一种可细胞原位包覆的多孔冻凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一类新型可细胞原位包覆的多孔冻凝胶的制备方法：双键功能化的高分子溶解到甘油或者二甲基亚砜和血清的磷酸缓冲溶液中，将细胞均匀分散到此溶液中，缓慢冷冻，然后交联形成细胞原位包覆的多孔冻凝胶。本发明还公开了上述制备方法所制得的多孔冻凝胶。所制备的多孔冻凝胶，具有良好的生物相容性、高弹性和贯通孔结构，可以作为细胞载体和组织工程/修复支架材料等，在生物医学材料领域有广泛的用途。
【专利说明】
一种可细胞原位包覆的多孔冻凝胶及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一类新型多孔冻凝胶细胞载体的制备，属于生物医学材料领域。
【背景技术】
[0002]近几十年中，多孔高分子材料在疾病的诊断及治疗、再生医学以及组织器官的修复或替换等领域表现出广泛的应用前景，其研究也越来越来受到人们的重视。聚合物冻凝胶由于具有良好的生物相容性、渗透性、贯通孔结构以及高弹性等特性，在细胞载体、医用敷料、组织工程支架等生物医用领域得到了广泛的应用。
[0003]目前冻凝胶制备过程中通常采用纯水或者磷酸缓冲溶液作为溶剂，冷冻过程不利于细胞的存活。现在报道的冻凝胶支架需要预先制备，然后再进行细胞的种植，但是这种细胞负载方式会造成冻凝胶内部细胞分布不均匀，进而导致组织再生不均匀，影响再生组织的形状及功能。
[0004]细胞冻存是细胞保存的主要方法，可以实现细胞的长期存活。细胞冻存液中含有的甘油或二甲基亚砜能够提高细胞膜对水的通透性，缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。将细胞冻存液用作大分子单体的溶剂，不仅可以降低冻凝胶制备中的冷冻过程对细胞的损伤，也可以实现细胞在冻凝胶中的均匀分布。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题在于提供一种可以完成细胞均匀包覆、同时具有良好的吸水性和高弹性以及贯通孔结构的生物相容性冻凝胶及其制备方法。
[0006]本发明多孔冻凝胶的制备方法的技术方案是:双键功能化的高分子(例如:聚乙二醇，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素，明胶等)溶液在冷冻状态下交联，形成具有多孔结构的冻凝胶，具体为:
(1)双键功能化的高分子(聚乙烯醇或者透明质酸或者壳聚糖或者明胶)的合成:高分子溶解在磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入N，N-二甲基甲酰胺，搅拌均匀，然后加入催化剂(三乙胺或者二甲氨基吡啶)，搅拌均匀后加入一定量的甲基丙烯酸缩水甘油酯，聚合物和三乙胺(或者二甲氨基吡啶)的摩尔比为1:5?100，三乙胺(或者二甲氨基吡啶)与甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1:1。3 7 ° C搅拌I?15天，透析，冻干，得到双键功能化的高分子；
(2)双键功能化的聚乙二醇(PE⑶A)合成:将聚乙二醇溶解在甲苯中，120?160摄氏度回流半小时以上，共沸除水，冷却到室温，然后加入催化剂碳酸钾或碳酸钠或三乙胺，再加入丙烯酰氯，聚乙二醇和丙烯酰氯的摩尔比为1:2?12，20?60摄氏度下反应5?24小时，抽滤，在过量乙醚中重沉淀，得到PEGDA ；
(3)细胞原位包覆的多孔冻凝胶的制备:将细胞均匀分散到上述功能化高分子的细胞冻存液溶液中，然后与氧化还原聚合引发剂混合均匀，缓慢低温冷冻，冷冻反应6?24小时；或者和光聚合引发剂，缓慢低温冷冻，紫外光照5分钟，得到多孔冻凝胶。
[0007]所述的氧化还原聚合引发剂为过硫酸胺/四甲基二乙胺。
[0008]所述的光引发剂为2-轻基-4’-(2-轻乙氧基)-2_甲基苯丙酮。
[0009]所述的细胞冻存液为甘油或二甲基亚砜和血清的磷酸缓冲溶液，其中甘油或二甲基亚砜的体积浓度为5%?15%，血清的体积浓度为10%?80%。
[0010]本发明还公开了上述合成方法所制得的多孔冻凝胶。
[0011]本发明同时还公开了上述合成方法所制得的多孔冻凝胶可以作为细胞载体和组织工程支架材料。
[0012]透明质酸和硫酸软骨素是在体内很多组织存在的一种生物材料，在体内可生物降解;壳聚糖和明胶也是具有良好生物相容性的天然高分子材料。聚乙二醇(PEG)是Π)Α批准的可用于体内的具有生物惰性的生物材料，它在体内不会引起凝血反应，通过肾脏排出体内。细胞冻存是可以实现细胞长期存活保存方法。采用以上材料结合细胞冻存过程制备新型多孔冻凝胶，不仅具有具有良好的生物相容性，还实现了细胞在多孔冻凝胶支架中的均匀分布，它的贯通孔结构有利于细胞的生长、增殖、分化以及细胞外基质的沉积，其可以作为细胞载体和组织工程/修复支架材料等，具有有益的技术效果和广泛应用前景。
[0013]
【附图说明】
[0014]图1为实施例1所得的双键功能化的透明质酸的核磁共振氢谱；图2为实施例2所得的双键功能化的聚乙二醇的核磁共振氢谱；图3为实施例1所得的多孔冻凝胶中的MSC的活-死细胞双重染色；图4为实施例5所得的多孔冻凝胶中的MSC的活-死细胞双重染色。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例对本发明做进一步说明。
[0016]实施例1:0.5 g透明质酸钠(HA)完全溶解到100 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌5天，透析，冻干，得到双键功能化透明质酸(HAGMA)j_1.0 mL二甲基亚砜和4.0 mL胎牛血清溶解到5.0 mL磷酸缓冲溶液中制得细胞冻存液。将0.04 g的HAGMA溶解在1.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和20%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将小鼠骨髓间充值干细胞(MSC)均匀分散到混合溶液中，将MSC悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。体外培养24小时后对其进行活-死细胞双重染色。
[0017]实施例2:2.0 g数均分子量为6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到装有50毫升甲苯的100毫升圆底烧瓶中，135摄氏度下回流2小时，共沸蒸馏除去微量的水分。待甲苯溶液冷却到室温后，加入0.13克干燥的碳酸钠，再将溶解在10毫升四氢呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入烧瓶中，冰浴反应30分钟后，于45摄氏度反应过夜，抽滤、浓缩并重沉淀于过量乙醚中，进一步抽滤、干燥，再溶解到20 mL纯水中，透析，冻干，得到PEGDA。将0.1 g的PEGDA溶解在1.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和30%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入过硫酸胺/四甲基二乙胺，然后将小鼠骨髓间充值干细胞(MSC)均匀分散到混合溶液中，再将MSC悬液加入模具中，缓慢低温冷冻，反应过夜，然后将反应体系放置到37 °(:的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
[0018]实施例3:0.5 g硫酸软骨素钠(CS)溶解在50 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌5天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的硫酸软骨素钠(CSGMA)；将0.08 g的CSGMA溶解在1.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和20%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
[0019]实施例4:0.5克壳聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌3天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的壳聚糖(Chitosa-GMA);将0.1 g的Chitosa-GMA溶解在
1.0mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和40%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入过硫酸胺/四甲基二乙胺，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，再将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻，反应24小时，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
[0020]实施例5:0.5 g透明质酸钠(HA)溶解在100 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后依次加入2.52 g三乙胺和3.54 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌5天。浓缩，透析，冻干，得到HAGMA; 6 g明胶(GeIatin)溶解在150 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和20 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，40 °C搅拌5天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的明胶(Gelatin-GMA);将0.03 g的HAGMA和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在1.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和20%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。体外培养24小时后对其进行活-死细胞双重染色。
[0021]实施例6:0.5克壳聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌3天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的壳聚糖(Chitosa-GMA);将0.1 g的Chitosa-GMA溶解在
1.0mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和30%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
[0022]实施例7:2.0 g数均分子量为6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到装有50毫升甲苯的100毫升圆底烧瓶中，135摄氏度下回流2小时，共沸蒸馏除去微量的水分。待甲苯溶液冷却到室温后，加入0.13克干燥的碳酸钠，再将溶解在10毫升四氢呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入烧瓶中，冰浴反应30分钟后，于45摄氏度反应过夜，抽滤、浓缩并重沉淀于过量乙醚中，进一步抽滤、干燥，再溶解到20 mL纯水中，透析，冻干，得到PEGDA。将0.1 g的PEGDA溶解在1.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和50%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
[0023]实施例8:1.0 g数均分子量为6000 g/mol的聚乙二醇(PEG)溶解到装有50毫升甲苯的100毫升圆底烧瓶中，135摄氏度下回流2小时，共沸蒸馏除去微量的水分。待甲苯溶液冷却到室温后，加入0.13克干燥的碳酸钠，再将溶解在10毫升四氢呋喃中的0.1 mL的丙烯酰氯慢慢滴入烧瓶中，冰浴反应30分钟后，于45摄氏度反应过夜，抽滤、浓缩并重沉淀于过量乙醚中，进一步抽滤、干燥，再溶解到10 mL纯水中，透析，冻干，得到PEGDA;5 g明胶(Gelatin)溶解在150 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和15 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，40 °C搅拌5天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的明胶(Gelatin-GMA);将0.1 g的PEGDA和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在1.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和20%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
[0024]实施例9:0.5克壳聚糖(Chitosa)溶解在50 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入20 mL的N，N-二甲基甲酰胺，然后加入3.54 g甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌3天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的壳聚糖(Chitosa-GMA) ;5 g明胶(Gelatin)溶解在150 mL磷酸缓冲溶液(PBS，pH 7.4)中，加入50 mL的N，N_二甲基甲酰胺，然后依次加入10 g三乙胺和15 g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)，40 °C搅拌5天。浓缩，透析，冻干，得到双键功能化的明胶(Gelatin-GMA);将0.1 8的01^083-6嫩和0.01 g的Gelatin-GMA共同溶解在I.0 mL细胞冻存液(含10%二甲基亚砜和20%血清的磷酸缓冲溶液)中，并加入光引发剂，然后将MSC均匀分散到混合溶液中，将细胞悬液加入模具中，缓慢低温冷冻4小时，紫外光照5分钟，然后将反应体系放置到37 °C的培养基中，得到负载细胞的多孔冻凝胶。
【主权项】
1.一种可细胞原位包覆的多孔冻凝胶的制备，其特征是:双键功能化的高分子(例如:聚乙二醇，壳聚糖，透明质酸，硫酸软骨素，明胶等)溶液在冷冻状态下交联，形成具有多孔结构的冻凝胶，具体为: 将细胞均匀分散到双键功能化高分子的细胞冻存液溶液中，然后与氧化还原聚合引发剂混合均匀，缓慢低温冷冻，冷冻反应2?24小时;或者和光聚合引发剂，缓慢低温冷冻，紫外光照5分钟，得到多孔冻凝胶。2.根据权利要求1所述的冻凝胶的制备方法，其特征在于:所述的自由基聚合引发剂为过硫酸胺/四甲基二乙胺;光聚合引发剂为2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。3.根据权利要求1所述的冻凝胶的制备方法，其特征在于:所述的细胞冻存液为甘油或者二甲基亚砜和血清的磷酸缓冲溶液，其中甘油或二甲基亚砜的体积浓度为5%?15%，血清的体积浓度为10%~40%。4.根据权利要求1所述的冻凝胶的制备方法，其特征在于:双键功能化的高分子溶液的浓度为2%?20% (g/mL)。5.权利要求1所述的制备方法制得的冻凝胶。6.权利要求5所述的冻凝胶在细胞载体以及组织工程支架材料上的应用。
【文档编号】C08J3/075GK106075599SQ201610523925
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】范长江
【申请人】青岛大学