负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法和伤口敷料应用
【专利摘要】本发明公开了一种负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜的制备方法和应用。将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)为壳，聚己内酯(PCL)负载积雪草苷为内芯，通过同轴静电纺丝法制备核/壳结构载药纳米纤维膜。本发明方法具有制备原料易于获取、操作简单、可调控性强、易于大规模工业化生产的特点。本发明制得的负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜应用于伤口敷料，具有载药量可控、药物利用率高、以及出色的伤口促愈作用的优点。
【专利说明】
负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法和伤口敷料应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种载药纳米纤维膜的制备，具体涉及一种负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜的制备方法，以及负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜应用于促进伤口愈合的医用敷料。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体面积最大、且具有高级组织结构的器官，它的功能是防止细菌侵蚀和感染、保护人体、调节体温和排泄体液等。大面积皮肤损伤除了皮肤和组织受到破坏以外，还有可能引起整个身体一系列复杂的病理、生理变化，如新陈代谢加剧、水分和蛋白质过度散失、免疫系统失调等，严重的还会危及生命。因此，不论伤后时间早晚，必须用创伤敷料将裸露的创面暂时性覆盖，以提供有利于创面愈合、促进组织修复的环境，尽快地修复皮肤缺损创面，恢复其生理功能。传统医用敷料多以清洁或保护伤口的纱布、棉花等材料为主，成本低廉、制作简单，但存在难以克服的先天性缺陷:对创面的愈合无明显促进作用；换药时可引起疼痛且易损伤新生组织;敷料被浸透时，病原体易通过;换药工作量大等。随着人们对伤口和伤口复愈过程的不断了解，以及材料科学的不断发展，许多新型的高分子材料也被应用于医用敷料的生产中，并在临床应用中承担越来越重要的作用。
[0003]静电纺丝技术是一种高效制备纳米纤维的方法，其中同轴静电纺丝得到的超细纤维膜除了具有普通电纺膜的高比表面积和孔隙率的优点以外，还具有独特的核/壳结构。它在内芯包载生物活性药物时具有保护药物的作用，使其在恶劣的环境中保持稳定，防止它的分解和变性，还能达到持续地对生物活性物质或者药物进行输送的目的，是一类具有较好市场前景的伤口敷料加工方法。
[0004]积雪草(Centella asiatica)，又称半边钱，为伞形科积雪草属植物，广泛分布于长江流域以南各地，是民间常用中草药，我国医学上用积雪草外用及内服治病已有两千多年历史。积雪草苷是从中药积雪草中提取的主要单体成分，现代药理学研究表明，它具有抑制成纤维细胞增殖的作用。积雪草苷通过降低促进瘢痕增生的TGF - fomRNA的表达和增加抑制瘢痕增生的TGF - ^mRNA的表达，从而引起金属基质蛋白酶抑制物(TMPS)表达明显减少，达到促进I型胶原降解，减轻瘢痕增生的作用。专利号为CN201510994598.5的专利“一种具有促进伤口愈合功效的医用敷料及制法”，专利号为CN201510994602.8的专利“具有促进皮肤创面修复的医用薄膜及制备方法”，专利号为CN201510994598.5的专利“一种具有促进伤口愈合功效的医用敷料及制法”，专利号为CN201510994613.6的专利“促进皮肤创面修复的敷料及制备方法”，虽然将积雪草苷作为有效成分应用于伤口敷料，但都是通过凝胶或涂敷剂型给药。不同剂型不同给药方式，对药代动力学和相对生物利用度的影响十分巨大。考虑到积雪草苷具有不稳定、易失活的缺点，可将其作为主药，通过同轴静电纺丝技术制备成核/壳结构的载药电纺纤维膜鲜有报道。这种方法不仅使积雪草苷在临床上得到更广泛的应用，也为中药剂型开发开辟了新途径。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种负载中药积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜的制备方法，以及该载药纳米纤维膜作为伤口敷料的应用。以具有良好生物相容性、生物降解性的生物医用高分子材料聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)为壳，具有良好的纺丝性能和优良的力学性能的聚己内酯(PCL)负载积雪草苷为内芯，通过同轴静电纺丝法制备一种核/壳结构载药纳米纤维膜。制得的载药纳米纤维膜在促进伤口愈合上具有突出优势，可用于医用伤口敷料。制备原料易于获取，价格便宜，制备工艺简单，易于大规模工业化生产，具有很好的市场前景。
[0006]—种负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法，包括如下步骤:
(1)将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)溶于有机溶剂一，制成浓度为0.1-0.3g/mL的壳层纺丝溶液；
(2)将聚己内酯(PCL)溶于有机溶剂二，形成浓度为0.13?0.27g/mL的溶液，并加入
0.02-0.08 g/mL的积雪草苷配制成内芯纺丝溶液；
(3)将上述壳层纺丝溶液、内芯纺丝溶液两种溶液分别加入两个注射器中，由同轴针头连接入同轴静电纺丝装置，进行高压静电纺丝，得到负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜。
[0007]所述高压静电纺丝条件为:电源电压12kV?21 kV、针头与接收基板之间的距离为12cm?16 cm、供料速度外层为0.5 mL/h?1.3 1111^/]1、内层为2.0 mL/h?3.5 mL/ho
[0008]所述有机溶剂一是二氯甲烷、N，N_二甲基甲酰胺的混合溶液;其中，二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的体积比为3?4:10
[0009]所述有机溶剂二是二氯甲烷。
[0010]所述的制备方法制得的纳米纤维膜，其特征在于:所述纳米纤维膜的形貌为核/壳结构。
[0011]所述的负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法制备的负载纳米纤维膜在促进伤口愈合敷料中的应用。
[0012]本发明外壳纺丝溶液选用乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)，是由于PLGA具有优异的生物相容性和生物可降解性。在生物体内，可降解为被活体细胞代谢的乳酸，最终能够完全降解为二氧化碳和水，保证生物体的安全。
[0013]所述的内层芯液的载体材料选用聚己内酯(PCL)，是由于PCL电纺成丝性能极好，细胞毒性小，尺寸稳定性优。
[0014]所述的二氯甲烷/ N，N_二甲基甲酰胺的混合溶液，体积比优选为3?4: 1，这个比例利于PLGA完全溶解其中形成均一溶液。
[0015]所述的药物为中药积雪草中的有效成分积雪草苷，有促进体内胶原合成和心血管生成、刺激肉芽生长等重要作用，从而加快细胞增殖，促进创面愈合。
[0016]所述的静电纺丝装置可采用本领域现有的通用装置，针头采用同轴针头。
[0017]由于聚己内酯(PCL)不溶于水，而且其有机溶液与水相接触后会发生相分离现象，导致溶质析出变成凝胶状物质。为了保证电纺的稳定性，应避免使用水作溶剂，因此对于PLGA/PCL体系，选择二氯甲烷/ N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液作为PLGA的溶剂，PCL的溶剂为二氯甲烷。这种相容的体系可以有效的降低内外溶液间的界面张力，使电纺过程更加稳定不易产生液滴等缺陷。
[0018]核/壳纤维形成的决定因素之一是内外管溶液具有相适宜的浓度和流速:浓度太小电纺不稳定，不能得到较多核/壳纤维，浓度太大电纺将不能进行;外管流速过小，不能包裹住内层溶液，外管流速过大，内层溶液不连续，同轴电纺效果接近普通电纺。因此，本发明中壳层纺丝溶液浓度为0.1-0.3 g/mL；内芯纺丝溶液浓度为0.13-0.27 g/mL，供料速度壳层为0.8 mL/h?2.0mL/h、内层为0.5 mL/h?1.6 mL/h。
[0019]本发明中药物积雪草苷的浓度优选0.02?0.08g/mL，是兼顾了得到直径分布均匀、表面光滑的电纺纳米纤维膜以及使载药电纺膜中药物的含量与市售的成品药相近。
[0020]本发明具有如下优点:
(1)本发明采用了乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)作为外壳纺丝材料，具有优异的生物相容性和生物可降解性。作为与皮肤接触的第一层，可有效保证生物体的安全；
(2)本发明以电纺成丝性能极好，细胞毒性小，尺寸稳定性优的聚己内酯(PCL)为负载药物的内芯纺丝材料，与药物具有良好的相容性，可实现药物的有效担载并维持纤维使用时形状的完整性；
(3)调节静电纺丝过程中的电源电压、针头与接收基板的距离、供料速度及纺丝液的浓度、环境参数等，可以得到不同形貌及纤维直径的纳米纤维膜，从而实现纤维膜的可控性制备;
(4)本发明所述的负载中药积雪草苷的核壳结构纳米纤维膜不仅具有很高的孔隙率和比表面积，而且此剂型克服了积雪草苷具有不稳定、易失活的缺点，利用载药高分子材料的生物相容性与可降解性，在保护伤口的同时使药物随着载体的降解缓慢释放出来，起到消炎抗菌的作用，加快伤口的愈合速度的作用；
(5)本发明制得的负载中药积雪草苷的核壳结构纳米纤维膜应用于伤口敷料，相对于普通的凝胶或涂覆膜，具有载药量可控，释放速率可控，降低突释，可使环境中药物长期维持有效的药物浓度，极大提高药物利用率及作用效果等众多的技术优势；
(6)本发明制得的负载中药积雪草苷的核壳结构纳米纤维膜应用于伤口敷料，相较于传统纱布敷料，可大大克服换药时引起疼痛且易损伤新生组织、敷料被浸透时，病原体易通过以及换药工作量大等缺点；
(7)本发明制得的负载中药积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜应用于伤口敷料，避免了传统中药及其复方在加工过程中烦琐的处理工序，可克服因中药的某些药代动力学原因引起的疗效不稳的缺点，有利于药物规范化研究、开发、生产、管理；
(8 )本发明制备方法简单、操作便捷，在对载体材料进行电纺的同时，实现对药物的担载，且可根据疾病治疗的不同需要，调整所需的载药量，进而可方便地实现个体化药物释放治疗。
【附图说明】
[0021]图1为实施例1制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜的扫描电镜图；
图2为实施例1制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜的透射电镜图；
图3为实施例1、2、3、4制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜的体外释药曲线； 图4(a)为伤口造模的肉眼观察照片； 图4(b)为实施例1、2、3、4制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜致伤2天后点伤口愈合的肉眼观察照片；
图4(c)为实施例1、2、3、4制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜致伤5天后点伤口愈合的肉眼观察照片；
图4(d)为实施例1、2、3、4制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜致伤7天后点伤口愈合的肉眼观察照片；
图5A?图5E为实施例1、2、3、4制备的负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜显微镜下观察致伤7天后的创面修复情况组织切片图。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为3:1)，制成浓度为0.15 g/mL的壳层纺丝溶液;将聚己内酯(PCL)溶于二氯甲烷，形成浓度为0.13 g/mL的溶液，并加入0.02 g/mL的积雪草苷配制成内芯纺丝溶液。将壳层纺丝溶液、内芯纺丝溶液两种溶液分别加入两个注射器中，由同轴针头连接入同轴静电纺丝装置，在电源电压12 kV、针头与接收基板之间的距离为13cm、供料速度外层为0.5 !^/!!、内层为〗^ mL/h的纺丝条件下，得到负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜。
[0023]实施例2
将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为3.5:1)，制成浓度为0.20 g/mL的壳层纺丝溶液;将聚己内酯(PCL)溶于二氯甲烷，形成浓度为0.15 g/mL的溶液，并加入0.04 g/mL的积雪草苷配制成内芯纺丝溶液。将壳层纺丝溶液、内芯纺丝溶液两种溶液分别加入两个注射器中，由同轴针头连接入同轴静电纺丝装置，在电源电压14 kV、针头与接收基板之间的距离为14cm、供料速度外层为0.7 mL/h、内层为2.4 mL/h的纺丝条件下，得到负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜。
[0024]实施例3
将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为4:1)，制成浓度为0.23 g/mL的壳层纺丝溶液;将聚己内酯(PCL)溶于二氯甲烷，形成浓度为0.20 g/mL的溶液，并加入0.06 g/mL的积雪草苷配制成内芯纺丝溶液。将壳层纺丝溶液、内芯纺丝溶液两种溶液分别加入两个注射器中，由同轴针头连接入同轴静电纺丝装置，在电源电压16 kV、针头与接收基板之间的距离为15cm、供料速度外层为0.9 !^/!!、内层为〗』mL/h的纺丝条件下，得到负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜。
[0025]实施例4
将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液(二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为4:1)，制成浓度为0.27 g/mL的壳层纺丝溶液;将聚己内酯(PCL)溶于二氯甲烷，形成浓度为0.25 g/mL的溶液，并加入0.08 g/mL的积雪草苷配制成内芯纺丝溶液。将壳层纺丝溶液、内芯纺丝溶液两种溶液分别加入两个注射器中，由同轴针头连接入同轴静电纺丝装置，在电源电压19 kV、针头与接收基板之间的距离为16cm、供料速度外层为1.0 mL/h、内层为3.0mL/h的纺丝条件下，得到负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜。
[0026]应用例I
负载积雪草苷的核壳结构纳米纤维膜应用于伤口敷料的动物实验:本实验利用了大鼠全层皮肤缺损创面模型，观察创伤愈合的自然过程，评价电纺膜和药物的疗效。将大鼠于背部脊柱两侧一厘米处剪出直径为Icm的圆形皮肤伤口，去除表皮、真皮及皮下结缔组织，深至肌层，每只大鼠做5个伤口(图4(a))。
分别取实施例1、2、3、4中制备的载药纳米纤维膜，贴敷在A，B, C，D四个伤口上，其中伤口 E采用纱布覆盖，做空白对照。定期取材，进行肉眼外表观察致伤后不同时间点的创面组织切片，分析伤口肉芽组织生长情况，对四个创面的愈合情况进行评估。结果如图4(b-d)所示。
[0027]创伤2天后，各组伤口创缘皮肤都有收缩并伴有结痂现象，伤口表面均有较严重的炎症反应，除去材料后伤口为红色。实施例1、实施例2膜、实施例3膜和实施例4膜处理的伤口有较少的炎性渗出物，伤口颜色发白。空白组E (普通纱布覆盖)的炎症反应最重，伤口面积最大(图4(b))。
[0028]创伤5天后，伤口结痂更加明显，伤口面积明显缩小，此时伤口颜色红润炎症反应基本结束，均可见鲜红的肉芽组织。但相较于空白组E (普通纱布覆盖)，实施例1、实施例2膜、实施例3膜和实施例4膜处理的伤口明显愈合效果更好，表皮已生成(图4(c))。
[0029]创伤7天后，实施例1、实施例2膜、实施例3膜和实施例4膜处理的伤口创缘周边几乎全部被新生表皮覆盖，鲜有焦痂存在。但空白组E伤口愈合情况明显较差(图4( d))。
[0030]说明所制备的载药纳米纤维膜可以起到有效的伤口促愈作用。
[0031]应用例2
负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜应用于伤口敷料的动物实验:创面愈合是由多种细胞和组织参与的复杂生理修复过程，成纤维细胞在创伤的修复中起着十分重要的作用。本实验利用了大鼠全层皮肤缺损创面模型，观察创伤愈合的自然过程，评价电纺膜和药物的疗效。将大鼠于背部脊柱两侧一厘米处剪出直径为Icm的圆形皮肤伤口，去除表皮、真皮及皮下结缔组织，深至肌层，每只大鼠做5个伤口。
[0032]分别取实施例1、2、3、4中制备的载药纳米纤维膜，贴敷在A，B,C，D四个伤口上，其中伤口 E采用纱布覆盖，做空白对照。致伤7天后取材，进行显微镜下观察创面组织切片。具体做法为将大鼠用10%水合氯醛麻醉，用无菌手术器械取创面新生皮肤及周围正常皮肤，深达肌层表面深筋膜(取材时多取些切口周围的皮肤，可以防止损伤新生的皮肤，同时也方便固定时不容易卷曲)。将取下后的皮肤用镊子摊平，真皮面向下贴在有孔的塑料固定盒中，立即将盒放入4%的多聚甲醛固定液中，在4°C的冰箱中固定24小时。期间不定时摇晃，以便于组织固定的更完全。取出固定后的组织用pH为7.4的PBS液每5 min冲洗一遍，冲洗两次。冲洗完后置于20%的蔗糖溶液中脱水，沉底后换用30%的蔗糖溶液继续脱水沉底，之后换用35 %的蔗糖溶液脱水，至组织块沉底。将脱完水的组织放入冰冻切片机中OTC包埋，制作厚度为10-20 μπι的切片。用PBS液每5 min冲洗切片一遍，冲洗3次。将制作好的切片水洗1-2 S，用苏木精液染色(60°C) 30?60 S。流水洗去苏木精液并用1%盐酸乙醇冲洗。流水冲洗切片，用0.5 %伊红液染色30?60 S。依次用流水、80%乙醇、95%乙醇、无水乙冲洗卜2 s制成切片。切片用石炭酸二甲苯冲洗2?3 s，二甲苯冲洗2?3 s冲洗两次，用树脂封片，制成透明封片观察。分析伤口肉芽组织生长情况，对五个创面的愈合情况进行评估。结果如图5A、图5B、图5C、图图5E所示。
[0033]肉芽组织中的细胞间质主要成分是胶原，胶原不断合成、分泌、改构、更新，不断改善修复组织的结构和强度。成纤维细胞为合成胶原的主要细胞，在创伤修复后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的重建。
[0034]致伤7天后，实施例1、2、3、4中制备的载药纳米纤维膜覆盖的伤口均有较为疏松的成纤维细胞和丰富的毛细血管，说明均有晚期肉芽组织生成，且新生上皮组织覆盖了晚期肉芽组织创面，有小血管和毛囊形成，伤口进入最终修复阶段。而E组(图5E)相较于其余四组，成熟的成纤维细胞较少，肉芽组织的成熟度较低。
【主权项】
1.一种负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法，包括如下步骤: (1)将乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)溶于有机溶剂一，制成浓度为0.1-0.3g/mL的壳层纺丝溶液； (2)将聚己内酯(PCL)溶于有机溶剂二，形成浓度为0.13?0.27g/mL的溶液，并加入0.02-0.08 g/mL的积雪草苷配制成内芯纺丝溶液； (3)将上述壳层纺丝溶液、内芯纺丝溶液两种溶液分别加入两个注射器中，由同轴针头连接入同轴静电纺丝装置，进行高压静电纺丝，得到负载积雪草苷的核/壳结构纳米纤维膜。2.根据权利要求1所述的负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法，其特征在于，所述高压静电纺丝条件为:电源电压12 kV?21 kV、针头与接收基板之间的距离为12cm?16 cm、供料速度外层为0.5 mL/h?1.3 1111^/]1、内层为2.0 mL/h?3.5 mL/ho3.根据权利要求1所述的负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法，其特征在于，所述有机溶剂一是二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液;其中，二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的体积比为3?4:104.根据权利要求1所述的负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法，其特征在于，所述有机溶剂二是二氯甲烷。5.如权利要求1至4任一项所述的制备方法制得的纳米纤维膜，其特征在于:所述纳米纤维膜的形貌为核/壳结构。6.如权利要求5所述的负载中药积雪草苷的核/壳结构的纳米纤维膜制备方法制备的纳米纤维膜在促进伤口愈合敷料中的应用。
【文档编号】D01D5/34GK106075539SQ201610435975
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】吕媛媛, 嵇媛媛, 顾伟, 宣贵达, 沈王兴
【申请人】浙江大学城市学院