一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗及其应用
【专利摘要】本发明属于鱼用生物制品与养殖鱼类病害防控技术领域，具体涉及一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗及其应用。灭活疫苗抗原为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种C4(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年3月19日，保藏编号CGMCC No.7335。本发明灭活疫苗可有效诱导水产养殖鱼类产生特异性免疫应答，并提供有效的保护，制备本发明的杀鲑气单胞菌灭活疫苗所使用材料成本低，对环境与宿主安全。CGMCC No. 733520130319
【专利说明】
一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于鱼用生物制品与养殖鱼类病害防控技术领域，具体涉及一种杀鲑气单 胞菌灭活疫苗及其应用。
【背景技术】
[0002] 杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，属弧 菌科、气单胞菌属。杀鲑气单胞菌是一种重要的鱼类病原菌，其宿主包括鲑鳟鱼类、鲤科鱼 类、梭鱼、鲈鱼以及比目鱼等，可以引起养殖和野生鱼类发生严重的疥疮病/溃烂病，造成鱼 类大量死亡。参照伯杰氏细菌分类手册，杀鲑气单胞菌被分为5个亚种，分别是Aeromonas salmonicida subsp·salmonicida、Aeromonas salmonicida subsp.masoucida、Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes、Aeromonas salmonicida subsp·smithia、Aeromonas salmonicida subsp.pectinolytica。不同亚种引起的鱼类疾病各不相同，具有较强的亚种 差异性，由杀娃气单胞菌杀娃亚种(Aeromonas salmonicida subsp · salmonicida)引起的 病害一般被称为疖病（Furunculosis)，而由其他亚种引起的病害一般被称为溃烂病 (Ulcer)。在欧洲引起鳟鲑鱼类病害的杀鲑气单胞菌多为杀鲑亚种，在亚洲报道的鱼类杀鲑 气单胞菌病原主要是杀日本鲑亚种。由于病原具有很强的地域多样性，在不同地区获得的 病原分离株抗原性差异较大，杀鲑气单胞菌不同亚种之间也存在很多生理生化特征差异。 目前，在欧洲使用的杀鲑气单胞菌疫苗都是以杀鲑亚种菌株为抗原制备的，国内外还没有 关于以杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种为抗原制备疫苗的文献报道。
[0003] 作为一种重要的鱼类病原，杀鲑气单胞菌给我国鱼类健康养殖带来巨大危害。制 备适于我国鱼类养殖病害防控应用的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗十分必要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗及其应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0006] -种杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其特征在于:灭活疫苗抗原为杀鲑气单胞菌杀日本 娃亚种C4(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)，菌株保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年3月19日，保藏编号CGMCC No. 7335，分类学命 名：杀娃气单胞菌Aeromonas salmonicida。 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0007] 所述灭活疫苗抗原为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种菌株经甲醛溶液灭活获得。
[0008] 所述灭活疫苗为乳化疫苗的水相和乳化疫苗的油相以体积比1:1~1:2比例混合； 其中，乳化疫苗的水相内含灭活疫苗抗原悬液，灭活抗原悬液中细菌细胞终浓度大于2 X 108cells/ml〇
[0009] 所述乳化疫苗的水相为将Tween-80加入到灭活疫苗抗原悬液中，搅拌混勾，得到 乳化疫苗的水相;其中，灭活疫苗抗原悬液占水相体积比的94%-98%，Tween-80占水相体 积比的2 %-6 %;
[0010] 乳化疫苗的油相为运动粘度7-13的疫苗用白油、Span-80和硬脂酸铝混合，而后加 热至硬脂酸铝溶化，得到熟化的疫苗油相;其中，运动粘度7-13的疫苗用白油添加量为油相 体积的92%-96%，Span-80添加量为油相体积的4%-8%，硬脂酸铝添加量为其硬脂酸铝与 油相质量体积比1.5%-2.5%。
[0011] -种杀鲑气单胞菌灭活疫苗的应用，所述疫苗在预防杀鲑气单胞菌引起的养殖鱼 类疾病的灭活疫苗中的应用。
[0012]本发明将杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种菌株依次经活化、培养、发酵培养和甲醛灭 活后，将灭活后的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种细菌细胞离心使用无菌水重悬，使用常规方 法分别制备疫苗的水相与油相，并乳化得到所述杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活油乳化疫 苗。
[0013] 本发明采用抗原为灭活的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种，所述菌株保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年3月19日，保藏号为CGMCC No. 7335，分离自发病的大西洋鲑病灶，具有极强致病性，其形态、生理生化、16SrRNA基因序 列进化发育分析、PCR鉴定等特征与杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的特征符合。
[0014] 该菌株在LB培养基中培养24h的菌落呈圆形、半透明、略呈白色，表面光滑、边缘整 齐，直径约〇.8_，革兰氏染色阴性，短杆状，无鞭毛，不运动，参见表1、图1)
[0015] 表1:细菌CGMCC No .7335的生理生化特征
[0018] 注："+"表示反应为阳性，表示反应为阴性。
[0019] 本发明所具有的优点如下：
[0020] 1.本发明采用分离自发病鱼病灶处的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No.7335 制备的灭活疫苗免疫鱼，诱导养殖鱼类产生特异性免疫应答，可增强养殖鱼抵抗杀鲑气单 胞菌杀日本鲑亚种感染的能力，提供保护效应。
[0021 ] 2.本发明的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗，可以使免疫鱼获得抵抗杀鲑气 单胞菌杀鲑亚种感染的能力，提供交叉保护效应。
[0022] 3.本发明的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗，采用灭活方法制备抗原，有效 保留细菌表面抗原，并且具有很好的安全性，不存在环境安全问题。
[0023] 4.本发明的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活油乳疫苗，采用常规疫苗制备工艺， 通过发酵培养、制备水相、制备油相、乳化等环节制备疫苗，所采用的工艺简单、成本较低， 可应用于大规模工业化生产。
[0024] 5.本发明的疫苗接种方式是注射免疫，注射免疫是目前被认为最为有效的鱼用疫 苗接种方式，结合成熟的疫苗接种平台，可以方便并有效地使宿主获得免疫保护。
[0025] 6.本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活油乳疫苗;所提供的疫苗可以是鱼类宿 主抵抗由杀鲑气单胞菌引起的疾病，可用于海水、淡水养殖阶段的鱼类，具有高效、安全性 好、保护率尚的优点，从而弥补目如的广品空白。
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例提供的用扫描电镜观察本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种 CGMCC No.7335的形态图。
[0027]图2为本发明实施例提供的不同浓度抗原的本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭 活油乳疫苗免疫大西洋鲑的保护效果图。
[0028]图3为本发明实施例提供的使用本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗免疫 楓叶鲑对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCCN0.7335的保护效果图。
[0029]图4为本发明实施例提供的使用本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗免疫 楓叶鲑对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种NCHMBl 102的保护效果图。
[0030] 图5为本发明实施例提供的使用本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗免疫 大西洋鲑与未免疫大西洋鲑在入海后的累积死亡情况图。
[0031] 图6为本发明实施例提供的使用本发明杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种灭活疫苗免疫 大西洋鲑后其血清抗体效价变化情况图。
【具体实施方式】
[0032]下面根据【附图说明】和实施例、应用例对本发明做进一步说明。
[0033] 实施例1
[0034] 杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No.7335经过复壮，挑取单菌落接种至LB液体 培养基中摇床培养24-48小时，加入终浓度为0.3 %甲醛室温灭活48小时，5000转/分钟转速 离心10分钟，用无菌水洗涤、并用无菌水重悬菌体至浓度为109cell S/ml，即得到灭活疫苗 抗原。
[0035] 取19.2ml上述灭活疫苗抗原悬液，加入0.8ml灭菌Tween-80搅拌混勾，制备成乳化 疫苗的水相;而后用疫苗用白油18.8ml，1.2mlSpan-80，0.4g硬脂酸铝相混合，加热使硬脂 酸铝完全溶化，灭菌制备成乳化疫苗的油相;使用磁力搅拌器5000rpm转速，将等体积的油 相缓慢加入到水相中，搅拌10分钟形成乳白色油包水性油乳疫苗。
[0036] 实施例2
[0037] 杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No.7335经过复壮，挑取单菌落接种至LB液体 培养基中摇床培养24-48小时，加入终浓度为0.3 %甲醛室温灭活48小时，5000转/分钟转速 离心10分钟，用无菌水洗涤、并用无菌水重悬菌体至浓度为109cell S/ml，即得到灭活疫苗 抗原。
[0038] 取19.6ml上述灭活疫苗抗原悬液，加入0.4ml灭菌Tween-80搅拌混勾，制备成乳化 疫苗的水相;而后用疫苗用白油38.4ml，1.6mlSpan-80，0.6g硬脂酸错相混合，加热使硬脂 酸铝完全溶化，灭菌制备成乳化疫苗的油相;使用分散机1000 Orpm转速，将40ml的油相缓慢 加入到20ml水相中，搅拌3分钟形成乳白色油包水性油乳疫苗。
[0039] 实施例3 [0040]步骤1)疫苗注射
[0041 ]按照上述实施例1中疫苗的制备方法制备疫苗，疫苗水相中灭活疫苗抗原分别设 置高浓度疫苗抗原（抗原细胞浓度I X IO8Ce 11 s/ml)、低浓度疫苗抗原（抗原细胞浓度I X 105cells/ml)以及无灭活疫苗抗原的无抗原疫苗（即，水相为无菌水和Tween-80)，以无抗 原疫苗作为对照。
[0042] 将300尾大西洋鲑(体重尾35g-40g)随机分为3组，每组100尾。将这3组分别命名为 高浓度组、低浓度组和对照组。将高浓度组的每尾大西洋鲑腹腔注射1〇〇μ1抗原细胞浓度1 X IO8Cell s/ml的疫苗，将低浓度组的每尾大西洋鲑腹腔注射100μΙ抗原细胞浓度I X 105cellS/ml的疫苗，将对照组的每尾大西洋鲑腹腔注射100μ1无抗原的乳液。
[0043]步骤2)细菌悬液制备
[0044] 在LB液体培养基中培养杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No. 7335至0D600为 〇 . 8，然后离心（5000转/分钟，室温，IOmin)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5 X 107cfu/ml，即为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No. 7335悬液。
[0045] 步骤3)攻毒感染
[0046] 在上述各组大西洋鲑按照步骤1)注射疫苗30天后，分别再向上述高浓度组、低浓 度组和对照组的大西洋鲑各20尾，肌肉注射100μΙ上述步骤2)的细菌悬液。持续观察10天， 记录各组死亡情况(参见图2)。
[0047]由图2可见，注射感染杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No.7335后10天内，高浓 度抗原疫苗免疫的大西洋鲑没有死亡;低浓度抗原疫苗免疫的大西洋鲑累计死亡5尾;对照 大西洋鲑累积死亡16尾。根据以下公式计算相对免疫保护率(RPS):
[0048] RPS= (1-免疫组累计死亡率/对照组累计死亡率）X 100%
[0049] 结果显示高浓度抗原疫苗使大西洋鲑获得100%保护效果，低浓度抗原疫苗使大 西洋鲑获得75%保护效果。
[0050] 实施例4
[0051] 步骤1)疫苗注射
[0052]按照实施例2疫苗的制备方法制备疫苗水相中灭活疫苗抗原浓度I X 109cellS/ml 的疫苗，以及无灭活疫苗抗原的无抗原疫苗（即，水相为无菌水和Tween-80)，以无抗原疫苗 作为对照。
[0053] 将200尾楓叶鲑(60g-80g)随机分为2组，每组100尾。将这2组分别命名为免疫组和 对照组。将免疫组的每尾楓叶鲑腹腔注射1〇〇μ1抗原细胞浓度I X IO9CelIs/ml的疫苗，将对 照组的每尾楓叶鲑腹腔注射100μΙ无抗原的乳液。
[0054]步骤2)细菌悬液制备
[0055] 在LB液体培养基中分别培养杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCCNo. 7335与杀鲑气 单胞菌杀鲑亚种NCHMBl 102至0D600为0.8，然后分别离心(5000转/分钟，室温，IOmin)，收集 菌体，分别将两个细菌悬浮于PBS中至终浓度为5 X 107cfu/ml，即分别为杀鲑气单胞菌杀日 本鲑亚种CGMCC No.7335悬液与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种NCHMBl 102悬液。
[0056] 步骤3)攻毒感染
[0057] 在上述各组大西洋鲑按照步骤1)注射疫苗30天后，分别取上述免疫组和对照组各 20尾的楓叶鲑，肌肉注射100μΙ上述步骤2)的杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No.7335的 悬液；另，再分别取免疫组和对照组各20尾楓叶鲑，肌肉注射100μΙ上述步骤2)的杀鲑气单 胞菌杀鲑亚种ΜΠΜΒ1102的悬液。持续观察10天，记录各组死亡情况(参见图3)。
[0058] 其中，NCMB 1102,保藏在英国国家工业与海洋细菌保藏中心（公司）（National Collection of Industrial and Marine Bacteria(NCIMB)Ltd)，保藏日期：1962年 10月26 日。保藏地：英国阿伯丁（Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen)
[0059] 由图3可见，疫苗免疫楓叶鲑对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCC No.7335的免疫 保护率为70 %;
[0060] 由图4可见，疫苗免疫楓叶鲑对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种NCHMBl 102的免疫保护率为 50% 〇
[0061 ] 实施例5
[0062]步骤1)疫苗注射
[0063]按照实施例2的制备方式，分别制备灭活疫苗抗原浓度I X 109cellS/ml的疫苗以 及无灭活疫苗抗原的无抗原疫苗（即，水相为无菌水和Tween-80)，以无抗原疫苗作为对照。 [0064] 将40000尾大西洋鲑(35g-40g)随机分为2组，每组20000尾。将这2组分别命名为免 疫组和对照组。将免疫组的每尾大西洋鲑腹腔注射100μΙ灭活疫苗抗原细胞浓度I X I O9Ce 11 s/ml的疫苗，将对照组的每尾大西洋鲑腹腔注射100μΙ无抗原的乳液。
[0065] 步骤2)标记与养殖生产
[0066] 使用红色荧光标记物在免疫组大西洋鲑眼部注射标记，使用绿色荧光标记物在对 照组大西洋鲑眼部注射标记。
[0067] 将标记的免疫组和对照组大西洋鲑混在一起养殖于生产车间（初始密度5kg/m3水 体，水温14°C_16°C)，通过标记物区分免疫组与对照组死亡大西洋鲑，持续记录生产过程中 由于杀鲑气单胞菌引起大西洋鲑死亡的累积死亡率(参见图5)。
[0068]由图5可见，至接种疫苗后190天，免疫大西洋鲑的累积死亡率为4.66%，明显低于 未免疫大西洋鲑的累积死亡率52.43 %。
[0069]免疫后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、10个月、11个月、12个月采集免 疫大西洋鲑与未免疫大西洋鲑血液制备血清，通过ELISA方法检测抗体效价(参见图6) [0070]由图6可见，免疫大西洋鲑抗杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种CGMCCN0.7335的抗体效 价在免疫后1个月时明显升高，至免疫后第5个月达到最高，在免疫后12个月时，免疫大西洋 鲑血清抗体效价仍然明显高于对照组大西洋鲑血清抗体效价。
【主权项】
1. 一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其特征在于：灭活疫苗抗原为杀鲑气单胞菌杀日本鲑 亚种C^4(Aeromonas salmonicida subsp .masoucida)，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年3月19日，保藏编号CGMCC No.7335。2. 按权利要求1所述的杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其特征在于:所述灭活疫苗抗原为杀鲑 气单胞菌杀日本鲑亚种菌株经甲醛溶液灭活获得。3. 按权利要求1或2所述的杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其特征在于:所述灭活疫苗为乳化 疫苗的水相和乳化疫苗的油相以体积比1:1~1:2比例混合;其中，乳化疫苗的水相内含灭 活疫苗抗原悬液，灭活抗原悬液中细菌细胞终浓度大于2 X 108cellS/ml。4. 按权利要求3所述的杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其特征在于： 所述乳化疫苗的水相为将Tween-80加入到灭活疫苗抗原悬液中，搅拌混匀，得到乳化 疫苗的水相；其中，灭活疫苗抗原悬液占水相体积比的94 %-98 %，Tween-80占水相体积比 的 2%-6%; 乳化疫苗的油相为运动粘度7-13的疫苗用白油、Span-80和硬脂酸铝混合，而后加热至 硬脂酸铝溶化，得到熟化的疫苗油相;其中，运动粘度7-13的疫苗用白油添加量为油相体积 的92%-96%，Span-80添加量为油相体积的4%-8%，硬脂酸铝添加量其与油相质量体积比 1.5%-2.5%〇5. -种权利要求1所述的杀鲑气单胞菌灭活疫苗的应用，其特征在于:所述疫苗在预防 杀鲑气单胞菌引起的养殖鱼类疾病的灭活疫苗中的应用。
【文档编号】A61K39/106GK106075419SQ201610412249
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610412249.2, CN 106075419 A, CN 106075419A, CN 201610412249, CN-A-106075419, CN106075419 A, CN106075419A, CN201610412249, CN201610412249.2
【发明人】肖鹏, 张丽娜, 孙斌, 王先平, 杜以帅, 孙明哲, 王顺奎, 于凯松, 刘鹰
【申请人】中国科学院海洋研究所