一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子及其制备方法，所述纳米粒子的成分包括：3?丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA和N?乙烯基己内酰胺NVCL。制备方法包括：将AAPBA、NVCL和引发剂混合，溶解在溶剂中；在无氧条件下，采用可逆加成反应，得到聚合物p(NVCL?co?AAPBA)；将聚合物溶于超纯水中，300r/min旋转3h，得到具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子。本发明的方法反应简单快速；纳米粒子可以用于包载胰岛素，所包裹的胰岛素可以随着葡萄糖浓度的升高，改变释药速度，有着很好的实用价值。
【专利说明】
一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子及其制备方法
技术领域
[0001]本发明属于纳米粒子的制备领域，特别涉及一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子及其制备方法。
【背景技术】
[0002]当前糖尿病已成为影响人类健康最严重的疾病之一，目前唯一有效的治疗方法是每日皮下注射胰岛素，给予胰岛素可以很好的调剂其血糖水平，但是却不能根据葡萄糖浓度来调节其血糖的变化，此外胰岛素注射过量可导致低血糖效应，严重者可导致患者亡，所以设计一种根据体内的葡萄糖浓度来自动调节胰岛素分泌的智能型载药系统是十分必要的。近年来关于葡萄糖敏感性材料被广泛的研究报道，伴刀豆球蛋白、葡萄糖氧化酶和苯硼酸系统是三种葡萄糖敏感性的主要单体，由于伴刀豆球蛋白和葡萄糖氧化酶是基于蛋白质应用的，所以其有一定的缺陷，这主要是由于其在体内不稳定，可以刺激血液产生抗体，此外其还价格昂贵，不易于工业化生产。
[0003]相反，PBA可以克服这些缺点，PBA可以提供一个葡萄糖敏感性的硼羟基，硼羟基可以根据葡萄糖的浓度而控制自身的大小，进而用来调节血糖的浓度变化，然而PBA作为葡萄糖敏感性有一个最大的缺点，就是它的PKa值要远高于人体正常情况下的pH值，否则就会失去其葡萄糖敏感性，所以当前许多专家和学者针对这种情况想出了三种手段来降低PBA的PKa值。第一种方法外，将使用一种含有羧基的高分子聚合物，这种聚合物可以和硼羟基发生结合反应，进而导致其PKa的下降，另一种方法为将PBA与另一种高分子材料结合，调控二者的比例，以寻找一个最佳的比例，使得其PKa降低，目前温敏性材料研究最多，这主要是由于温敏性材料可以改变PBA的溶解度，此外其可以提高药物的载药率，进而达到降低其pKa的作用。
[0004]关于温敏性材料，应用最多的为聚(N-1sopropylacryIamide)P(NIPAAm)，此温敏性材料被广泛的应用于载药系统，同时已有的研究报道，其可以降低PBA的pKa值，使得其可以适用于载药系统，然而P(NIPAAm)有一个最大的缺陷，就是其有一定的毒理性，特别是其在中度到高度的酸性水溶液中可以分解，产生一种有毒的有机胺成分，这种有机胺具有一定的神经毒性，因此当前科学家均在积极的寻找替代其的温敏性成分。(N-vinylcaprolactam) P (NVCL)是一种温敏聚合物，目前已经有的研究报道，其相较于P(NIPAAm)具有明显的低毒性，同时由于其具有优良的性能，可以适用于包括水凝胶、纳米粒子等多种载药系统。
[0005]目前已经有温度和葡萄糖敏感的NVCL和4-vinylpheny lboroni c (VPBA)结合的微凝胶的专利，但是，上述形成的微凝胶有一个缺点，就是其的水溶性是很差的，可能并不适合用于载药系统。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子及其制备方法，该方法纳米粒子可以用于包裹胰岛素，且具有很好的释药性能。
[0007]本发明的一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子，所述纳米粒子的主要成分为3-丙烯酰胺基苯硼酸(3-(ACRYL0YLAMIN0)BENZENEB0R0NICACID，AAPBA)以及温度敏感性基团N-乙烯基己内酰胺(N-Vinylcaprolactam，NVCL);其中，AAPBA与NVCL的质量比为1:10。
[0008]本发明的一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子的制备方法，包括:
[0009](I)将AAPBA和NVCL和引发剂混合，溶解在溶剂中；在无氧条件下，采用可逆加成反应，得到聚合物P(NVCL-co-AAPBA);其中，AAPBA与NVCL的质量比为1:10;
[0010](2)将步骤(I)中的聚合物溶于超纯水中，300r/min旋转3h，得到具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子。
[0011 ] 所述步骤(I)中引发剂为AIBN;溶剂为DMF;引发剂的质量与AAPBA和NVCL的质量之和比为1: 1100;溶剂与AAPBA的比例为Iml:1OOmg。
[0012]所述步骤(I)中AAPBA与NVCL的质量比为1:10。
[0013]所述步骤(I)中可逆加成反应的条件为:70°C反应8h。
[0014]所述步骤(2)中旋转的转速为300r/min，时间为3h。
[0015]所述步骤(2)中纳米粒子的直径为100-200nm;具有葡萄糖敏感性和温度敏感性，用于载药微球具有很好的包载率和稳定的释药率。
[0016]本发明中纳米粒子的最佳条件:AAPBA/NVCL为1:10;所用的引发剂为六181所反应的最佳环境为无氧;反应时间Sh。
[0017]所述制作纳米粒子不需要特别的条件，反应简单快速，制作的纳米粒子稳定，任何添加特定条件的其它专利都属于本专利的范畴。
[0018]本发明的纳米粒子可以载胰岛素、载药量高、同时溶解性好、具有稳定的释药性，同时其是低毒的，具有很好的临床应用价值。
[0019]所得的P(NVCL-C0-AAPBA)高分子聚合物通过核磁和红外对其进行了表征，实验的方法如下:
[0020 ] (I)准确称量P (NVCL-CO-AAPBA) 2mg，使用傅里叶红外仪对其进行扫描即可。
[0021](2)称取3-5mg的p(NVCL-co-AAPBA)，将其用氘带DMSO溶解后，使用核磁H谱测定即完成。
[0022]形成的纳米粒子的基本性能表征:
[0023](I)分别称取多份Img p(NVCL-co-AAPBA)，将其溶解于不同浓度(0g/mL、lg/mL、2g/mL、3g/mL)的葡萄糖水溶液中、不同pH值的溶液(pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)以及不同温度的溶液中(I2度到37度，每5度测定一次)，低速旋转1h后，使用DLS测定其粒径是否随着上述控制的液体浓度而变化。
[0024](2)将P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子的水溶液滴一滴，置于铜网上，投射电镜观察其形貌特点。
[0025]形成的纳米粒子的载药特点测试:
[0026](3)将Img胰岛素，与1mg的p(NVCL-co-AAPBA)溶解于1mL的水溶液中，在低速300r/min的转速下，将其旋转3h，即完成，之后根据公式计算载药率和包封率。
[0027](4)将包裹有胰岛素的？(附0^0^4?84)纳米粒子置于?!1值为7.4的水溶液中，温度设置为37摄氏度，考查其在120h内的释药特点。
[0028]有益效果
[0029](I)本发明利用AAI3BA和NVCL制作的具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的高分子无规共聚物及其所形成的自组装纳米粒子，其制备方法操作简单、实验条件温和；
[0030](2)本发明的制作的纳米粒子药物装载量高，能够缓释，且在体内稳定，其分解产物在体内没有毒副作用，可能在今后具有临床应用价值；
[0031](3)本发明的纳米粒子可以用于包载胰岛素，所包裹的胰岛素可以随着葡萄糖浓度的升高，通过改变纳米粒子的大小而改变释药速度(苯硼酸中的硼酸会识别葡萄糖中的羟基，进而拉拽纳米粒子，通过改变纳米粒子的大小而改变释药速度)，有着很好的实用价值。
【附图说明】
[0032]图1为本发明中p(NVCL-co-AAPBA)的合成示意图；
[0033]图2为实施例1所得的p(NVCL-co-AAPBA)的红外图谱；
[0034]图3为实施例1所得的P(NVCL-co-AAPBA)的核磁图谱；其中，A、B、C和D分别对应AAPBA、NVCL、pnycI和p(NVCL-co-AAPBA)；
[0035]图4为实施例2所得的p(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子的TEM;
[0036]图5为实施例2中p(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在不同葡萄糖浓度中的粒径变化；
[0037]图6为实施例2中P(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在不同pH值的水溶液中的粒径变化；
[0038]图7为实施例2中P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在不同温度中的粒径变化；
[0039]图8为实施例3中p(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子的载药率和包封率；
[0040]图9为实施例3中p(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在体外的释药特点；
[0041 ] 图10为实施例4中p(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子的细胞毒性考查。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0043]实施例1
[0044](I)称取AAPBA100mg，NVCL1000mg;同时加入Img的AIBN，将上述所有材料混合后溶解于ImL的DMF中，充满氮气、70°C，反应8h，即反应生成p(NVCL-co-AAPBA)。
[0045](2)称取1mg的p(NVCL-co-AAPBA)，将其溶于1mL的超纯水中，在低速300r/min的转速下，将其旋转3h，即形成P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子。
[0046](3)准确称量p(NVCL-co-AAPBA)2mg，使用傅里叶红外仪对其进行表征，如图2所示。AAPBA呈现出6个主要的特征峰，分别为C = O的吸收峰(1660cm—M，C = C的吸收峰(1620cm—1KO-B-O的吸收峰(1352cm—O以及B-O的吸收峰(1014cm—O，苯环的吸收峰位于1555cm—1到1610cm—1之间，同时苯环在698cm—1和791cm—1还有一个微弱的吸收峰。在p(NVCL)和p(NVCL-co-AAPBA)之间，二者的C = C吸收峰消失，这提示其发生了聚合反应，此外P(NvCL-CO-AAI3BA)在1340cm—1位置出现一个O-B-O的吸收峰，这提示，AAI3BA成功的聚合到P(NVCL)0
[0047](4)称取3-5mg的p(NVCL-co-AAPBA)，将其用氘带DMSO溶解后，使用核磁H谱表征，如图3所示。AAPBA(图3A)的溶于DMSO中的核磁H谱吸收峰为:δ: 10.09 (1H, 4-H)，8.10-7.25(苯环)，6.47(1!1，2-!0，6.20(1!1，3-!1)和5.75(2!1，1-!0。附(^溶于0150中的核磁!1谱吸收峰为:7.23(1Η，3-Η)，5.81(2Η，2-Η)，4.46(2Η，4-Η)，3.35(2Η，1-Η)，1.62(2Η，6-Η)，2.40(2Η，5-Η)和1.14(2!1，7-!0 4(附(^)溶于0150中的核磁!1谱吸收峰为5:4.33(1!1，4-!0，7.22(1!1，2-H),4.33(2H,2-H)，1.04(6H,1-H) dUAPBA-co-NVCL)溶于 DMSO中的核磁 H 谱吸收峰为 δ:9.55( 1HJ-H) ,8.17-7.32(苯环的吸收峰)，7.22( 1H，2-H) ,4.33( 1Η，6-Η)，3.19(2H，5-H),2.36(IH，4-H)和1.65(6H，3-H).与AAPBA和NVCL的吸收峰相比较，可以明显看出，p(AAPBA-co-NVCL)有一个明显的苯环吸收峰，提示AAPBA成功的聚合到p (NVCL)。
[0048]实施例2
[0049]实施例1中得到的纳米粒子的基本性能。
[0050](I)分别称取多份Img p(NVCL-co-AAPBA)，将其溶解于不同浓度(0g/mL、lg/mL、2g/mL、3g/mL)的葡萄糖水溶液中、不同pH值的溶液(pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)以及不同温度的溶液中(I2度到37度，每5度测定一次)，低速旋转1h后，使用DLS测定其粒径。其中，图5为所得的P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在不同葡萄糖浓度中的粒径变化；图6为所得的p(NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在不同pH值的水溶液中的粒径变化；图7为所得的P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子在不同温度中的粒径变化。
[0051 ] (2)将P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子的水溶液滴一滴，置于铜网上，透射电镜观察其形貌特点，TEM图如图4所示。
[0052] 实施例3
[0053 ]实施例1中得到的纳米粒子的载药特点。
[0054](1)将11^胰岛素，与1011^的？(,(^-(3044?84)溶解于1011^的水溶液中，在低速300r/min的转速下，将其旋转3h，即完成，之后根据公式计算载药率和包封率，如图8所示。
[0055](2)将包裹有胰岛素的P (NVCL-co-AAPBA)纳米粒子置于0mg/mL、lmg/mL、2mg/mL和3mg/mL葡萄糖浓度的，pH值为7.4的水溶液中，温度设置为37摄氏度，考查其在120h内的释药特点，如图9所示。
[0056]实施例4
[0057]p(NVCL-co_AAPBA)(实施例1)的细胞毒性考查。
[0058]将处于对数生长期的单层培养PIEC细胞用胰蛋白酶消化、离心、悬浮、细胞计数板计数，制备成15个/mL的细胞悬液，然后以2X 14个/孔的接种密度将其接种在已经灭菌处理的96孔细胞培养板上进行培养。培养24h后，把P (NVCL-co-AAPBA)的I3BS溶液加入到接种的细胞中，最终形成的聚合物浓度为25，50，100，250，500mg/L，比较其细胞生长特点，如图1O所示。
【主权项】
1.一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子的成分包括:3-丙烯酰胺基苯硼酸AAPBA和N-乙烯基己内酰胺NVCL;其中，AAPBA与NVCL的质量比为1:10。2.一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子的制备方法，包括: (1)将AAPBA、NVCL和引发剂混合，溶解在溶剂中；在无氧条件下，进行可逆加成反应，得到聚合物P(NVCL-co-AAPBA);其中，AAPBA与NVCL的质量比为1:10； (2)将步骤(I)中的聚合物溶于超纯水中，旋转，得到具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子。3.根据权利要求2所述的一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中引发剂为AIBN;溶剂为DMF;引发剂的质量与AAPBA和NVCL的质量之和比为1:1100;溶剂与AAPBA的比例为Iml: 10mgo4.根据权利要求2所述的一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中可逆加成反应的条件为:70 0C反应Sh。5.根据权利要求2所述的一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中旋转的转速为300r/min，时间为3h。6.根据权利要求2所述的一种具有葡萄糖敏感性和温度敏感性的自组装纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中纳米粒子的直径为100-200nm。
【文档编号】A61P3/10GK106075404SQ201610415172
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610415172.4, CN 106075404 A, CN 106075404A, CN 201610415172, CN-A-106075404, CN106075404 A, CN106075404A, CN201610415172, CN201610415172.4
【发明人】朱利民, 武俊紫, 吴焕玲, 李赫宇, 周开春
【申请人】东华大学