葫芦素b在制备蛋白磷酸酶2a癌性抑制因子抑制剂中的应用
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从葫芦科植物中分离提取的类四环三萜类化合物葫芦素B作为蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂的应用。本发明中葫芦素B作为蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂中的主要成分，能够显著抑制蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子表达，可单独给药或者联合治疗,包括与放疗、化疗、手术治疗、其它生长因子抑制剂和性激素抑制剂，以及任何肿瘤治疗药物和方法的联合应用。
【专利说明】
葫芦素B在制备蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂中的应用
技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及一种葫芦素B在制备蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂中的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤尤其是恶性肿瘤是威胁人类健康的一大疾病，肿瘤治疗是当今人类面临的一大医学难题。肿瘤往往是由于癌基因发生获得功能性突变、抑癌基因发生丧失功能性突变所引起。这些基因发生突变往往导致肿瘤细胞逃逸凋亡、对正常的抗生长信号不敏感、获得自给自足的生长信号及无限复制的潜能、以及组织浸润与转移的能力，进而产生复发及药物耐受。因此，肿瘤事实上是细胞信号传导发生异常的疾病。针对肿瘤发生发展中起关键作用的因子寻找特异结合并抑制其活性的化合物，对肿瘤的机理研究以及治疗都具有积极意义。
[0003]蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(cancerousinhibitor ofprotein phosphatase2A，CIP2A)是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的内源性癌性抑制因子，通过抑制PP2A的蛋白磷酸酶活性，进而使癌蛋白c-Myc丝氨酸62位组成性磷酸化，稳定c_Myc蛋白表达。同时，PP2A作为一种蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，在肿瘤细胞中发挥着抑癌因子的作用，作为Akt及ERK的上游因子，PP2A能够直接去Akt及ERK的磷酸化。据报道，在很多癌症中，PP2A活性被抑制，与癌细胞的恶性转化密切相关。在肿瘤细胞中PP2A的活性抑制多是因为肿瘤细胞过表达CIP2A。近年来，CIP2A在包括肺癌，胃癌，乳腺癌在内的各种实体瘤及血液系统肿瘤中的作用被不断发现，通过稳定癌蛋白c-Myc功能，及活化Akt、E2F1、PLK1等因子，参与肿瘤的恶性转化、复发及药物耐受。据报道，在癌细胞中，通过抑制CIP2A重激活PP2A的活性能够显著抑制肿瘤生长及恶性转化。因此，筛选直接靶向CIP2A的化合物，对于改善肿瘤治疗疗效具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明通过从使用葫芦素B抑制CIP2A，从而激活其底物抑癌蛋白PP2A活性以达到个体化治疗目的。
[0005]本发明中葫芦素B可以为任何药物治疗学上可接受的葫芦素B盐类，所形成的以葫芦素B或其盐为主要成分的CIP2A抑制剂可以为任何药物治疗学上可接受的剂型，葫芦素B的使用剂量可以为任何药物治疗学上可接受的剂量。
[0006]本发明用于治疗胃癌、乳腺癌、肺癌、及神经胶质瘤。，可单独给药或者联合治疗，包括与放疗，化疗，手术治疗，其它生长因子抑制剂和性激素抑制剂，以及任何治疗肿瘤的药物和方法联合应用。特别是葫芦素B与顺铂联合使用能够有效治疗胃癌、肺癌及神经胶质瘤。
[0007]葫芦素B在细胞和动物荷瘤模型中显著抑制CIP2A表达，对其它正常组织无明显毒副作用，同时具有剂量适中，疗效显著，作用靶点明确等优点，在临床上具有广泛抗癌应用前景。
【附图说明】
[0008]图1所示为本发明葫芦素B对胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞及正常细胞生长的影响。
[0009]图2所示为本发明葫芦素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞中CIP2A表达水平检测图。
[0010]图3所示为本发明葫芦素B激活胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞中CIP2A底物PP2A活性检测图ο
[0011]图4所示为本发明葫芦素B和顺铂联合应用的协同抗胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞的作用效果对比图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例进一步解释本发明。实施例中用到的主要材料如下:
[0013]葫芦素B:购自上海源叶生物科技有限公司，纯度经高效液相色谱(HPLC)测定大于95%。使用二甲基亚楓(DMSO)配置成lOOmmol/L的储液，冻于-20度，每次使用时用培养基稀释至工作浓度。
[0014]细胞系:实施例中所用细胞系均购自ATCC或中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0015]抗体:CIP2A，抗体购自美国Santa &1^公司沖？24，64?0!1抗体购自美国(^11SignalingTechnology公司DPP2A蛋白磷酸酶活性测定试剂盒购自美国Upstate公司。
[0016]实施例1葫芦素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞生长
[0017]分别将处于对数生长期的各种类型的癌细胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)、和DBTRG(神经胶质瘤)细胞及人正常支气管上皮细胞16-HBE，人正常胃黏膜上皮细胞GES-1接种于96孔板(每孔接种约5000个细胞，90μ1培养基)，培养(37°C，5%⑶2培养箱)24小时后用不同浓度梯度(10-1200nmol/L)的葫芦素B(Cucurbitacin B,CuB)处理5种细胞。分别培养20和44小时后每孔加入10μ1浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液，继续培养4小时。终止反应后，吸掉培养基，每孔加入150μ1 二甲基亚砜，低速振荡充分溶解，然后用酶标仪测定490nm处的吸光值(0D490)。根据生长抑制率结果，计算出CuB对6种细胞24小时的半数抑制浓度(IC5q)，具体IC5q值见图1F，结果显示CuB可抑制多种不同类型的癌细胞的增殖(图1A-1D)，且对正常的16-!fflE和GES-1毒性相对较小(图1E)。
[0018]实施例2葫芦素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞的CIP2A蛋白表达。
[0019]具体实施方法如下:
[0020]分别将各种类型的癌细胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)和DBTRG(神经胶质瘤)细胞按照一定的密度接种于6孔板，24小时后待细胞融合度达到80%后，分别以不同浓度的(:118处理5607901细胞(0醒01/1、251111101/1、50醒01/1、100醒01/L)，MCF-7/Adr(0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L)，NC1-H1975 细胞(Onmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L)、DBTRG细胞(0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/1^)，24小时后用1\503 Loading Buf fer裂解细胞提取总蛋白，以同等量的蛋白进行Western Blot免疫印迹实验，分别用抗CIP2A和抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)抗体来进行免疫印迹，检测加药处理情况下它们表达的变化情况。结果如图2所示，胃癌细胞SGC7901(图2A)，乳腺癌细胞MCF-7/Adr(图2B)，肺癌细胞NC1-H1975(图2C)，以及神经胶质瘤细胞DBTRG(图2D)中，CuB都能够剂量依耐性地下调CIP2A蛋白的表达。
[0021]实施例3葫芦素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞中CIP2A的底物蛋白PP2A的磷酸酶活性
[0022]具体实施方法如下:
[0023]分别将各种类型的癌细胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)和DBTRG(神经胶质瘤)细胞按照一定的密度接种于1cm培养皿，24小时后待细胞融合度达到70 % -80 %左右，分别以不同浓度的CuB处理SGC7901细胞(Onmo I/L、25nmo I/L、50nmo I /L、100nmol/L)，MCF-7/Adr(0nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L)，NC1-H1975 细胞(Onmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L)、DBTRG细胞(Onmol/L、10nmoI/L、200nmoI/L、400nmo I/L)，24小时后用RIPA裂解液裂解四种经过不同浓度的CuB处理的细胞，蛋白溶液置于-20 0C保存。各取I OOyg蛋白，分别与4yg PP2A抗体孵育，4 0C孵育1小时。在混合液中分别加入40μ1的蛋白A琼脂糖珠(proteinA agarose beads)，4°C孵育2小时。离心收集beads，用预冷的700ylPBS洗涤3次，然后用500ylSer/ThrAssay Buffer洗涤一次。下一步，加入750臟01凡的磷肽化1108。11(^6。1^(16)30<€孵育10分钟，期间不断搅拌。下一步，加入10(^1的孔雀石绿磷酸检测溶液(Malachite Green Phosphate Detect1n Solut1n)，混勾后在650nm波长下，多功能酶标仪(B1-Tek)检测吸收值。如图3所示可知，葫芦素B抑制胃癌、乳腺癌、肺癌及神经胶质瘤细胞中CIP2A的底物蛋白PP2A的磷酸酶活性。实验结果表明，随着浓度的增加，PP2A酶活性呈现明显上升趋势。*表示与对照组相比有显著差异(*，p<0.05;**，ρ<0.01)。
[0024]实施例4葫芦素B和顺铂协同抑制胃癌、肺癌及神经胶质瘤细胞检测实验
[0025]将各种类型的癌细胞系SGC7901(胃癌)、MCF-7/Adr(乳腺癌)、NC1-H1975(肺癌)和DBTRG(神经胶质瘤)细胞预贴壁24小时以后，用不同浓度的CuB(0nmOl/L、25nmOl/L、50nmol/L)联合顺铂(0ymol/L、10ymol/L、20ymol/L)处理BGC823细胞；用不同浓度的CuB(01、50醒01/1、1001111101/1)联合顺铂01、1(^11101/1、2(^11101/1)处理从:1-!11975细胞；用不同浓度的(^1113((^1]101/1^、50111]101/1^、100111]101/1^)联合顺钼((^1]101/1^、1(^1]101/1^、2(^1]101/1^)处理胶质瘤U251细胞，44小时后加入MTT检测试剂再孵育4小时，然后用酶标仪测定其在490nmol/L的吸光值(0D490)。结果如图4所示，葫芦素B联合顺铂处理，可明显降低胃癌，肺癌及神经胶质瘤细胞的0D490，表现出显著的协同效果，但是葫芦素B联合顺铂不能显著降低乳腺癌的0D490。葫芦素B和顺铂协同抑制胃癌，肺癌及神经胶质瘤细胞。
[0026]上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
[0027]另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。
【主权项】
1.一种蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂，其特征在于使用葫芦素B抑制蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子。2.根据权利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂，其特征在于葫芦素B可以为任何药物治疗学上可接受的葫芦素B盐类。3.根据权利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂，其特征在于葫芦素B可以为任何药物治疗学上可接受的剂型。4.根据权利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂，其特征在于:葫芦素B及其类似物可以为任何药物治疗学上可接受的剂量。5.根据权利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂，其特征在于用于治疗胃癌及神经胶质瘤。6.根据权利要求1所述的蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子抑制剂，其特征在于可单独给药或者联合治疗，包括与放疗、化疗、手术治疗、其它生长因子抑制剂和性激素抑制剂，以及任何肿瘤治疗药物和方法的联合应用。7.根据权利要求6所述的联合治疗方法，其特征在于葫芦素B可以与顺铂联合使用。
【文档编号】A61K31/575GK106074567SQ201610522886
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】刘莹, 郭阳, 张亮, 刘雪文, 段超, 黄秋月
【申请人】湖北医药学院