一种采用灌注?压差法制备脱细胞基质生物材料的方法

文档序号:10705530阅读:549来源:国知局
一种采用灌注?压差法制备脱细胞基质生物材料的方法
【专利摘要】本发明涉及一种采用灌注?压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,包括:(1)将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器,灌注消毒液同时超声振荡进行预灭菌;(2)依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液,利用渗透压差和/或液压差洗去细胞内容物、清除抗原;最终消毒灭菌、保存,即得。本发明可以显著缩短生化试剂的处理时间、降低生化试剂的使用浓度;明显提高了脱细胞基质生物材料中粘连蛋白类、生长因子类、蛋白聚糖类、糖蛋白类、葡糖胺基聚糖类等生物活性成分的保留量;同时力学强度保留好、脱细胞彻底,病毒等生物负载清除干净;工业化生产方便,具有良好的应用前景。
【专利说明】
一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物支架材料领域,特别涉及一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质 生物材料的方法。
【背景技术】
[0002] 脱细胞技术制备的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分生物材料是软 组织修复材料的重要发展方向。相关产品在国外被广泛的用于各种创面,如代替脑膜、胸 膜、血管、骨膜、心包、关节囊等,肝脾等实质脏器破损填塞止血、吻合口加强、膀胱悬吊、盆 底重建以及各种复杂疝和腹壁缺损的治疗如伴有污染的腹壁缺损、合成补片植入后感染、 肠痿二次手术治疗、造口旁疝预防等。
[0003] ECM是所有组织器官的组成部分,维持着各种组织器官的三维结构和储存营养物 质,支撑着细胞赖生存、活动和变化。ECM作为组织修复和再生支架材料具有较多优势:①结 构和组分接近自然,生物相容性佳:ECM的主要成分包括结构蛋白(主要为I型和m型胶原纤 维,含少量IV型和VI型胶原纤维,其余部分主要为糖蛋白、纤粘蛋白、糖胺聚糖类(硫酸软骨 素、硫酸肝素、透明质酸、蛋白多糖、结合生长因子和储留水等)、生长因子与酶类(碱性成纤 维细胞生成因子(bFGF)-2、转化生长因子(TGF)-I胰岛素样生长因子(IGF)和血管内皮生 长因子(VEGF)、肝脏生长因子(HGF)等);②ECM保留"组织特异性"微环境,能够维持生长其 上的细胞形态和表型、增进细胞的粘附、增殖和分化:以骨骼肌ECM为例,其ECM高IV型胶原 含量(骨骼肌基底膜的主要成分),具有复杂的、具有启动功能的三维超微结构,包括平行排 列的基底膜(肌内膜管)结构、残存的神经和血管通路,利于成肌细胞粘附、迀移、激活和融 合,且其降解产物对维持成肌细胞和卫星细胞的活力非常重要。③ECM有良好的可降解性和 降解速率可控性,降解更符合再生规律;④ECM具有一定的孔隙率,便于组织间的营养和物 质空气的交换;⑤ECM具有一定的机械强度能够对组织的生长起到支持作用。
[0004] ECM材料的制备均是将取自同种、异种的组织,经脱细胞处理去除组织中的所有细 胞、抗原、脂质、可溶性蛋白质等物质、保留下具有完整外观形态和组织学及超微结构的不 溶性细胞外基质。ECM生物修补材料携带生物活性成分的多少将直接影响其体内重塑和修 复效果。脱细胞方案十分严酷,生物活性成分将丢失殆尽(粘连蛋白、生长因子和糖胺聚糖 类等生物活性成分含量保留量低于30% ),植入后仅可诱导再生出血管化的结缔组织填充 组织缺损、实现解剖层面的修复。中国目前临床上已有的关于ECM材料的应用,包括替代脑 膜、胸膜,盆底重建、肛痿修补以及各种复杂疝和腹壁缺损的治疗等均属于这一水平。保留 了天然ECM中40%以上的生物活性成分、低免疫原性的产品植入后则能实现组织特异性的 诱导再生;如实现肌肉筋膜等组织再生和神经支配恢复而改善残疾肢体功能和断指再造, 疗效肯定。
[0005] 因此,相关制备技术发展的方向即是彻底脱细胞的同时最大限度保留生物活性成 分、并减少因材料引起的各种并发症如浆液肿、修复区失弹性等。已有的片状ECM材料的脱 细胞方法一般都是化学除垢剂联合其他辅助试剂振荡法,即将片状材料置于处理液中剧烈 震荡摇摆。这一方法存在较多缺点:首先,外基质生物材料如小肠粘膜下层、膀胱基质,多为 致密结缔组织结构,一般的生化试剂+物理振荡的方法并不能使得试剂穿透结缔组织,试剂 只能被动的处理材料表层细胞成分,无法深入具有一定厚度的组织发挥完全彻底的脱细胞 作用。其次,振荡过程中极易导致片状的细胞外基质材料纠结而致使不能全部得到彻底的 脱细胞处理,部分细胞外基质材料片段上的生物负载如真菌、病毒等灭活不充分,植入引起 较高水平的炎症反应、降低材料重塑效果;再次,振荡洗出DNA、抗原等物质需要较长的处理 时间、生物活性成分丢失多,如细胞外基质生物材料制备过程中都经历了碱处理,这一步骤 虽然可用于促进材料的显著扩张(体积增加甚至达到6倍)、提高了孔隙率和表面的均匀性、 降低脂质含量,但同时也几乎全部耗尽了细胞外基质中生物活性成分如生长因子、糖蛋白、 葡萄糖胺聚糖、蛋白聚糖等,部分厂家常在之后步骤中,再次通过喷雾、浸泡、沉浸等方法补 充生物活性成分;最后,振荡工艺过程需要多次人工更换液体,分离材料,操作繁琐,所需时 间较长。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材 料的方法,该方法可以显著缩短生化试剂的处理时间、降低生化试剂的使用浓度;明显提高 了脱细胞基质生物材料中粘连蛋白类、生长因子类、蛋白聚糖类、糖蛋白类、葡糖胺基聚糖 类等生物活性成分的保留量;同时力学强度保留好、脱细胞彻底,病毒等生物负载清除干 净;工业化生产方便,具有良好的应用前景。
[0007] 本发明的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,包括:
[0008] (1)将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器,灌注消毒液同时超声振 荡进行预灭菌;
[0009] (2)依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液,利用渗透 压差和/或液压差洗去细胞内容物、清除抗原;最终消毒灭菌、保存,即得。
[0010]所述步骤(1)中的原材料为哺乳动物(人、猪、牛、胎牛、马、羊、狗)的空腔脏器(肠、 胃、膀胱)的粘膜下层或全层。
[0011 ]所述步骤(1)中的灌注反应器为"灌注-套管机-灌注"自动脱细胞反应器。
[0012] 所述步骤(1)中的消毒液为醇与过氧化物、氧化性消毒剂或非氧化性消毒剂中一 种或多种;预灭菌的时间为1~5小时。预灭菌处理包括单纯腔内灌注或腔内外联合灌注,灌 注方式为循环或非循环灌注,消毒后PBS和去离子水交替灌注冲洗。消毒液优选为过氧乙酸 (Peroxyacetic acid,PAA)/乙醇(EtOH)混合液,其中PAA的终浓度(V/V)为0 ·05-0 · 5%,乙 醇的终浓度(V/V)为0.5-10%,PAA/乙醇混合液的作用时间1-5小时,优选为2-3小时,灌注 速度为管腔内外液体每15分钟更新一遍。
[0013] 所述步骤(2)中的细胞内容物清洗液为含盐缓冲液、碱性溶液或DNA增溶性缓冲盐 等溶液中一种或几种;洗去细胞内容物的时间为0.1-16小时。
[0014] 所述步骤(2)中的抗原封闭/清除液为离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或 酶类(DNA酶、RNA酶、半乳糖苷酶)溶液中的一种或几种,如浓度0.005-0.1 %的十二烷基硫 酸钠或0.01-1 %的Triton-X,表面活性剂处理同时可协助脱脂、进一步降低DNA含量。清除 抗原的时间为0.1 -16小时。
[0015] 所述步骤(2)中的洗去细胞内容物、清除抗原之前(之中、之后也可)还包括灌注脱 脂溶剂进行脱脂处理。
[0016] 所述脱脂溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、氯仿中的一种或几种。
[0017] 步骤(2)中的灌注处理包括管腔内灌注和管腔外灌注,管腔内外流动液体的种类、 压力(可内外反复交替利用液体压力差产生透壁液体交换)以及液体流向(同向或反向)均 可不同。灌注方式为循环或非循环灌注,管腔内外灌注系统各自独立。管腔外液体的质量与 材料的体积比多2:1且要求材料全部浸于管腔外液体中。管腔内外液体流量要求每15分钟 全部更新一遍。
[0018] 预灭菌消毒液、细胞内容物清洗液、抗原清除液可于管腔内外同时灌注但保持不 同渗透压或液体压力,优选方案是管腔内外同时存在一定的渗透压差和液体压差,渗透压 与液体压形成同方向的透壁流,在不增加被灌注腔壁力学负荷的前提下达到增加细胞内容 物的灌注洗出、降低免疫原性和封闭抗原的效果。
[0019] 所述灌注处理管腔内外液体压力差,不超过被灌注空腔脏器的粘膜下层或全层的 爆破压(Burst Pressure)的最大值;管腔内外渗透压差为2-10倍,优选2-4倍。
[0020] 所述步骤(2)中的消毒灭菌的方法为全反应器系统预灭菌、全程灭菌液体灌注、灌 注消毒液、环氧乙烷灭菌、超临界CO2灭菌、等离子体处理、γ射线辐射灭菌中的一种或几 种。
[0021] 所述步骤(2)中的保存为冷冻干燥保存或保存液保存。
[0022]所述预灭菌、洗去细胞内容物、清除抗原、消毒灭菌后均进行灌注清洗,以便除去 保留在材料内或材料上的引进的化学残留物。包括反复交替灌注去离子水、磷酸缓冲盐或 生理盐水,可辅助超声振荡。
[0023] 本发明灌注脱细胞处理的全程工作温度1_30°C,优选为4°C。
[0024]本发明全部操作步骤,除最初接入反应器需要手工操作外,全程处理可由生产线 自动完成。
[0025]本发明的高压灌注指的是在肠管内外同时以不同压力(等静水压)/渗透压的灌注 消毒液、抗原灭活试剂、脱脂剂,形成肠管内外的均匀的液体压力差或渗透压差,借助这种 压力差和快速的液体运输交换过程使试剂中的成分主动性穿透组织,增强各项试剂的功 能,缩短处理时间,增强细胞破碎效果,快速洗去细胞内容物,达到彻底脱除细胞的效果。这 种压力差通常为肠管内部压力/渗透压高于外部压力/渗透压。
[0026]本发明的原理:高压/渗透压差的灌注方法处理细胞外基质生物材料的过程可以 分为三步:在灌注早期,由于肠管内外存在均匀的液体压/渗透压差,势必导致一定程度的 肠管内外液体交换过程,而这种液体交换过程鉴于肠管的完整性仅能通过细胞间隙发生。 这样一方面可以增大试剂与细胞膜的接触面积,促进试剂深入组织内部破坏细胞膜;另一 方面压力/渗透压差在一定程度上具有破碎细胞的效果。而单纯使用生物化学试剂脱细胞 时,仅通过提高试剂浓度,延长处理时间并不能达到相似效果。在灌注中期,在较短时间内, 材料内部的细胞膜和核膜基本破碎,细胞内容物流出分散。在灌注后期,肠管内外的压力差 导致的液体交换可以在细胞间隙和破碎细胞内进行,以完全透壁流动的液体交换方式快 速、彻底冲洗出残留细胞内容物。在这一步完全可以更换功能性试剂为中性化缓冲液体,以 达到相同的效果,减少破坏性试剂的使用。
[0027] 灌注-压差法的优势:相对于振荡法的不足①振荡过程中极易导致片状的细胞外 基质材料缠绕而致使不能全部得到彻底的脱细胞处理,②振荡洗出DNA、抗原等物质需要较 长的处理时间、生物活性成分丢失多,③工艺过程操作繁琐;腔内外联合灌注制备法处理膜 状或管状细胞外基质材料,通过压力形成内腔、外腔等壁两侧可反复交替的透壁液体流动, 以温和的方式持续不断的洗去DNA、抗原等物质。使用灌注可使用最少的液体流量、最短的 处理时间即可脱脂、洗走细胞成分、清除抗原和消毒,如灌注-压差法以十分之一的化学试 剂浓度、二分之一的处理时间即获得与机械振荡法一样的DNA去除和封闭抗原效果,同时保 留有更高的生物活性成分含量。此外,灌注-压差法全部流程都可以使用电脑控制完成,除 了最初将膜状原材料接入反应器需要人工操作,其他步骤均可程控完成,不需要像机械振 荡法那样反复需人工解开膜状脱细胞基质材料纠结、换液,适合工业化生产。
[0028] 通过调节腔内外灌注压力成的透壁液体流动,可以使得化学/生物试剂快速充分 的与细胞膜接触,致使细胞膜和细胞核结构破坏,内容物流出,极大的缩短试剂的处理时间 和降低浓度,且透壁流动可以确保细胞内容物的彻底洗出。整个脱细胞过程快速、彻底且温 和,更好的保留生物活性成分含量。
[0029] 有益效果
[0030]本发明可以显著缩短生化试剂的处理时间、降低生化试剂的使用浓度;明显提高 了脱细胞基质生物材料中粘连蛋白类、生长因子类、蛋白聚糖类、糖蛋白类、葡糖胺基聚糖 类等生物活性成分的保留量;同时力学强度保留好、脱细胞彻底,病毒等生物负载清除干 净;工业化生产方便,具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0031 ]图1为本发明自动脱细胞反应器结构原理图;
[0032]图2为本发明的具体操作图;
[0033]图3为本发明制备的脱细胞基质生物材料的生物学特性比较;其中,A为DNA残留 量,B为血管内皮生长因子含量,C为转化生长因子_i3,D为成纤维生长因子;*代表两组间比 较存在显著性差异(P〈〇. 05)。
[0034] 图4为本发明制备的脱细胞基质生物材料的力学特性比较;其中,A为单向拉伸强 度;B为爆破力;C为透湿性;*代表两组间比较存在显著性差异(P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0036] 实施例1
[0037]灌注法脱细胞基质的制备:
[0038] 原材料获取:植物源饲料封闭饲养的大猪,体重150公斤以上,死亡后半小时取出 空肠。腔内冲洗后置于2°C的长征-1号器官保存液中,运输过程中维持温度不超过4°C。
[0039] 预灭菌:猪空肠接入灌注反应杆,腔内循环灌注0.05%过氧乙酸/5%乙醇混合消 毒液,灌注速度l〇〇ml/min/m,同时腔外浸泡于0.05%过氧乙酸/5%乙醇混合消毒液,处理 时间15分钟。已证实处理5分钟可以完全灭活猪荚膜病毒,生物负载量降至不高于2CFU/g、 内毒素量降至不高于20EU/g、指示病毒量降至100PFU/g,bFGF在这一步骤中损失不超过 10%〇
[0040]分离猪小肠粘膜下层:猪空肠使用通用机猪肠衣机(3-U-400Stridhs型,瑞典AB Stridhs Maskiner公司)制备。PBS和去离子水交替灌注冲洗。
[0041 ] 脱脂处理:依次管腔内外反向灌注50 %、70 %、90 %、100 %乙醇各15分钟,循环灌 注,腔内压力高于腔外,腔内灌注速度l〇〇ml/min/m,辅助170kHz的超声振荡。结束后去离子 水灌注15分钟进入下一步骤。
[0042]洗出细胞内容物:管腔内外反向灌注DNA增溶性缓冲盐溶液30分钟,非循环灌注, 腔内压力高于腔外,腔内灌注速度l〇〇ml/min/m,腔内外渗透压差4倍。结束后去离子水灌注 15分钟进入下一步骤。
[0043]抗原封闭:管腔内外反向灌注0.005%的十二烷基硫酸钠溶液30分钟,非循环灌 注,腔内压力高于腔外,腔内灌注速度l〇〇ml/min/m。结束后去离子水、IXPBS液交替灌注2 轮,每次各灌注15分钟,进入下一步骤。
[0044]消毒和保存:自0.05 %PAA/5 %ET0H灌注后,所有灌注的液体,包括去离子水,均为 已灭菌液体。最终获得猪空肠 SIS基质真空冷冻干燥后,γ射线辐射灭菌,保存。
[0045] 实施例2
[0046] 灌注法脱细胞基质生物材料的检测:
[0047]脱细胞彻底性测定:组织学染色未见细胞核结构,DAPI染色阴性,使用Picogreen 法测定猪空肠 SIS基质干重中残留DNA的含量低于500ng/mg。残留DNA链的长度小于300bp。
[0048] 生物安全性测定:内毒素含量0.25EU/g,生物负载、真菌、病毒检测均为0,未检测 至IjSDS残留,IgA含量0 · lyg/g,脂质含量0 · 5%。
[0049] 使用灌注-压差法,制备猪SIS来源的脱细胞基质,获得的产品生物活性均符合如 下标准:
[0051 ] 实施例3
[0052]灌注-压差法与机械法和搅拌法脱细胞基质生物材料的比较
[0053]灌注-压差法、机械法和振荡法使用的试剂均仅为O. I %PAA/4%ET0H溶液。
[0054] 灌注-压差法:取30cm猪小肠粘膜下层,接入灌注反应器中,以0.1%PAA/4%ET0H 溶液与腔内外灌注2小时,腔内外压力差为40KPa,非循环灌注,灌注速度为每15分钟整个系 统更新一次。
[0055] 机械法:取30cm猪小肠粘膜下层,浸没于适量0.1%PAA/4%ET0H溶液,以170kHz的 超声振荡,每超声15分钟间歇15分钟,并更换溶液,共持续2小时。
[0056] 搅拌法:取30cm猪小肠粘膜下层,浸没于适量0.1 %PAA/4%ET0H溶液,以IOOrpm/ min的转速搅拌2小时,期间每30分钟更换一次液体。
[0057]测定三种方法获得的脱细胞基质中残留DNA含量(脱细胞彻底性KPicogreen法), 生长因子残留(ELISA法),力学性能。
[0058]比较结果:由图3和图4可知,灌注法在细胞脱除较为彻底的基础上,保留大量生长 因子,且力学特性较优。
【主权项】
1. 一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,包括: (1) 将原材料分离出粘膜下层或全层后接入灌注反应器,灌注消毒液同时超声振荡进 行预灭菌; (2) 依次向分离出的空腔内灌注细胞内容物清洗液和抗原封闭/清除液,利用渗透压差 和/或液体压差洗去细胞内容物、清除抗原;最终消毒灭菌、保存,即得脱细胞基质生物材 料。2. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(1)中的原材料为哺乳动物的空腔脏器。3. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(1)中的消毒液为醇与过氧化物、氧化性消毒剂或非氧化性消毒剂中的一 种或几种;预灭菌的时间为1~5小时。4. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(2)中的细胞内容物清洗液为含盐缓冲液、碱性溶液、DNA增溶性缓冲盐溶 液中的一种或几种;洗去细胞内容物的时间为〇. 1 -16小时。5. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(2)中的抗原封闭/清除液为离子型表面活性剂溶液、非离子型表面活性 剂溶液、酶类溶液中的一种或多种;清除抗原的时间为0.1-16小时。6. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(2)中的洗去细胞内容物、清除抗原之前还包括灌注脱脂溶剂进行脱脂处 理。7. 根据权利要求6所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述脱脂溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、氯仿中的一种或几种。8. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(2)中的消毒灭菌的方法为全反应器系统预灭菌、全程灭菌液体灌注、灌 注消毒液、环氧乙烷灭菌、超临界C0 2灭菌、等离子体处理、γ射线辐射灭菌中的一种或多 种。9. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其特 征在于:所述步骤(2)中的保存为冷冻干燥保存或保存液保存。10. 根据权利要求1所述的一种采用灌注-压差法制备脱细胞基质生物材料的方法,其 特征在于:所述预灭菌、洗去细胞内容物、清除抗原、消毒灭菌后均进行灌注清洗,清洗方法 为反复交替灌注去离子水、磷酸缓冲盐或生理盐水,辅助超声振荡。
【文档编号】A61L27/36GK106075583SQ201610531693
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】张剑
【申请人】中国人民解放军第二军医大学, 上海卓阮医疗科技有限公司
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