专利名称：具有空间保护的表位区域的蛋白酶缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学修饰的枯草杆菌蛋白酶，该蛋白酶可用于组合物，例如，个人护理组合物，洗衣组合物，硬表面清洁组合物和精细织品清洗组合物中。
背景技术：
酶是最大一类天然生成蛋白质。其中的一类是能催化水解其它蛋白质的蛋白酶。典型地，通过将天然生成和基因工程蛋白酶掺加到清洗组合物中，尤其是洗衣用的那些清洗组合物中已使得这种水解蛋白质的能力得以开发利用。
清洗领域中，最常用的是丝氨酸蛋白酶。大多数丝氨酸蛋白酶是细菌生成的，而其中的一小部分是由其它微生物生成的，例如真菌。参见，Siezen等人“枯草杆菌蛋白酶的同源性模拟及蛋白质工程策略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，Vol.4，No.7，pp.719-737(1991)。遗憾的是，野生型蛋白酶在其天然环境中的功效往往不能被优化用于清洗组合物的非天然环境中。具体地说，蛋白酶特性，例如，热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性以及底物特异性等，在该蛋白酶天然环境之外都未必能达到最佳使用状态。
现已用几种方法改变丝氨酸蛋白酶的野生型氨基酸序列，以增强蛋白酶在非天然洗涤环境中的功效。这些方法包括蛋白酶的遗传重构和/或化学修饰以增强蛋白酶在迥然不同条件下的热稳定性和氧化稳定性。
但是，由于这类蛋白酶对于哺乳动物是外源性的，所以它们是潜在抗原。作为抗原，这些蛋白酶会引起哺乳动物的免疫原和/或变应原应答(本发明中统称为免疫原应答)。
另外，虽然在通过遗传重构和化学修饰开发用于洗衣的更高效蛋白酶的持续研究中已取得了显著的成效，但是这类蛋白酶还未在商业上用于个人护理组合物和精细织品洗涤剂中。在诸如肥皂、凝胶、浴液、香波和精细织品洗涤剂等产品中不添加蛋白酶的主要原因是由于上述的人体致敏会导致不良的免疫原应答的问题。因此，提供一种具有蛋白酶的清洁性能同时又使所激发的免疫原应答降至最小的个人护理组合物或精细织品洗涤剂将具有十分重要的意义。
目前，用下述方法可使对蛋白酶的免疫原应答减至最小将化学修饰的蛋白酶固定化、制粒、包被或溶解以避免其成为空气传播的。这些方法虽然考虑了消费者与空气传播蛋白酶的接触，但仍存在着组织与最终组合物持久接触和在生产过程中工人与含有蛋白酶的粉尘或气雾接触的危险。
也已提出通过将聚合物连接到蛋白酶上可以达到降低蛋白酶的免疫原性的目的。例如，参见，1979年12月18日颁布的授予Davis等的美国专利4179337；1999年1月5日颁布的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的美国专利5856451；1999年1月7日公开的并且由Olsen等转让给NovoNordisk的WO 99/00489；1998年7月16日公开的并且由Olsen等转让给Novo Nordisk的WO 98/30682；和1998年8月13日公开的，Von Der Osten等的WO 98/35026。然而，这些提议并没有表明为了最有效地降低免疫原性应答而将聚合物连接到所述蛋白酶的特定氨基酸区域的重要性。
最近已经发现枯草杆菌蛋白酶包含三个表位区域并且发现一种或多种聚合物，多肽，或其它基团应连接在这些区域的一个或多个上以实现该蛋白酶免疫原性的显著性降低。例如参见美国专利申请09/088912，Weisgerber等，转让给宝洁公司，1998年6月2递交。
本发明人已经发现在该蛋白酶的一个或多个表位区域附近的空间保护是防止或阻碍表位的呈递和降低该蛋白酶的免疫原性的一个可供选择的机制。因此，本发明人提供了化学修饰的枯草杆菌蛋白酶，其中所述的修饰是在与一个或多个表位区域空间靠近的区域上。因此，本发明人已发现了能激发减弱的免疫原应答但仍保持它们作为有效和活性蛋白酶的活性的枯草杆菌蛋白酶。因此，本发明所述的蛋白酶缀合物适合用于几种类型的组合物中，包括但不限于，洗衣、清洗餐具、清洁坚硬表面，护肤、护发、美容、口腔护理以及清洗接触透镜的组合物。
发明概述本发明涉及蛋白酶缀合物，该缀合物包括一个蛋白酶部分和一个或多个附加部分，其中每个附加部分都与所述蛋白酶部分的表位保护位置共价相连，其中(a)第一表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的1，2，3，4，5，6，7，12，17，36，40，41，43，44，45，67，86，87，89，206，209，210，212，213，214，215，和216；(b)第二表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，144，和145；和(c)第三表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的9，10，22，23，24，62，63，143，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272，和275；并且其中附加部分各自独立地具有下列结构 其中所述X不存在或为一连接部分；R1不存在或选自第一多肽和第一聚合物；R2不存在或选自第二多肽和第二聚合物；其中所述的X、R1和R2中至少有一个不存在。
本发明的蛋白酶缀合物相对于亲本蛋白酶而言具有降低的免疫原性。因此，这样的蛋白酶缀合物适合用于几种类型的组合物，包括但不限于洗衣组合物，清洗餐具、清洁坚硬表面、护肤、护发、美容、口腔护理和清洗接触透镜组合物。
发明详述本发明的主要组分如下所述。另外还包括对用于本发明实施方案中的各种任选及优选组分的非限制性描述。
本发明可以包括任意一种本发明所述的必需或任选组分和/或限量，或者由或基本由任意一种本发明所述的必需或任选组分和/或限量所组成。
除另有说明外，所有百分比和比率都以重量来计算。除另有说明外，所有百分比都是根据组合物总量来计算的。
所有组分或组成含量都以该组分或组成的活性物含量为参照，并且排除杂质，例如，可能存在于商业来源产品中的残留溶剂或副产物。
本发明中所提及的所有文献，包括所有专利、专利申请以及印刷出版物均在此全文引入作为参考。
本发明中使用商品名的物质包括，但不限于酶。本发明人在本发明中并不打算受到某一商品名物质的限制。某一商品名物质的等效物(例如，从不同来源得到的名称或目录(参考)号不同的物质)可以用来进行替代并用于本发明所述的蛋白酶缀合物和组合物中。
本发明使用缩写来描述氨基酸。表1中提供了本发明使用的一系列缩写表I氨基酸三字母缩写 单字母缩写丙氨酸 Ala A精氨酸 Arg R天冬酰胺Asn N天冬氨酸Asp D
半胱氨酸 Cys C谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu E甘氨酸 Gly G组氨酸 His H异亮氨酸 Ile I亮氨酸 Leu L赖氨酸 Lys K甲硫氨酸 Met M苯丙氨酸 Phe F脯氨酸 Pro P丝氨酸 Ser S苏氨酸 Thr T色氨酸 Trp W酪氨酸 Tyr Y缬氨酸 Val V定义本发明使用的术语“突变”是指基因序列和/或由该基因序列产生的氨基酸序列中的变化。突变包括野生型蛋白质序列中氨基酸残基的缺失、取代和添加。
本发明使用的术语“亲本”是指一种可用于进一步修饰以形成本发明的蛋白酶缀合物的蛋白质(野生型或变体)。
本发明使用的术语“野生型”是指由天然存在的生物体所产生的蛋白质，例如蛋白酶或其它酶。
本发明使用的术语“变体”是指其氨基酸序列不同于相应的野生型蛋白质的氨基酸序列的蛋白质。
本发明使用的所有聚合物分子量都用重均分子量来表示。
尽管本发明所述的缀合物不只限于那些含有枯草杆菌蛋白酶BPN′及其变体的缀合物，但所有氨基酸编号方式均参照由SEQ ID NO1表示的枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列。枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列的进一步描述见Wells等人，核酸研究，Vol.11，pp.7911-7925(1983)。
本发明的蛋白酶缀合物本发明的蛋白酶缀合物是包括蛋白酶部分以及一个或多个附加部分的化合物，其中所述的蛋白酶部分和附加部分通过共价连接(即，共价键)相连。蛋白酶部分本发明的蛋白酶部分是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶，野生型或其变体。本发明使用的术语“枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶”是指与枯草杆菌蛋白酶BPN′的序列具有至少50％，优选80％氨基酸序列同源性的蛋白酶。野生型枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶由，例如，嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、Bacillus amylosaccharicus，地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、以及枯草芽孢杆菌微生物产生。关于枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其同源性的讨论可参见Siezen等人，“枯草杆菌蛋白酶的同源性模拟和蛋白质工程策略，枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族”，蛋白质工程，Vol.4，No.7，pp.719-737(1991)。
本发明中使用的优选的蛋白酶部分包括，例如，从解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌中获得的蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶BPN，枯草杆菌蛋白酶BPN′，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶DY，枯草杆菌蛋白酶309，蛋白酶K以及铝热酶，包括A/S Alcalase(可从Novo Industries，Copenhagen，Denmark购得)，望菌酶(Esperase)(Novo Industries)，沙芬酶(Savinase)(Novo Industries)，Maxatase(可从Genencor International Inc.购得)，Maxacal(GenencorInternational Inc.)，Maxapem 15(Genencor International Inc.)，以及上述酶的变体。本发明中使用的特别优选的蛋白酶部分包括从解淀粉芽孢杆菌获得的蛋白酶及其变体。本发明中最优选的蛋白酶部分是枯草杆菌蛋白酶BPN′及其变体。
下文中被称为“蛋白酶A”的本发明中使用的特别优选的枯草杆菌蛋白酶BPN′变体公开于1991年7月9日颁发给Venegas的美国专利5,030,378，上述变体的特征在于在枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列中具有下列突变(a)第166位上的Gly被选自下列的氨基酸残基取代Asn、Ser、Lys、Arg、His、Gln、Ala以及Glu；第169位上的Gly被Ser取代；以及第222位上的Met被选自下列的氨基酸残基取代Gln、Phe、His、Asn、Glu、Ala和Thr；或者b)第160位上的Gly被Ala取代，以及第222位上的Met被Ala取代。
下文中称为“蛋白酶B”的，在本发明中用作亲本氨基酸序列的另一个优选的枯草杆菌蛋白酶BPN′变体公开于1988年1月7日公开的转让给Genencor国际公司的EP-B251,446中，上述变体的特征在于在野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′的氨基酸序列中在下列的一个或多个位置具有突变Tyr21，Thr22，Ser24，Asp36，Ala45，Ala48，Ser49，Met50，His67，Ser87，Lys94，Val95，Gly97，Ser101，Gly102，Gly103，Ile107，Gly110，Met124，Gly127，Gly128，Pro129，Leu 135，Lys170，Tyr171，Pro172，Asp197，Met199，Ser204，Lys2l3，Tyr214，Gly215，以及Ser221；或者在上列位置中的两处或多处与选自下列位置上的1个或多个突变相结合Asp32，Ser33，Tyr104，Ala152，Asn155，Glu156，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217以及Met222。
本发明中使用的其它优选的枯草杆菌蛋白酶BPN′变体下文中称为“蛋白酶C”，其描述见1995年4月20日公开的转让给Genencor国际公司的WO 95/10615，上述变体的特征在于野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′氨基酸序列在Asn76位置上具有一个突变，结合有选自下列位置上的1个或多个突变Asp99，Ser101，Gln103，Tyr104，Ser105，Ile107，Asn109，Asn123，Leu126，Gly127，Gly128，Leu135，Glu156，Gly166，Glul95，Asp197，Ser204，Gln206，Pro210，Ala216，Tyr217，Asn218，Met222，Ser260，Lys265以及Ala274。
用于本发明的其它优选的枯草杆菌蛋白酶BPN′变体，下文中称为“蛋白酶D”，其描述见1988年7月26日授予Estell等人的美国专利4,760,025，上述变体的特征在于在野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′氨基酸序列中具有选自下列氨基酸位置上的一个或多个突变Asp32，Ser33，His64，Tyr104，Asn155，Glul56，Gly166，Gly169，Phe189，Tyr217以及Met222。
本发明的更优选的蛋白酶部分选自枯草杆菌蛋白酶BPN′，蛋白酶A，蛋白酶B，蛋白酶C，以及蛋白酶D，其中蛋白酶D最优选。
如果不拘泥于理论，本发明的蛋白酶部分具有三个表位区域第一表位区域，第二表位区域和第三表位区域。第一表位区域出现在对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点70-84；第二表位区域出现在对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点103-126；以及第三表位区域出现在对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的位点220-246。参见，例如，1998年6月2日由Weisgerber等申请的并且转让给宝洁公司的美国专利申请09/088,912；1999年7月22日由Rubingh等申请的共同未决的美国专利申请60/144991，“在表位区域具有氨基酸取代和缺失的丝氨酸蛋白酶变体”；和1999年7月22日由Sikorski等申请的共同未决的美国专利申请60/144980，“在表位区域具有氨基酸取代的丝氨酸蛋白酶变体”。
本发明人已惊奇地发现了与至少一个上述表位区域空间上靠近的表位保护位置。还发现通过将一个或多个附加部分与蛋白酶部分的氨基酸在表位保护位置上共价相连使这些表位受到保护而免遭水解，并因而避免表位外露。
适合于用附加部分进行共价修饰的表位保护位置取决于人们期望保护的表位。更优选地，将至少一个附加部分与第一表位区域中的表位保护位置共价连接。
已经发现第一表位区域中的表位保护位置是对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的1，2，3，4，5，6，7，12，17，36，40，41，43，44，45，67，86，87，89，206，209，210，212，213，214，215和216。更优选地，第一表位区域中的表位保护位置是对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的1，2，3，4，5，17，40，41，43，67，86，87，和214。
已经进一步发现第二表位区域中的表位保护位置是对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，144和145。优选地，第二表位区域中的表位保护位置是对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的27，47，48，50，52，102，127，128，130，131，132，134，138，和141。
已经进一步发现第三表位区域中的表位保护位置选自对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的9，10，22，23，24，62，63，143，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272和275。优选地，第三表位区域中的表位保护位置是对应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的22，23，24，143，146，155，173，189，197，203，204，253，254，265，和275。
在本发明的优选实施方案中，蛋白酶部分包含亲本氨基酸序列的修饰的序列。亲本氨基酸序列可以是上述蛋白酶中的任一种，具有与上述相同的优选限制因素。在这个实施方案中，亲本氨基酸序列在一个或多个亲本氨基酸残基上被取代氨基酸所取代以生成适合与一个或多个本发明附加部分连接的蛋白酶部分。按照本发明，所述取代应该在一个或多个表位保护位置上进行。表位保护位置，及其优选的限制因素如上所述。
为了最好地实现1个或多个附加部分与所述蛋白酶部分在1个或多个表位保护位置上的选择性连接，所述取代应该用不存在于亲本氨基酸序列中的(亲本氨基酸序列所独有的)取代氨基酸来进行。在这方面，任一种亲本氨基酸序列所独有的取代氨基酸都可以使用。例如，由于半胱氨酸残基不存在于枯草杆菌蛋白酶BPN′的野生型氨基酸序列中，所以在枯草杆菌蛋白酶BPN′的1个或多个表位保护位置上用1个或多个半胱氨酸残基进行取代适合于本发明。其中半胱氨酸残基存在于亲本氨基酸序列的表位保护位置之外的位置上时，优选用另一种氨基酸残基在上述各位置进行取代，以确保在表位保护位置上与1个或多个附加部分选择性偶联。半胱氨酸是用于在1个或多个表位保护位置上取代的最优选的取代氨基酸。
其它优选的取代氨基酸包括赖氨酸。其中所述取代氨基酸是赖氨酸时，优选将存在于亲本氨基酸序列表位保护位置之外的位置上的赖氨酸残基突变成另一种氨基酸残基，以便使该表位保护位置上的1个或多个赖氨酸残基的功能化具有选择性。例如，赖氨酸残基存在于枯草杆菌蛋白酶BPN′的第170位上，该位置是如本发明所定义的表位保护位置。出现于枯草杆菌蛋白酶BPN′序列中的所有其它赖氨酸残基的位点选择性突变都可以进行，接着用附加部分选择性功能化第170位上的赖氨酸残基。另外，可以使所述表位保护位置的任一位置上的氨基酸残基突变为赖氨酸(例如)，随后用附加部分在那些位置上选择性功能化。附加部分本发明所述的蛋白酶缀合物包括1个或多个附加部分，其中每个所述附加部分都在如上所述的表位保护位置上与1个氨基酸残基共价连接。所述的附加部分可以是任何化学结构。优选地，该附加部分在空间上阻碍与之连接的表位保护位置，或如本发明所定义的任何其它的表位保护位置。附加部分的非限制性实例包括，但不限于，分子量低于大约1600，优选低于大约800，更优选低于大约400，并且最优选低于大约300的分子；多肽；和聚合物。本发明中所用的术语“多肽”是指包含两个或多个氨基酸残基的分子。本发明中所用的术语“聚合物”是指任何包含两个或多个相同(优选5个或多个相同)单体单元的分子。
优选地，所述附加部分具有如下的结构 其中所述的X不存在或为一个连接部分；R1不存在或选自第一多肽和第一聚合物；R2不存在或选自第二多肽和第二聚合物；其中X、R1和R2中至少一个不存在。
优选地，所述蛋白酶缀合物中包括1～约15个，更优选约2～约10个，最优选约1～约5个附加部分。
其中所述的R1和R2各自独立为多肽部分或聚合物部分时，R1和R2可以相同或不同。优选地，其中所述R1是多肽部分时，R2不存在或为多肽部分，并且最优选不存在。最优选地，其中R1是多肽部分时，R2不存在或为相同的多肽部分，并且最优选不存在。优选地，其中所述的R1是聚合物部分时，R2不存在或为聚合物部分。最优选地，其中所述R1是聚合物部分时，R2不存在或为相同的聚合物部分。其中R1和R2中至少一个分别是所述第一聚合物及第二聚合物时，X优选不存在。多肽部分本发明所述多肽部分包括含有2个或多个氨基酸残基的多肽部分。优选的多肽部分选自包括酶在内的蛋白质。优选的酶包括蛋白酶，纤维素酶，脂肪酶，淀粉酶，过氧化物酶，微过氧化物酶，半纤维素酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶(包括，例如，NADH还原酶)，氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖多硫酸酯酶、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、硫酸软骨素酶、漆酶、转移酶、异构酶(包括，例如，葡萄糖异构酶和木糖异构酶)、裂合酶、连接酶、合成酶以及果类来源的酶(包括，例如，木瓜蛋白酶)。更优选用作多肽部分的酶包括蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶和果类来源的酶，其中蛋白酶更为优选。
用作多肽部分的脂肪酶的实例包括来自下列微生物的脂肪酶腐殖霉属、假单胞菌属、镰孢属、毛霉属、色杆菌属、曲霉属、念珠菌属、地丝菌属、青霉属、根霉属和芽孢杆菌属。
商品化脂肪酶的实例包括Lipolase、Lipolase Ultra，Lipozyme，Palatase，Novozym435，和Lecitase(所有这些都可以从Novo NordiskA/S，Copenhagen，Denmark购得)，Lumafast(可购自Genencor，Int.，Rochester，NY)，以及Lipomax(Genencor，Int.)。
用作多肽部分的蛋白酶实例包括丝氨酸蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶型酶。最优选用作多肽部分的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，正如本发明上文在“蛋白酶部分”的讨论中所定义的那样。
最优选地，其中所述的多肽部分是丝氨酸蛋白酶时，所述的多肽部分独立地包含本发明上述的蛋白酶部分的定义。优选地，如上所述，所述多肽部分的氨基酸序列是对亲本氨基酸序列修饰后的序列，其中的修饰在1个或多个如上所述的表位保护位置上(该亲本氨基酸序列可以称为“第二”亲本氨基酸序列)。在这种情况下，所述的连接部分(其中所述的蛋白酶部分不存在)或蛋白酶部分(其中所述的连接部分不存在)之一通过存在于多肽部分的1个表位保护位置上的1个取代氨基酸共价连接到多肽部分上。其中所述的多肽部分是丝氨酸蛋白酶时，同等优选的，更优选的，以及最优选的表位保护位置组别如上所述适用于蛋白酶部分以及它们的对应的亲本氨基酸序列。
最优选地，其中所述的多肽部分是丝氨酸蛋白酶时，所述的多肽部分和所述的蛋白酶部分是等同部分。在这种情况下，所述的多肽部分和所述的蛋白酶部分优选地通过二硫桥相连，其中X不存在，并且最优选地，R2不存在。聚合物部分本发明所述附加部分可以包括聚合物部分。本发明中所用的术语“聚合物部分”，是指任何包含两个或多个相同(优选5个或多个相同)单体单元的分子。合适的聚合物部分的实例包括聚亚烷基氧化物、聚醇、聚乙烯基醇、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、纤维素、葡聚糖、淀粉、糖原、琼脂糖、瓜尔胶、支链淀粉、菊粉、黄原胶、角叉菜胶、果胶、生物聚合物、藻酸水解产物和脱乙酰壳多糖的水解产物。优选的聚亚烷基氧化物包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇和聚丙二醇。优选的葡聚糖包括羧甲基葡聚糖。优选的纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素。优选的淀粉包括羟乙基淀粉和羟丙基淀粉。更优选的聚合物是聚亚烷基氧化物。最优选的聚合物部分是聚乙二醇。
其中R1和R2各自独立为聚合物部分时，优选地，R1和R2的集合分子量(即，R1的分子量加上R2的分子量)为约0.2kD(千道尔顿)～约40kD，更优选为约0.5kD～约40kD，更优选为约0.5kD～约20kD，并且最优选为约1kD～约10kD。
其中R1和R2各自为聚合物部分时，优选地，R1和R2各自独立地具有0.1kD～约20kD的分子量，更优选地分子量为0.25kD～约20kD，更优选为约0.5kD～约10kD，并且最优选为约0.5kD～5kD。
其中R1和R2各自为聚合物部分时，优选地，R1和R2分子量之比为约1∶10～约10∶1，更优选为约1∶5～约5∶1，并且最优选为约1∶3～约3∶1。
其中R1为聚合物部分并且R2不存在时，优选地，R1的分子量为约0.1kD～约40kD，更优选地为约0.5kD～约40kD，更优选为约0.5kD～约20kD，并且最优选为约1kD～约10kD。连接部分本发明使用的X可以不存在或是一连接部分，该连接部分与一个或多个多肽部分或一个或多个聚合物部分或两者共价连接，并且同时还与蛋白酶部分的一个表位保护位置上的氨基酸残基共价连接。所述连接部分一般可以是任一种小分子，即，分子量小于约1600，优选小于约800，更优选小于约400，更优选小于约300的分子。最优选的连接部分包括那些可与半胱氨酸残基或赖氨酸残基共价结合的连接部分，最优选半胱氨酸残基。
连接部分的实例及相关化学公开于1995年8月29日颁布的授予Harris的美国专利5,446,090；1992年12月15日颁布的授予Merrill的美国专利55,171,264；1992年11月10日颁布的授予Rhee等人的美国专利5,162,430；1992年10月6日颁布的授予Shadle等人的美国专利5,153,265；1992年6月16日颁布的授予Zalipsky的美国专利5,122,614；Goodson等人，“重组白介素-2在其糖基化位点上的定点聚乙二醇化”，生物技术，Vol.8，No.4，pp.343-346(1990)；Kogan，“适用于选择性蛋白质修饰的取代后的甲氧基-聚(乙二醇)衍生物的合成”，合成通讯，Vol.22，pp.2417-2424(1992)；以及Ishii等人，“琥珀酰亚胺环状态对芘马来酰亚胺标记的αα-原肌球蛋白的荧光及结构特性的影响”，生物物理学杂志，Vol.50，pp.75-80(1986)。最优选的连接部分是取代的(例如，烷基)或未取代的琥珀酰亚胺。
作为另外的实例，下列非限制性试剂可以被用来形成所述的连接部分N-[α-马来酰亚胺基乙酸基]琥珀酰亚胺酯；N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酸基琥珀酰亚胺；双马来酰亚胺基己烷；N-[β-马来酰亚胺基丙酸基]琥珀酰亚胺酯；双[2-(琥珀酰亚胺基氧羰氧基)-乙基]砜；双[磺基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯；1，5-二氟-2，4-二硝基苯；二甲基己二酰亚氨酸酯·2HCl；二甲基庚二酰亚氨酸酯·2HCl；二甲基辛二酰亚氨酸酯·2HCl；戊二酸二琥珀酰亚胺酯；辛二酸二琥珀酰亚胺酯；间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟琥珀酰亚胺酯；N-羟琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸；N-琥珀酰亚胺基-6-[4’-叠氮基-2’硝基苯氨基]酸酯；2，3-二溴丙酸N-羟琥珀酰亚胺酯；4-[马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；4-(对-马来酰亚胺基甲苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯；琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰氨基)己酸酯]；双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧羰氧基)-乙基]砜；N-[γ-马来酰亚胺基丁酸基)]磺基琥珀酰亚胺酯；N-羟磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯；N-[κ-马来酰亚胺基十一烷酸基]磺基琥珀酰亚胺酯；间-马来酰亚胺基苯甲酸基-N-羟磺基琥珀酰亚胺酯；磺基琥珀酰亚胺基[4-叠氮水杨酸基氨基]己酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-7-叠氮-4-甲基香豆素-3-乙酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-6-[4’-叠氮-2’-硝基苯基氨基]己酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-4-[对叠氮苯基]丁酸酯；磺基琥珀酰亚胺基[4-磺乙酰基]氨基苯甲酸酯；磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯；和磺基琥珀酰亚胺基-4-[对-马来酰亚胺基苯基]-丁酸酯。这些试剂的每一种都从Pierce化学公司，Rockford，IL购得。
任选部分本发明的蛋白酶缀合物可以另外包含一个或多个其它的化学结构，包括(例如)与未在本发明中举例说明的蛋白酶的其它残基或者甚至于在不带有附加部分的表位保护位置上连接的一个或多个小分子，多肽和/或聚合物(在本文中被称为“补充部分”)。补充部分可以包括如上所述的多肽部分，聚合物部分，和连接部分。此外，例如，分子量为约100Da～约5000Da，优选地为约100Da～约2000Da，更优选地为约100Da～约1000Da，更优选地为约100Da～约750Da，并且最优选地为约300Da的一种或多种聚合物(最优选的是聚乙二醇)可以共价连接到本发明蛋白酶部分的除本发明所列举的残基之外的残基上。使用本发明所述的和本领域熟知的技术(包括通过如本发明所述的连接部分)，在该蛋白酶部分的任何位置上，可以将这样的聚合物部分直接连接到本发明的蛋白酶部分上。这种任选类型的聚合物缀合物的非限制性实例在1999年1月7日公开的WO 99/00849(Olsen等，Novo NordiskA/S)中有所叙述。
制备方法所述的在一个或多个表位保护位置(或蛋白酶部分的任何其它位置)上具有取代的蛋白酶部分通过对编码亲本氨基酸序列的核苷酸序列进行突变制备而成。这类方法为本领域所熟知；一种这样的方法的非限制性实例如下所述将含有野生型枯草杆菌蛋白酶BPN′基因(Mitchison，C.和J.A.Wells，“枯草杆菌蛋白酶BPN′中二硫键的蛋白质工程”，生物化学，Vol.28，pp.4807-4815(1989))的噬菌粒(pSS-5)转化入大肠杆菌dut-ung-菌株CJ236，以及对Yuckenberg等人，“使用含尿嘧啶的DNA和噬菌粒载体的体外定点诱变”，定点诱变-一种实用的方法，McPherson，M.J.编著，pp.27-48(1991)一文中描述的方法改进后，用VCSM13辅助噬菌体(Kunkel等人，“不需表型选择的快速、有效的定点诱变”，酶学方法，Vol 154，pp.367-382(1987))制备含尿嘧啶的单链DNA模板。从Zoller，M.J.和M.Smith，“用M13衍生的载体进行寡核苷酸定点诱变一种用于在任一DNA片段中产生点突变的有效的通用方法”，核酸研究，Vol.10，pp.6487-6500(1982)一文中公开的方法改进而来的引物定点诱变来制备所有的突变体(基本上如Yuckenberg等人，上述)。
用380B DNA合成仪(Applied Biosystems Inc.)制备寡核苷酸。将诱变反应产物转化入大肠杆菌MM294菌株(美国典型培养物保藏中心大肠杆菌33625)。所有突变都经DNA测序证实，并将分离的DNA转化入枯草杆菌表达菌株PG632(Saunders等人，“从枯草杆菌中分泌人甲状旁腺激素34-氨基酸片段的信号序列切割位点的优化”，基因，Vol.102，pp.277-282(1991)以及Yang等人，“枯草杆菌中性蛋白酶基因的克隆以及该克隆基因在建立体外衍生的缺失突变中的应用”，细菌学杂志，Vol.160，pp.15-21(1984)。
按下述方法进行发酵。用一升含有10g/L葡萄糖的LB肉汤将含有目的蛋白酶的枯草杆菌细胞(PG632)培养至对数中期，并接种到总体积为9升的Biostat C发酵罐(Braun Biotech，Inc.，Allentown，PA)中。发酵培养基中含有酵母提取物、酪蛋白水解产物、水溶性部分水解的淀粉(Maltrin M-250)、消泡剂、缓冲液、以及微量矿物质(参见“芽孢杆菌生物学工业应用”，Doi，R.H.和M.McGloughlin，编著(1992))。发酵过程中肉汤的pH恒定保持在7.5。加入卡那霉素(500μg/mL)对诱变质粒进行抗生素选择。细胞在37℃下培养18小时直至A600约为60，收获产物。
通过下述步骤处理发酵肉汤得到纯的蛋白酶。用0.16μm滤膜通过切向流滤除肉汤中的枯草杆菌细胞。然后，用8,000分子量切断滤膜超滤浓缩无细胞肉汤。用浓缩后的MES缓冲液(2-(N-吗啉代)乙磺酸)将pH值调至5.5。用S-琼脂糖凝胶通过阳离子交换层析进一步纯化该蛋白酶，并用NaCl梯度洗脱。参见Scopes，R.K.“蛋白纯化原理及操作”，Springer-Verlag，New York(1984)用pNA测定法(DelMar等人，分析化学，Vol.99，pp.316-320(1979))测定梯度洗脱期间收集的级分中的活性蛋白酶浓度。本测定法可以测量出该蛋白酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)时释放出对硝基苯胺的速率。用分光光度计在410nm处测量由水解反应产生黄色的速率，该速率与活性蛋白酶部分的浓度成比例。此外，用280nm处的吸光度测量值确定总蛋白浓度。活性蛋白酶/总蛋白之比给出蛋白酶纯度，并可用来鉴定收集到的原液中的级分。
为了避免存储过程中蛋白酶的自身溶解，向从层析柱中得到的混合级分中加入等重量的丙二醇。当纯化过程完成后，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测蛋白酶原液的纯度，用II型胰蛋白酶抑制剂-T火鸡卵清(Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)通过活性位点滴定方法测定绝对酶浓度。
在为了使用的制备中，通过Sephadex-G25(Pharmacia，Piscataway，NeW Jersey)大小排阻柱洗脱蛋白酶原液以除去丙二醇，并更换缓冲液。将酶原液中的MES缓冲液更换成0.01M KH2PO4溶液，pH 5.5。
可以用制得的蛋白酶与一个或多个附加部分功能化生成蛋白酶缀合物。优选活化附加部分前体以增强其与蛋白酶部分前体的反应性(附加部分前体与蛋白酶部分前体反应生成由所述附加部分及所述蛋白酶部分所组成的蛋白酶缀合物)。这类活化方法为本领域所熟知。下面给出蛋白酶缀合物制备方法的非限制性实施例。
实施例1 根据上述方案，用下述方法将在1个表位保护位置上含有半胱氨酸残基的蛋白酶与一聚合物部分偶联(其中“P”表示减去由半胱氨酸取代生成的巯基的蛋白酶部分，n为聚乙二醇单体重复单元的数目(例如，n＝77))。
用亮氨酸取代第217位上的酪氨酸以及用半胱氨酸取代第161位上的丝氨酸制备得到枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。该变体在磷酸盐缓冲液(pH5.5)中的浓度达到约2mg/mL。然后，用稀的氢氧化钠溶液将pH升至7.5。以25∶1的活化聚合物与变体之比，将上述变体与一甲基聚乙二醇马来酰亚胺混合。在环境温度下混合1小时后，用稀磷酸将混合物的pH调至5.5，并用分子量切断超滤器过滤除去过量的聚合物。浓缩物中含有纯化的蛋白酶缀合物。
实施例2 根据上述方案，用下述方法将在1个表位保护位置上含有半胱氨酸残基的蛋白酶部分与一聚合物部分偶联(其中“P”表示减去由半胱氨酸取代生成的巯基的蛋白酶部分，n为聚乙二醇单体重复单元的充分数目(例如n＝77))。
用亮氨酸取代第217位上的酪氨酸以及用半胱氨酸取代第261位上的苯丙氨酸制备得到枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。该变体在磷酸盐缓冲液(pH 5.5)中的浓度达到约2mg/mL。然后，用稀的氢氧化钠溶液将pH升至7.5。以25∶1的活化聚合物与变体之比，将上述变体与二甲基聚乙二醇马来酰亚胺混合。在环境温度下混合1小时后，用稀磷酸将混合物的pH调至5.5，并用分子量切断超滤器过滤除去过量的聚合物。浓缩物中含有纯化的蛋白酶缀合物。
实施例3将琥珀酰亚胺保护的聚合物选择性地偶联到1个或多个表位保护位置上的赖氨酸上(其中“MPEG”和“PEGM”为同等物，代表一甲基聚乙二醇，其中“P”代表减去图示的赖氨酸胺基的蛋白酶部分) 实施例4将碳化二亚胺保护的聚合物选择性地偶联到1个或多个表位保护位置上的赖氨酸上(其中“MPEG”和“PEGM”为同等物，代表一甲基聚乙二醇，“P”代表减去图示的赖氨酸胺基的蛋白酶部分，X和X′为含有碳化二亚胺部分的侧链，例如烷基) 实施例5 用下述方法将在1个表位保护位置上含有半胱氨酸残基的蛋白酶部分与烷基马来酰亚胺偶联(其中“P”表示减去由半胱氨酸取代生成的巯基的蛋白酶部分，“R”为烷基)。该实施例中，R1和R2各自不存在，连接部分由烷基马来酰亚胺衍生而来。
用亮氨酸取代第217位上的酪氨酸以及用半胱氨酸取代第163位上的丝氨酸制备得到枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。用0.01M KH2PO4缓冲液(pH 7)制备20mL浓度约为1mg/mL的上述变体的溶液。向该溶液中加入1.5当量的烷基马来酰亚胺。在环境温度下轻微混合该溶液1小时。用标准方法从上述溶液中获得生成的蛋白酶缀合物。
实施例6 用下述方法在1个表位保护位置上含有半胱氨酸残基的蛋白酶部分形成二聚体(其中“P”表示减去半胱氨酸取代生成的巯基的蛋白酶部分)。该实施例中，所述的蛋白酶部分和多肽部分是等同的(并且X不存在)。
用亮氨酸取代第217位上的酪氨酸以及用半胱氨酸取代第163位上的丝氨酸制备得到枯草杆菌蛋白酶BPN′的变体。用0.01M KH2PO4缓冲液(pH8.6)制备20mL浓度约为1mg/mL的上述变体的溶液。在环境温度下，向溶液中轻轻地吹入氧约1小时，生成期望的蛋白酶缀合物二聚体。用标准方法从上述溶液中获得生成的蛋白酶缀合物。
分析方法可以用下列方法测试本发明所述蛋白酶缀合物的酶促活性和免疫原应答，这两种方法都是本领域技术人员已知的。其它本领域熟知的方法也可以替代使用。
蛋白酶缀合物活性可以用本领域熟知的方法来测定本发明所述蛋白酶缀合物的蛋白酶活性。两种这样的方法描述如下皮肤碎屑活性方法用Scotch#3750G带，反复地从受试者腿部剥取人体皮肤碎屑直到带子上基本铺满碎屑。然后，将带子切割成1平方英寸的正方形，放在一边。在10mm×35mm陪替氏培养皿中，将2mL 0.75mg/mL的对照酶(例如，枯草杆菌蛋白酶BPN′)或待测蛋白酶缀合物加入到0.01MKH2PO4pH 5.5缓冲液中。向该溶液中加入1mL 2.5％月桂酸钠pH 8.6溶液。将溶液置于平台振荡器上轻轻混合。将上述制得的正方形带在不断轻轻混合下浸泡于溶液中(碎屑面向上)10分钟。然后，用自来水轻轻漂洗正方形带15秒。将Stevenel蓝染液(3mL，购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)吸移到一干净的陪替氏培养皿中。在轻轻混合下将漂洗过的正方形带置于染液中(碎屑面向上)3分钟。从染液中取出正方形带，在两个盛有300mL蒸馏水的烧杯中连续漂洗，每次15秒。空气干燥该正方形带。视觉或用比色计比较从对照酶获得的正方形带与从蛋白酶缀合物获得的正方形带之间颜色强度的差异。与对照酶正方形带相比，蛋白酶缀合物正方形带的颜色强度较弱，这说明蛋白酶缀合物的活性较高。着色胶原活性方法将50m含有0.01M CaCl2的0.1M tris缓冲液(三-羟甲基-氨基甲烷)(pH 8.6)和0.5g azocoll(偶氮颜料浸渍的胶原，购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)混合。25℃下温育该混合物，同时在平板振荡器上轻轻混合。用0.2微米注射滤器过滤2mL该混合物，读取该混合物在520nm处的吸光度把分光光度计的调节器调整归零。向剩余的48mltris/azocoll混合物中加入1ppm对照酶(例如，枯草杆菌蛋白酶BPN′)或待测蛋白酶缀合物。在总共10分钟的时间内，每隔2分钟用0.2微米注射滤器过滤2mL含对照物/蛋白酶缀合物的溶液。对于每份过滤后的样品，立即读取520nm处的吸光度。绘制结果相对于时间的曲线。对照物及待测缀合物的斜率表明的是该样品的相对活性。斜率越大表示活性越高。可以将待测蛋白酶缀合物活性(斜率)表示为对照物活性(斜率)的百分比。
用于测定免疫原性的小鼠鼻内试验用本领域已知方法或通过本文下述的用于测定免疫原性的小鼠鼻内试验可以测定本发明的蛋白酶缀合物的免疫原性潜力。该试验类似于Robinson等，“小鼠对枯草杆菌蛋白酶Carlsberg(Alcalase)的特异性抗体应答反应一种鼻内暴露模型的研制”，基础和应用毒理学(Fundamental and Applied Toxicology)，Vol.34，15-24页(1996)和Robinson等，“利用小鼠鼻内试验(MINT)来测定洗涤剂酶的变应原效力与豚鼠气管内(GPIT)试验的比较”，毒理学科学，Vol.43，39-46页(1998)中描述的测定法，这两种测定法可以用来代替下文所述的试验。
重量大约为18至大约20克的BDF1雌性小鼠(Charles River实验室，Portage，MI)被用于该试验。给药前将这些小鼠隔离一个星期。将这些小鼠关在放有木屑垫草的笼子中，这些笼子放置在控制湿度(30-70％)和温度(67-77°F)的房间内，该房间内进行12小时明暗交替的循环。这些小鼠随意食用Purina鼠食(Purina Mills，Richmond，IN)和水。
用待测潜在抗原(作为阳性对照的枯草杆菌BPN′或一种本发明的分子间交联的蛋白酶)对一组中的5只小鼠进行给药。给药前，通过腹膜内(i.p.)注射Ketaset(88.8mg/kg)和Rompun(6.67mg/kg)的混合物对每只小鼠进行麻醉。将被麻醉的小鼠握在手掌中，背朝下，用5mL溶解了蛋白酶的缓冲液(0.01M KH2PO4，pH5.5)进行鼻内给药。当每组给药剂量相同时，可以针对不同的剂量进行试验。给药溶液被轻轻地点在每只小鼠的鼻孔外并被小鼠吸入。在第3，10，17和24天重复给药。
在第29天收集血清样品。通过抗原捕获ELISA方法测定小鼠血清中的酶-特异性IgG1抗体。利用标准的ED50值可以比较蛋白酶缀合物和枯草杆菌蛋白酶BPN′的免疫原性。
本发明的组合物本发明的蛋白酶缀合物可以用于适合使用各自的亲本蛋白酶的任一情况。一个这样的实例包括清洁组合物。由于本发明蛋白酶缀合物合乎需要的减弱的免疫原性，该蛋白酶缀合物还可以用于曾经从使用蛋白酶中受益最小的情况。这类用途的实例包括蛋白酶缀合物必定与哺乳动物皮肤(特别是人体皮肤)紧密接触的情况，例如其中使用个人护理组合物。
清洁组合物所述的蛋白酶缀合物可用于清洁组合物包括，但不限于，洗衣组合物、坚硬表面清洗组合物、精细织品清洗组合物包括餐具清洗组合物，以及自动洗碗机洗涤剂组合物。
本发明所述清洁组合物包括有效量的一种或多种本发明所述蛋白酶缀合物以及清洁组合物载体。
本发明使用的“有效量的蛋白酶缀合物”或者类似表述是指足以达到特定清洁组合物中所需蛋白水解活性的蛋白酶缀合物的量。所述有效量可被本领域普通技术人员容易地确定，并取决于多种因素，例如所用蛋白酶缀合物的具体种类，清洗的用途，清洁组合物的具体组成，以及需要使用的是液体还是干的(例如，颗粒状、棒状)组合物，等。优选地，所述清洁组合物中包含约0.0001％～约10％，更优选约0.001％～1％，以及最优选约0.01％～约0.1％的一种或多种本发明所述的蛋白酶缀合物。下面更详细地讨论了蛋白酶缀合物可以用于其中的不同清洁组合物的几个实例。
除本发明所述的蛋白酶缀合物外，本发明清洁组合物还包括其中含有一种或多种与蛋白酶缀合物相容的清洁组合物材料的清洁组合物载体。本发明使用的术语“清洁组合物材料”是指任何选定的用于特定类型的所需的组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、块、喷雾剂、棒、膏、凝胶)的材料，这些材料也是与用于组合物中的蛋白酶缀合物相容的。清洁组合物材料的具体选择可通过考虑待清洗的表面材料、对于在使用过程中的清洗条件(例如，通过洗涤剂的使用)所需的组合物形式容易地进行。本发明所用的术语“相容的”是指清洁组合物材料不会使蛋白酶缀合物的蛋白水解活性降低到这样的程度，即在正常使用情况下蛋白酶不像所期望的那样有效。下文中详细举例说明了具体的清洁组合物材料。
本发明的蛋白酶缀合物可用于期望泡沫丰富且清洁效果良好的多种洗涤剂组合物中。因此，蛋白酶缀合物可以与各种常规成分一起使用，提供充分配制的坚硬表面清洗剂、餐具清洗组合物、织物清洗组合物等。这类组合物可以液体、颗粒、棒状等形式使用。这类组合物可以配制成“浓缩”洗涤剂，其中含有多达约30％～约60％(重量)的表面活性剂。
本发明所述的清洁组合物可以任选地，以及优选地，包含各种表面活性剂(例如，阴离子、非离子或两性离子表面活性剂)。典型地，这类表面活性剂在组合物中的含量约5％～约35％。
用于本发明的表面活性剂的非限制性实例包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐以及伯和无规烷基硫酸盐；通式CH3(CH2)X(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸盐，其中x和(y+l)是至少约为7的整数，优选至少约为9，以及M是一种水溶性的阳离子，特别是钠；C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(特别是EO 1-5乙氧基硫酸盐)；C10-C18烷基烷氧基羧酸盐(特别是EO 1-5乙氧基羧酸盐)；C10-C18烷基聚葡糖苷及其相应的硫酸化聚葡糖苷；C12-C18α-磺化脂肪酸酯；C12-C18烷基及烷基酚烷氧基化物(特别是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)；C12-C18甜菜碱及磺基甜菜碱；C10-C18胺氧化物等。本发明优选烷基烷氧基硫酸盐(AES)和烷基烷氧基羧酸盐(AEC)。另外，还优选根据配方师的愿望将这类表面活性剂与胺氧化物和/或甜菜碱或磺基甜菜碱表面活性剂联用。其它常规的有用表面活性剂列于标准教科书中。特别有用的表面活性剂包括C10-C18N-甲基葡糖胺，其描述见1993年3月16日颁布的授予Connor等人的美国专利5,194,639。
本发明所述组合物中还可以包括多种能在洗涤剂清洁组合物中发挥功效的其它成分，其中包括，例如，其它活性成分、载体、水溶助长剂、加工助剂、染料或色料以及用于液体制剂的溶剂。如果希望额外增加泡沫，则可以向组合物中加入C10-C16烷醇酰胺等增泡剂，典型地加入量为约1％～约10％。C10-C14一乙醇酰胺和二乙醇酰胺代表一类典型的这样的增泡剂。将这类增泡剂与高效发泡辅助表面活性剂，例如上述的胺氧化物、甜菜碱以及磺基甜菜碱联用也是有利的。如果需要，可以加入MgCl2、MgSO4等可溶性镁盐，典型地约0.1％～约2％，以提供额外的泡沫。
本发明所述的液态洗涤剂组合物可以包含水以及其它溶剂作为载体。低分子量的伯或仲醇的实例有甲醇、乙醇、丙醇以及异丙醇，它们都是合适的。优选用一元醇来溶解表面活性剂，但是含有约2～约6个碳原子和约2～约6个羟基的多元醇(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、丙三醇以及1，2-丙二醇)也可以使用。所述组合物可以包含约5％～约90％，典型地约10％～约50％的这类载体。
优选配制成洗涤剂组合物以便于在含水的清洗操作中使用期间，洗涤用水的pH值为约6.8～约11。因此，典型地将成品在该范围内配制。将pH值控制在推荐使用水平的技术包括，例如缓冲液、碱和酸的使用。这类技术为本领域技术人员所熟知。
当配制本发明所述的坚硬表面清洗组合物和织物清洗组合物时，配方师可以希望使用约5％～约50％(重量)的助洗剂。典型的助洗剂包括1-10微米沸石、聚羧酸盐例如柠檬酸盐和氧代丁二酸氢盐、层叠硅酸盐、磷酸盐等。其它常规助洗剂见标准配方手册。
同样，配方师可以在这类组合物中使用各种另外的酶，例如纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，典型用量为约0.001％～约1％(重量)。各种去污酶及织物护理酶都为洗衣洗涤剂领域所熟知。
各种漂白化合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐等也可以用于此类组合物中，典型用量为约1％～约15％(重量)。如果需要，这类组合物还可以包含漂白活化剂，例如四乙酰乙二胺、壬酰羟苯磺酸盐等，这些也为本领域已知。典型用量为约1％～约10％(重量)。
去污剂，尤其是阴离子低聚酯型，螫合剂，尤其是氨基磷酸盐以及乙二胺丁二酸氢盐，粘土污垢去除剂，尤其是乙氧基化四亚乙基五胺，分散剂，尤其是聚丙烯酸盐和聚天冬氨酸盐，增白剂，尤其是阴离子增白剂，抑泡剂，尤其是硅氧烷及仲醇，织物软化剂，尤其是绿土粘土等都可以用于这类组合物中，用量为约1％～35％ (重量)。标准配方手册以及公开的专利中都包含了对这类常规材料的丰富详尽的描述。
酶稳定剂也可以用于清洁组合物中。这类酶稳定剂包括丙二醇(优选为约1％～约10％)、甲酸钠(优选为约0.1％～约1％)以及甲酸钙(优选为约0.1％～约1％)。
本发明的蛋白酶缀合物也可以用于坚硬表面清洗组合物中。本发明使用的“坚硬表面清洗组合物”是指用于清洗坚硬表面，例如地板、墙壁、浴室瓷砖等的液态及颗粒状的洗涤剂组合物。本发明所述的坚硬表面清洗组合物包含有效量的一种或多种本发明所述蛋白酶缀合物，优选组合物中的蛋白酶缀合物含量为约0.001％～约10％，更优选约0.01％～约5％，还更优选约0.05％～约1％(重量)。除含有一种或多种蛋白酶缀合物外，这类坚硬表面清洗组合物典型地还包括表面活性剂和水溶性的螯合助洗剂。但是，在某些专用产品，例如喷雾型窗户清洗剂中，有时并不使用所述表面活性剂，这是由于它们可能会在玻璃表面产生薄膜状和/或斑点状的残迹。
当含有表面活性剂组分时，其在本发明组合物中的含量可低至0.1％，但是，典型地，该组合物中表面活性剂的含量为约0.25％～约10％，更优选约1％～约5％。
典型地，所述组合物中包含约0.5％～约50％的去垢助剂，优选约1％～约10％。
优选的pH范围应为约7～12。如果需要调节pH，常用的pH调节剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸都可以使用。
溶剂也可以包含在所述组合物中。有用的溶剂包括，但不限于，乙二醇醚例如二甘醇单己基醚，二甘醇单丁基醚，乙二醇单丁基醚，乙二醇单己基醚，丙二醇单丁基醚，二丙二醇单丁基醚，以及二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。在使用时，这类溶剂的典型用量为约0.5％～约15％，更优选约3％～约11％。
此外，当向要清洗的表面“全强度”施用本发明的组合物后不清洗该表面时，可以在该组合物中使用高挥发性溶剂，例如异丙醇或乙醇以加快表面上组合物的蒸发。使用时，挥发性溶剂在组合物中的典型用量为约2％～约12％。
实施例7-12液态坚硬表面清洗组合物
所有配方均调至pH7。
在本发明的另一个实施方案中，餐具清洗组合物包含一种或多种本发明的蛋白酶缀合物。本发明使用的“餐具清洗组合物”是指用于清洗餐具的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒状的以及液态的形式。
实施例13-16液态餐具洗涤剂
所有配方均调至pH7。
实施例17-19液态织物清洗组合物
个人护理组合物本发明所述的蛋白酶缀合物特别适合用于个人护理组合物，例如留存型和漂洗型护发剂，香波、留存型和漂洗型防治粉刺组合物、洗面乳及调理剂、淋浴凝胶、肥皂、泡沫及非泡沫型洁面剂、化妆品、手用、面用及体用润肤剂、保湿剂、贴敷剂和面膜，留存型面部保温剂，化妆及清洁擦剂、口腔护理组合物、catamenials以及接触透镜护理组合物。本发明所述的个人护理组合物包含一种或多种本发明所述的蛋白酶缀合物和个人护理载体。
为了便于说明，本发明所述蛋白酶缀合物适合包含在下列参考文献中所述的组合物中1997年6月24日颁布的授予Linares等人的美国专利5,641,479(皮肤清洁剂)；1997年2月4日颁布的授予Wivell等人的美国专利5,599,549(皮肤清洁剂)；1996年12月17日颁布的授予Ha等人的美国专利5,585,104(皮肤清洁剂)；1996年7月30日颁布的授予Kefauver等人的美国专利5,540,852(皮肤清洁剂)；1996年4月23日颁布的授予Dunbar等人的美国专利5,510,050(皮肤清洁剂)；1997年3月18日颁布的授予Guang Lin等人的美国专利5,612,324(抗粉刺制剂)；1996年12月24日颁布的授予Warren等人的美国专利5,587,176(抗粉刺制剂)；1996年8月27日颁布的授予Venkateswaran的美国专利5,549,888(抗粉刺制剂)；1995年11月28日颁布的授予Corless等人的美国专利5,470,884(抗粉刺制剂)；1997年7月22日颁布的授予Gordon等人的美国专利5,650,384(淋浴凝胶)；1997年3月4日颁布的授予Moore等人的美国专利5,607,678(淋浴凝胶)；1997年4月29日颁布的授予Coffindaffer等人的美国专利5,624,666(头发调理剂和/或洗发香波)；1997年4月8日颁布的授予Bolich等人的美国专利5,618,524(头发调理剂和/或洗发香波)；1997年3月18日颁布的授予Inman的美国专利5,612,301，(头发调理剂和/或洗发香波)；1996年11月12日颁布的授予Wells的美国专利5,573,709(头发调理剂和/或洗发香波)；1996年1月9日颁布的授予Pings的美国专利5,482,703(头发调理剂和/或洗发香波)；1994年4月12日再颁布的授予Grote等人的美国专利Re.34,584(头发调理剂和/或洗发香波)；1997年6月24日颁布的授予Date等人的美国专利5,641,493(化妆品)；1997年2月25日颁布的授予Blank等人的美国专利5,605,894(化妆品)；1996年12月17目颁布的授予Yoshioka等人的美国专利5,585,090(化妆品)；1990年7月3日颁布的授予Cheney等人的美国专利4,949,179(手用、面用及体用润肤剂)；1997年3月4日颁布的授予McAtee等人的美国专利5,607,980(手用、面用及体用润肤剂)；1977年8月30日颁布的授予Richter等人的美国专利4,045,364(化妆用或清洁用的擦剂)；1994年10月12日公开的Touchet等人的欧洲专利申请，EP 0 619 074(化妆用或清洁用的擦剂)；1990年12月4日颁布的授予Brown-Skrobot等人的美国专利4,975,217(化妆用或清洁用的擦剂)；1992年3月17日颁布的授予Seibel的美国专利5,096,700(口腔清洁组合物)；1991年7月2日颁布的授予Sampathkumar的美国专利5,028,414(口腔清洁组合物)；1991年7月2日颁布的授予Benedict等人的美国专利5,028,415(口腔清洁组合物)；1989年9月5日颁布的授予Davies等人的美国专利4,863,627(接触透镜清洗组合物)；1988年5月24日颁布的授予Huth等人的美国专利Re.32,672(接触透镜清洗组合物)；以及1986年9月2日颁布的授予Schafer的美国专利4,609,493(接触透镜清洗组合物)。
为了进一步说明本发明所述的口腔清洁组合物，可以向组合物中加入药物上可接受量的一种或多种本发明所述蛋白酶缀合物用来清除牙齿或假牙上的蛋白性污渍。本发明使用的“口腔清洁组合物”是指洁齿剂、牙膏、牙粉、漱口剂、口腔喷雾剂、口香糖、糖锭、香囊、片剂、生物凝胶、预防用糊剂、牙齿处理溶液等。优选地，所述的口腔清洁组合物包括约0.0001％～约20％(重量)的一种或多种本发明所述的蛋白酶缀合物，更优选约0.001％～约10％，还更优选约0.01％～约5％，以及药物上可接受的载体。本发明使用的“药物学上可接受的”是指该术语描述的药物、药剂或惰性成分适合用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激作用、过敏反应等，具有合理的效果/风险比。
典型地，所述口腔清洁组合物的药物上可接受的口腔清洁载体成分通常占组合物重量的约50％～约99.99％，优选约65％～约99.99％，更优选约65％～约99％。
可加入到本发明所述口腔清洁组合物的口腔清洁组分中的药物上可接受的载体成分以及任选成分为本领域技术人员众所周知。多种多样的组合物类型、口腔清洁组合物中使用的载体成分以及任选成分都已在本发明上述的参考文献中公开。
在本发明的另一个实施方案中，用于在口腔外清洗假牙的假牙清洗组合物包含一种或多种本发明所述的蛋白酶缀合物。这类假牙清洗组合物中包含有效量的一种或多种蛋白酶缀合物以及假牙清洗载体，所述蛋白酶缀合物在组合物中的重量百分含量优选约0.0001％～约50％，更优选约0.001％～约35％，还更优选约0.01％～约20％。各种假牙清洗组合物形式，例如泡腾片等都为本领域所熟知(参见，例如美国专利5,055,305，Young)，并且通常适合于掺入一种或多种蛋白酶缀合物用于清除假牙上的蛋白性污渍。
在本发明的另一个实施方案中，接触透镜清洗组合物中包括一种或多种本发明所述的蛋白酶缀合物。这类接触透镜清洗组合物中包含有效量的一种或多种蛋白酶缀合物以及接触透镜清洗载体，所述蛋白酶缀合物在组合物中所占重量百分比优选约0.01％～50％，更优选约0.01％～约20％，还更优选约1％～约5％。各种接触透镜清洗组合物形式，例如片剂、液体等都为本领域所熟知，并且通常适合于掺入一种或多种蛋白酶缀合物用于清除接触透镜上的蛋白性污渍。
实施例20-23接触透镜清洗组合物
实施例24-27洗浴产品
实施例28-31洗面产品
实施例32-33留存型皮肤保温组合物
实施例34擦净剂组合物
上述组合物被浸渍到一由纤维素和/或聚酯所组成的机织吸收层上，以吸收层重量计，组合物为约250％。
序列表<110>宝洁公司<120>具有空间保护的表位区域的蛋白酶缀合物<130>表位保护<140>PCT/US00/<141>2000-07-11<160>1<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>275<212>PRT<213>解淀粉芽孢杆菌<400>1Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Ar9 Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270Ala Ala Gln27权利要求
1.一种蛋白酶缀合物，其特征在于所述缀合物包含一个蛋白酶部分以及一个或多个附加部分，其中所述蛋白酶部分包括第一表位区域，第二表位区域和第三表位区域，其中每个附加部分都与所述蛋白酶部分的表位保护位置共价相连，其中(a)第一表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的1，2，3，4，5，6，7，12，17，36，40，41，43，44，45，67，86，87，89，206，209，210，212，213，214，215，和216；(b)第二表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的25，26，27，46，47，48，49，50，51，52，53，54，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，144，和145；和(c)第三表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的9，10，22，23，24，62，63，143，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，253，254，256，265，267，269，271，272，和275。
2.根据权利要求1的蛋白酶缀合物，其中每个附加部分独立地具有下列结构 其中X不存在或为一连接部分；R1不存在或选自第一多肽和第一聚合物；R2不存在或选自第二多肽和第二聚合物；其中X、R1和R2中至少有一个不存在。
3.根据权利要求2的蛋白酶缀合物，其中所述的蛋白酶部分具有亲本氨基酸序列的修饰的氨基酸序列，其中所述的修饰的氨基酸序列包括在一个或多个表位保护位置上被一取代氨基酸取代并且其中每个附加部分与一个取代氨基酸共价连接。
4.根据权利要求3的蛋白酶缀合物，其中所述的取代氨基酸为半胱氨酸。
5.根据权利要求4的蛋白酶缀合物，其中所述的亲本氨基酸序列选自枯草杆菌蛋白酶BPN′，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶DY，枯草杆菌蛋白酶309，蛋白酶K、铝热酶，蛋白酶A，蛋白酶B，蛋白酶C，和蛋白酶D，以及它们的变体。
6.根据权利要求5的蛋白酶缀合物，其中(a)第一表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的1，2，3，4，5，6，7，12，17，40，41，67，86，87，89，206，209，214，和215；(b)第二表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的27，47，48，50，52，102，127，128，130，131，132，134，138，和141；和(c)第三表位区域中的表位保护位置选自相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的22，23，24，143，146，155，173，189，197，203，204，253，254，265，和275。
7.根据权利要求6的蛋白酶缀合物，其中R1和R2不存在。
8.根据权利要求6的蛋白酶缀合物，其中R1为选自枯草杆菌蛋白酶BPN′，枯草杆菌蛋白酶Carlsberg，枯草杆菌蛋白酶DY，枯草杆菌蛋白酶309，蛋白酶K、铝热酶，蛋白酶A，蛋白酶B，蛋白酶C，和蛋白酶D，以及它们的变体的第一多肽。
9.根据权利要求8的蛋白酶缀合物，其中所述的第一多肽在其选自下列的位置上与所述的连接部分或所述的蛋白酶部分共价相连相应于枯草杆菌蛋白酶BPN′的1，2，3，4，5，6，7，9，10，12，17，22，23，24，25，26，27，36，40，41，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，62，63，67，86，87，89，91，99，100，101，102，127，128，129，130，131，132，133，134，136，137，138，140，141，143，144，145，146，154，155，156，157，172，173，187，189，195，197，203，204，206，209，210，212，213，214，215，216，253，254，256，265，267，269，271，272，和275。
10.根据权利要求9的蛋白酶缀合物，其中X不存在并且其中所述的蛋白酶部分及第一多肽通过二硫桥共价相连。
11.根据权利要求6的蛋白酶缀合物，其中R2不存在，第一聚合物是聚乙二醇。
12.根据权利要求11的蛋白酶缀合物，其中至少一个附加部分与选自第一表位区域，第二表位区域和第三表位区域的表位区域中的表位保护位置共价相连。
13.一种清洁组合物，所述组合物包含权利要求1中所述的蛋白酶缀合物和一种清洁组合物载体。
14.一种个人护理用组合物，所述组合物包含权利要求1中所述的蛋白酶缀合物和一种个人护理用载体。
全文摘要
本发明涉及枯草杆菌蛋白酶缀合物,该缀合物包含一个蛋白酶部分和一个或多个附加部分。每个附加部分都与该蛋白酶部分的表位保护位置共价相连。该蛋白酶缀合物相对于亲本蛋白酶而言具有降低的免疫原性。本发明还涉及包含此类蛋白酶缀合物的清洁和个人护理组合物。
文档编号A61Q11/00GK1372593SQ00810746
公开日2002年10月2日 申请日期2000年7月11日 优先权日1999年7月22日
发明者D·N·鲁宾夫, D·J·维斯格伯, P·E·克雷 申请人:宝洁公司