一种轮叶党参提取物在制备预防肾损伤药物及保健品中的新用图
【专利摘要】本发明公开了一种轮叶党参（Codonopsis lanceolata）提取物在制备保护顺铂（Cisplatin）致急性肾损伤药物中的应用，属于医药产品研究开发领域。动物实验研究表明：与模型组相比，该轮叶党参提取物可以有效降低血清中肌酐（CRE），尿素氮（BUN），炎症因子(TNF?α)，白介素1β（IL?1β）和肾组织中丙二醛（MDA）的含量；此外，组织病理学表明，该轮叶党参提取物可以减少肾组织的病变，减少肾组织细胞的凋亡；免疫组织化学表明轮叶党参提取物能够有效降低Bax的表达，并且升高Bcl?2的表达。因此，可把该轮叶党参提取物及含有该提取物的有效组分制备成预防急性肾损伤的药物或保健品，其药物或保健品形式可以是现有的任何剂型，如片剂，胶囊剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。
【专利说明】
一种轮叶党参提取物在制备预防肾损伤药物及保健品中的新 用途
技术领域
[0001] 本发明公开了蒸制轮叶党参(Steamed Coc/o/3opsis _/a/3 ceo_/a ia)在制备预 防急性肾损伤药物的新用途，属于中药的新生物活性的医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 顺铂（Cisplatin)对多种肿瘤具有良好的疗效，是临床使用的最有效和最常见的 抗肿瘤药物之一。目前，顺铂作为一种重要的化疗药物在临床广泛应用。顺铂作为一种广谱 抗癌药物，疗效与用药量成正比，但同时随着用量的增大，药物毒性也增大，容易引起多种 不良反应，如胃肠道反应、骨髓抑制、耳毒性等，尤其是它在肾脏中高聚集、高排泄、高代谢。 其中肾毒作用尤为突出，这对顺铂的剂量使用造成了影响，在一定程度上限制了它的应用。 统计显示，单用顺铂时，肾毒性发生率高达28-36%，而临床化疗肾损害的发生率为25%- 35%。这极大的限制了顺铂的用量和临床的应用。如何预防顺铂的毒副作用成为了人们关注 的问题。 氧化应激已被证实是顺铂肾毒性的重要机制之一，顺铂进入机体后，通过抑制细胞还 原和清除活性氧簇(ROS)的能力，使细胞中ROS水平升高，使机体发生氧化应激，最终导致机 体组织器官的损伤。生物体内存在两类活性氧清除系统，一类是酶促防御系统，主要包括超 氧化物歧化酶(S0D)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽氧过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶 (GSH-R)等，另一类是非酶促反应系统，包括维生素 A、C、E，半胱氨酸，辅酶Q、硒等。在正常情 况下，机体的活性氧代谢处于平衡状态，顺铂可以通过三种方式影响活性氧簇打破机体的 这种平衡：其一，顺铂经过水解后产物的活性物质可以迅速与机体内含巯基的谷胱甘肽 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧剂反应，使它们降解或失活，从而引发氧化应激反应。 其二，顺铂在机体内代谢的过程中会产生大量的氧自由基，自由基可以引起线粒体膜脂质 过氧化反应导致线粒体功能抑制，还可以使膜蛋白功能的受损，破坏核酸及染色体。其三， 在机体长成ROS的过程中，铁离子是重要的催化剂，而细胞内的铁离子的主要来源为细胞色 素 P450(CYP)系统，顺铂可以通过影响CYP系统诱导ROS的产生，进而引发机体氧化过激反 应。 目前，相关证据表明，热加工方法会使中草药的结构发生改变，并导致生物活性的变 化，且具有改变口感，便于保存等优点。在这些热加工方法中，蒸制是对于中草药最有效的 方法。蒸制人参(红参)就是一个具有代表性的例子，蒸制使其人参皂苷进行广泛的转换，因 此红参比之前具有更多的药理活性（Weon, J.B. Cognitive-Enhancing Effect of Steamed and Fermented Codonopsis lanceolata \ A Behavioral and Biochemical Study. Evid Based Complement Alternat Med, 2014. 2014: p. 319-436)。并且之前的研究表明，蒸制和发酵能够增强轮叶党参对神经的认知和保护作用(Lili Jiao , X.Z., Mingzhu Wang, e t a 1 · Chemical and antihyperglycemic activity changes of ginseng pectin induced by heat processing. Carbohydrate Polymers, 2014. 114: p. 567-573)。但单纯探讨蒸制轮叶党参对顺铂致肾损伤保护作用尚无研究。 轮叶党参Coc/o/3OjOSis 2a/3ceo2a ia属桔梗科党参属多年生草本植物，有补虚润 肺、通乳排脓之功效，常用于气津两伤或气血两亏(李晓峰.党参的化学成分及药理作用研 究概况[J].中国乡村医药，2014, 21: 83-84)。轮叶党参主要的药理功效包括抗炎症、对 缺血性损伤和酒精性肝损伤的保护作用(Cho, K. Protective effect of Coc/ofiOjOsis lanceola ta root extract against alcoholic fatty liver in the rat. J Med Food, 2009. 12(6): p. 1293-301)。 基于传统中药热处理理论，轮叶党参经蒸制处理后，还原糖含量增加，口感好，有效成 分容易溶出，极大的提高了轮叶党参的利用率。 到目前为止，未见有关该药物对顺铂(Cisplatin)所致急性肾损伤保护作用的报道，本 发明创造性的提出并证明了该提取物的急性肾损伤保护作用。蒸制轮叶党参可以通过高温 处理轮叶党参而获得，操作简便，是一种非常有前途和开发价值的肾保护剂。
【发明内容】
[0003]本发明提供了蒸制轮叶党参在制备预防顺铂(Cisplatin)诱导的急性肾损伤药物 中的应用。 本发明所述的蒸制轮叶党参在用于上述用途时，其口服是安全的，在口服情况下，其可 以以常规的形式给药，如片剂，胶囊剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。 本发明制备保护急性肾损伤药物是由该药物粉末与固体或液体的赋形剂一起构成的， 这里使用的固体或液体的赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个例子，散剂是内服的 粉末剂，它的赋形剂有乳糖，淀粉，糊精，碳酸钙，合成或天然硫酸铝，氧化镁，硬脂酸镁，碳 酸氢钠，干燥酵母等;溶液剂的赋形剂有水，甘油，1，2-丙二醇，单糖浆，乙醇，乙二醇，聚乙 二醇，山梨糖醇等;软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木蜡、 液体石蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。本发明的药物组合物可以按现有技术中已知的方法 如混合、制粒、压片来制备。本发明药物组合物还可以包括各种药学使用的任何组分，如香 味剂、着色剂、甜味剂等。 本发明的有益效果在于，蒸制轮叶党参可以通过高温加热来获得，其操作方便，容易获 得，工业化前景好，同时具有疗效显著和毒副作用小等优点。 本发明可以通过下面的实验例进一步说明。 实验例.蒸制轮叶党参对顺铂致小鼠肾损伤的保护作用及机制 1材料与方法 1.1实验动物 SPF级ICR小鼠，雄性，体重20-22g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格 证号：SCXK(吉）2011-0004。在12h白天和夜晚循环的环境中适应性饲养，自由饮水和进食， 1周后进彳丁试验。 1.2试剂与药物 新鲜的轮叶党参，购自吉林省白山市，由吉林农业大学李伟副教授鉴定;顺铂，上海思 域化工科技有限公司，纯度>99.0%;苏木素-伊红染液(H&E)，肌酐(CRE)，尿素氮(BUN)，丙二 醛(MDA)等试剂盒，购自南京建成生物工程研究所;炎症因子TNF-α和IL-Ιβ，购自美国R&D公 司；兔来源单克隆抗体Bax和Bcl-2,购自美国Cell Signaling Technology公司；免疫组化 试剂盒，购自武汉博士德;Hoechst 33258染色液，购自上海碧云天生物技术有限公司；其余 试剂均为分析纯。 1.3仪器 BP21ID分析天平，德国Sartorius ;HC-2517高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公 司；组织匀浆机，上海书俊仪器设备有限公司；连续光谱扫描式酶标仪Spectra Max Plus 384，美国分子生物仪器公司；高压灭菌蒸汽锅，上海博讯实业有限公司；显微镜Olympus BX-60,日本奥林巴斯株式会社。 1.4样品的制备 蒸制轮叶党参(steamed Coc/o/3〇j〇sis _/a/3ceo_/aia, SCL)的制备:鲜轮叶党参洗 净、去皮，高压灭菌蒸汽锅105°C蒸Ih，烘箱45°C烘干，打碎成粉状，过40目筛，经水超声波提 取即得蒸制轮叶党参提取物。该提取物加入CMC-Na助悬，根据预实验及参考文献，确定SCL 给药剂量为200和400mg/Kg。 2实验方法 2.1动物分组及给药 将ICR小鼠随机分成空白对照组(Normal )、肾损伤模型组(Cisplatin)、SCL低剂量给药 组(Cisplatin+SCL-200 mg/kg)、SCL高剂量给药组(Cisplatin+SCL-400 mg/kg)剂量组，每 组10只。每天各给药组按体重lOmL/Kg连续灌胃10天，每天1次，空白组和模型组均灌胃同体 积生理盐水。于第7天给药后，禁食不禁水12h，肾损伤模型组和各给药组一次性腹腔注射 20mg/Kg顺铂生理盐水溶液，继续给药3天，末次给药后禁食不禁水12h后眼眶静脉丛取血， 离心制备血清，脱臼处死小鼠，迅速取出肾组织。将左肾置于生理盐水中制成匀浆，3000 rmp/min离心5 min，取上清液，试剂盒检测相关生化指标;右肾10%甲醛固定后进行病理学 及免疫组织化学分析。 2.2血清中CRE，BUN及肾组织中MDA的测定 取离心后的血清，分别采用肌氨酸氧化酶法和脲酶法试剂盒测定血清中CRE和BUN水 平;取肾组织匀浆上清液，采用TBA法测试盒测定MDA的含量，按照试剂盒说明书进行操作， 酶标仪相应波长处比色测定OD值，计算含量。 2.3血清中了即-€1和11^1|3炎症因子的测定 采用ELISA法测定血清中炎症因子TNF-α和IL-W的水平，根据说明书进行操作，酶标仪 450nm波长处比色法测定OD值，计算含量。 2.4 H&E病理组织学染色 取小鼠肾脏中部做横切面取材，常规石蜡包埋、切成5μπι的切片，每组随机选取3张组织 切片，进行脱蜡，梯度过酒精，苏木素 (Hematoxy I in)染细胞核，自来水冲洗返蓝，之后伊红 (Eosin)染细胞质，常规脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肾小管病变。 2.5 Hoechst 33258染色 随机从每组中选取3张组织切片，常规石蜡包埋，切成5μπι的切片，用Hoechst 33258 (10 yg/mL)进行染色，之后PBS洗3次，染色的细胞核在紫外光的激发下可视并在荧光显微 镜下拍摄。 2.6免疫组织化学染色 同上，肾组织5μπι石蜡切片进行常规脱蜡，在柠檬酸缓冲液（0.01M，pH 6.0)中进行 20min抗原修复，之后用TBS(0.01M，pH 7.4)洗3次，加入1%血清蛋白孵育111，加入8&1(1: 200)，Bcl-2( 1:400)抗体4° C孵育过夜，之后加入二抗孵育30min，用DAB显色和苏木素染 色，光学显微镜下检测，细胞周围有棕黄色即为阳性染色。 2.7统计学方法 所有数据应用SPSS 17.0软件进行分析处理。各项数据以Mean 土 SD表示，P〈0.01或P 〈0.05具有统计学意义。 3结果 3.1对小鼠体重及脏器指数的影响 与正常对照组小鼠相比，一次性顺铂注射3天后，小鼠状态萎靡，毛色灰暗，体重略有减 轻，但无统计学意义(P >0.05)，肾指数显著升高(P〈0.05)，表明代谢器官受损严重，出现 了免疫抑制反应;SCL各给药组，小鼠状态明显好转，体重下降得到缓解，可以明显改善顺铂 所致的肾指数下降(P〈0.05)，但对肝和脾指数影响较小。 表1. SCL对小鼠体重及脏器指数的影响（Mean 土 SD，n=10) Table I. Effects of SCL on body weight and organ indices in mice (Mean ± SD, n=10^
注:与空白对照组比较，<0.01;与模型组比较，<0.05 3.2对小鼠血清中BUN,CRE水平及肾组织中MDA含量的影响 如表2所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中BUN和CRE水平均显著性升高（P < 〇.01 )，表明急性肾损伤模型成立;与模型组比较，SCL低剂量组(200 mg/Kg)能够降低血清 中BUN和CRE水平，但不具有显著性(P > 0.05);SCL高剂量组(400 mg/Kg)小鼠血清中BUN和 CRE水平均显著性降低(P < 0.05)。 与空白组相比，模型组小鼠肾组织匀浆中MDA的含量显著增加 (P < 0.05)，表明顺铂急 性肾损伤导致脂质过氧化;与模型组相比，SCL各剂量组均能不同程度的降低肾组织中MDA 的含量，高剂量具有显著性差异(P <〇.〇5)。 表2. SCL对小鼠血清中BUN, CRE及肾组织中MDA水平的影响（Mean 土 SD, /3 =10) Table 2. Effects of SCL on BUN and CRE in serum, and MDA content in kidney tissues (Mean ± SDj n =10)
注:与空白对照组比较，<0.01;与模型组比较，bP <0.05 3.3对小鼠血清中TNF-α和IL-1 β水平的影响 研究表明：炎症反应在顺铂致肾毒性的发生和发展起着重要的作用，因此采用ELISA法 观察血清中TNF-a和IL-Ιβ炎症因子的水平。结果见附图1，与空白组比较，模型组中小鼠血 清中TNF-a和IL-Ιβ的水平明显升高(P < 0.01或P < 0.05);与模型组相比，SCL各剂量给药 组均能够降低血清中TNF-a和IL-Ιβ的水平，且具有显著性差异(P <0.01或P <0.05)。表 明SCL能够部分通过抑制炎症因子的表达而发挥肾保护作用。 3.4 H&E肾组织病理形态学 H&E染色结果表明（见附图2A):空白组肾组织结构正常，可见正常肾小球及其周围肾小 管，无肾小管变性坏死及透明管型等现象;而模型组可见肾小管上皮细胞胞界不清，部分细 胞坏死，核固缩或消失，肾小管管腔内有均质红染的透明管型等现象;低剂量组与模型组比 较，细胞坏死程度减轻，核固缩或消失现象减少，但仍可见部分透明管型；高剂量组细胞坏 死明显减少，透明管型现象显著减少，可见清晰的球囊腔，细胞形态基本正常。 3.5 Hoechst 33258染色 Hoechst 33258染色结果表明（见附图2B):空白组无蓝色荧光的细胞核，说明无细胞凋 亡现象；而模型组可见大量的具有均匀荧光强度的细胞核且大部分细胞核表现出正常轮 廓;SCL低、高剂量组中表现出明显的细胞核破碎和凝结减少，说明其能显著抑制细胞凋亡， 且呈现剂量依赖性关系。 3.6对细胞调亡相关蛋白表达的影响 抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax在调控线粒体依赖通路中具有重要角色[11]，因此 本实验用免疫组织化学法检测了 SCL对Bcl-2和Bax表达的影响。如附图3A和3B所示:模型组 表现出Bax的高表达和Bcl-2的低表达;而相反地，SCL各剂量给药组均在不同程度上降低了 Bax的表达，并且升高了 Bcl-2的表达，且呈现一定的剂量依赖性关系，此结果进一步验证了 病理学观察结果，亦证明SCL部分通过抗凋亡信号通路而发挥肾保护作用。 3.7对肾纤维化的影响 经给药治疗后，HE染色观察发现，SCL能有效减少顺铂所致的肾组织纤维化病变。 4结论 SCL在200-400mg/kg剂量范围内，可以显著改善顺铂诱导的小鼠急性肾损伤，主要通过 改善急性氧化应激水平及降低炎症因子，部分通过抗凋亡信号通路而发挥肾保护作用，是 一种很有前景的肾组织保护剂。 实施例药物的实施例 制备药剂的实施例一 胶囊剂的制备200g蒸制轮叶党参粉末，药用淀粉适量，两者充分混匀，装胶囊，制成 1000粒胶囊，每粒重0.25g，每粒含蒸制轮叶党参200mg。口服，每次4粒，每日三次。 制备药剂的实施例二 片剂的制备200g蒸制轮叶党参，药用淀粉适量，两者充分混匀，用乙醇做粘合剂制湿 颗粒，干燥，过120目筛整粒，装胶囊，每粒200 mg，每次口服1 -2粒，每日2次。 制备药剂的实施例三 滴丸剂的制备聚乙二醇4議300g，在水浴上熔化，加入蒸制轮叶党参原料200g，搅拌 均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90 °C下滴入冷却过的液体石蜡中（温度土 4°C )，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得蒸制轮叶党参滴 丸1000粒。口服，一次4粒，每日三次，饭后服用。 以上根据上述实施方式对本发明的蒸制轮叶党参在制备预防急性肾损伤药物的应用 进行了说明，但本发明并不限于上述实施方式，在不脱离其要旨的范围内，可在各种方式中 实施本发明。除了上述实施方式之外，其它等同技术方案也应当在其保护范围之内，在此不 再--叙述。 附图1.蒸制轮叶党参对小鼠血清中炎症因子的影响(Mean±SD, /3 =10) 附图2.肾脏组织学变化和Hoechst 33258染色（X400) 附图3. SCL对凋亡相关蛋白表达的免疫组织化学分析（X 400)。
【主权项】
1. 一种轮叶党参（C oc/o/JOjOsis』a/3ceo』aia )提取物在制备预防急性肾损伤 药物及保健品中的新用途。2. 根据权利要求1所述的轮叶党参提取物，其特征在于:轮叶党参根经高温蒸制，干燥， 粉碎，提取所获得的提取物。3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述的肾损伤疾病为顺铂(Cisplatin)所 致的氧化应激损伤，具体包括改善顺铂所致的肾纤维化，细胞凋亡及炎症反应。4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于:将蒸制轮叶党参(Steamed Cot/o/3〇j〇sis h/jceohia)提取物作为有效组分或与其它药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或 添加成份混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成用于治疗或预防急性肾损伤的制药 中可接受的剂型，如片剂，胶囊剂，丸剂，软胶囊，颗粒剂和贴剂等。
【文档编号】A23L33/00GK106074661SQ201610559411
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月16日
【发明人】李伟, 赵立春, 孙印石
【申请人】吉林农业大学