催化型抑制剂由于不形成断裂DNA因此具有更 低的毒性和副作用，为目前Top II抑制剂研究的热点方向。我们的实验证明，本发明所公开 的新型2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物在体外实验中，SPS-L3在10μΜ时可以完全抑 制Top II对超螺旋DNA的解旋作用，远高于阳性对照VP16(et〇p〇Side)的抑制浓度（50μΜ)。 而且与传统的Top II毒剂不同，2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物不会形成酶-DNA-药 物三元复合物，不会产生断裂DNA。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026] (1)所合成的系列化合物证明咔唑基是必不可少的，当咔唑基换成苯基或取代苯 基，对Top II的抑制活性将降低。
[0027] (2)本发明提供的化合物对多种细胞株，具有显著的抑制作用，抑制活性在0.2-16 μΜ，绝大部分化合物的活性优于阳性对照VP-16。在制备新型的抗肿瘤药物方面具有良好的 应用前景。因此本发明所述的2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物可用于制备抗癌的药 物。
[0028] (3)本发明2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物是一种新型的Top II催化型抑 制剂，具有更低的毒副作用。另外，Top II在肿瘤细胞中普遍高表达，已成为肿瘤治疗的重 要靶标，我们的化合物证明对Top II有效，说明其抗肿瘤具有普适性。
【附图说明】
[0029] 图1.SPS-L3抑制Top II对pBR322超螺旋质粒DNA的解旋实验图。
[0030] 图2.SPS-L3对Top II的断裂DNA实验影响图。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过说明书附图和实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实 施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的 技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0032] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。
[0033]化合物的合成，参照专利黄志纾，古练权，刘真权等，一种2-取代芳乙烯基-N-甲基 化喹啉衍生物的制备及其在抗阿尔兹海默症药物中的应用，申请号2013102680611。
[0034] 实施例1:本专利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物对Top II ATPase抑 制作用
[0035]因为我们目标是为了获得Top II的催化型抑制剂，如果用全酶筛选，无法区分所 得到的化合物是催化型抑制剂还是毒剂，所以我们在筛选时采用重组的酶，仅仅是Top II 的ATPase部分，去掉了和DNA结合的C端和中间的催化区，这样可以有效的排除形成酶-药 物-DNA三元复合物机制的影响，筛选所得到的化合物再进行其他实验的验证和确证。
[0036] 孔雀绿-磷钼酸铵比色法检测化合物对Top II ATPase抑制活性，选用384孔板直 接配制15yL的筛选体系，依次加入ddH2〇，5 X ATPase reaction buffer，ATPase，待测化合 物，ATP。振荡器上震荡30s，转移至37°C烘箱孵育一定时间（Top II ATPase孵育时间为 45min)，每孔加入40yL现配的孔雀绿试剂和5yL34%柠檬酸钠，混匀，静置15min后使用酶标 仪测定样品在620nm下的紫外吸光度（0D值），根据OD值的变化计算得到待测化合物的 ATPase抑制活性。其中，每次加入Iyg的Top II ATPase，被测试化合物终浓度为100μΜ，ΑΤΡ 的终浓度为ImM。阳性对照为I，4_萘醌
[0037] 结果如表1所示，只有芳基为N-乙基取代咔唑基的化合物（SPS-L1~L7)才显示明 显的Top II ATPase抑制活性，100μΜ下，抑制活性66-86%，比阳性对照1，4-萘醌（100μΜ， 62%抑制率)还要高。苯环或取代苯环，吲哚基的活性不佳，而喹啉环的4位氨基取代则有很 大的基团宽容度，受取代胺基种类影响较小。
[0038] 表1. 2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物对TopII ATPase抑制活性
[0043] 实施例2:本专利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物对Hela，MCF_7，HepG2 实体瘤肿瘤细胞株(贴壁细胞)的的抑制作用
[0044] 我们将初筛中对Top II ATPase抑制活性大于50%的化合物(SPS-Ll~L7)进行细 胞水平的活性验证，以MTT法测试化合物的抗肿瘤活性，选取的细胞株包括Hela，MCF-7， HepG2实体瘤细胞株。取对数生长期的相应细胞株的细胞悬液(经0.25 %胰蛋白酶消化使细 胞脱落)〇. 5-1.0 X 105/ml，分装于96孔培养板中，150yL/孔，培养24小时，待细胞贴壁后，分 别加入50yL相应不同浓度的药物或试液，实验设阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组 (VP16)和6个不同浓度给药组。每组设4个平行孔。置恒温5 % C〇2培养箱37 °C培养48小时，在 实验结束前4小时每孔加入20yL MTT液（5mg/ml)，4小时后吸弃培养液，每孔加入0.1ml DMSO，平板摇床震摇。5分钟待结晶溶解后置酶联检测仪，于570nm波长测各孔的OD值，按下 列公式求生长抑制率，并用Bliss法求出半数抑制浓度IC 50。
[0045] 药物对肿瘤细胞抑制率=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值）X 100%。
[0046]结果如表2所示。所有化合物对三株肿瘤细胞Hela，MCF-7，HepG2显示很强的抗肿 瘤活性，优于阳性对照VP16。
[0047]表2 ·化合物SPS-Ll ~L7对He la ,MCF-7，HepG2和CA-46肿瘤细胞的 IC5Q (MTT，μΜ)
[0049]实施例3:本专利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物对CA-46肿瘤细胞株 (悬浮细胞)的的抑制作用
[0050]取对数生长期的相应细胞株的细胞悬液0.5-1 .OX 105/ml，分装于96孔培养板中， 150μ!7孔，培养24小时，分别加入50yL相应不同浓度的药物或试液，实验设阴性对照组(培 养基）、阳性对照组(VP16)和6个不同浓度给药组。每组设3个平行孔。置恒温5%⑶ 2培养箱 37°C培养48小时，在实验结束前4小时每孔加入20yL MTT液(2.5mg/ml)，4小时后每孔加入 0.1ml三联液，平板摇床震摇。5分钟待结晶溶解后置酶联检测仪，于570nm波长测各孔的OD 值，按下列公式求生长抑制率，并用Bliss法求出半数抑制浓度IC50。
[0051 ] 药物对肿瘤细胞抑制率=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值）X 100%。
[0052]通过对体外细胞毒实验测试了化合物的抗肿瘤活性，结果如表2所示本专利所述 化合物在体外对肿瘤细胞株CA-46具有较强的抑制作用。
[0053]实施例4:本专利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物对Top II抑制作用 [0054] 在上述实施例2和3初步酶学水平和细胞水平筛选的基础上，选择对Top II ATPase有抑制活性的化合物对Top II全酶进行抑制活性实验，以确证化合物的对Top II的 抑制活性。采用PBR322质粒松散法进行细胞体系外拓扑异构酶活性测定。其中重组人拓扑 异构酶II购于TopoGEN公司。将IU的拓扑异构酶与待测药物（终浓度20，10，5，2.5，1.25， 0.625μΜ)以及0.2yg超螺旋pBR322质粒混合加入拓扑异构酶缓冲液中，37°C水浴孵育30分 钟后进行琼脂糖凝胶电泳，GelRed染色后利用凝胶成像仪进行检测。结果如图1所示，本专 利所述的化合物在浓度为1 〇μΜ时可以完全抑制Top 11的活性，远高于阳性对照VP16 (etoposide)的抑制浓度(50μΜ)。因此，本专利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物 可用于制备以拓扑异构酶为靶点的抗癌药物。
[0055] 实施例5:本专利所述2-取代芳乙烯基-N-甲基化喹啉衍生物对Top II介导的DNA 断裂实验
[0056]该实验可以检测化合物抑制酶的活性过程是否有断裂DNA产生，是属于毒剂还是 催化型抑制剂。
[0057] 1.配制1 %的琼脂糖凝胶及5 X Top II buffer，随后使用ddH20稀释化合物及配置 0 · 1μg/μL的pBR322DNA溶液。
[0058] 2.迅速从-80°C冰箱中取出购买回来的Topo II(浓度为20U/yL)并用CldH2O稀释得 到浓度为5U/yL的Topo II溶液，置于冰上待用。
[0059] 3.在20yL的反应体系中分别加入2yL的pBR322DNA溶液，2yL的Topo II溶液，2yL的 化合物溶液，4yL的5XTopo II buffer，并用CldH2O补全体积。
[0060] 4.配制好样品后，立即放入37 °C水浴中孵育6min。
[0061 ] 5.依次加入IyL 10%SDS，2yL 250mM NaEDTA(pH8.0)以及2yL 0.8mg/mL的蛋白酶 1(。45°(：水浴中孵育3〇1^11。
[0062] 6.样品与5yL 6Xloading buffer混合后70°C水浴孵育2min。取12yL加入琼脂糖 凝胶的样品孔中，65V电压下进行电泳lh。
[0063] 7.电泳完毕后，将琼脂糖凝胶放入含有Gel-Red的I XTAE染色液中染色0.5h，再在 65V电压下进行电泳lh，凝胶成像仪中拍照。
[0064] 实验结果如图2显示，阳性对照VP16产生明显的缺口DNA(N)及线性DNA(L)，这都是 DNA断裂的条带，而我们的化合物SPS-L3不仅无断裂条带的产生，而且还会减少VP16断裂条 带的产生，本发明同时在除SPS-L3其他化合物中均发现此现象，说明该系列化合物是一典 型的Top II催化型抑制剂。
【主权项】
1. 一种2-取代芳乙締基-N-甲基化哇嘟衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在 于，所述衍生物结构式如式I所示，式I; 其中，R为氨、五元或六元含氮杂环基； 所述R中任意一个或多个氨被取代，取代基选自烷基、径基、胺基。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R为氨、六元含氮杂环基或六元含氮氧杂环 基;所述R中任意一个或多个氨被取代，取代基选自Cl-5烷基、径基、胺基。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R为氨、甲基赃嗦基、赃晚基、吗嘟基、径乙 基赃嗦基、二甲氨基乙基赃嗦基或二甲氨基丙基赃嗦基。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗宫颈癌、乳腺癌、肝癌 或淋己癌的药物。5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为注射剂、片剂、丸剂、胶囊 剂、悬浮剂或乳剂。6. -种2-取代芳乙締基-N-甲基化哇嘟衍生物在制备抑制拓扑异构酶II活性的药物 中的应用，其特征在于，所述衍生物结构式如式I所示，式I; 其中，R为氨、五元或六元含氮杂环基； 所述R中任意一个或多个氨被取代，取代基选自烷基、径基、胺基。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，R为氨、六元含氮杂环基或六元含氮氧杂环 基； 所述R中任意一个或多个氨被取代，取代基选自Cl-5烷基、径基、胺基。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，R为氨、甲基赃嗦基、赃晚基、吗嘟基、径乙 基赃嗦基、二甲氨基乙基赃嗦基或二甲氨基丙基赃嗦基。
【文档编号】A61K31/4709GK106074551SQ201610480497
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】黄世亮, 黄志纾, 古练权, 麦燕雯, 刘真权
【申请人】中山大学