豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用及该豌豆活性肽的制备方法，该肽粉由分子量小于1000Da的肽组成，肽粉来自于豌豆蛋白水解产物；制备方法如下：(1)利用碱性蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解反应后将所得到的豌豆蛋白水解物进行冷冻干燥；(2)利用超滤膜对豌豆蛋白酶解液进行分级分离，得到活性最强的组分；(3)收集活性最高的组分，冻干成粉末即所得豌豆肽粉。(4)将干燥得到的粉末溶解在细胞培养液DMEM中，制备成含不同浓度豌豆肽的细胞培养液，用于测定豌豆肽对癌细胞生长的抑制作用。该豌豆活性肽在对癌细胞的抑制率能达到61.92％。
【专利说明】
豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用及其制备方法
技术领域：
[0001] 本发明涉及豌豆活性肽的应用，尤其是一种豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应 用及其制备方法。
【背景技术】：
[0002] 肝癌发病率和病死率在恶性肿瘤中分别位居第5和第2位，全球每年大约有70万人 死于肝癌，是严重威胁世界人民健康的恶性肿瘤之一。近年来治疗肝癌的主要手段是以手 术切除为基础、并辅助化疗、热疗等综合治疗。尽管随着外科治疗技术的提高，其发病率和 死亡率都呈下降趋势。然而由于大多数原发性肝癌患者的病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅 速导致早期诊断困难，而且治疗后的耐药、复发和转移成为了肝癌患者死亡的主要原因。因 此，开发出一种适合癌症病人日常食用及手术等治疗后用于保健的功能性食品能在一定程 度上缓解癌症病情。
[0003] 豌豆是一种优良的植物蛋白资源，豌豆蛋白占干豌豆质量的23%~25 %，豌豆蛋 白是一种较好的必需氨基酸源，其组成比较平衡，与FA0/WH0推荐模式较为接近。然而，由于 蛋白的可消化性差，因此豌豆蛋白的营养价值不能充分发挥。目前我国的豌豆蛋白一般被 用作饲料，没有很好地利用豌豆蛋白的营养价值，造成了资源的浪费。据研究表明，目前全 球所面临的问题是随着蛋白质需求量的增加，许多优质的蛋白资源却不能被有效利用，因 此将这部分作为副产物的优质植物蛋白资源加工为高附加值产品的方法就有待改善，经过 水解分离精制得到的多肽，具有高溶解性、高稳定性、高吸湿保湿性、抗凝胶性等特点，尤其 是小分子肽，人体吸收速度快，利用率高，同时具有多种生物活性，是一种能够利用植物蛋 白资源的手段。
[0004] 现代营养学研究发现，人体对蛋白质的消化吸收主要是以低肽的形式吸收。据报 导，肽的吸收机制优于蛋白质和氨基酸。当前关于肽的活性研究主要集中于其抗氧化、抑菌 和降血压等发面。关于抗肿瘤多肽的研究，主要来源是海洋生物类，本专利开发了一种来源 于豆类植物蛋白的抗肿瘤多肽，成本更低，为抗肿瘤多肽的原料来源提供了更优的资源。
【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是提供一种制备抑制肝癌细胞生长的活性多肽的方法，优选出碱性 蛋白酶酶解豌豆蛋白的方案，得到抗肿瘤肽粗品。经过中空纤维超滤膜装置和搅拌式超滤 装置分级分离纯化，得到纯度较多的抗肿瘤肽。
[0006] 为实现以上目的，本发明所采用的实施方式如下：
[0007] -种豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用。
[0008] -种豌豆活性肽在抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞生长中的应用。
[0009] -种豌豆活性肽在抑制人肝癌细胞HepG2中的应用。
[0010] -种豌豆活性肽在抑制人乳腺癌细胞SK-BR-3中的应用。
[0011] -种豌豆活性肽在抑制人胃癌细胞MGC-803中的应用。
[0012] 而且，所述的豌豆活性肽的分子量小于lOOOKDa。
[0013]而且，所述的豌豆活性肽的制备方法为，步骤如下：
[0014] ⑴用去离子水配制4%-6%(g/100ml)豌豆蛋白溶液，70°c-90°c下热处理豌豆蛋 白10min-30min，调节pH值为7.5-9.0，加入碱性蛋白酶，在45 °C -60 °C水浴中反应4h-6h后， 90°C_100°C 沸水浴灭酶 10min-15min;
[0015] ⑵将水解后得到的豌豆蛋白水解液冷冻干燥，将干燥粉溶解在细胞培养液DMEM 中，制备成含不同浓度豌豆肽的细胞培养液；
[0016] ⑶利用孔径大小不同的滤膜对豌豆蛋白酶解液进行分级分离，得到分子量小于 1000 KDa的超滤组分；
[0017]⑷将分子量小于1000 KDa的超滤组分冻干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0018]而且，所述的分级分离是采用中空纤维超滤膜装置和搅拌式超滤装置联合使用。
[0019] 本发明的优点和积极效果是：
[0020] 1、本发明采用碱性蛋白酶水解豌豆蛋白的方法制备出一种能抑制HepG2细胞生长 的活性肽，通过超滤膜得到纯度较高的活性肽组分。该豌豆活性肽在对癌细胞的抑制率能 达到61.92 %。
[0021] 2、本发明工艺简单，成本低廉，应用范围广泛;对今后开发利用含有豌豆多肽的保 健品的生产奠定了理论基础。
[0022] 3、本发明为患癌病人开发一种安全性高的保健品，同时为研究和开发多肽的新功 效提供数据，有助于满足人们日益提高的生活水平要求。
【附图说明】：
[0023] 图1是豌豆蛋白酶解液、蛋白粉、5-FU对癌细胞生长抑制作用比较图；
[0024] 图2是倒置显微镜下观察的豌豆多肽对癌细胞形态结构的影响；
[0025] 图3是各级超滤组分对癌细胞生长抑制作用比较图；
[0026]图4为本发明方法的流程图。
【具体实施方式】：
[0027] 实施例1
[0028] 一种豌豆活性肽在抑制人肝癌细胞HepG2中的应用。
[0029] 所述的豌豆活性肽的制备方法为，步骤如下：
[0030] (1)蛋白酶解液的制备:准确称取6g豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去离子水中混匀，70 °C下热处理豌豆蛋白15min，按照酶与底物比为lOOOOU/g加入碱性蛋白酶，调节pH值为8.5， 在55°C水浴锅中反应5h后，90°C沸水浴灭酶IOmin，测定水解度为18.18% ;
[0031] (2)将水解后得到的豌豆蛋白水解液进行冷冻干燥，将干燥粉溶解在细胞培养液 DMEM中，制备成含不同浓度豌豆肽的细胞培养液用于测定对癌细胞生长的抑制作用；
[0032] (3)将用碱性蛋白酶酶解得到的豌豆蛋白酶解液通过中空纤维膜超滤装置和搅拌 式超滤装置分离成分子量（>60KDa，6KDa-60KDa，lKDa-6KDa，〈IKDa)的各个组分，操作步骤 如下：
[0033] a.安装超滤装置
[0034] b.清洗超滤膜
[0035] c.将豌豆蛋白酶解液用蒸馏水稀释至固形物含量为2%后，用蠕动栗输送进中空 纤维中，调节蠕动栗的转速和出液口的流速，使装置的压力维持在一个安全范围内，待进豌 豆蛋白酶解液全部进入中空纤维后，将浓液口的截留液进行稀释重新超滤，重复多次，直至 浓液口截留液的固形物含量基本保持不变，在此期间收集截留液和滤过液，并经旋转蒸发 仪浓缩后冻干成肽粉用于检测对癌细胞生长的抑制作用。
[0036] (4)将所得大活性最强的超滤组分收集，冻干成粉末，即所得豌豆肽粉；
[0037] (5)用MTT法检测豌豆蛋白酶解液对癌细胞生长的抑制作用
[0038] 将豌豆肽粉以一定浓度加到细胞培养液DMEM中，用于检测豌豆肽对癌细胞体外生 长的抑制作用，操作步骤如下：
[0039] a.将处于对数期的细胞用胰酶消化成单细胞悬液，计数后，调整细胞密度为5 X 104个/mL，以每孔IOOmL接种到96孔板中，在37°C，5%C02培养箱中培养24小时；
[0040] b.向实验组细胞中每孔加200uL相应的豌豆肽细胞培养液，空白对照组加200uL完 全培养液，以含相同浓度豌豆蛋白粉的培养液为阴性对照和含相同浓度5-FU的培养液为阳 性对照，在37°C，5%C02培养箱中继续培养24小时；
[00411 c.吸出旧培养液，每孔加入5mg/mLMTT溶液20uL和细胞培养液180uL，37摄氏度再 培养4小时后，小心吸出培养上清液，每孔加入150uLDMS0，震荡15分钟，使紫色洁净物充分 溶解；
[0042] d.用酶标仪在570nm处测定每孔的吸光度值(A值），以空白孔调零，记录实验结果；
[0043] f.按照以下公式计算对肿瘤细胞的抑制率:抑制率
[0044] 图1为豌豆蛋白酶解液、蛋白粉、5-FU对癌细胞生长抑制作用比较图，从图中可以 看出豌豆蛋白粉对HepG2细胞影响较小，但经蛋白酶作用后生成的酶解产物对HepG2细胞生 长的抑制率大大提高，在浓度为lmg/mL时对HepG2细胞的抑制率相当于5-氟尿嘧啶的 68.13%〇
[0045] 图2为倒置显微镜下观察豌豆蛋白酶解液对癌细胞形态的影响 [0046] a: 100%DEME培养液培养24小时后细胞形态；
[0047] b:含lmg/mL豌豆蛋白酶解液的DMEM培养液培养24小时后细胞形态；
[0048] c:含lmg/mL5-FU的DMEM培养液培养24小时后的细胞形态。
[0049] 从图中可以看出，用100 %DMEM培养液培养的细胞呈纺锤状，形态规则，细胞贴壁 较好;经药物作用后大多数细胞变圆，皱缩，边界不清，即死细胞较多。
[0050] 图3为各级超滤组分(浓度为lmg/mL)对癌细胞生长的抑制作用，从图中可以看出 分子量在IKDa以下的肽段对HepG2细胞生长的抑制作用最强，经分离后，活性组分纯度较 高，相比分离前，分子量在IKDa以下的肽粉活性增强。对癌细胞的抑制率能达到61.92%。 [0051 ] 实施例2
[0052] 一种豌豆活性肽在抑制人乳腺癌细胞SK-BR-3中的应用。
[0053]所述的豌豆活性肽的制备方法为，步骤如下：
[0054] ⑴蛋白酶解液的制备:准确称取Sg豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去离子水中混匀，70 °C下热处理豌豆蛋白15min，按照酶与底物比为lOOOOU/g加入碱性蛋白酶，调节pH值为8.5， 在55°C水浴锅中反应4h后，90°C沸水浴灭酶15min，测定水解度为16.39% ;
[0055] ⑵将水解后得到的豌豆蛋白水解液冷冻干燥，将干燥粉溶解在细胞培养液DMEM 中，制备成含不同浓度豌豆肽的细胞培养液；
[0056] ⑶利用孔径大小不同的滤膜对豌豆蛋白酶解液进行分级分离，得到分子量小于 1000 KDa的超滤组分；
[0057]⑷将分子量小于1000 KDa的超滤组分冻干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0058] 实施例3
[0059] 一种豌豆活性肽在抑制人胃癌细胞MGC-803中的应用。
[0060]所述的豌豆活性肽的制备方法为，步骤如下：
[00611 ⑴蛋白酶解液的制备:准确称取6g豌豆蛋白粉，加入到IOOmL去离子水中混匀，70 °C下热处理豌豆蛋白15min，按照酶与底物比为lOOOOU/g加入碱性蛋白酶，调节pH值为8.0， 在50°C水浴锅中反应4h后，90°C沸水浴灭酶15min，测定水解度为17.10% ;
[0062]⑵将水解后得到的豌豆蛋白水解液冷冻干燥，将干燥粉溶解在细胞培养液DMEM 中，制备成含不同浓度豌豆肽的细胞培养液；
[0063]⑶利用孔径大小不同的滤膜对豌豆蛋白酶解液进行分级分离，得到分子量小于 1000 KDa的超滤组分；
[0064]⑷将分子量小于1000 KDa的超滤组分冻干成粉末，得到豌豆活性肽粉。
[0065]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用。2. -种豌豆活性肽在抑制肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞生长中的应用。3. -种豌豆活性肽在抑制人肝癌细胞HepG2中的应用。4. 一种豌豆活性肽在抑制人乳腺癌细胞SK-BR-3中的应用。5. -种豌豆活性肽在抑制人胃癌细胞MGC-803中的应用。6. 根据权利要求1-5任一权利要求所述的豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用，其 特征在于:所述的豌豆活性肽的分子量小于lOOOKDa。7. 根据权利要求1-5任一权利要求所述的豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用，其 特征在于:所述的豌豆活性肽的制备方法为，步骤如下： ⑴用去离子水配制4%-6%，g/100ml豌豆蛋白溶液，70-90°C下热处理豌豆蛋白10-30min，调节pH值为7.5-9.0，加入碱性蛋白酶，在45-60 °C水浴中反应4-6h后，90-100 °C沸水 浴灭酶l〇_15min; ⑵将水解后得到的豌豆蛋白水解液冷冻干燥，将干燥粉溶解在细胞培养液DMEM中，制 备成含不同浓度豌豆肽的细胞培养液； (3)利用孔径大小不同的滤膜对豌豆蛋白酶解液进行分级分离，得到分子量小于 lOOOKDa的超滤组分； ⑷将分子量小于l〇〇〇KDa的超滤组分冻干成粉末，得到豌豆活性肽粉。8. 根据权利要求7所述的豌豆活性肽在抑制癌细胞生长中的应用，其特征在于:所述的 分级分离是采用中空纤维超滤膜装置和搅拌式超滤装置联合使用。
【文档编号】A61P35/00GK106075384SQ201610445484
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】王艳萍, 潘芬
【申请人】天津科技大学