一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物及其合成方法
【专利摘要】本发明提供了一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，该药物的有效成分为多肽，多肽由丝氨酸和天门冬氨酸两种氨基酸组成，多肽中含有2～50个氨基酸，丝氨酸和天门冬氨酸的个数比为(0.25～4)：1，药物中有效成分的质量含量为50～60％。与现有技术相比，本发明以骨质疏松治疗为目标、以来源于体内天然蛋白的小分子活性多肽为骨靶治疗药物，该靶向药物兼具有成骨细胞靶向性、良好的促进成骨能力，低细胞毒性和副作用，较低的用药量，将为未来骨质疏松治疗提供重要药选择。
【专利说明】
一种靶向増强成骨细胞骨形成的药物及其合成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物及其合 成方法。
【背景技术】
[0002] 骨是高等脊椎动物体内一种高度特异的结缔组织，它提供了对肌体的支持作用和 肌肉附着部位。它也是无机离子的主要来源，并积极参与体内的钙磷平衡。骨骼的正常发育 和维护需要骨不断吸收和重建。生理状态下，这种平衡是协调的，成骨细胞、破骨细胞以及 骨细胞的功能正常，骨量和微观结构的完整性保持在一个稳定的状态。然而，这种骨改建失 衡是众多骨疾病包括骨质疏松症，佩吉特氏症，骨质疏松症，骨转移癌，类风湿性关节炎，骨 髓炎等的重要原因。
[0003] 作为一个复杂的活组织，骨主要由三种不同类型的细胞:成骨细胞，破骨细胞和骨 细胞。成骨细胞是骨形成细胞，来源于局部的成骨祖细胞，负责合成骨基质。破骨细胞是骨 吸收细胞，核大，来源于多种造血组织。这两种类型的细胞只存在于骨表面的矿化骨基质， 而骨细胞位于骨基质内，并能吸收并形成骨基质。由于其通过突触相连的特性。骨细胞外基 质是由有机质以及高度矿化的羟基磷灰石组成的。随着骨生物学研究的不断深入，近几年 骨代谢疾病的治疗药物不断发展，骨形成表面、骨吸收表面、破骨细胞、骨基质等已经作为 新的治疗靶点纳入研究。虽然有些研究产物已应用于药物的开发，但具体到骨及细胞受体， 大多数新开发的治疗药物不具备骨特异性。
[0004] 骨质疏松症(0 Serteoporo Seri Ser)是一种由骨代谢失衡引起的骨量减少、骨 骼微细结构发生破坏所导致骨骼脆弱而易发生骨折的全身性疾病。骨质疏松症是一个世界 范围内重要的健康问题。随着人口老龄化的加重，骨质疏松症的患病人数显著增加。目前， 全世界约有2亿人罹患骨质疏松症，其发病率已跃居常见病的第七位。其中绝经后女性的患 病率更高。65岁以上的女性高发骨折，严重影响中老年的生活质量、健康和寿命。
[0005] 目前治疗骨质疏松症的药物分为三类：1)抑制骨吸收药物，如双磷酸盐、雌激素 等;2)促进骨形成药物，如甲状旁腺素、氟化物等;3)双向作用药物:维生素 K、锶盐等。由于 骨组织有着硬度大、局部血供不丰富、渗透性差和生理生化过程特殊等特点，按一般的给药 途径很难使药物转运至病灶部位。这些药物常通过全身给药，增大使用剂量才能在骨组织 中达到有效的治疗浓度。由于药物缺乏骨特异性，不仅降低了药物的治疗指数，而且会对病 人的非骨组织或器官造成不必要的毒副作用，如激素替代疗法的长期副作用的最近的报告 显示，以代表药物甲状旁腺素为例，应用超过两年疗效降低，骨量丢失，甚至严重副作用可 有神经症状，肾衰竭等。因此寻求一种靶向性能好的治疗骨质疏松的药物已经十分必要了。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种靶向性能好、毒 性和副作用小的靶向增强成骨细胞骨形成的药物及其合成方法。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种靶向增强成骨细胞骨形成的药 物，该药物的有效成分为多肽，所述的多肽由丝氨酸和天门冬氨酸两种氨基酸组成，所述多 肽中含有2~50个氨基酸，所述丝氨酸和天门冬氨酸的个数比为(0.25~4): 1，所述药物中 有效成分的质量含量为50~60%。
[0008] 所述的多肽包括3个丝氨酸和2个天门冬氨酸，所述多肽的序列为Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸。
[0009] 牙和骨组织作为人体中矿化程度最高的器官，其中的促进矿化蛋白具有增加骨 量，治疗骨质疏松的潜力。Ser Asp Ser Ser Asp选自牙本质磷蛋白（DPP)-级结构，该蛋白 氨基酸排列顺序有特征性的Ser Asp以及Ser Ser Asp重复序列。选择该序列有以下原因： (I )DPP来源于人体矿化程度最高的硬组织，牙齿，其表达位置为矿化的牙本质，骨组织中也 有表达；（2)DPP是牙本质中表达量最高的细胞外基质蛋白，在牙槽骨中也有显著表达；（3) DPP缺乏的小鼠其牙本质和骨组织矿化受到明显抑制，牙齿变薄，牙槽骨吸收明显；（4)蛋白 质化学，细胞学及组织学实验证实，DPP中氨基酸Asp是高度酸性的氨基酸，导致Ser Asp Ser Ser Asp酸性较高，能够特异性结合骨组织表面的羟基磷灰石，明显促进成牙细胞和成 骨细胞的成熟和分泌矿化基质。作为较特异的矿化调节蛋白，在牙本质的发育与矿化过程 中起重要作用。（5)体内体外研究发现Ser Asp Ser Ser Asp多肽，能够通过与成骨细胞表 面特异性蛋白骨膜蛋白（perio Sertin)结合，并胞吞进入细胞，从而特异性靶向作用于成 骨细胞。
[0010]作为牙和骨中重要的促矿化蛋白的重复氨基酸序列，所述多肽Ser Asp Ser Ser Asp具有DPP促进成骨基质蛋白表达，促进骨基质矿化的功能。
[0011] 所述的药物还包括生理盐水，作为溶剂，使得药物可以直接静脉注射。
[0012] 所述的多肽表面修饰有PEG，即聚乙二醇。
[0013] -种如上所述靶向增强成骨细胞骨形成的药物的合成方法，包括以下几个步骤：
[0014] (1)多肽的制备:通过十二通道半自动多肽合成仪按比例将氨基酸缩合成多肽，待 用；
[0015] (2)多肽的活化:将步骤（1)所得多肽溶于去离子水中，然后加入与多肽等质量的 EDC和NHS进行多肽的活化;其中，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NHS 为N-羟基琥珀酰亚胺；
[0016] (3)多肽的修饰:将PEG与多肽以（0.5~2): 1的质量比进行混合，静置过滤后即得 所述靶向增强成骨细胞骨形成的药物。
[0017] 步骤⑵所述活化的温度为2~10°C，活化时间为5~20min。
[0018] 步骤(3)所述静置的温度为2~10°C，静置的时间为10~20h。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几方面：
[0020] (1)本发明的有效成分来源于具有高矿化调节能力的天然蛋白DPP，具有很高的靶 向性，可以将药物准确送至骨细胞中，减少了药物的副作用；
[0021] (2)本发明的有效成分来源于具有高矿化调节能力的天然蛋白DPP，具有促进成 骨，促进生物矿化的作用；
[0022] (3)本发明采用短肽，合成简单，生产成本低。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明的合成步骤示意图；
[0024] 图2为药物的体内器官分布实验结果图；
[0025] 图3为实施例1药物在成骨细胞表面的靶向实验结果图；
[0026] 图4为小鼠注射实施例1药物1月后骨量变化示意图；
[0027] 图5为小鼠注射实施例1药物3天后骨基质蛋白表达结果图；
[0028] 图6为骨质疏松症模型小鼠注射实施例1药物1月后骨量CT分析结果图。
【具体实施方式】
[0029]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0030] 实施例1
[0031] 一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其有效成分为多肽，该多肽由3个丝氨酸和 2个天门冬氨酸组成，其序列为Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天门 冬氨酸，其中多肽的表面修饰有PEG。
[0032]该药物还包括生理盐水，有效成分的含量为55%，在使用时，直接通过静脉注射进 入人体。
[0033] 上述靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其合成方法如图1所示，包括以下几个步 骤：
[0034] (1)多肽的制备:通过十二通道半自动多肽合成仪按Ser: Asp = 2: 3比例将氨基酸 缩合成多肽，待用；
[0035] (2)多肽的活化:将步骤（1)所得多肽溶于去离子水中，然后加入与多肽等质量的 EDC和NHS进行多肽的活化;活化的温度为4°C，活化时间为IOmin;
[0036] (3)多肽的修饰:将PEG与多肽以1:1进行混合反应，静置过滤后即得所述骨质疏松 症靶向治疗多肽药物。静置温度为4°C，静置时间为12h。
[0037] (4)多肽的保存:将修饰后多肽进行冻干，-80 °C冰箱保存。
[0038] 将上述靶向药物带上荧光标记，鼠尾静脉注射FITC荧光标记所述药物后，通过活 体成像仪观察，其结果如图2所示，结果显示，荧光信号在软组织器官中相近，在骨组织中实 验组明显高于对照组，说明该载体具有骨靶向作用。
[0039] 小鼠尾静脉注射所述药物递送FITC荧光标记小核酸后，切片观察，结果如图3所 示，结果显示，荧光蛋白在成骨细胞中特异性富集，说明该载体具有成骨细胞靶向作用。
[0040] 小鼠尾静脉注射所述药物1月后，将骨组织固定切片观察，结果如图4所示，该药物 能够使骨小梁增粗，骨量增加。
[0041] 小鼠尾静脉注射所述药物3天后，提取骨组织RNA，进行实时PCR检测，结果如图5所 示，该药物能够增加骨桥蛋白（0CN)、骨涎蛋白（B SerP)、碱性磷酸酶(ALP)等骨基质蛋白的 表达。
[0042] 成骨细胞将上述所得的靶向药物，体内注射，靶向干预雌激素缺乏造成的骨质疏 松，注射一月后，骨质疏松症小鼠骨量明显增加，结果如图6所示，说明该多肽药物治疗骨质 疏松症。
[0043] 实施例2
[0044] -种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其有效成分为多肽，该多肽由1个丝氨酸和 1个天门冬氨酸组成，其序列为Ser Asp，其中，Ser代表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸，其中多 肽的表面修饰有PEG。
[0045] 该药物还包括生理盐水，有效成分的含量为50%，在使用时，直接通过静脉注射进 入人体。
[0046] 上述靶向增强成骨细胞骨形成的药物，包括以下几个步骤：
[0047] (1)多肽的制备：通过十二通道半自动多肽合成仪按Ser:Asp = 1:1比例将氨基酸 缩合成多肽，待用；
[0048] (2)多肽的活化:将步骤（1)所得多肽溶于去离子水中，然后加入与多肽等质量的 EDC和NHS进行多肽的活化;活化的温度为2°C，活化时间为20min;
[0049] (3)多肽的修饰:将PEG与多肽以0.5:1进行混合反应，静置过滤后即得所述骨质疏 松症靶向治疗多肽药物。静置温度为2 °C，静置时间为20h。
[0050] (4)多肽的保存:将修饰后多肽进行冻干，-80 °C冰箱保存。
[0051] 将所得多肽进行检测，结果显示，该多肽具有靶向治疗骨质疏松的作用。
[0052] 实施例3
[0053] 一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其有效成分为多肽，该多肽由10个丝氨酸 和40个天门冬氨酸组成，其序列为：
[0054] Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp，其中，Ser代表丝氨酸， Asp代表天门冬氨酸，其中多肽的表面修饰有PEG。
[0055] 该药物还包括生理盐水，有效成分的含量为60%，在使用时，直接通过静脉注射进 入人体。
[0056] 上述靶向增强成骨细胞骨形成的药物，包括以下几个步骤：
[0057] (1)多肽的制备:通过十二通道半自动多肽合成仪按Ser: Asp = 1:4比例将氨基酸 缩合成多肽，待用；
[0058] (2)多肽的活化:将步骤（1)所得多肽溶于去离子水中，然后加入与多肽等质量的 EDC和NHS进行多肽的活化;活化的温度为10°C，活化时间为5min;
[0059] (3)多肽的修饰:将PEG与多肽以2:1进行混合反应，静置过滤后即得所述骨质疏松 症靶向治疗多肽药物。静置温度为1 〇 °C，静置时间为IOh。
[0060] (4)多肽的保存:将修饰后多肽进行冻干，-80 °C冰箱保存。
[0061] 将所得多肽进行检测，结果显示，该多肽具有靶向治疗骨质疏松的作用。
[0062] 实施例4
[0063] -种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其有效成分为多肽，该多肽由8个丝氨酸和 2个天门冬氨酸组成，其序列为Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Ser Asp，其中，Ser代 表丝氨酸，Asp代表天门冬氨酸，其中多肽的表面修饰有PEG。
[0064] 该药物还包括生理盐水，有效成分的含量为53%，在使用时，直接通过静脉注射进 入人体。
[0065] 上述靶向增强成骨细胞骨形成的药物，包括以下几个步骤：
[0066] (1)多肽的制备：通过十二通道半自动多肽合成仪按Ser: Asp = 4:1比例将氨基酸 缩合成多肽，待用；
[0067] (2)多肽的活化:将步骤（1)所得多肽溶于去离子水中，然后加入与多肽等质量的 EDC和NHS进行多肽的活化;活化的温度为4°C，活化时间为17min;
[0068] (3)多肽的修饰:将PEG与多肽以1:1进行混合反应，静置过滤后即得所述骨质疏松 症靶向治疗多肽药物。静置温度为5 °C，静置时间为16h。
[0069] (4)多肽的保存:将修饰后多肽进行冻干，_80°C冰箱保存。
[0070]将所得多肽进行检测，结果显示，该多肽具有靶向治疗骨质疏松的作用。 <110>同济大学 <]20> -种靶向增强成骨细胞骨形成的药物及其合成方法 <160> 3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <221>多肽 <400> 1 Ser Asp Ser Ser Asp I S <210>2 <211>50 <212> PRT <213>人工序列 [0071 ] <400> 2 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp I 5 10 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp II 15 20 Ser Asp Asp Asp Ser Asp Asp Asp Asp Asp 21 25 30 Ser Asp Asp Asp Ser \sp Asp A.sp Asp Asp 31 35 40 Ser Asp Asp Asp See Asp \sp Asp Asp Asp 41 45 50 <210>3 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <400> 3 Ser Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Scr Asp I 5 10
【主权项】
1. 一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其特征在于，该药物的有效成分为多肽，所述 的多肽由丝氨酸和天门冬氨酸两种氨基酸组成，所述多肽中含有2~50个氨基酸，所述丝氨 酸和天门冬氨酸的个数比为(0.25~4): 1，所述药物中有效成分的质量含量为50~60%。2. 根据权利要求1所述的靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其特征在于，所述的多肽包 括3个丝氨酸和2个天门冬氨酸，所述多肽的序列为Ser Asp Ser Ser Asp，其中，Ser代表丝 氨酸，Asp代表天门冬氨酸。3. 根据权利要求1所述的一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其特征在于，所述的药 物还包括生理盐水。4. 根据权利要求1所述的一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物，其特征在于，所述的多 肽表面修饰有PEG。5. -种如权利要求1~4任一所述靶向增强成骨细胞骨形成的药物的合成方法，其特征 在于，该方法包括以下几个步骤： (1) 多肽的制备:通过十二通道半自动多肽合成仪按比例将氨基酸缩合成多肽，待用； (2) 多肽的活化:将步骤（1)所得多肽溶于去离子水中，然后加入与多肽等质量的EDC和 NHS进行多肽的活化； (3) 多肽的修饰:将PEG与多肽以（0.5~2): 1的质量比进行混合，静置过滤后即得所述 靶向增强成骨细胞骨形成的药物。6. 根据权利要求5所述的一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物的合成方法，其特征在 于，步骤(2)所述活化的温度为2~10°C，活化时间为5~20min。7. 根据权利要求5所述的一种靶向增强成骨细胞骨形成的药物的合成方法，其特征在 于，步骤(3)所述静置的温度为2~10°C，静置的时间为10~20h。
【文档编号】A61K38/05GK106075389SQ201610596298
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月27日 公开号201610596298.6, CN 106075389 A, CN 106075389A, CN 201610596298, CN-A-106075389, CN106075389 A, CN106075389A, CN201610596298, CN201610596298.6
【发明人】孙瑶, 王晓刚, 蔡明详
【申请人】同济大学