Angpt2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了ANGPT2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用，本发明首次证实在小鼠CCM3模型和人的CCM3脑血管组织中，发现ANGPT2显著上调，在小鼠CCM3敲除模型中应用ANGPT2中和抗体能够显著改善因血管渗漏导致的脑出血情况，并显著降低血管畸形病灶数目。由此可见，ANGPT2在血管发生异常的疾病发病中起重要调控作用，应用ANGPT2中和抗体等抑制剂，能够为制备血管发生异常疾病相关的药物提供依据。
【专利说明】
ANGPT2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及ANGPT2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]脑海绵状血管畸形(cerebral carvernous malformat1n，CCM)是发生在中枢神经系统的一种血管错构畸形，是先天性脑血管畸形的一种，约占脑血管畸形的10%?20%，人群患病率约0.1%?4%。
[0003]CCM由缺乏肌层和弹性纤维的大小不等的海绵状血管窦组成，团状毛细血管扩张，内壁为单层扁平的内皮细胞(endothelial cells,ECs)，缺乏周细胞(pericyte，PCs)覆盖，无正常的血管基膜。由于血管内皮屏障发生改变，导致血管通透性增高，红细胞外渗，并继发脑实质炎症反应，从而显著增加中风、癫痫、神经功能缺失的风险。
[0004]CCM分为散发性和常染色体显性遗传，遗传性CCM与3个致病基因种系突变相关，包?CCMl(KRITl,7qll.2-q21)^CCM2(MGC4607^7pl5-pl3)^PCCM3(CCM3^3q25.2-q27)o90%l^上的CCM病人携带这3个致病基因的突变。近十几年来，3个CCM致病基因种系突变的研究报道非常多。由于CCM病灶组织内体细胞基因突变的发现提出了“二次打击”机制(two-hitmechanism)学说，认为其参与了脑海绵状血管瘤的发病机制，导致表达于脑海绵状血管瘤毛细血管腔内皮细胞的致病基因编码蛋白完全失去功能。这种学说最近已经在小鼠动物模型中被证实。出生后特异的内皮细胞Ccm基因的失活，会导致大脑出现CCM样的损伤。虽然CCM发病机制尚不清楚，但分子遗传学研究为我们深入理解CCM的发病机制和临床治疗提供了重要依据。鉴于目前缺乏有效的治疗药物，手术切除是CCM的唯一治疗手段，因此，研究CCM的发病机制和寻找新的有效药物或治疗方法是当前的研究热点。
[0005]血管生成素(ang1poietin)是内皮细胞特异性的促血管生成因子，在血管生成中起到重要作用。血管生成素家族有4种亚型，分别为Ang-1，Ang-2，Ang-3，Ang-4.Ang-1为由498个氨基酸组成的同源六聚体，基因位于8q22，主要由血管内皮周围细胞(如周细胞)分泌，广泛分布于胚胎及富含血管的成熟组织中，如子宫内膜、卵巢、肺、皮肤等。Ang-2基因位于8q23，是由496个氨基酸组成的同源二聚体，主要由内皮细胞分泌，分布于胚胎及血管重塑明显的成熟器官，如胎盘、子宫、卵巢等。Tie 2是血管生成素家族的共同受体，Ang-1可与Tie 2受体特异性结合使其磷酸化，调节血管内皮细胞间及和周围支持细胞间的相互作用，促进微血管结构的成熟和稳定，降低血管通透性。Ang-2(又简称ANGPT2)通过竞争阻断Ang-1与Tie 2受体结合，抑制Tie 2受体磷酸化，减弱内皮细胞与周围支持细胞及基质间的相互作用，解除血管基底膜和周围细胞对血管结构的限制，松解血管结构，促使内皮细胞分离和迀移，导致血管的稳定性降低，通透性增加。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了ANGPT2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用，本发明发现ANGPT2在血管发生异常的疾病发病中起重要调控作用，应用ANGPT2中和抗体等ANGPT2抑制剂，能够为制备CCM及其他血管瘤疾病药物提供依据。
[0007]本发明采用的技术方案为:ANGPT2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用，所述ANGPT2抑制剂通过降低ANGPT2蛋白水平来治疗血管瘤，所述血管瘤以单层扩张的血管内皮细胞和减少的周细胞覆盖为特征。
[0008]作为对上述技术方案的进一步改进，所述血管瘤为脑海绵状血管瘤，所述血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。
[0009]作为对上述技术方案的更进一步改进，所述脑海绵状血管瘤由CCM3基因的功能缺失引发。
[0010]作为对上述技术方案的更进一步改进，所述ANGPT2抑制剂为ANGPT2中和抗体。
[0011]作为对上述技术方案的更进一步改进，所述ANGPT2中和抗体为单克隆抗体。
[0012]作为对上述技术方案的进一步改进，所述ANGPT2中和抗体的用量为10yg/g体重。
[0013]作为对上述技术方案的更进一步改进，所述ANGPT2中和抗体隔天腹腔注射。
[0014]作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物通过稳定血管内皮细胞连接、血管内皮细胞和周细胞的相互作用和血管的完整性来抑制血管瘤损害。
[0015]作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物还包括药学上可接受的载体。
[0016]本发明建立了他莫昔芬诱导内皮细胞特定Ccm3基因敲除的CCM3小鼠动物模型(Ccm3-1ecK0);通过实时全内反射荧光显微镜，观察Ccm3-1ecK0小鼠脑微血管结构出现CCM样改变，内皮细胞和周细胞松解，缝隙连接被破坏，血管通透性增加；同时，内皮细胞分泌ANGPT2增加。进一步，通过ANGPT2中和抗体，挽救内皮细胞特异性敲除CCM3引起的脑血管病变，病灶数目减少。
[0017]发明人还在人的CCM标本中，证实了ANGPT2在正常脑组织区域不表达，但是在CCM损伤区域显著上调。
[0018]因此，可以利用ANGPT2中和抗体，制备出治疗CCM及其他血管畸形(即血管瘤)疾病药物。
[0019 ]相对于现有技术，本发明的有益效果为:
[0020]本发明实验结果首次证实在小鼠CCM3模型和人的CCM3脑血管组织中，发现ANGPT2显著上调，在小鼠CCM3敲除模型中应用ANGPT2中和抗体能够显著改善因血管渗漏导致的脑出血情况，并显著降低血管畸形病灶数目。由此可见，ANGPT2在血管发生异常的疾病发病中起重要调控作用，应用ANGPT2中和抗体等抑制剂，能够为制备血管发生异常疾病相关的药物提供依据。
【附图说明】
[0021 ]图1显示了诱导型的内皮细胞特异性CCM3敲除的小鼠快速出现脑和视网膜CCM病变表型;野生型(WT)和诱导型的内皮细胞特异性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P2-P10天取脑组织进行检测；其中，A显示了P2，P5，PlO天的WT和Ccm3-1ecKO小鼠脑组织切片HE染色结果;B显示了 P2，P5，PlO天的WT和Ccm3_iecK0小鼠脑组织总CCM病灶数量统计结果;C显示了 P2，P5，PlO天Ccm3-1ecK0小鼠脑组织CCM不同大小病灶数量统计结果；图D-G显示了CCM病变部位血管渗漏，其中:D为PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠新鲜脑组织;E-G:P10天的小鼠用FITC-葡聚糖灌注后进行免疫荧光检测，E为脑组织荧光图，箭头指示血管渗漏，F为⑶31染色图，箭头表示正常脑组织结构，星号*显示CCM病灶，G伊文思蓝白蛋白检测评价小鼠血脑屏障渗透性；图H-J显示了Ccm3-1ecKO小鼠视网膜病变，对PlO天的WT和Ccm3-1ecKO小鼠视网膜组织的CD31和isolectin蛋白进行免疫荧光染色，放大倍数H为20X，I为80X，星号*显示CCM病变部位呈海绵状异常血管团，J显示了损害区域占比。
[0022]图2显示了 Ccm3-1ecK0小鼠血管内皮细胞连接的破坏、EC与PC的解离、和ANGPT2表达的升高;野生型(WT)和诱导型的内皮细胞特异性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P5和PlO天取脑组织进行检测;其中，A显示了PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小脑组织切片内皮细胞标记⑶31和周细胞标记NG2免疫荧光染色，B显示了⑶31和EC-PC缝隙链接标记connexin-43(CX43)染色，其中，箭头指示正常脑组织结构，星号*显示CCM病灶，箭指示小脑叶之前的血管;C分别显示了NG2和CX43在⑶31阳性的血管上的覆盖率;D-F显示了 PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小脑组织切片VE-cadherin/CD31染色(D)和claudin-5/⑶31染色(E)，箭头指示正常脑组织结构，星号*显示CCM病灶;方框区域图片用高倍显示WT和Ccm3_iecK0病灶中VE-cadherin/CD31免疫焚光染色；F分别显不了 VE-cadherin和claudin-5在CD31阳性的血管上的覆盖率;G-H显示了 P5和PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小脑组织切片ANGPT2/⑶31染色结果，其中图G中的高倍图源自方框区域，标尺:10ym; I显示了 ELI SA检测WT和Ccm3-1ecK0小鼠的小脑、视网膜、肺和血液中的ANGPT2蛋白水平的结果；J-K显示了 qRT-PCR和蛋白免疫印迹分别检测P5和PlO天的WT和Ccm3_iecK0小鼠小脑组织中ANGPT2-TIE2信号通路的mRNA水平和蛋白水平的结果，所得统计数据为倍数变化(Ccm3-1ecKO组数值除以WT组数值所得倍数改变，把WT组的数值当为1);L-M显示了 ANGPT2-TIE2信号通路在人CCM3病灶高表达，人CCM3切片标本作CD31和ANGPT2或p-TIE2(L)或Claudin-5(M)免疫荧光共染色，其中，箭头指示正常血管，星号*指示CCM病灶，箭显示CCM病灶中八恥?了2-1'^2染色阳性但(:1311(1丨11-5染色阴性。11=10，冲〈0.05，*仲〈0.01(非配对双尾七检验)，数值为均数土标准误。
[0023]图3显示了CCM3维护EC管腔形成和周细胞募集;其中，A-B显示了Organotypic血管生成实验结果;siRNAs转染的HBMVECs被种在单层融合的成纤维细胞之上，在培养液中加或不加ant1-ANGPT2(10yg/ml)，共培养14天，通过VE-cadherin和collagen IV免疫荧光染色观察EC出芽和管腔形成过程，结果如图A所示;B显示定量分析显示血管分支的数量、平均管腔直径、和成管的面积(collagen IV覆盖的区域)；C_D显示了3D出芽实验结果;siRNAs转染的HBMVECs包被在cytodex球珠上，然后cytodex球珠被埋在fibrin胶里，在EGM2培养液中培养8天，结果如图C、D所示，其中，箭头指示出芽，星号指示管腔，图D显示了出芽数量、出芽长度和管腔面积的定量分析结果；图E-F显示了3D出芽实验观察EC-PC相互作用；为了同时观察出芽过程中的EC和PC，我们把表达绿色荧光蛋白EGFP的HBMVEC转染不同的siRNAs(包括(:壮1或010或1^(:138)和表达红色荧光蛋白1110^^7的正常!181^?(:以2:1的比例同时包被在cytodex球珠上，在培养液中加或不加ant1-ANGPT2( 10yg/ml)，共培养8天；图E、F显示了观察到的EC出芽和周细胞覆盖率及定量分析结果;n= 10，*P〈0.05，#P〈0.01,标尺:ΙΟΟμπι，实验重复三次；需要说明的是，图B从左至右依次显示了 siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2的分支数量、管腔直径、血管面积，图D从左至右依次显示了siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2 的出芽数量、出芽长度、血管面积，图 F从左至右依次显示了 siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2、s iCCM3/s iUNCl 3B/aAngpt2 的出芽数量、PC 覆盖率。
[0024]图4显示了 ANGPT2中和抗体能阻断Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管损害的形成;野生型(WT)、诱导型的内皮细胞特异性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)和在Ccm3_iecKO基础上合并Unc13b基因敲除(Ccn^kx/^^CdhS-CreEin^UnclSb—A，DK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，从P2开始，隔天腹腔注射ANGPT2中和抗体(10yg/g体重)或正常IgGl到小鼠体内，在PlO天取脑组织进行检测；图A为新鲜脑组织大体形态学图片，箭显示CCM病灶，标尺:2mm;图B-C显示了HE染色和CCM病灶统计结果图；图D-E显示了NG2/CD31，VE-cadherin/CD31 和Claudin-5/CD31免疫荧光共染和统计结果图；图F显示了ANGPT2/CD31免疫荧光共染结果图；G显示了ELISA检测脑组织中ANGPT2蛋白水平的结果图；图H-1显示了P-TIE2/CD31免疫荧光共染和定量分析结果图；η = 1，*P〈0.05，**P〈0.01，标尺:ΙΟΟμπι，数值为均数土标准误；需要说明的是，图C、E、G、I分别从左至右依次显示了WT+IgG、WT+aAngpt2、iecK0+IgG、iecK0+aAngpt2、DK0+aAngpt2的CCM病灶数量，NG2覆盖率、VE-cad覆盖率、Cld5覆盖率，Angpt2蛋白水平和P-TIE2阳性的EC。
【具体实施方式】
[0025]为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0026]我们研究发现，在内皮细胞特异敲除Ccm3基因的小鼠CCM模型中，内皮细胞分泌到胞外的ANGPT2增多，引起周细胞解离，血管通透性增加;通过ANGPT2抗体，中和分泌到胞外的ANGPT2，能够减轻CCM样损伤，揭示ANGPT2抗体可能成为CCM治疗的新途径。
[0027]它莫西芬(tamoxifen)，也即他莫昔芬；Ccm3与CCM3可替换使用；Ang_2、Angpt2、ANGPT2可替换使用；磷酸化的TIE2、p-Tie2、p-TIE2可替换使用;Uncl3b和Uncl3B可替换使用;Px天即第X天;aAngpt2即Angpt2中和抗体。
[0028]实施例
[0029]1、材料与方法
[0030]1.1它莫西芬诱导的血管内皮细胞特异性的(:(；1113基因敲除鼠((:(；1113-16(；1(0)模型的建立
[0031]为了便于通过Cre-LoxP系统研究Ccm3在血管内皮细胞中的功能，我们使用Cdh5-CreERT2转基因小鼠。Cdh5-CreERT2转基因技术原理是，首先将雌激素受体(ER)的配体结合域(LBD)突变，进而使其与Cre重组酶融合产生一个嵌合重组酶(Cre-ER)，该酶活性依赖于它莫西芬的存在，而不受体内雌激素的影响。通过利用Cdh5基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中的表达。该转基因小鼠若服用它莫西芬，Cre重组酶的活性被激活，SP可导致Cre介导的重组在预定时间内和特定的组织细胞类型(这里是指血管内皮细胞)上发生。Cdh5-CreERT2转基因小鼠的获取也可参考已报道的文献(可参见:Wang，Y.，etal.Ephrin-B2controls VEGF-1nduced ang1genesis andIymphangi ogene s is.Nature.2010May 27；465(7297):483-6.do 1: 10.1038/nature09002.)DCcm3fl/fl 小鼠(可参见:He Y，et al.Stabilizat1n of VEGFR2 s i gna lingby cerebral cavernous malformat1n 3is critical for vascular development.SciSignal.2010Apr 6;3(116):ra26.do1:10.1126/scisignal.2000722.)与Cdh5_CreERT2转基因小鼠交配，即得到可诱导的血管内皮细胞特异性的Ccm3基因敲除鼠(Ccm3-1ecK0)。为了在小鼠体内用它莫西芬诱导Ccm3基因的敲除，我们用玉米油把它莫西芬(Sigma，T5648)配成浓度为10mg/ml的液体，给刚出生的Ccm3-1ecK0和WT(Ccm3fVfl)幼鼠从Pl至P3每天喂10Ug/g(体重)的它莫西芬一次，连续三天。我们从Dr.Nils Brose(Max Planck Institute ofExperimental Medicine ,Germany)得到Unc 13B基因缺失鼠，该鼠无任何表型，除了在I年后可发生癫痫，这可能是由于UNC13在脑的功能缺失导致。
[0032]1.2临床样品
[0033]我们从耶鲁大学医学院的神经病理学系的人体标本档案馆得到CCM3样品。所有样品均由两名独立的富有经验的病理学家来评估CCM3样品的免疫组化结果，他们事先并不知道患者的临床信息。我们得到8例CCM3患者的蜡块标本，并且每个蜡块已有切好的切片20多张。我们通过H&E染色发现6例CCM3样本含有典型的CCM样损害，其病变周围有相对正常的组织包绕;2例CCM3样本有明显的血管纤维化。我们进一步把这8例CCM3样本进行免疫染色分析。
[0034]1.3小鼠体内ANGPT2中和抗体治疗
[0035]我们用无菌的生理盐水把人源化的鼠单克隆ANGPT2中和抗体(Genentech，USA，或DarronMedscience公司(广州道瑞医药科技有限公司))稀释成lmg/mL。从P2开始，隔天腹腔注射ANGPT2中和抗体(10yg/g体重)或正常IgGl到WT或Ccm3_iecK0小鼠体内。
[0036]1.4异硫氰酸荧光素葡聚糖$11~(:-(1^壮&11)灌注和伊文思蓝化^11 Blue)染料渗透试验
[0037]异硫氰酸荧光素葡聚糖(FD2000S; Sigma-Aldrich公司，St.Louis，M0，美国)溶于无菌的生理盐水，离心10，OOOg 5分钟，调整浓度为50mg/ml，收集上清，避光。同胎出生的WT或Ccm3-1ecK0小鼠经ANGPT2中和抗体处理或不经ANGPT2中和抗体处理均称重，并腹部注射麻醉((氯胺酮100mg/kg+甲苯噻嗪10mg/kg))。眼球后注射按照已发表的文献进行。注射部位选定为左眼角外眦。用3/10ml胰岛素注射器(31G针头)轻轻的沿45°角刺入小鼠的眼眶静脉窦。以10μ1异硫氰酸荧光素葡聚糖对应Ig体重来根据体重换算相应异硫氰酸荧光素葡聚糖注射量，并注射入小鼠眼眶静脉窦。5分钟后，收集脑和视网膜，并进行组织铺片或切片免疫染色处理。
[0038]伊文思蓝染料渗透性实验(Miles实验)。伊文思蓝染液(用0.9%NaCl溶液配成1%伊文思蓝溶液;Sigma-Aldrich)注射入已麻醉的WT和Ccm3-1ecK0小鼠眼球后血管丛，注射量为ΙΟμΙ/g体重。注射30分钟后，杀死小鼠并往左心室灌注PBS，以清洗血管内的染料。收集小脑组织，并在60°C中干燥过夜，在伊文思蓝染料取出前称重，用Iml的甲酰胺55°C下孵育小脑组织16小时以取出伊文思蓝染料。用分光光度计(激发光波长为630nm)来检测伊文思蓝的含量。
[0039]1.5免疫荧光分析
[0040]收集小鼠脑组织，用4%多聚甲醛固定，OCT包埋并切片(5μπι厚度)，PBS冲洗两次组织切片以移除OCT，并用PBS配成含5 %驴血清和0.3 % Tri tonX-100的封闭液，封闭和渗透组织切片半小时，以排除非特异性染色。组织切片用一抗4°C孵育过夜，如抗⑶31(1:100)，抗NG2(1: 100)，抗 VE-cadherin(l: 100)，抗 ΖΟ_1(1: 100)，抗 Claudin-5 (1: 100)，抗Ang1poietin-2(l: 100)，抗Connexin_43(l: 100)等。次日用PBS冲洗组织切片三遍，用二抗(l:200to 1:400)在室温下孵育组织切片I小时。然后用I3BS冲洗三遍，组织切片用含DAPI(Vector Laboratory)的防焚光淬灭封片剂封片并拍照。细胞爬片免疫焚光染色方法与组织切片类似。简言之，4 % PFA固定HBMVECs 20分钟，用PBS清洗掉PFA，继而用0.1 %的TritonX-1OO处理细胞爬片2分钟以增加细胞通透性。封闭细胞半小时，相继用一抗二抗孵育细胞，然后进行封片和拍照。
[0041]视网膜荧光染色。异硫氰酸荧光素葡聚糖灌注P5至P15出生的新生小鼠的眼眶周静脉丛，收集眼球并在冰上用4%多聚甲醛固定2小时。继而用PBS清洗掉4%PFA，在显微镜下去除角膜、晶状体、巩膜和玻璃体血管，解剖出完整的视网膜。将视网膜浸润于含5%驴血清、0.5%Triton的PBS中4°C封闭过夜，然后相继用含1%驴血清、0.1%Triton的PBS稀释一抗(1:50)并4°C孵育过夜，荧光二抗4°C孵育过夜，用PBS清洗视网膜5次。以视乳头为中心，在视网膜上用剪刀对称地沿周边视网膜向中心放射状做4个切口，使视网膜平铺成花瓣状，荧光封片剂封片。用TCS SP5共聚焦显微镜(Leica，德国)拍照。用NIH Image J软件统计血管面积占整个视网膜的百分比。
[0042]1.6组织中的基因表达
[0043]用含DNaseI的RNeasy 1^1:((^38611，\^1611(^3，0六)消化组织，提取出总1?嫩。按Qiagen标准程序(Super Script first-strand synthesis system;Qiagen)将RNA(Iyg量)进行反转录。继而用特定引物(如ANGPTl ,ANGPT2和Tie-2)和iQ SYBRGreen Supermix配好反应液，在iCycler实时监测系统(B1-Rad Laboratories, Inc.,Hercules ,CA)进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR) ^NGPTl，ANGPT2和Tie-2引物序列如下:
[0044 ] 小鼠来源:
[0045]ANGPTIRTF:ATTCTTCGCTGCCATTCT
[0046]ANGPTIRTR:CAGTTCCCGTCGTGTTCT
[0047]ANGPT2RTF:TTCCTCTTGGGTGCTTTA
[0048]ANGPT2RTR:CGCTTATTTGGTGGTTATT[0049 ] T i e 2RTF:AGGGCAAGATGGATAGGG
[0050 ] T i e 2RTR:TGAGCACAGGGAGGGTTA[0051 ]人来源:
[0052]ANGPTIRTF:AGAACCTTCAAGGCTTGGTTAC
[0053]ANGPTIRTR:GGTGGTAGCTCTGTTTAATTGCT
[0054]ANGPT2RTF:CTCGAATACGATGACTCGGTG
[0055]ANGPT2RTR:TCATTAGCCACTGAGTGTTGTTT
[0056]Tie2RTF:TCCGCTGGAAGTTACTCAAGA
[0057]T i e 2RTR:GAACTCGCCCTTCACAGAAATAA
[0058]1.7细胞培养和生长因子
[0059]我们根据以前的实验方法(可参见:Waters JP,Kluger MS,Graham M,Chang WG,Bradley JR and Pober JS.1n vitro self-assembly of human pericyte-supportedendothelial microvessels in three-dimens1nal coculture:a simple model forinterrogating endothelial-pericyte interact1ns.J Vasc Res.2013;50:324-31.)分离Ccm3_iecK0小鼠脑微血管内皮细胞(Mouse brain microvascular ECs，MBMVECs)。纯的微血管内皮细胞表达VE-cadherin，血管性假性血友病因子(von ffillebrand factor)和CD31阳性及VEGFR2信号，但不表达周细胞的标记(如SMA和NG2)。所有实验我们用3代以内的原代脑微血管内皮细胞。我们用10nM的4羟基它莫西芬(Sigma, H7904)处理MBMVECs以在体外诱导Ccm3基因的敲除，用溶剂(DMSO/乙醇)处理的细胞为正常对照组。我们从Ang1-Proteomie公司(Boston，USA)购买到人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascularECs，HBMVECs ； cAP0002)和人脑微血管周细胞(HBMVPCs ； cAP-0030)。内皮细胞用微血管内皮细胞生长液(Microvascular Endothelial Cell Growth Medium_2MV，Lonza)培养，周细胞用含有FBS和生长因子(Ang1-Proteomie)的周细胞培养液培养。人肺成纤维细胞用含有1 % FBS的DMEM培养液培养，并在14代以内使用。
[0060] 1.8慢病毒载体和包装系统
[0061 ]我们使用Trans-Lentiviral 包装系统。CCM3-WT(l-212aa)和 CCM3-N(人类患者中含有N端l-95-aa的缩短突变体)的编码序列通过pLEX MCS载体克隆(Clontech)。从Clontech购买能表达mCherry(rLV.EFl.mCherry-9)的慢病毒。转染质粒并包装慢病毒。转染62小时后，收集条件培养基，通过低速离心清除碎片，0.45-μΜ过滤器(Falcon ,LincolnPark，NJ)过滤。然后用所得条件培养基稀释病毒载体，并加入8yg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，M0)，培养过夜转染HBMVEC。第二天换液，细胞继续培养36小时，并用荧光显微镜观察RFP的表达量。CCM3突变的表达量用蛋白质印迹检测。通过50，000g 90分钟高速离心条件培养液来浓缩病毒载体。离心后的浓缩小球用含有4yg/ml聚凝胺的PBS重悬，PBS体积为0.05%的初始条件培养液的容量，滴定病毒载体浓度并于_80°C中保存。
[0062]1.9酶联免疫吸附测定ANGPT2
[0063]为测量人内皮细胞的上清液中ANGPT2的含量，处理细胞后在不同时间点收集细胞上清液。ELISA实验严格按照标准的ELISA方法实施，并用以下抗体检测，R&D的抗ANGPT2抗体、重组人4吣?了2(625-4^025)、人4吣?了21&113(]\^8098)、人4吣?了2生物素化]\&113(831110981)。为了测量在老鼠细胞和组织的ANGPT2，相应的ELISA试剂盒来自R&D(MANG20 WPABCAM(abl71335)。为进行免疫印迹，速冻老鼠组织，并在聚丙烯酰胺凝胶电泳前混匀于RIPA裂解液。为酶联免疫吸附实验，需碾碎新鲜的老鼠组织并在无血清培养皿中孵化2小时，进而测定上清液中的ANGPT2蛋白水平。
[0064]1.10实时TIRF显微镜
[°065] 我们根据以前的实验方法(可参见:Zhang Y,Tang W1Zhang H,Niu X，Xu Y,ZhangJ,Gao K,Pan W1Boggon TJ,Toomre D,Min V and Wu D.A network of interact1nsenables CCM3and STK24to coordinate UNC13D-driven vesicleexocytosis inneutrophils.Dev Cel I.2013; 27: 215-26.)进行实时全内反射荧光显微镜检测。具体用1X70倒置显微镜像(Olympus)，装备一个氩激光谱线(488nm)，一个TIRFM冷凝器，一个60 X1.45NA TIRF物镜(Olympus)和一个EMCCD镜头(iXon887;AndorTechnology)。通过iQ软件(And0rTechn0l0gy)控制成像系统。关于活细胞成像，HBMVEC细胞种入含1.5号玻璃底的35mm培养皿中(MatTek，Ashland，MA)，并用EGM-2-MV培养基培养(Lonza，cc-3202)。首先用RNAiMAX(ThermoFisher)转染 siRNAs 到HBMVEC 细胞内。24 小时后，用Cytofect-内皮细胞转染试剂盒(Cell Applicat1ns Inc.,TF101K)转染VAMP8_Phluorin质粒到细胞内。再经过24小时，细胞放入37 0C的孵化室，以200毫秒的间隔获取转染细胞的实时动态图像，进而用MATLAB系统的ImageJl.42软件(来源于美国国立卫生研究院)处理分析图像。
[0066]I.11跨内皮通量和TEER测量
[0067]跨内皮通量的检测，内皮细胞接种入纤维蛋白包被的96W20idf金电极的ECIS培养皿中(Applied B1Physics)，并用EGM-2培养基(Lonza，cc_3202)培养并转染siRNAs。通过记录72小时内的细胞基质的电阻抗传感来评估内皮细胞的屏障功能。
[0068]1.12 Organotypic血管生成实验
[0069]我们采用经改进的Organotypic血管生成实验(可参见:Hetheridge C1Mavria Gand Mellor H.Uses of the in vitro endothelial-fibroblast organotypic co-culture assay in ang1genesis research.B1chem Soc Trans.201I;39:1597-600.)。用逆转录病毒(Μ0Ι 20)转染HBMVECs使其表达绿色荧光蛋白(EGFP)，2天后再转染siRNAs到细胞体内；或直接给未转染EGFP的HBMVECs转染siRNAs，I天后消化HBMVECs，并在预先铺上2X 14人成纤维细胞并达到融合的24孔板内每孔接种含或不含EGFP表达的经siRNAs转染的8.5 X 13的HBMVECs。我们每两天给细胞换EGM2培养液，并在2至14天在荧光显微镜下直接通过绿色焚光蛋白观察小管形成，或通过VE-cadherin和Co I Iagen IV免疫焚光染色观察小管形成。
[0070]1.13三维出芽实验
[0071 ]用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)转染siCtrl, siUNC13B，siCCM3或siCCM3与siUNC13B的联合到HBMVECs作用8小时或过夜，接着给HBMVECs换成新鲜的微血管内皮细胞生长液(Microvascular Endothelial Cell Growth Medium_2MV，Lonza)培养。我们参照文南犬(Nakatsu MN and Hughes CC.An optimized three-dimens1nal in vitro modelfor the analysis of ang1genesis.Methods Enzymol.2008 ;443:65-82.)进行三维出芽实验。细胞转染24小时后，S卩被消化并与一定数量的微载体珠(C3275，Sigma)混匀在含有1.5ML EGM2 — MV培养液的流式细胞管里，放进培养箱培养，4小时内每隔20分钟轻拍打管壁，以使最终每个微载体珠包被有接近400个细胞。第二天，把这些包被有HBMVECs的微载体珠包埋在2mg/ml的纤维蛋白胶里，继而把20，000/孔的成纤维细胞铺在纤维蛋白胶上层，并给每孔细胞1.01^含或不含4如?12中和抗体(148/!111或1(^8/1111;661^1^6(*或广州道瑞医药科技有限公司)的EGM2—MV培养液。每两天给细胞换液并从2至13天通过显微镜观察细胞出芽状况、管腔形成、血管分支形成及融合过程。
[0072]1.14HBMVECS和HBMVPCs共培养系统的三维出芽实验
[0073]我们参照文献进行血管内皮细胞和周细胞的相互作用的三维出芽实验(Waters，J.P.,et al.1n vitro self-assembly of human pericyte-supported endothelialmicrovessels in three-dimens1nal coculture:a simple model for interrogatingendothelial-pericyte interact1ns.J Vasc Res 50，324-331(2013);Chang，W.G.，Andrejecsk,J.ff.,Kluger,M.S.,Saltzman,ff.M.&Pober,J.S.Pericytes modulateendothelial sprouting.Card1vasc Res 100，492-500(2013);Scheppke，L.，etal.Notch promotes vascular maturat1n by inducing integrin-mediated smoothmuscle cell adhes1n to the endothelial basement membrane.Blood I19，2149—2158(2012).首先用逆转录病毒(MOI 20)转染HBMVECs使其表达绿色荧光蛋白(EGFP)，用腺病毒(MOI 20)转染HBMVPCs使其表达mCherry。继而用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)转染siCtrl，siUNC13B，siCCM3 或 siCCM3 与 siUNC13B 的联合到 HBMVECs。细胞转染 24 小时后，即被消化并按ECs:PCs(2:1)的比例与一定数量的微载体珠(C3275，Sigma)混匀，培养在含有
1.5MLEGM2—MV培养液的流式细胞管里，放进培养箱，4小时内每隔20分钟轻拍打管壁，以使最终每个微载体珠包被有接近400个细胞。我们选择ECs:PCs(2:1)的比例是因为周细胞比血管内皮细胞长得快，且在ECs: PCs (1:1)的比例条件下周细胞限制内皮细胞的出芽。第二天，把这些包被有HBMVECs的微载体珠包埋在2mg/ml的纤维蛋白胶里，继而把20，000/孔的成纤维细胞铺在纤维蛋白胶上层，并给每孔细胞1.0ML含或不含ANGPT2中和抗体(lyg/ml或10yg/ml;美国Genentech公司或广州道瑞医药科技有限公司)的EGM2—MV培养液。每两天给细胞换液并从2至8天通过荧光显微镜观察内皮细胞出芽状况、血管内皮细胞形成小管的周细胞的覆盖率。
[0074]以上试验中我们所用的siRNA由美国SantaCruz公司合成，人的UNC13B基因为以下三个有效s iRNA的混合物:
[0075]sc-42022A:
[0076]正义链序列:GGAUUGCGCUGAAGACUAUtt
[0077]反义链序列:AUAGUCUUCAGCGCAAUCCtt
[0078]sc-42022B:
[0079]正义链序列:GACAUCAAGUCAAGAGUAAtt
[0080]反义链序列:UUACUCUUGACUUGAUGUCtt[0081 ] sc-42022C:
[0082]正义链序列:GGAUCGACCUCUCUACAUAtt
[0083]反义链序列:UAUGUAGAGAGGUCGAUCCtt
[0084]CCM3基因的s iRNA为以下三种s iRNA的混合物:
[0085]sc-62084A:
[0086]正义链序列:GGAUAUAGCUAGUGCAAUAtt
[0087]反义链序列:UAUUGCACUAGCUAUAUCCtt；
[0088]sc-62084B:
[0089]正义链序列:CAACCGACUAAUUCAUCAAtt
[0090]反义链序列:UUGAUGAAUUAGUCGGUUGtt；
[0091]sc-62084C:
[0092]正义链序列:GGAUUAUUGCCAUCUUACAtt
[0093]反义链序列:UGUAAGAUGGCAAUAAUCCtt。
[0094]2.结论
[0095]2.1诱导型的血管内皮细胞特异性Ccm3敲除的小鼠产生CCM损害
[0096]给刚出生的WT(Ccm3fl/fl)幼鼠和可诱导的血管内皮细胞特异性的Ccm3基因敲除(Ccm3-1ecK0)小鼠从Pl至P3每天喂他莫昔芬，在P2-P10取脑组织进行检测。结果发现，Ccm3-1ecK0小鼠能在小脑快速产生CCM血管损害，即扩张膨胀伴出血的毛细血管，该病损在P5可见、PlO急剧增大增多(如图1A—C所示)。没有Ccm3-1ecK0能存活超过Ρ15(η>50)<^ΙΤ(:-dextran小鼠体内循环灌注实验显示，FITC-dextran局限于WT小鼠脑和视网膜的毛细血管床内，但在Ccm3-1ecK0小鼠FITC-dextran弥散渗漏到小脑扩张的毛细血管床外的周边组织(如图1D-F所示hEvans Blue染料渗漏实验也证实了Ccm3_iecK0小鼠小脑增强的血管渗漏(如图1G所示)XCM样静脉血管畸形也在Ccm3ECK0小鼠视网膜周边血管丛被检测到(如图1H-1所示)。
[0097]2.2CCM损害表现为血管内皮细胞连接的破坏和ANGPT2表达的升高
[0098]Ccm3_iecK0小鼠的小脑血管损害以单层扩张的血管内皮和严重减少的周细胞覆盖为特征(如图2A-C所示)。缝隙连接蛋白connexin-43免疫荧光染色在Ccm3-1ecK0小鼠也明显减少，这表明血管内皮细胞和周细胞相互作用的完整性受破坏(如图2A-C所示)。类似地，Ccm3_iecK0小鼠血管内皮细胞粘合连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白claudin-5在小脑CCM血管损害处表达不规则、明显减少(如图2D-F所示)。血管内皮细胞分泌的ANGPT2被经典地认为是ANGPTl的拮抗剂，ANGPT2能拮抗ANGPTl稳定血管的功能，增加血管内皮细胞通透性。在WT小鼠小脑ANGPT2可在正常血管内皮细胞内检测到，然而它在Ccm3-1ecK0小鼠的小脑扩张的血管内和血管病损周围均显著升高(如图2G-H所示)JLISA也检测到Ccm3-1ecKO小鼠的小脑和视网膜显著升高的ANGPT2蛋白水平，但在Ccm3-1ecK0小鼠的肺和血样未检测到升高的ANGPT2蛋白水平(如图21所示)，这与CCM血管损害形成部位一致。ANGPT2(而不是ANGPTl或TIE2)的mRNA表达水平在P5天Ccm3-1ecK0小鼠的小脑轻度增加，在PlO显著增加(如图2J所示)。我们意外地发现Ccm3ECK0小鼠的小脑增加的TIE2蛋白磷酸化水平(如图2K所示)，提示CCM血管损害发展过程中ANGPT2-TIE2信号通路的激活。为证明ANGPT2的上调具有临床相关性，我们检测CCM3病变患者的ANGPT2的表达水平。我们在相对正常区域的脑组织未发现ANGPT2和p-TIE2阳性染色，但在CCM病变区域发现显著升高的ANGPT2和P-TIE2表达，伴血管内皮细胞紧密连接的破坏(如图2L-M所示)。
[0099]2.3 CCM3-ANGPT2信号轴调控EC管腔形成和周细胞募集
[0100]如我们在Ccm3-1ecK0小脑所见CCM3调控血管管腔直径，我们用体外实验EC出芽模型和管腔形成模型分析CCM3对内皮出芽和管腔形成的影响。表达绿色荧光蛋白EGFP和/或siRNAs转染的HBMVECs被种在单层融合的成纤维细胞之上，在7至14天共培养过程中观察管腔形成过程。VE-cadherin和collagen IV免疫荧光染色显示CCM3缺失的内皮细胞出芽和管腔形成明显增加(如图3A所示)。定量分析显示血管分支的数量、平均管腔直径、和成管的面积(Co I Iagen IV覆盖的区域)在CCM3敲低组明显增加(如图3A-B所示)。因CCM3缺失引起的增加的EC出芽和扩大的管腔形成不受正常IgG处理的影响，但能被同时沉默UNC13B表达或用ANGPT2中和抗体所抑制(如图3A-B所示)。为了进一步证实CCM3调控EC管腔形成和周细胞募集，我们用3D出芽实验来验证，该实验中ECs包被在cytodex球珠上，然后cytodex球珠被埋在fibrin胶里，继而在胶上层铺上成纤维细胞。我们发现，因CCM3敲低引起的增加的EC出芽和扩大的管腔形成能被同时沉默UNC13B表达或用ANGPT2中和抗体所抑制(如图3C-D所示)。
[0101]3D出芽实验也是被用来研究周细胞或平滑肌细胞募集和血管成熟的一个系统。为了同时观察出芽过程中的E C和PC，我们把表达绿色荧光蛋白EGFP的HBMVE C转染不同的siRNAs(包括Ctrl或CCM3或UNC13B)和表达红色荧光蛋白mCherry的正常HBMVPC以2:1的比例同时包被在cytodex球珠上。在出芽过程中，PC被招募到正常的EC上，但CCM3敲低的EC不能招募PC(如图3E所示)。然而，在EC同时沉默UNCl3B表达或用ANGPT2中和抗体或两者的结合能恢复正常的PC募集到出芽EC上(如图3E-F所示)。我们的结果提示CCM3能通过抑制EC中ANGPT2的胞吐作用，维护正常EC细胞连接、EC管腔形成和PC募集。
[0102]2.4 ANGPT2中和抗体能阻断Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管损害的形成
[0103]研究表明高剂量的ANGPT2中和抗体能强烈抑制血管生成。大体形态学和HE染色结果显示ANGPT2中和抗体能显著减少Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管损害的形成(如图4A-C所示)。我们进一步检测ANGPT2中和抗体和Uncl3b基因缺失的联合效应对CCM血管损害的影响。ANGPT2中和抗体能完全消除DKO小鼠(Ccm3-1ecK0:Uncl3b—Λ)小脑和视网膜的CCM血管病变(如图4Α-C所示)ο微血管周细胞(NG2阳性)覆盖率在正常IgG处理的Ccm3-1ecKO小鼠为20 %，在ANGPT2中和抗体处理的Ccm3-1ecKO小鼠上升到超过80 %，而在ANGPT2中和抗体处理的DKO小鼠上升到接近100 % (如图4D-E所示)。在EC粘附连接和紧密连接方面，我们也发现类似的结果(如图4D-E所示)。我们进一步在体内实验检测ANGPT2中和抗体对ANGPT2-TIE2信号通路的影响。我们检测到Ccm3-1ecK0小鼠的小脑病变扩张血管周围弥漫着ANGPT2阳性的免疫荧光染色伴随着升高的TIE2蛋白磷酸化染色(如图4F，H所示)<XCm3-1ecK0小鼠的病变小脑弥漫的ANGPT2阳性的免疫荧光染色，升高的ANGPT2总蛋白水平和TIE2蛋白磷酸化水平能被ANGPT2中和抗体显著降低，甚至在DKO小鼠能被ANGPT2中和抗体完全抑制(如图4F-1所示)。综上所述，我们的研究结果支持以下结论:Ccm3基因敲除能诱导ECs分泌ANGPT2，从而导致EC细胞连接的破坏、EC和PC的解离，有助于CCM疾病表型的进展。
[0104]3.结论分析
[0105]本研究，我们报道血管内皮细胞特异性Ccm3基因敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠产生的CCM损害表现为小脑出血、EC细胞连接的破坏、EC和PC的解离，这与小脑扩张的微血管周围升高的ANGPT2分泌有关。我们在Ccm3-1ecK0小鼠小脑和视网膜组织发现升高的ANGPT2分泌，但未在肺组织和血样中发现升高的ANGPT2分泌。CCM3只在脑和视网膜对ANGPT2有作用，这为血管内皮细胞特异性Ccm3基因敲除的小鼠只在脑和视网膜组织产生CCM损害提供了一个可能的解释。体外研究证实血管内皮细胞Ccm3基因缺失能导致EC细胞连接的破坏、扩大的管腔形成和减少的周细胞募集。这些EC表型与Ccm3基因缺失内皮细胞中增高的ANGPT2分泌和释放有关，ANGPT2中和抗体能显著抑制Ccm3基因缺失的EC表型，在小鼠CCM模型能抑制CCM损害的进展，这与它能稳定EC细胞连接、EC-PC相互作用和血管完整性有关。
[0106]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【主权项】
1.ANGPT2抑制剂在制备用于治疗血管瘤的药物中的应用，所述ANGPT2抑制剂通过降低ANGPT2蛋白水平来治疗血管瘤，所述血管瘤以单层扩张的血管内皮细胞和减少的周细胞覆盖为特征。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述血管瘤为脑海绵状血管瘤，所述血管内皮细胞为脑血管内皮细胞。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述脑海绵状血管瘤由CCM3基因的功能缺失引发。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述ANGPT2抑制剂为ANGPT2中和抗体。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗体为单克隆抗体。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗体的用量为10yg/g体重。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗体隔天腹腔注射。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述药物通过稳定血管内皮细胞连接、血管内皮细胞和周细胞的相互作用和血管的完整性来抑制血管瘤损害。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述药物还包括药学上可接受的载体。
【文档编号】A61K45/00GK106075448SQ201610590828
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月25日 公开号201610590828.6, CN 106075448 A, CN 106075448A, CN 201610590828, CN-A-106075448, CN106075448 A, CN106075448A, CN201610590828, CN201610590828.6
【发明人】王敏, 周焕娇
【申请人】广州道瑞医药科技有限公司