一种用于组织损伤修复的生物补片的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及医疗器械领域，特别涉及一种用于组织损伤修复的生物补片。
【背景技术】
[0002]现实社会中交通事故、工伤事故、运动意外及临床手术等事件均会造成组织损伤，临床上多使用作为生物补片进行替代和修复人体组织的材料。生物补片是指取自同种一种对组织，经脱细胞处理去除组织中含有的各种细胞而完整保留细胞外基质的三维框架结构并能用于修复人体软组织的材料。根据组织来源可分为同种异体材料如真皮脱细胞基质、羊膜、硬脑膜等，异种异体材料如猪小肠黏膜下层、牛、马的心包、牛腹膜等。虽然这种天然生物补片已经商品化，但是制备繁琐，价格高昂。寻找价格低廉、简便易得、生物相容性好的人工合成生物补片来替代天然生物补片仍然是研究的热点。
【发明内容】
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[0003]本实用新型的目的在于提供一种生物相容性好、价格低廉、简便易得的用于组织损伤修复的生物补片。
[0004]本实用新型的技术解决方案是:
[0005]一种用于组织损伤修复的生物补片，包括生物材料基底层和细胞基质层，基质层附着在基底层上，基底层与细胞基质层的接触面上设有若干个平行的沟槽。沟槽可以为突出于基底层表面的凸形沟槽，也可以为自基底层表面向内凹陷的沟槽形状。沟槽为横向或纵向排布。
[0006]优选沟槽的尺寸为:宽为10-50 μπι，深为10-30 μπι。
[0007]上述的生物补片，所述生物材料基底层上的孔隙率为50% -90%，且孔径为10 μ m-100 μ mD
[0008]上述的人工合成生物补片，所述生物材料基底层厚度为0.l_3mm。
[0009]上述的人工合成生物补片，所述生物材料基底层由丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种制成。
[0010]上述的生物补片，所述细胞基质层是自体的或同种异体来源细胞分泌形成后脱细胞而获得，所述细胞是施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种。
[0011]上述生物补片不含有发泡剂和/或交联剂。
[0012]本实用新型还公开了上述生物补片的制备方法，
[0013](1)设计PDMS弹性印章纹路，将生物材料溶液加到印章上，成型脱模后采用冻干的方法制备获得表面具有沟槽纹路的生物材料基底层；
[0014](2)将生物材料基底层与细胞进行培养，得到贴附生长有细胞的生物材料基底层；
[0015](3)将生长有细胞的生物材料基底层进行脱细胞处理，将其进一步进行冻干，得到生物补片。
[0016]本实用新型的一个优选方案如下:
[0017]根据微沟槽的尺寸大小对细胞的形状和铺展行为影响的原则，设计可以引导神经细胞的取向分布的具有沟槽状的微图形结构。
[0018]本实用新型所使用的弹性印章为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)，其制备方法为将室温下配制好的PDMS液体和交联剂按10:1的比例混合均匀后，浇铸到事先采用掩膜曝光获得的具有横向或纵向的沟槽状微图形化分布的硅片基母模板上，然后将其放入真空干燥箱中抽真空排除气泡，并进行干燥固化，最后进行固化后剥离即得到平面PDMS弹性印章。
[0019]用乙酸溶解壳聚糖配制一定浓度(1%、2%和5% )的溶液，然后将该溶液滴加在PDMS上，置于-60°C —90°C，冷冻2-4小时，将冷冻后壳聚糖冰体置于碱性溶液中和固定，用水清洗；对定型的壳聚糖基底层进行冷冻干燥，得到具有多孔结构、表面具有沟槽状分布的多孔壳聚糖基底层。
[0020]将多孔壳聚糖基底层进行三维细胞培养得到表面贴附生长有细胞的壳聚糖基底层取出。将生长有细胞的壳聚糖基底层进行脱细胞处理，将其进一步进行冻干，得到本实用新型所述生物补片。
[0021]使用扫描电镜检测本实用新型所述生物补片孔隙的孔径为10 μπι-100 μπι。
[0022]本实用新型生物补片基底层同时具有多孔和沟槽纹路结构，不但可以调控细胞的取向性生长和分布，沟槽纹路结构所具有的力学性能可以使细胞基质层能够更好的粘附在基底层上，避免脱落。本实用新型所述产品具有稳定的结构，合适的孔径、孔隙率及通透性，能够模拟正常组织结构，能够提供组织生长的管道及细胞基质，并且可以承载利于组织修复和再生的细胞，本实用新型的产品所用材料为天然可降解性材料，与人体有着良好的生物相容性，制得的产品不含有由制备工艺带入的外源性毒、副作用的发泡剂和交联剂。本实用新型具有很好的抗拉强度且具有细胞基质层，更有利于输送细胞生长过程所需的营养物质，给细胞提供良好的生长环境。使用效果好。本实用新型方法简便易行。
【附图说明】
[0023]图1为本实用新型所述生物补片基底层表面竖向沟槽纹路示意图。
[0024]图2为本实用新型所述生物补片基底层表面横向沟槽纹路示意图。
[0025]图3为细胞在本实用新型所述生物补片表面图形化的基底层上取向性生长示意图。
[0026]图4为本实用新型所述凸形沟槽的生物补片结构示意图(1为基底层，2为沟槽，3为细胞基质层)。
[0027]图5为本实用新型所述凹形沟槽的生物补片结构示意图(1为基底层，2为沟槽，3为细胞基质层)。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例对本实用新型作进一步说明。
[0029]在本实用新型中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0030]下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本实用新型。应理解，这些实施例只是为了举例说明本实用新型，而非以任何方式限制本实用新型的范围。
[0031 ] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0032]实施例1
[0033](1)施万细胞的培养及纯化
[0034]取新生一天SD大鼠，处死后酒精消毒，取双侧坐骨神经，置于冰浴操作台去除神经外膜及黏连组织，胶原酶/胰酶混合消化完全后离心弃上清液，完全培养基重悬细胞，接种到PDL事先包被好的培养皿中培养。24小时更换成含有阿糖胞苷(10 μΜ)的完全培养基培养48小时，更换为含有HRG(50ng/ml)和Forsklin (2 μ Μ)的完全培养基继续培养，每3天换液，直到细胞融合。待细胞融合后，胰酶消化后离心得到细胞沉淀，用1ml含Thyl.1的完全培养基(1:1000)重悬细胞，冰上孵育2小时；离心弃上清，用DMEM和补体的混合物(3:1)重悬细胞，37°C孵育1小时，离心后完全培养基清洗2次，重新接种于培养皿中，隔天换液，细胞长满后即可以使用。
[0035](2)皮肤来源的成纤维细胞的培养
[0036]取新生1天的SD大鼠，处死后酒精消毒，取出背部皮肤置于预冷的解剖液中小心地剔除皮下组织(脂肪和皮下筋膜层、血管等)；PBS清洗3次后，用手术刀片切成小块(〈lmmXlmm)，以I型胶原酶(lmg/ml)完全消化后离心弃上清液，完全培养基重悬细胞，接种到培养皿培养，细胞融合90%后传代培养。成纤维细胞在原代培养过程中会有上皮细胞污染，大多数杂细胞(上皮和内皮细胞)会在几次传代后逐渐死亡。因此，本实用新型所用细胞为传3代以上细胞。
[0037](3)皮肤干细胞