一种胰岛素口服硒纳米制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明属于药物制剂技术领域，公开了一种能够促进胰岛素口服吸收兼具硒协同降血糖效应的胰岛素口服硒纳米制剂及其制备方法。该制备方法于胰岛素和壳聚糖的溶液或混悬液中加入含硒试剂，在还原剂作用下生成载胰岛素的硒/壳聚糖纳米粒。本发明的胰岛素口服硒纳米制剂可有效包载胰岛素，使胰岛素高效包载于壳聚糖与硒形成的纳米粒中，降低口服给药后其在胃肠道中的释放和暴露，从而提高胰岛素的胃肠道稳定性，改善了硒的可吸收性和生物活性，从而可提高胰岛素和硒的生物利用度。此外，硒的加入使得该制剂能够在降血糖的同时，能够通过硒的抗氧化、血糖调节和胰岛素样作用重构机体功能，通过硒的胰岛素样作用协同降血糖，实现糖尿病标本兼治的作用。
【专利说明】
一种胰岛素口服砸纳米制剂及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于药物制剂技术领域，特别涉及一种能够促进胰岛素口服吸收兼具砸协同降血糖效应的胰岛素口服砸纳米制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病(diabetes)是严重危害人类健康的常见病、多发病。近年来，糖尿病发病率呈上升趋势，据WTO评估成年人糖尿病发病率高达9%。胰岛素是治疗胰岛素依赖性I型糖尿病的一线药物，也是II型糖尿病中晚期治疗的辅助用药。目前，皮下注射是胰岛素的最基本给药方式。然而，皮下注射途径给药存在诸多弊端，如给药次数频繁、注射疼痛、病人血糖波动大、易产生胰岛素血症和注射部位器质病变。因此，研究和开发胰岛素非注射途径给药制剂对糖尿病治疗具有十分重要的临床意义。
[0003]在各种非注射给药途径中，口服给药是最方便也是最能被病人接受的给药方式。近年来，国内外研究机构和医药公司投入了大量的人力物力从事胰岛素口服给药制剂的研发工作。但由于胰岛素为生物大分子治疗剂，存在(I)胃肠道中不稳定，易被胃肠道中胃蛋白酶和胰蛋白酶消化降解；(2)分子量大、生物膜渗透性差，难以透过胃肠道上皮吸收的问题。因此，口服生物利用度极低，难以通过口服给药达到治疗目的。为改善胰岛素口服给药的生物利用度，各种技术手段被尝试和运用了。常用的改善胰岛素口服吸收的方法有:(I)对胰岛素进行结构修饰提高其胃肠道稳定性，如接入PEG链；(2)采用渗透剂和酶抑制剂与胰岛素供给药，以减少胰岛素的降解和提高其口服吸收量；(3)将胰岛素包封于纳米载体中，如纳米球、纳米囊、脂质体减少胰岛素暴露和改善胃肠道吸收；(4)使用配体或穿膜肽修饰载胰岛素纳米粒，改善胃肠道稳定性和口服吸收。然而，这些制剂手段由于制备复杂或技术缺陷或成本较高，未能取得满意的研究结果。此外，单纯的胰岛素给药仅能起到降血糖效果，不能逆转和修复受损的胰岛β细胞，对糖尿病治疗仅停留在治标的层面。亟需一种既能够实现胰岛素口服传递，又能够起到平衡体内血糖水平，达到糖尿病标本兼治的药物制剂。
[0004]人体内的微量元素与糖尿病之间存在着某种内在联系。研究表明，砸表现出胰岛素受体后激酶抑制作用，具有一定的生理胰岛素样效应，对糖代谢存在调节作用。砸缺乏可引起胰岛辟田胞分泌功能改变，胰岛素分泌和储备减少。II型糖尿病患者血清砸均值明显低于健康人，而补砸后血糖水平下降明显。砸是GSH-Px酶系的组成成分，在糖代谢的磷酸戊糖途径中，恢复糖尿病患者肝组织中的GSH-Px活性，从而维护肝的糖代谢平衡XSH-Px的过氧化物分解功能还可阻止自由基和过氧化物对胰岛素Α/Β肽间的二硫键破坏，起到增敏胰岛素的作用。因此，将胰岛素与砸剂型化，开发具有促进胰岛素口服吸收和补砸功能的治疗剂对糖尿病的防治具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术中胰岛素口服生物利用度低、降糖作用弱等缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种能够促进胰岛素口服吸收兼具砸协同降血糖效应的胰岛素口服砸纳米制剂。
[0006]本发明的胰岛素口服砸纳米制剂由胰岛素、壳聚糖和砸组成，其中，胰岛素包封于由壳聚糖和砸形成的纳米粒中。
[0007]本发明另一目的在于提供一种上述能够促进胰岛素口服吸收兼具砸协同降血糖效应的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法。
[0008]本发明制备方法通过将胰岛素于溶液中与壳聚糖通过静电复合形成粗分散物混悬液，加入可还原性含砸试剂在还原剂作用下生成低价砸，沉淀或附着于胰岛素/壳聚糖复合物上形成包衣纳米粒。该砸/壳聚糖纳米粒可有效包载胰岛素，实现了胰岛素的高包载、降低口服给药后其在胃肠道中的释放和暴露，从而提高胰岛素的胃肠道稳定性和口服生物利用度。本发明的载胰岛素砸纳米制剂除能够提高胰岛素的生物利用度外，还能够通过砸的胰岛素样作用协同降血糖。
[0009]本发明的目的通过下述方案实现:
[0010]—种能够促进胰岛素口服吸收兼具砸协同降血糖效应的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，包括以下步骤:于胰岛素和壳聚糖的溶液或混悬液中加入含砸试剂，在还原剂作用下生成载胰岛素的砸/壳聚糖纳米粒。
[0011]上述制备方法通过将胰岛素于溶液中与壳聚糖通过静电复合形成粗分散物混悬液，加入可还原性含砸试剂在还原剂作用下生成低价砸，沉淀或附着于胰岛素/壳聚糖复合物上形成包衣纳米粒。其中，胰岛素包载于砸与壳聚糖形成的纳米骨架或贮库中。
[0012]上述制备方法中，所述胰岛素、壳聚糖和含砸试剂的用量比为1:(0.25?10):(0.5?20) 0
[0013]上述制备方法中，所述含砸试剂与还原剂化学计量比为1:0.1?1:50。
[0014]上述制备方法中，所述的含砸试剂为可还原性含砸试剂，可选自含+6价砸或+4价砸的化合物和单质砸中的至少一种，优选为砸酸、亚砸酸、砸酸盐、亚砸酸盐和灰黑色单质砸中的至少一种，更优选为亚砸酸和亚砸酸盐中的至少一种。
[0015]上述制备方法中，所述的壳聚糖可选自低分子壳聚糖、高分子壳聚糖及壳聚糖衍生物中的至少一种，优选为低分子壳聚糖。
[0016]上述制备方法中，所述的还原剂可选自谷胱甘肽、维生素C(抗坏血酸)、巯基乙醇、半胱氨酸、多酚或多羟基化合物、不饱和烯烃或芳烃中的至少一种，优选为谷胱甘肽和维生素C中的至少一种。
[0017]上述制备方法中，所述胰岛素和壳聚糖优选分别配成溶液后再混合得到溶液或混悬液。优选使用酸性介质分别溶解胰岛素和壳聚糖获得胰岛素溶液和壳聚糖溶液。
[0018]所述酸性介质可选自无机酸、有机酸或其混合酸溶液。所述的无机酸可为盐酸、硫酸等;所述的有机酸可为一元酸、二元酸或多元酸，如甲酸、醋酸、乙二酸等。所述的酸性介质优选为盐酸、硫酸、甲酸、醋酸和乙二酸中的至少一种。更优选溶解壳聚糖的酸性介质为醋酸，溶解胰岛素的酸性介质为盐酸。
[0019]上述制备方法具体包括以下步骤:
[0020]将壳聚糖溶液和胰岛素溶液混合，调节pH至胰岛素析出形成混悬液;加入含砸试剂和还原剂，反应，得到胰岛素口服砸纳米制剂。
[0021]所述反应的时间可为0.5h至数天。
[0022]所述调节pH可调节至5.5?8.0。通过调节pH至胰岛素等电点以上，以降低胰岛素溶解度，使其析出与壳聚糖耦合。
[0023]为了更好地实现本发明，上述制备方法更具体包括以下步骤:
[0024]使用酸性介质溶解胰岛素和壳聚糖，分别配制胰岛素溶液和壳聚糖溶液;将胰岛素溶液和壳聚糖溶液混合，调节体系PH值至等电点以上，使胰岛素析出并与壳聚糖形成复合物;加入含砸试剂、还原剂反应，生成低价砸，形成胰岛素口服砸纳米制剂。
[0025]本发明提供上述制备方法得到的胰岛素口服砸纳米制剂，其胰岛素包封率为10?100%，载药量为I?50%。
[0026]通过以上制备方法，胰岛素被包载于壳聚糖与砸形成的纳米粒中。该纳米粒制剂增强了胰岛素的胃肠道稳定性和口服吸收性能，也改善了砸的可吸收性和生物活性，从而可提高胰岛素和砸的生物利用度。此外，砸的加入使得该制剂能够在降血糖的同时，还能够通过砸的抗氧化、血糖调节和胰岛素样作用重构机体功能，实现糖尿病标本兼治的作用，是一种极具开发前景的制剂。
[0027]本发明进行了体外稳定性和体内降血糖实验。结果表明，本发明制备的胰岛素口服砸纳米制剂在模拟人工胃液中稳定性良好，口服后可显著降低正常和糖尿病大鼠血糖水平，且维持时间相对皮下注射胰岛素组较长。
[0028]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0029](I)本发明制剂具有高的胰岛素载药量，通常纳米粒对胰岛素载药量低于30%，本发明制备的载胰岛素砸纳米粒载药率可达到45%以上；
[0030](2)本发明制剂对胰岛素具有极高的胃肠道保护作用，可显著降低胰岛素口服给药后的酶或体液降解；
[0031](3)本发明制剂可促进胰岛素口服吸收，凭借纳米粒的纳米尺度效应提高了胰岛素的跨胃肠上皮吸收量，从而提高了胰岛素的口服生物利用度；
[0032](4)本发明制剂含有微量元素砸，在实现胰岛素口服吸收降糖的同时，还能够利用砸在糖尿病治疗上的生理调节作用，实现糖尿病标本兼治的功能。
【附图说明】
[0033]图1是胰岛素砸纳米制剂的粒径分布图。
[0034]图2是胰岛素砸纳米制剂与胰岛素溶液在模拟人工胃液中的稳定性比较图。
[0035]图3是胰岛素砸纳米制剂在正常大鼠体内的降血糖效果图。
[0036]图4是胰岛素砸纳米制剂在糖尿病大鼠体内的降血糖效果图。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0038]下列实施例中的试剂均可从商业渠道获得。
[0039]实施例1:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0040]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为5mg/mL;然后，配制2.5mg/mL的亚砸酸钠(Na2SeO3)溶液和lOmg/mL的谷胱甘肽(GSH)溶液。取壳聚糖溶液1mL，搅拌下缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育15min。然后，缓慢加入Na2SeO3溶液5mL，继续孵育Ih。再缓慢加入GSH溶液5mL，反应Ih，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0041]实施例2:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0042]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为5mg/mL;然后，配制2.5mg/mL的砸酸钠(Na2SeO4)溶液和lOmg/mL的谷胱甘肽(GSH)溶液。取壳聚糖溶液1mL，搅拌下缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育15min。然后，缓慢加入Na2SeO4溶液5mL，继续孵育Ih。再缓慢加入GSH溶液5mL，反应Ih，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0043]实施例3:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0044]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为5mg/mL;然后，配制2.5mg/mL的亚砸酸钠(Na2SeO3)溶液和10mg/mL的维生素C溶液。取壳聚糖溶液1mL置于磁力搅拌器上，缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育15min。然后，缓慢加入Na2SeO3溶液5mL，继续孵育Ih。再缓慢加入维生素C溶液5mL，反应lh，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0045]实施例4:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0046]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为5mg/mL;然后，配制2.5mg/mL的砸酸钠(Na2SeO4)溶液和10mg/mL的维生素C溶液。取壳聚糖溶液1mL置于磁力搅拌器上，缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育15min。然后，缓慢加入Na2SeO4溶液5mL，继续孵育Ih。再缓慢加入维生素C溶液5mL，反应lh，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0047]实施例5:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0048]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为5mg/mL;然后，配制2.5mg/mL的亚砸酸钠(Na2SeO3)溶液和10%的2-巯基乙醇溶液(v/v)。取壳聚糖溶液1mL置于磁力搅拌器上，缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育15min。然后，缓慢加入Na2SeO3溶液5mL，继续孵育Ih。再缓慢加入2-巯基乙醇溶液5mL，反应lh，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0049]实施例6:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0050]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为5mg/mL;然后，配制2.5mg/mL的亚砸酸钠(Na2SeO3)溶液和10mg/mL的半胱氨酸溶液。取壳聚糖溶液1mL置于磁力搅拌器上，缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育15min。然后，缓慢加入Na2SeO3溶液5mL，继续孵育Ih。再缓慢加入半胱氨酸溶液5mL，反应lh，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0051]实施例7:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0052]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为2.5mg/mL;然后，配制5mg/mL的亚砸酸钠(Na2SeO3)溶液和5mg/mL的GSH溶液。取壳聚糖溶液1mL置于磁力搅拌器上，缓慢滴加胰岛素溶液5mL，孵育30min。然后，缓慢加入Na2SeO3溶液2.5mL，继续孵育4h。再缓慢加入GSH溶液10mL，反应12h，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0053]实施例8:胰岛素口服砸纳米制剂的制备
[0054]将胰岛素溶解于pH2的盐酸溶液中，配制浓度为2.5mg/mL胰岛素溶液;再将壳聚糖溶解于I %醋酸溶液中，使其浓度为2.5mg/mL ；然后，配制1mg/mL的亚砸酸钠(Na2Se03)溶液、10mg/mL的维生素C溶液和10mg/mL的GSH溶液。取壳聚糖溶液1mL置于磁力搅拌器上，缓慢滴加胰岛素溶液1mL，孵育30min。然后，缓慢加入Na2SeO3溶液5mL，继续孵育8h。再缓慢加入维生素C和GSH溶液各50mL，反应24h，即得红色透明带乳光的载胰岛素砸纳米粒悬液。
[0055]实施例9:胰岛素砸纳米粒粒径及体外稳定性
[0056]粒径测定:取实施例1中的胰岛素砸纳米粒悬液，采用动态光散射技术测定胰岛素砸纳米粒的粒径。具体操作为:量取实例I中的胰岛素砸纳米粒10yL，去离子水稀释到lmL，置于粒径测定样品池中，25°C下平衡120s，仪器自动优化测量参数，由内嵌软件直接读取Z-average粒径作为胰岛素砸纳米粒的平均粒径。其粒径分布结果如图1所示。由图可见，制备的载胰岛素砸纳米粒粒径在120nm左右。小粒径的纳米粒子可有效通过胃肠道粘膜层和粘膜上s tagnant层，从而提高所载药物的跨膜转运量。本发明制备的载胰岛素砸纳米粒粒径较小，为胰岛素的跨膜吸收创造了有利条件。
[0057]稳定性考察:配制模拟人工胃液(SGF，含0.32%胃蛋白酶，pH1.2)，称取3.2g胃蛋白酶，加入pH 1.2的稀盐酸使之溶解，并定容至100mL，即得。取胰岛素溶液或实施例1中的胰岛素砸纳米粒悬液ImL加入到4mL人工胃液中，37°C下10rpm振荡孵育。在设定的时间点(5、15、30、60、120和240111丨11)取样20(^1^，立即用0.1]\1 NaOH 200yL终止降解反应。样品随后用甲醇-水溶液处理释放出被包封的胰岛素，通过HPLC测定残留的胰岛素浓度，并绘制残留胰岛素浓度对孵育时间曲线，以评价砸纳米粒对胰岛素稳定化作用。结果如图2所示。由图可见，游离胰岛素在模拟人工胃液中降解极快，在5分钟内即降解完全;而本发明制备的载胰岛素砸纳米粒可显著抵抗胃蛋白酶的降解作用，孵育4小时其累计降解百分数少于20%。砸纳米粒显著地提高了胰岛素在胃肠道的稳定性，从而解决了胰岛素胃肠道降解失活不能口服的给药难题。
[0058]实施例10:胰岛素砸纳米粒体内降血糖作用
[0059](I)正常SD大鼠口服给药后的降血糖作用
[0060]SD大鼠12只，实验前禁食12h，禁食期间允许自由饮水。实验时随机分为四组，每组6只。第一组皮下注射给予剂量lIU/kg的胰岛素溶液作为阳性对照(s.c);第二组口服给予剂量50IU/kg胰岛素溶液(溶解于pH 7.4缓冲液)作为阴性对照(1.g);第三组取实施例1中的胰岛素砸纳米粒制剂，口服给予剂量50IU/kg胰岛素砸纳米悬液(1.g);第四组口服给予生理盐水作空白对照组。给药前，通过尾静脉取血250yL。皮下注射组给药后，于0.15、0.25、
1、2、3、4、6、8和1h时间点通过尾静脉取血250yL。灌胃组给药后，分别于0.25、0.5、1、2、3、
4、6、8、10和12h通过尾静脉取血250yL。血样取出后立即用5000g离心力离心lOmin，分离上清血浆。通过葡萄糖氧化酶法测定血浆中葡萄糖浓度，测定结果如图3所示。由图可见，与对照组相比，胰岛素溶液组口服基本无降糖作用，而载胰岛素砸纳米粒组具有显著的降血糖效应，其降血糖效应在程度上接近于胰岛素皮下注射组。值得注意的是，载胰岛素砸纳米粒组的降血糖作用可维持较长时间，这是皮下注射胰岛素溶液所并不具备的优势。这种降糖效应既可减少了给药次数，又可避免血糖波动引起的病人不适。
[0061](2)GK糖尿病大鼠口服给药后的降血糖作用
[0062]使用基因敲除大鼠依照前述(I)中相同方法进行实验，糖尿病大鼠口服给予不同胰岛素制剂后血糖随时间变化如图4所示。由图可见，载胰岛素砸纳米粒在糖尿病大鼠上的降血糖效应类似于在正常大鼠上获得的结果，同样具有显著和持久的降血糖作用。本发明的载胰岛素砸纳米粒在两种动物模型上均获得了显著的降血糖效果，显示本发明述及的胰岛素砸纳米粒制剂极具应用前景和开发潜力。
[0063]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤:于胰岛素和壳聚糖的溶液或混悬液中加入含砸试剂，在还原剂作用下生成载胰岛素的砸/壳聚糖纳米粒。2.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述胰岛素、壳聚糖和含砸试剂的用量比为1: (0.25?10): (0.5?20)。3.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述含砸试剂与还原剂化学计量比为1:0.1?1:50。4.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述的含砸试剂为含+6价砸或+4价砸的化合物和单质砸中的至少一种;所述的壳聚糖为低分子壳聚糖、高分子壳聚糖及壳聚糖衍生物中的至少一种;所述的还原剂为谷胱甘肽、维生素C、巯基乙醇、半胱氨酸、多酚或多羟基化合物、不饱和烯烃或芳烃中的至少一种。5.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述的含砸试剂为砸酸、亚砸酸、砸酸盐、亚砸酸盐和灰黑色单质砸中的至少一种;所述的壳聚糖为低分子壳聚糖;所述的还原剂为谷胱甘肽和维生素C中的至少一种。6.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述胰岛素和壳聚糖分别配成溶液后再混合得到溶液或混悬液，所述配成溶液指使用酸性介质分别溶解胰岛素和壳聚糖获得胰岛素溶液和壳聚糖溶液。7.根据权利要求6所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于:所述酸性介质为无机酸、有机酸或其混合酸溶液。8.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤: 将壳聚糖溶液和胰岛素溶液混合，调节PH至胰岛素析出形成混悬液;加入含砸试剂和还原剂，反应，得到胰岛素口服砸纳米制剂。9.根据权利要求1所述的胰岛素口服砸纳米制剂的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤: 使用酸性介质溶解胰岛素和壳聚糖，分别配制胰岛素溶液和壳聚糖溶液;将胰岛素溶液和壳聚糖溶液混合，调节体系PH值至等电点以上，使胰岛素析出并与壳聚糖形成复合物；加入含砸试剂、还原剂反应，生成低价砸，形成胰岛素口服砸纳米制剂。10.一种胰岛素口服砸纳米制剂，其特征在于根据权利要求1?9任一项所述的制备方法得到。
【文档编号】A61K47/48GK106075403SQ201610410740
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月12日 公开号201610410740.1, CN 106075403 A, CN 106075403A, CN 201610410740, CN-A-106075403, CN106075403 A, CN106075403A, CN201610410740, CN201610410740.1
【发明人】张兴旺, 吴宝剑, 邓雯姬
【申请人】暨南大学