专利名称：稀有糖的生物活性的利用方法及配合了稀有糖的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及稀有糖的生物活性的利用方法和以稀有糖为有效成分配合的组合物，特别是涉及功能性食品、医药品或化妆品。
背景技术：
单糖大体可分为具有多羟基醛结构的的醛糖、具有多羟基酮结构的酮糖、以及还原这些糖而得到的糖醇。还可以根据自然界中存在的量进行分类。即，国际稀有糖学会将稀有糖定义为“自然界中仅微量存在的糖”，也就是自然界中含量稀少的单糖。对稀有糖来说，用一般的有机化学合成方法的合成反应中大多数其产量很少。因此，目前多数的稀有糖的性质不得而知，对包括D-阿洛糖的己醛糖(六碳醛糖)的稀有糖也多数不知道其性质。
作为属于己醛糖的稀有糖，除了D-阿洛糖外，可举例出D-古洛糖、D-艾杜糖、D-塔罗糖、D-阿卓糖、L-甘露糖、L-葡萄糖、L-半乳糖等。另外，在包括D-阿洛酮糖的己酮糖(六碳酮糖)的稀有糖中也是相同的，作为属于己酮糖的稀有糖可举例出D-阿洛酮糖、L-阿洛酮糖、D-山梨糖、L-山梨糖、D-塔格糖、L-塔格糖、L-果糖等。
过去，关于糖类与癌症的关系，如专利文献1中所述，人们知道的有对预防癌症有效的多糖类。另外，也有糖链与癌转移之间的关系的报告，如利用低聚糖的整肠作用消除便秘具有预防大肠癌的效果，近年来agarisuku等多糖类具有抗癌效果等。
另一方面，作为利用糖类的活性氧性质的类型，如专利文献2所述，人们知道的有活性氧抑制剂，这种活性氧抑制剂含有具有抑制活性氧性质的多糖类。
在单糖类中，阿洛酮糖属于己酮糖(六碳糖)。阿洛酮糖中人们知道的有两种旋光异构体D-型与L-型。在这里，D-阿洛酮糖在自然界中存在稀少，因此根据国际稀有糖学会的定义，被定义为“稀有糖”，但是，该D-阿洛酮糖最近由于差向异构酶的出现(如参见专利文献3)尽管价格很贵，但已经比较容易得到。在该公报中暗示有调配的D-阿洛酮糖可以作为甜味剂、发酵用碳源、试剂、化妆品和医药品的原料和中间体等可有效地利用。根据该公报，作为甜味剂，记载有可利用于提高饮料、饲料、牙膏、内服药等口服物甜味性的内容，但是并没有公开作为食用配料的具体构成。在专利文献4中公开有D-阿洛酮糖的旋光异构体L-阿洛酮糖能够用于食用配料的内容。
专利文献1特开平5-112455号公报专利文献2特开平7-285871号公报专利文献3特开平6-125776号公报专利文献4特开昭57-129671号公报发明内容本发明人着眼于稀有糖的生理活性，并通过采用细胞的实验进行对其的证实。21世纪被称为是生命科学的世纪，目前，有关DNA和蛋白质的研究已经在国际范围内广泛开展。对快速基因组研究中的糖来说其重点在糖链研究，而发明人则着眼于“单糖”，以单糖中是否有生理活性为切开口进行了研究。作为本发明的背景，长期累计地进行了有关稀有糖生产的包罗性的研究，最近确立了大量生产部分稀有糖的技术。
本发明的目的在于，提供稀有糖尤其是D-阿洛糖和D-阿洛酮糖的生理活性作用的利用方法以及利用稀有糖的生理活性的功能性食品、医药品等的创造。
本发明的内容为以下(1)至(9)的稀有糖的生理活性作用的利用方法(1)一种稀有糖的生理活性作用的利用方法，其特征在于，将稀有糖作用于生理活性作用敏感性细胞，改变该细胞的功能。
(2)在所述(1)的方法中，其特征在于，所述细胞为人体细胞。
(3)在所述(1)或(2)的方法中，其特征在于，作为所述稀有糖采用了以稀有糖为有效成分配合的组合物。
(4)在所述(3)的方法中，其特征在于，所述组合物为功能性食品、医药品或化妆品。
(5)在(1)至(4)的任一项方法中，其特征在于，所述稀有糖为属于醛糖及/或酮糖的稀有糖。
(6)在(5)的方法中，其特征在于，所述醛糖为D-阿洛糖。
(7)在(6)的方法中，其特征在于，所述细胞选自癌细胞增殖抑制作用敏感性细胞和活性氧产生抑制作用敏感性细胞。
(8)在(5)的方法中，其特征在于，所述酮糖为D-阿洛酮糖。
(9)在(8)的方法中，其特征在于，所述细胞选自趋化因子分泌抑制作用敏感性细胞、微神经胶质的游走抑制作用敏感性细胞以及血糖降低作用敏感性细胞。
本发明的内容为以下述(10)至(17)的稀有糖为有效成分配合的组合物(10)一种以稀有糖为有效成分配合的组合物，该组合物被添加在生理活性作用敏感性细胞，具有改变该细胞的功能的作用。
(11)在所述(10)的组合物中，其特征在于，所述细胞为人体细胞。
(12)在所述(10)或(11)的组合物中，其特征在于，所述稀有糖为属于醛糖及/或酮糖的稀有糖。
(13)在所述(12)的组合物中，其特征在于，所述醛糖为D-阿洛糖。
(14)在所述(13)的组合物中，其特征在于，所述细胞选自癌细胞增殖抑制作用敏感性细胞和活性氧产生抑制作用敏感性细胞。
(15)在所述(12)的组合物中，其特征在于，所述酮糖为D-阿洛酮糖。
(16)在所述(15)的组合物中，其特征在于，所述细胞选自趋化因子分泌抑制作用敏感性细胞、微神经胶质的游走抑制作用敏感性细胞以及血糖降低作用敏感性细胞。
(17)在所述(10)至(16)的任一项组合物中，其特征在于，所述组合物为功能性食品、医药品或化妆品。
图1为表示本发明中的D-阿洛糖对肝癌细胞(HepG2)增殖具有抑制效果的图。
图2为表示本发明中的D-阿洛糖对子宫癌细胞(Hela)增殖具有抑制效果的图。
图3为表示本发明中的D-阿洛糖对卵巢癌细胞(OVCAR3)增殖具有抑制效果的图。
图4为表示本发明中的D-阿洛糖对皮肤角化细胞(HaCaT)增殖具有抑制效果的图。
图5为表示本发明中的D-阿洛糖对癌细胞增殖抑制具有浓度依赖性的图。
图6为表示实施例3中的稀有糖的、对HL60的增殖抑制效果的图。
图7为表示实施例3中的稀有糖的、对Daudi细胞的增值抑制效果的图。
图8为表示实施例3中的稀有糖的、对THP1细胞的增值抑制效果的图。
图9为表示实施例3中的稀有糖的、对KS1细胞的增值抑制效果的图。
图10为表示实施例3中的稀有糖的、对MT2细胞的增值抑制效果的图。
图11为表示实施例3中的稀有糖的、对KG1细胞的增值抑制效果的图。
图12为表示根据流动血细胞计数方法的、D-阿洛糖对细胞周期的影响的图。
图13为表示白血球的产生活性氧的随时间的变化的图。
图14为表示本发明的D-阿洛糖对白血球的活性氧产生具有抑制效果的图。
图15为表示各糖对在白血球的活性氧开始产生后没有活性氧抑制效果的图。
图16为表示实施例9中的本发明的D-阿洛糖对活性氧产生抑制具有浓度依赖性的图。
图17为表示对视网膜缺血和再循环障碍的D-阿洛糖的效果的图。
图18涉及实施例7的D-阿洛糖对皮瓣缺血再循环障碍的减轻效果，为表示着生面积(％)的全部数据的表。
图19涉及实施例7的D-阿洛糖对皮瓣缺血再循环障碍减轻效果，为表示方差分析(一元配置)的表。
图20涉及实施例7的D-阿洛糖对皮瓣缺血再循环障碍减轻效果，为表示平均值与标准偏差的图。
图21涉及实施例7的D-阿洛糖对皮瓣缺血再循环障碍减轻效果，为表示多重比较鉴定结果的表。
图22涉及实施例8的影响老鼠的肾缺血再循环障碍的稀有糖的效果，为代替表示RNA分析法的结果的照片。图中表示CINC-1的mRNA出现量。以GAPDH(glyceraldehydes 3-phosphatedehydrogenase)的mRNA作为标准，在照片中可以看出这个量基本没有变化。在此基础上与CINC-1的mRNA出现量进行比较。从左开始依次表示缺血前、缺血后、投入D-阿洛糖后缺血、投入D-阿洛酮糖后缺血的肾。CINC-1的mRNA在缺血前完全没有出现，但随着缺血而出现，又随着D-阿洛糖与D-阿洛酮糖的投入而抑制出现量。
图23为表示实施例9的稀有糖的、对海马神经细胞死亡抑制效果的图。
图24为表示实施例9的脑缺血带来谷氨酸向神经细胞外释放，以及阿洛糖的释放抑制效果的图。
图25为表示实施例9的脑缺血带来谷氨酸向神经细胞外释放，以及2-脱氧葡萄糖的释放抑制效果的图。
图26为表示在实施例10中D-阿洛酮糖具有MCP-1的分泌抑制效果的图。
图27为表示在实施例10中D-阿洛酮糖作用于刺激MCP-1的分泌的细胞因子而抑制MCP-1的分泌的图。
图28为表示在实施例11中D-阿洛酮糖影响微神经胶质的出现量的图。
图29为表示在实施例12中D-阿洛酮糖影响胰岛素分泌刺激效果的图。
图30为说明实施例12中所使用的反转肠道的实验例的图。
图31为表示在实施例12中D-阿洛酮糖影响葡萄糖吸收的图。
图32为表示在实施例12中涉及因稀有糖投入的、对老鼠血糖值的影响，以及因在麻痹状态下投入生理食盐水的、对血糖的影响的图。
图33涉及因实施例13的稀有糖的投入的、对老鼠血糖值的影响，为表示因在麻醉状态下投入D-葡萄糖的、对血糖的影响的图。
图34涉及因实施例13的稀有糖的投入的、对老鼠血糖值的影响，为表示因在麻醉状态下投入D-阿洛酮糖的、对血糖的影响的图。
图35涉及实施例14的酮糖的高血糖状况改善效果，为表示在IVGTT中对血液中D-葡萄糖浓度的影响的图。
图36涉及实施例15的酮糖的高血糖状况改善效果，为表示胰岛素的分泌动态的图。
图37涉及实施例15的酮糖的高血糖状况改善效果，为表示D-阿洛酮糖对高血糖的作用的图。
图38涉及实施例15的稀有糖在高血糖条件下是否有抑制糖化效果的研究，为说明GA测定原理的图。
图39涉及实施例15的稀有糖在高血糖条件下是否有抑制糖化效果的研究，为表示稀有糖的糖化作用的研究图。
图40涉及实施例15的稀有糖在高血糖条件下是否有抑制糖化效果的研究，为表示与葡萄糖共存条件下稀有糖的糖化作用的研究图。
图41为单糖结构(Izumoring)连接图。
图42为图41的下段的IzumoringC6的说明图。
图43为图41的中段的IzumoringC5的说明图。
实施发明的最佳方式稀有糖可以定义为一种在自然界中仅微量存在的单糖。在本发明中稀有糖同样符合上述定义，优选的是属于醛糖的D-阿洛糖或属于酮糖的D-阿洛酮糖。自然界中大量存在的单糖有D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-木糖、L-阿糖等7种，除此以外的单糖全部为稀有糖。糖醇可以由单糖还原得到，自然界中山梨糖比较多，除此以外，由于自然界中含量较少，因此将这些也定义为本发明的稀有糖。至今为止，这些稀有糖还很难得到，但是随着开发出从自然界中大量存在的单糖中制备稀有糖的方法，可利用该技术制造这些稀有糖。
为了更容易理解这些单糖的关系，以下基于所提到的Izumoring加以说明。由如图41所示的制备过程与分子结构(D型、L型)连接碳数从4到6的全部单糖的连接图为Izumoring全图。即，从图41中可以理解的是，单糖由碳数4、5、6全部连接而成的。全图由Izumoring C6中的连接、Izumoring C5中的连接、Izumoring C4中的连接及C4、C5、C6完全连接而成。这个想法很重要。减少碳数的方法主要采用发酵法。不同碳数的单糖全部连接在一起组成大的连接也是一种特征，另外，也能理解这种结构是没有利用价值的。
由6碳构成的单糖(己糖)Izumoring，如图41的下段及图42所示，由6碳构成的单糖(己糖)总共有34种，其中醛糖有16种、酮糖有8种、糖醇有10种。由包括本发明人的研究在内的研究中可知，这些糖可以由氧化还原酶反应、醛糖异构化酶反应、醛糖还原酶反应等转化得到。但是到目前为止的研究还没有将上基团、中间基团、下基团与酶反应联系在一起。属于上基团的D-葡萄糖、D-果糖由于自然界中大量存在，因此价格很低，但至今为止还不能从这些糖中合成出稀有糖。但是，本发明的发明人在研究过程中发现了能够结合这些稀有糖的酶。这起因于在具有从半乳糖醇合成D-塔格糖的酶的菌培养液中意外发现了D-山梨糖。调查其原因的结果发现这种菌可以产生被称为D-塔格糖3表异构酶(DTE)的酶。
从图41下段及图42所示可知，这种DTE是可以连接至今为止被切断的D-塔格糖与D-山梨糖之间的酶。更令人惊讶的是，这种DTE是使所有的酮糖的3位进行差向异构化的酶，作用于至今还不能合成连续的D-果糖和D-阿洛酮糖、L-山梨糖和L-塔格糖、D-塔格糖和D-山梨糖、L-阿洛酮糖和L-果糖，是一种具有非常宽范围基质特异性的独特的酶。由于该DTE的发现，全部单糖以环状相连，完成了单糖知识的结构化，将其命名为Izumoring。
仔细观察图42可知左侧是L型、右侧是D型、中间是DL型，而且也能知道以环的中央(星号)为中心L型与D型构成了点对称。例如D-葡萄糖与L-葡萄糖以中央点为基准构成点对称。并且Izumoring的价值也在于成为所有的单糖的生产设计图。前一个例中表示了由D-葡萄糖出发如果想生产出L-葡萄糖，则经过D-葡萄糖的异构化→差向异构化→还原→氧化→差向异构化→异构化可得到L-葡萄糖。
图中用6碳单糖(己糖)的Izumoring表示自然界中大量存在的糖与微量存在的稀有糖之间的关系。D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖及可以从牛奶中的乳糖生成的D-牛乳糖在自然界中大量存在，其外的可分类为自然界中仅微量存在的稀有糖。因DTE的发现，可以由D-葡萄糖生成D-果糖、D-阿洛酮糖，而且可以生成D-阿洛糖、阿洛糖醇、D-塔罗糖醇。
6碳单糖(己糖)Izumoring意义可以归纳为如下根据生成过程及分子结构(D型、L型)可以整理出全部单糖的结构(知识的结构化)、掌握单糖的全像、可以选择迅速有效的研究步骤、可以设计出最适合的生成路径、可以预见缺少部分。
如图41中段及图43所示，5碳单糖(戊糖)Izumoring是比6碳Izumoring还要小的环。但是与C6 Izumoring一样含有8个醛糖、4个酮糖和4个糖醇，并且全部都是由酶反应结合而成。不同点在于5碳单糖仅经过氧化还原反应、异构化反应全部连接成环状。另一方面，通过DTE的使用可以设计效率更高的生成路径。特别是从图43中明确可知，5碳Izumoring的较大特征在于，相对于点对称地配置全部单糖的6碳Izumoring，5碳Izumoring是以左右对称地配置的。这样全部的五糖是由氧化反应连接而成，因此与6碳Izumoring完全同样地具有如下意义结构上整理了全部戊糖(知识的结构化)、掌握了全像、可以选择迅速有效的研究步骤、可以设计出最适合的生成路径、可以预见缺少部分等。
如图41上段所示，由于4碳单糖(丁糖)结构上的特性，丁糖Izumoring的特征为没有形成环。在结构上具有与5碳Izumoring上半部分相同的结构。这个环的情形也与5，6碳情形一样，由氧化还原反应及异构化反应连接而成。由于DTE不与4碳酮糖反应，因此酮糖间的反应现在还不存在。但是预测有可能存在新的差向异构酶，这个研究目前还在进行当中。总的配置与5碳一样左右对称并且含有全部的4个醛糖、2个酮糖及3个糖醇。即，具有与5，6碳Izumoring相同的意义。
C6Izumoring的D-葡萄糖与C5Izumoring的D-阿糖醇及C4Izumoring的D-赤藓醇连在一起。这个连线表示可以用发酵法由D-葡萄糖生成D-阿糖醇及赤藓醇。即，C6Izumoring、C5Izumoring及C4Izumoring是连接在一起的。该连接是碳数减少的主要靠发酵法的反应，可使C6Izumoring与C4，C5进行连接，该连接通过除了向D-阿糖醇及赤藓醇的两个转化反应以外的发酵法进行。例如，可以由D-葡萄糖生成D-核糖。如上所述，通过3个Izumoring使全部碳4，5，6的单糖(醛糖、酮糖、糖醇)连接，由此明确了各个单糖在全部单糖中所在的位置。
可明确地确定，还原从未利用资源的木材中可生产的D-木糖而容易得到很有名的木糖醇。如果可以用生物反应大量得到特定的单糖，那么以这些单糖为原料转化为新的单糖是可行的。也就是说，从这一全像中可以掌握全部单糖原料的位置，因此可以设计出有用的利用方法。尤其是可以容易推测从废弃物及副产品获得单糖的利用方法。不仅是在稀有糖生产领域，而且在探索稀有糖的研究中也发挥作用。例如，当确定了某个稀有糖的生理活性时就可以从图41所示的连接图中确定其所在位置。并且通过与结构上相近的稀有糖进行生理活性的比较或者研究结构上有镜像关系的稀有糖的生理活性，有助于从分子结构上类推出稀有糖的生理活性的功能。还可以通过分析稀有糖的生理功能，积累Izumoring的性质，这样，可对整个单糖从至今为止的单纯列举的理解中大大利用于综合理解“单糖的结构”、“单糖的生产方法”及“单糖的生理功能”。
下面对在稀有糖中现在可以大量生产的两种稀有糖，即D-阿洛糖与D-阿洛酮糖进行说明。
本发明所使用的D-阿洛糖(D-己醛糖)是分类为醛糖(己醛糖)的D型阿洛糖，是熔点为178℃的六碳糖(C6H12O6)。
作为D-阿洛糖的制备方法有，用钠汞齐还原D-阿洛酸内酯的制备方法、还有根据西克瓦特·欧赛因·贝央等的记载在“Journal ofFermentation and Bioengineering”(第85卷、第539-541页、1998)中描述的用L-鼠李三糖·异构酶从D-阿洛酮糖合成的制备方法。
最近发表的特开2002-17392号公报中描述了将D-木糖·异构酶作用于含有D-阿洛酮糖的溶液从D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖的制备方法。
本发明的如抑制癌细胞增殖物质中使用的D-阿洛糖，可以根据上述制法或其它方法获得。根据上述特开2002-17392号公报中所述的制备方法，则因为可以大量生产，所以能够更容易地得到所需的D-阿洛糖。但是，至今为止的制造方法还不能完全满足D-阿洛糖的分离回收，因此在工业生产上必需经过一些不经济的工序。作为以下为目的，即，克服有关D-阿洛糖分离回收的现有技术中的缺点“必要的耗能过程”，也就是，提供有效地进行分离回收的方法，以及提供在技术上可行的高纯度D-阿洛糖的连续生产方法，在另一申请(特愿平2003-95828号)中正申请着以下内容根据D-阿洛糖的结晶化方法的区别方法以及在大量生产该糖的应用。该高纯度D-阿洛糖的分离回收方法的特征在于，在从将D-阿洛酮糖的一部分改变为D-阿洛糖的作为酶反应产物的例如35％D-阿洛酮糖与15％D-阿洛糖的混合溶液中回收D-阿洛糖时，利用D-阿洛糖难溶于乙醇和/或甲醇的性质将D-阿洛糖结晶化出来，分离出该D-阿洛糖的结晶。在上述方法中，在由酶反应将D-阿洛酮糖改变为D-阿洛糖时所使用的酶为“L-鼠李三糖异构酶”。L-鼠李三糖异构酶是在1998年的文献中公布的公知酶，优先举例来自Pseudomonas stutzerii的氧。菌株Pseudomonas stutzeriiLL172a是上述文献中记载的公知菌，保存在香川大学农学部生物资源营养化学科的何森健研究室。可以在财团法人发酵研究所得到同样的Pseudomonas stutzerii。认为Pseudomonas stutzerii IFO3773、Pseudomonas stutzerii IFO 13596也具有相同的活性。L-鼠李三糖异构酶可以容易地从各种微生物得到。在有L-鼠李三糖的培养条件中以诱导方式生产。一般可以通过培养具有L-鼠李三糖异构酶生成能力的微生物来获得。例如用L-鼠李三糖作为碳源培养各种微生物，则L-鼠李三糖将成为诱导剂在菌体内产出L-鼠李三糖异构酶。特别有利的是如果使用产生大量氧的突变体，则不必使用高价的L-鼠李三糖等，可以使用从培养菌体中提取的L-鼠李三糖异构酶，也可以将菌体直接使用。L-鼠李三糖异构酶根据使用目的不同，可以不是高纯度精制的酶，可以是粗酶。作为粗酶的具体例子，可使用上述具有产生L-鼠李三糖异构酶的微生物本身、其培养物和部分精制的培养物。本发明中通过使用特定的固定化方法得到的固定化酶或固定化菌体方式，可构筑输液压力低且稳定，且长时间连续使用的反应堆。
根据上述高纯度D-阿洛糖的连续制造方法，可以同时进行D-阿洛糖的分离、脱盐、脱离子、浓缩以及结晶，将以前各自工程中进行的分离方法可在一个工序中综合进行处理，因此可以在短时间内进行大量的生产。
本发明所使用的D-阿洛酮糖是分类为属于稀有糖的己酮糖的阿洛酮糖的D型六碳糖(C6H12O6)。这种D-阿洛酮糖可通过任一手段获取，包括可以在自然界中提取、也可以用化学或生物合成方法合成等。比较容易的方法是例如可使用表异构酶技术(参考特开平6-125776号公报等)制备。获得的D-阿洛酮糖液根据需要，可以用如除蛋白、脱色、脱盐等方法精制，也可以浓缩制成糖浆状的D-阿洛酮糖制品，还可以用柱状色谱分离法进行分离精制，很容易得到99％以上的高纯度的模型。这种D-阿洛酮糖不仅可以以单糖形式直接使用，还可以根据需要以各种衍生物的形式使用。
对本发明中所说的生理活性作用敏感性细胞是指，可被稀有糖作用而改变其功能的细胞，只要具有这样的功能的细胞就没有什么特别的限制。稀有糖作用于该细胞使细胞的功能发生变化。虽然根据稀有糖种类不同生理活性作用也不同，但是通过使用细胞的预实验可预测其作用，通过本实验可确定。作为该细胞，最好是人体细胞，但也包括人体细胞以外的细胞。细胞的形态可以是生物体的内脏细胞，也可以是培养细胞。
为了发挥将稀有糖影响于生理活性作用敏感细胞而改变该细胞的功能的作用，将稀有糖作用于细胞。本发明中使用的稀有糖具有水溶性，作用的形态没有限制。根据用途可以采用适当的手段作用稀有糖。
最好是采用下述方式，以稀有糖为有效成分的物质的形式将稀有糖作用于细胞。作为稀有糖以稀有糖为有效成分而配合的物质包含任何形态。
下面，作为两种有代表性的稀有糖，举例作为醛糖在Izumoring中与D-果糖最接近的D-阿洛糖，以及作为酮糖的D-阿洛酮糖，对其生理活性进行说明。
首先，表示D-阿洛糖的例子。
本发明的发明人发现稀有糖具有抑制产生活性氧的性质。本发明可以提供以作为醛糖的稀有糖为有效成分的活性氧产生抑制剂。
即，有数据表明D-阿洛糖可以保护内脏缺血障碍。做肝脏等的内脏手术时必须要暂时止住内脏的血液流动，其结果是内脏陷入缺血状态。手术结束后，再次流通血液时，从白血球中产生大量活性氧，可以认为这样的情况引起内脏障碍一个很大的原因。本发明的发明人用稀有糖使老鼠的肝脏处于较长时间的缺血状态，其时间为90分钟，之后，再流通血液并观察三个月后的生存率。通常的情况下老鼠的存活率只有30％，而在缺血前回流0.2g/kgD-阿洛糖时，老鼠存活率增至70％。为了证实这一点，用各种各样的稀有糖及自然界中大量存在的糖(葡萄糖)作用于白血球，调查来自白血球的对产生活性氧的效果。对白血球产生的活性氧添加各种各样的糖，结果发现仅D-阿洛糖具有非常强的抑制产生活性氧的效果，可以认为这是D-阿洛糖能够保护内脏的一个原因。
发现这种对缺血的保护作用对小肠或脑神经细胞也有效。尤其神经细胞是经不起缺血的，海马神经细胞在缺血5分钟也会死亡。对老鼠的脑部进行5分钟缺血后，80％的海马神经细胞将死亡，但是，如果在缺血前用含有D-阿洛糖的溶液进行回流，那么经过5分钟缺血后仍有70％的海马神经细胞可以存活。但在D-阿洛酮糖的实验中没有发现这种作用。
进一步证实这种缺血保护作用有视网膜缺血保护作用、使皮瓣生存率显著上升的作用和肾缺血保护作用，由于谷氨酸分泌抑制作用而引起脑神经细胞的缺血保护作用。
本发明的发明人发现属于稀有糖的乙醛糖(六碳糖)具有抑制癌细胞增殖的作用。本发明可以提供以属于稀有糖的乙醛糖为有效成分的癌细胞增殖抑制剂，即，研究了对采用来源于人体癌细胞的株化细胞的癌细胞的增殖效果。在后叙实施例中表示有结果。如果将癌细胞撒放在碟中并给予充分的营养及氧，那么癌细胞将逐渐增殖。如果在其中添加D-阿洛糖，则可发现它具有很强的抑制增殖的效果。同样在肝脏癌细胞及皮肤癌细胞中也确认了这种效果。作为以D-阿洛糖为有效成分的癌细胞增殖抑制剂的用法，有口服、静脉注射、动脉注射、淋巴管内注射以及直接使用于患病部位。另外，在癌细胞增殖抑制剂中作为有效成分包括的物质不仅限于D-阿洛糖，可包括对癌细胞增殖具有抑制效果(癌细胞增殖抑制效果)的其他醛糖类稀有糖。
关于D-阿洛糖对白血球细胞的影响，进一步确认了D-阿洛糖对某些白血病的细胞增殖具有抑制作用，解释了D-阿洛糖对细胞周期的影响的机理，即，细胞增殖的抑制延长细胞周期中的G2-M周期。
其次，表示对己酮糖的生理活性的例子。
这种属于稀有糖的己酮糖不影响糖代谢，可以作为趋化因子抑制物质、微神经胶质游走抑制物质、胰岛素分泌促进物质以及抑制癌细胞增殖物质，通过口服、腹腔内注入、动脉注入等多种途径使用。另外，可在患病处或患病周围处不经口服而使用。在这种情况下，属于稀有糖的己酮糖可以单独使用，也可以添加对属于稀有糖的己酮糖作用无妨碍的添加剂，或与其它物质(药理活性成分)结合使用。
下面，针对各种用途，详细说明本发明的实施方式。
本发明的发明人发现属于稀有糖的己酮糖具有抑制趋化因子的分泌的性质。根据该性质，可以提供以属于稀有糖的己酮糖为有效成分的趋化因子分泌抑制剂或物质。
目前死因排在第一位的是动脉硬化症。作为动脉硬化症的危险因素，可以指出糖尿病、高血脂症、高血压等。根据最近的报告，这些危险因素与动脉硬化症的研究已经达到分子水平的解释。动脉硬化症发病的起因是单球向血管壁的游走、由scavengerreceptor引起的胆固醇的积累和巨噬细胞的泡沫细胞化。在这个过程中暗示有各种各样的细胞因子及趋化因子的参与。作为趋化因子(引起细胞游走的细胞因子)的一种的MCP-1(monocytechemoattractant protein-1)为在动脉硬化发病处的血管内皮细胞中分泌、与单球的游走有关的因子，该因子作为在动脉硬化进展中发挥重要作用的因子尤其受到关注。
在破坏MCP-1或MCP-1受体CCR2的老鼠中不易产生动脉硬化，明显可知MCP-1对动脉硬化发病起着重要作用。
MCP-1是被称为IL-1β或TNF-α的炎症性细胞因子刺激而分泌的。作为这种抑制细胞因子的产生的药剂有pyrazolotriazin衍生物药剂和nitric oxide(NO)分泌诱发剂，适用于内脏保存。
作为炎症性细胞游走因子和趋化因子的产生抑制剂，也市售有琥珀酸钠甲基氢化波尼松(药效副肾皮质荷尔蒙剂)(例如法尔码西亚公司、富士制药公司、UCB JAPAN公司、沢井制药公司)。
另一方面，有降低血液中胆固醇的作用的己糖磷酸钙(葡萄糖磷酸钙等)可以作为糖类或糖类衍生物的动脉硬化治疗剂，这已在特开昭63-198630号公报中有公开。
另外，在特开平10-330268号公报中公开有抑制胶原的合成的吡喃吡喃酮(ピラノピラノン)化合物。
但还不清楚属于稀有糖的己酮糖及其衍生物的MCP-1分泌抑制效果以及利用这种效果的抑制动脉硬化方面的内容。
根据本发明，则通过确定属于稀有糖的己酮糖具有MCP-1分泌抑制效果，由此可证实属于稀有糖的己酮糖的在动脉硬化中的有用性及在临床应用上的可行性。在下述实施例中，首先讨论一下因作为属于稀有糖的己酮糖的一种的D-阿洛酮糖的、对血管内皮细胞分泌出的MCP-1的影响。另外也讨论一下当存在刺激血管内皮细胞分泌MCP-1的细胞因子时D-阿洛酮糖对MCP-1分泌的抑制效果。
由此，暗示着属于稀有糖的己酮糖对MCP-1分泌进行抑制，由此可单独或与其它物质(药理活性成分)结合使用己酮糖来有效地预防或治疗动脉硬化症。另外，可作为糖尿病、高血脂症、高血压等疾病的预防物质和治疗物质。另外，可作为细胞游走因子和趋化因子产生抑制物质、副肾皮质荷尔蒙剂或者消炎药的替代物质利用。另外，可用于内脏保存剂。
D-阿洛酮糖促进胰岛素的分泌。试验中，使用分泌胰岛素的老鼠胰脏β细胞株，当逐渐提高生理分泌物质D-葡萄糖的浓度时，胰岛素的分泌也随浓度而增加。如果将D-葡萄糖的浓度置于零，提高D-阿洛酮糖的浓度，则与D-葡萄糖一样，发现按照浓度依赖性来分泌胰岛素的反应。另外，投入11.2mM的D-葡萄糖时胰岛素分泌达到最大，在该状态下如果再加入D-阿洛酮糖，则在加入到与D-葡萄糖相同浓度时会再次促进胰岛素分泌，胰岛素的分泌量都超过了只添加D-葡萄糖时的最大分泌量和只添加D-阿洛酮糖时的分泌量。
如上所述，稀有糖具有生理活性的事实陆续知晓了。当将稀有糖投放到细胞外时，可考虑以下几方面的可能性。(1)通过载体进入细胞内的可能性、(2)与受体结合的可能性、(3)由于稀有糖的存在而改变细胞代谢的可能性等。在上述任一种途径中，可能是信息传到细胞核，核的DNA转录发生变化，因而蛋白质的合成发生变化，其结果导致细胞功能的改变。从D-阿洛酮糖的胰岛素分泌的例子中也可以看到，与以往已知的机制不同的可能性很高。稀有糖的作用机制至今几乎没有人进行过研究，在这种情况下为了寻找其机制，认为必须采取综合分析在使稀有糖作用于已处理过的细胞或内脏中的信息通路的方法。
本发明的发明人进一步进行研究，发现了在胰岛素分泌促进作用中确定了以下内容用动物(老鼠)实验证明D-阿洛糖稳定控制血糖值的作用、D-阿洛酮糖在高血糖状态下有降低高血糖的作用和促进胰岛素分泌的作用、以及通过D-阿洛酮糖几乎不产生蛋白质的糖化作用。
以上是举例表示作为医药品的应用。另外知道，D-阿洛酮糖还具有抑制作为动脉硬化的恶化因子的趋化因子MCP-1的从血管内皮细胞的分泌效果，以及抑制肝脏中的脂肪合成的效果，可以对动脉硬化起预防作用。还具有以下的可能性血管生成作用、免疫抑制作用等各种生理活性效果。另外，作为稀有糖的用途，除医药品外，还可以举例食品、饮料、尤其是功能性食品(预防肥胖等)、化妆品、饲料、农药(植物生长调节剂、植物抗病害增强剂等)。
以提供可大大降低农药的使用量、增强植物抵抗病害作用的物质为目的，本发明的另一个研究组另申请了一项发明(特愿平2003-95827号)，即由稀有糖作用的植物病害抵抗增强剂。将稀有糖作为增强植物抵抗病害作用的物质来使用时的好处可以举出(1)低浓度(100μg/ml)的稀有糖水溶液，不需要展开剂就可以迅速启动抵抗性遗传因子，(2)虽然稀有糖在自然界中仅微量存在，但由于是“天然物质”，因此可以是安全性很高的撒放剂，(3)由于稀有糖对病原菌作用不是很强的杀菌作用，因此没有必要考虑发生耐性菌，(4)稀有糖不仅可以做成单独的药剂，而且也可以开发成与杀菌剂混合的商品。
食品、饮料、化妆品或饲料中的配合量没有特别的限制，但最好是用0.01-10的重量百分比。当作为医药品时，可以采用胶囊、粉末、片剂等形式口服，由于其具有水溶性，除口服外还可以采用静脉注射、肌肉注射等方法。使用量比如，根据糖尿病症状的程度和体重、年龄、性别等不同，在使用时，最好根据症状确定适当的量。医药品中的配合量也没有特别的限制，但优选的剂量是对应1kg的体重口服时为0.01-2,000mg、静脉注射时为0.01-1,000mg、肌肉注射时为0.01-1,000mg的程度。
另外，本发明的稀有糖在食品材料中微量存在，安全性高，如果开发大量生产的技术，则在成本方面也有很高的利用价值。另外，在急性口服毒性试验中稀有糖的含量是在5,000mg/kg以上。
本发明中的功能性食品适用于预防特定疾病(如预防肥胖)的健康食品和预防医药品等领域。作为预防特定疾病的健康食品，除必要成分稀有糖外，作为任意成分可以适量配合通常食品中所添加的维生素类、碳水化合物、色素、香料等。食品可以是液体或固体等任意形态，可以做成用胶等外包而进行胶囊化的软胶囊剂后食用。胶囊比如可以由胶皮膜做成，该胶皮膜是在原料胶中加水溶解后加入可塑剂(甘油、D-山梨糖醇)而调制出来。
本发明药剂中的有效成分稀有糖不局限于稀有糖本身，还可以以作为该药剂而允许的盐来使用。该药剂可以单独以稀有糖作为制剂使用，也可以使用加工成制剂组合物的药剂，在该制剂组合物中添加有制药上可使用的载体或稀释剂。这种制剂或药剂组合物可以通过口服或者非口服的途径投入。例如，口服用固体或流体(凝胶体或液体)的制剂或药剂组合物，可以采用药片、胶囊、片剂、丸剂、粉末、颗粒或凝胶调制品等形态。准确的制剂或药剂组合物使用量根据作为其目的的使用形态和处置时间而变，因此其使用量为主治医师及兽医认定的适当的量。口服和投入使用量根据制剂的形态而可适当调整。作为片剂等口服固体制剂和口服液等可以将一日服用量分成一次至数次服用。另外，在下述的制剂形态中，一次可服用一日服用量的1/2-1/10，所述制剂是指，比如，糖汁、含片、片状剂等的、幼儿一次服用后在局部起作用的同时，因内服而也在全身发挥作用的制剂，在这种情况下，总服用量达不到一日的服用量也是可以的。
相反，从药剂形态考虑，如果不是过量的服用容量，那么也可以将相当于一日服用的量配合成一次分量。在制剂的调制方面，可以使用普遍使用的填充剂、增量剂、结合剂、粉碎剂、表面活性剂、润滑剂、涂层剂、徐放剂等稀释剂和赋形剂。另外，还可以根据需要使用溶解补助剂、缓冲剂、保存剂、融化剂、等渗透压化剂、乳化剂、悬浮化剂、分散剂、增粘剂、凝胶化剂、固化剂、吸收剂、粘附剂、弹性剂、可塑剂、吸附剂、香料、着色剂、调料、抗氧化剂、保湿剂、遮光剂、光泽剂、防静电性等。
本发明可以提供利用稀有糖的消炎作用的皮肤外用剂、即，从治疗药、皮肤外用剂、化妆品中人们所知的具有改善和预防皮肤粗糙和粗糙度效果的皮肤外用剂。本发明的皮肤外用剂是以稀有糖为必须成分的，除此之外，根据需要可以适当配合一般化妆品或医药品等皮肤外用剂中所使用的成分，如水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增粘剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、防氧化剂、表面活性剂、香料、色剂、各种皮肤营养剂等。除此之外，还可以适当配合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属封锁剂，咖啡因、丹宁、异搏定、甘草抽取物、甘草黄酮、木瓜果实热水抽取物、各种生药、醋酸生育酚、甘草次酸、凝血酸及其衍生物或其盐类等药剂，以及维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸糖苷、熊果苷、曲酸、D-葡萄糖、D-果糖、海藻糖等。本发明的皮肤外用剂对剂型没有特别的要求，可以是一般皮肤外用剂所使用的任意形态，如软膏、面霜、乳液、化妆水、润肤膏等。
下面根据实施例对本发明的详细内容进行说明，但本发明不局限于以下实施例。
实施例1(稀有糖对培养细胞增殖的影响)在以下条件下，将各种稀有糖以50mM的浓度加入培养液中，观察稀有糖对株化癌细胞的增殖过程。
(1)添加对象细胞以肝脏癌细胞(HepG2)、子宫癌细胞(Hela)、卵巢癌细胞(OVCAR3)、皮肤角化细胞(HaCaT)作为添加的对象细胞。
(2)添加的稀有糖除了D-阿洛糖外，作为作比较的糖，在各添加对象细胞中添加了葡萄糖以及属于酮糖稀有糖的D-阿卓糖。另外，作为对照物采用了D-果糖。
(3)实验方法在96目多孔塑料板(井)中散布各种添加对象细胞3,000-5,000个，根据细胞种类在添加有5-10％的Featal BovineSerum(FBS)的媒介体中培养4-5日。将D-阿洛糖、D-葡萄糖、D-阿卓糖以50mM的浓度添加至各添加对象细胞中。以与上述浓度同样的50mM的浓度添加作为对照物的D-果糖。为了观察对细胞增殖的影响，每24小时用下述MMT法确认细胞数。
<MMT法>
①试验药品的配制将定量MMT(tetrazolium salt)用AutoCrepe杀菌的PBS(-)溶解后得到杀菌过滤的MMT溶液。作为酸性溶液，在定量SSD(20g)中加入N，N-二甲基甲酰胺50mL和水，做成100mL，再加入1N盐酸约200mL调整pH至4.7。室温保存，使用前将其温度升至37℃。
②试验方法用TEP处理细胞，调制细胞悬浮液。将该细胞悬浮液按定量(300-52000细胞/井)分别注入各井中(96井板培养基0.1mL)。作为药剂的糖按定量加入，在二氧化碳孵化箱中一天前培养。然后加入上述MMT溶液0.5mg/mL，在二氧化碳孵化箱中培养4小时后完全除去培养基。然后，在保持37℃的室温中添加0.1mL/井的酸性溶液，再装入在微板搅拌机上，在37℃下振动20分钟使其溶解(将formazan在酸性溶液中溶解)。用分光光度计在570-600nm波长范围内测吸光度。在染色物质酸性溶液中溶解后，再用感光板阅读器(プレ一トリ一ダ)测定。
(4)实验结果①肝脏癌细胞(HepG2)，图1表示肝脏癌细胞(HepG2)细胞数随时间的变化。从图1中可知D-阿洛糖对HepG2细胞的增殖有很强的抑制效果。虽然D-阿卓糖也有抑制作用，但比D-阿洛糖其癌细胞增殖抑制效果弱。葡萄糖几乎没有抑制效果。
②子宫癌细胞(Hela)，子宫癌细胞(Hela)细胞数随时间的变化如图2所示。由图可知D-阿洛糖对Hela细胞的增殖有很强的抑制效果。
③卵巢癌细胞(OVCAR3)，卵巢癌细胞(OVCAR3)细胞数随时间的变化如图3所示。由图可知D-阿洛糖对OVCAR3细胞的增殖有很强的抑制效果。虽然D-阿卓糖也有抑制作用，但比D-阿洛糖细胞增殖抑制效果弱。葡萄糖对癌细胞增殖有促进作用。
④皮肤角化细胞(HaCaT)，皮肤角化细胞(HaCaT)的细胞数随时间的变化如图4所示。由图可知D-阿洛糖对HaCaT细胞的增殖有很强的抑制效果。虽然其他的稀有糖能达到D-阿卓糖的中等程度的抑制作用，但比D-阿洛糖其癌细胞增殖抑制效果弱。由图1-图4可知，D-阿洛糖的对癌细胞增殖抑制效果根据不同种类而其强度不同。属于醛唐稀有糖的D-阿洛糖具有抑制癌细胞增殖效果，可以作为抗癌药剂加以有效利用。另外，与D-阿洛糖相比，作为酮糖的D-阿卓糖的抑制癌细胞增殖的效果较弱，由此，不仅D-阿洛糖，其他的醛糖稀有糖也可以用作抗癌药剂有效利用。
实施例2(D-阿洛糖抑制癌细胞增殖效果对浓度的依赖性)实施例2研究了D-阿洛糖抑制癌细胞增殖效果随浓度的依赖性。
(1)实验方法选择卵巢癌细胞(OVCAR3)作为添加对象细胞，分别以1mM，5mM，10mM，20mM，50mM，100mM的浓度添加D-阿洛糖。实验条件包括卵巢癌细胞(OVCAR3)培养方法、细胞计数方法(MMT法)等，均与实施例1相同。
(2)试验结果加入各种浓度D-阿洛糖的卵巢癌细胞(OVCAR3)的细胞数随时间的变化如图5所示。抑制癌细胞增殖的效果从10mM浓度开始确定，浓度为20mM、50mM、100mM时效果逐渐增强。即，确认了D-阿洛糖的抑制效果与浓度相关。抑制效果被确认的浓度在实施例2中的实验条件下(10％胚胎血清)为10mM，但是该有效浓度在其他细胞中也是一样的。进一步用显微镜观察投入D-阿洛糖后的细胞，结果几乎没有发现死去的细胞，该结果在锥虫蓝色素排泄试验中也被确认了。由本实验可知，D-阿洛糖虽然有抑制细胞增殖效果，但没有杀死细胞的作用。
实施例3(稀有糖对血液系癌细胞株增值的影响)本实施例是涉及以属于稀有糖的醛糖为有效成分的癌细胞增殖抑制物质。虽然有各种治疗肿瘤、抗癌药，但一般都有很大副作用。现在与药品的目标放在疾病的治疗相比，反而对目标放在预防疾病的药剂或食品(功能性食品)的意识和期待更高。关于糖和癌之间的关系，虽然有糖链和癌转移等的有关报告利用低聚糖的整肠作用解除便秘，具有不容易得大肠癌的效果的报告，以及近年来的agarisuku等多糖类具有抑制癌效果的报告等，但是几乎没有单糖本身具有抑制癌细胞增殖效果的报告。在本实施例中研究了属于稀有糖的醛糖、酮糖对各种株化癌细胞增殖的影响。由此确认了属于稀有糖的醛糖具有抑制株化癌细胞增殖的效果。属于对糖代谢没有影响的稀有糖的醛糖被确认为具有抑制株化癌细胞增殖的效果可期待将其作为副作用小的抗癌药、预防剂、增殖抑制剂。另外，属于稀有糖的醛糖可期待提高作为功能性食品的附加价值。另外，作为属于稀有糖的醛糖最有效的是D-阿洛糖。
(1)目的比较研究稀有糖对细胞株增值抑制效果。
(2)方法使用了Myeloid(HL-60，THP-1，KG-1)、T-cell(MT-2)、B-cell(Dau di，KS-1)合计六株细胞株、稀有糖3种(D-psicose，D-altrose，D-allose)。将培养液与各种细胞株做成共1ml、1×105个，用库尔特计数器计量第4天和第7天的细胞数。糖分别添加0.05、0.5、5、50mM，对照物用D-glucose。
培养基FBS10％添加RPMI1460培养条件37℃，5％CO2培养容器FALCON，MULTIWELL，12well培养日数7天糖浓度0.05、0.5、5、50mM(3)结果(图6-图11)6株细胞中HL60与Daudi细胞的效果被确认了，但是在其他细胞中无法确定其明显的影响。
1)如图6所示，可以看见psicose与allose的抑制，但在altrose中却没有发现。
①allose糖浓度越高，对第7天的细胞增殖抑制作用越有增加的趋势。0.05mM62.6％，0.5mM67.7％，5mM41.5％，50mM30.7％.(将glucose作为100％)②psicose细胞增殖抑制与糖浓度无关，几乎没有变化。0.05mM84.7％，0.5mM80.7％，5mM84.2％，50mM93.6％.(将glucose作为100％)2)如图7所示，对allose有抑制效果，但psicose与altrose却无法确定。
①allose糖浓度越高，对第7天的细胞增殖抑制越有增加的倾向。0.05mM85.9％，0.5mM80.6％，5mM62.2％，50mM3.9％.(将glucose作为100％)3)如图8及图9所示，allose 50mM时发现了有细胞增殖抑制效果，但是在其他糖及浓度中没有发现明显的抑制效果。
4)如图10及图11所示，包括对照糖在内的全部糖及各种浓度都有抑制效果，由此推测糖对这些细胞没有特定影响。
由上述可知D-allose对HL60，Daudi，KS1，KG1等四种细胞均有抑制效果，并且在所使用的稀有糖中抑制效果也是最强的。还可以确认对不同细胞种类D-allose有不同的效果。
实施例4(D-阿洛糖对细胞周期的影响)(1)目的在各种各样的糖的试验中，在mM浓度下只有D-阿洛糖具有抑制癌细胞增殖的效果。由于其作用机制还不清楚，因此研究D-阿洛糖对细胞周期的影响。
(2)方法用流式细胞测量计进行了分析。所使用的细胞是OVCAR-3(卵巢癌)细胞。
1)细胞用胰蛋白酶进行处理，调制了细胞悬浮液。
2)在直径为100mm的plastic tissue中散布细胞，在CO2孵化箱中培养24小时(overnight)。
3)一个添加稀有糖(D-阿洛糖50mM)，另一个不添加稀有糖(用D-葡萄糖作对照)，均培养三日。
4)分离出的细胞用PBS(-)冲洗两次。
5)离心后加入3ml PBS(-)后用吸液管进行搅拌。
6)加入7ml100％ethanol后，在4℃下固化2小时。
7)以1500rpm离心5分钟。
8)用Cold PBS(-)冲洗两次。
9)离心后，添加RNase200ug/ml，在37℃下孵化30分钟。
10)添加0.5mlPI(propidium iodide)孵化15分钟。
11)用流式细胞测量计测定。
(3)结果添加D-阿洛糖的细胞在细胞周期的G2-M期的细胞率为22.6％，明显多于对照中的细胞率12.6％(图12)。
(4)观察1)由于至今为止几乎没有对稀有糖进行研究，因此现在对其生理功能也是处于未知状态。其中D-阿洛糖具有抑制癌细胞增殖的效果是至今也完全不清楚的新课题。2)对其机制还没明确，但通过这次研究发现具有延迟细胞周期G2期的效果。
实施例5(稀有糖对白血球产生活性氧的影响)按以下条件，研究了各种稀有糖对白血球产生活性氧的影响。在此，根据L012化学发光研究了稀有糖对白血球产生活性氧的作用。
(1)添加对象白血球采用老鼠白血球(颗粒球)。
(2)添加的稀有糖除作为醛糖稀有糖的D-阿洛糖外，作为比较用的其他稀有糖，采用了作为酮糖稀有糖的D-阿洛酮糖和D-阿卓糖、多元醇的塔罗糖醇，并且还用了自然界中大量存在的糖D-葡萄糖与D-果糖。
(3)实验方法①老鼠白血球活性氧的产生随时间变化...研究了由于向老鼠白血球(颗粒球)加入zymosan粒子而产生的活性氧随时间的变化。并研究了因存在各种稀有糖而引起的活性氧产生的随时间的变化。
②稀有糖对活性氧产生的影响...对白血球活性氧产生系统中加入各种糖并测量产生量。添加的糖浓度均为10mM。之前测定没有添加糖时的产生量。
③稀有糖对活性氧产生的作用...向白血球添加zymosan，噬菌作用开始产生活性氧后，分别添加10mM浓度的各稀有糖。
④D-阿洛糖对活性氧抑制效果的浓度依赖性...研究了D-阿洛糖对活性氧产生抑制效果的浓度依赖性。分别添加0mM、5mM、10mM浓度的D-阿洛糖。
(4)实验结果①老鼠白血球活性氧产生随时间的变化...研究向老鼠白血球(颗粒球)添加zymosan而产生的活性氧随时间的变化，结果如图13所示。由图可知活性氧的产生在2-3分钟时达到了峰值，之后逐渐减少。另外，该结果在稀有糖的存在下也没有发生变化。
②稀有糖对活性氧产生的影响...添加各种糖后测定产生量的结果如图14所示。由图可知只有D-阿洛糖对活性氧产生有抑制效果(n＝4)。包括葡萄糖在内的其他稀有糖(D-阿洛酮糖、D-阿卓糖、D-塔罗糖醇)均无抑制效果。
③稀有糖对活性氧产生的作用...开始产生活性氧后添加稀有糖的实验结果如图15所示。向白血球添加zymosan，噬菌作用开始产生活性氧后，添加10mM浓度的稀有糖时发现D-阿洛糖有抑制效果。从实施例5中可知活性氧的产生随时间变化与稀有糖的存在无关。并且可知，在研究的稀有糖中在D-阿洛糖具有特定的抑制活性氧产生的效果(活性氧产生抑制效果)。
④不同浓度D-阿洛糖度活性氧产生抑制效果的实验结果如图16所示。由结果可知，在这一系列浓度中，在5mM时无抑制效果，到了10mM开始出现50％以上的抑制效果，由此可确认D-阿洛糖的有效浓度在10mM左右。另外，从实施例10及实施例5中可知D-阿洛糖具有抑制活性氧产生的作用。由此推测其他的醛糖也有这种作用，应通过以后课题的研究证实。
这种活性氧产生抑制效果对于与广泛的活性氧有关的病态和疾病有效，可应用于今后的治疗药、功能性食品、外用剂等。比如可应用于，脑神经疾病(暂时性脑缺血发作、脑中风、帕金森综合症、外伤性癫痫症、脊椎损伤等)、心血管系病变(动脉硬化症、缺血性心肌损伤等)、呼吸道疾病(Adult respiratory distresssyndrome(ARDS)、间质性肺炎、肺纤维症、病毒性肺炎等)、消化道疾病(胃粘膜病变、肝缺血和再循环障碍、黄疸疾病、胰脏炎等)、肾疾病(肾小体肾炎、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、尿毒症等)、糖尿病、癌、眼科疾病(视网膜变性、未成熟儿视网膜症、白内障、眼炎症、角膜疾病等)、皮肤疾病(遗传过敏性皮炎、斑点、雀斑、色素沉着、皮肤老化等)、胶原病等治疗药，以及作为其他用途可应用于内脏保存剂、各种内脏干细胞保存剂、精子和卵子保存剂。另外，在本实施方式中，作为醛糖稀有糖用了D-阿洛糖，但其他具有活性氧产生抑制效果的醛糖稀有糖也可以应用于上述用途。
实施例6
(稀有糖对视网膜缺血和再循环障碍的效果)(1)目的对于暂时性眼缺血模型(老鼠)讨论D-阿洛糖对视网膜的影响。
(2)方法暂时性眼缺血样模型是将眼压提高到120mmHg而制成的。进行45分钟的缺血后，进行了再循环。微透析法测定缺血再循环时放出的谷氨酸浓度。
(3)结果如图17所示，在缺血前向静脉注入D-阿洛糖(200mg/kg体重)，与对照试验(没有注入D-阿洛糖)相比，前者缺血时抑制了谷氨酸的浓度，并且再循环时完全抑制了谷氨酸浓度。
(4)讨论与海马神经细胞一样，在视网膜缺血再循环障碍中，有由大量谷氨酸放出而引起神经毒性的现象。D-阿洛糖具有抑制谷氨酸放出效果，强烈地暗示着D-阿洛糖有视网膜神经保护作用。
实施例7(稀有糖(D-阿洛糖)对皮瓣缺血再灌注障碍减轻效果的实验)(1)目的本发明的发明人们在至今为止的基础研究中，一直从事岛状皮瓣缺血再灌注后的皮瓣坏死及游离皮瓣远位部坏死机制的解释工作。结果发现岛状皮瓣缺血再灌注后的皮瓣坏死及游离皮瓣远位部坏死与活性氧有关。另外，暗示着岛状皮瓣缺血再灌注后的皮瓣坏死及游离皮瓣远位部坏死与造成血肿和炎症产生的活性氧有关。本实施例7的第一目的为，要获得稀有糖对活性氧产生抑制作用的基础数据，第二目的为，以有效预防岛状皮瓣及游离皮瓣坏死的临床应用。另外，第三目的为，应用长期保存游离皮瓣、断肢的保存液和开发重新开始血液循环后的再灌注障碍的预防方法。
(2)实验方法1)向威斯特系老鼠( 7-8周、300g以下)的腹腔内注入戊巴比妥(耐波他)进行麻醉。
2)用电推子将腹部的毛剃掉。
3)在左腹部制作以左大腿动静脉作为血管茎的3×5cm岛状皮瓣。
4)一起抬上的皮瓣用4-0尼龙线缝回原位。
5)药剂(均用0.6ml)经右大腿静脉一次性注入。注入的药剂为各种浓度的D-阿洛糖、葡萄糖(0.2mg/g)、生理食盐水。
6)注入药剂后等待15分钟，之后将血管茎与动静脉夹紧。夹子使用了两个血管夹(静脉用60g)。
7)用激光多普勒血流计确认血液循环是否完全阻塞。
8)8小时后移走夹子。同样用激光多普勒血流计确认血液循环已开始。
9)一周后判断皮瓣的生死。
10)用数码相机拍摄后导入计算机，并用面积计算软件计算着生面积(％)。
(3)实验组有下述6组，各组均为n＝151)D-阿洛糖150mg(0.5mg/g)2)D-阿洛糖60mg(0.2mg/g)3)D-阿洛糖30mg(0.1mg/g)4)D-阿洛糖15mg(0.05mg/g)5)D-葡萄糖60mg(0.2mg/g)6)生理食盐水(对照物)(4)结果(图17-图20)图18表示着生面积(％)的全部数据，图19表示了方差分析(一元配置)的结果，图20表示了平均值与标准偏差，图21表示了多重比较检验(Fisher`s PLSD)的结果。多重比较检验中p＜0.05，由此可知有显著差异。
注入D-阿洛糖30mg(0.1mg/g)以上的1)、2)、3)的三个组，比注入生理食盐水的组6)均具有统计上的显著差异。另外，1)、2)的两组比投入葡萄糖的组5)也有统计上的显著差异。但是，注入15mg(0.05mg/g)的D-阿洛糖的4)，与注入生理食盐水的组6)及注入葡萄糖的组5)相比，没有明显的统计差异。注入葡萄糖的组5)与注入生理食盐水的组6)相比没有明显的统计上的显著差异。由此可知，D-阿洛糖与D-葡萄糖不同，其具有延长皮瓣着生面积的效果，可以说这种效果的产生需要注入30mg(0.1mg/g)以上。
(5)讨论通过上述实验证明了D-阿洛糖具有皮瓣缺血再灌注障碍的减轻效果。有必要验证这一机制是通过何种作用而引起的。我们认为D-阿洛糖可能具有抗氧化作用。为了证明这一点有必要测定各种氧化负荷指标。首先由TBA(硫巴比妥)法连续测定皮瓣组织中的过氧化脂质。并且还有必要测定4-hydroxy-2noneal-modified protein(由HNE的免疫染色测定)、白血球数(由HE标本测定)等其他参数。
了解了作用机理的基本内容，就可以讨论以什么时机注入为最有效。现在是皮瓣一起抬上后(夹紧皮瓣的血管茎的15分钟之前)由静脉注入全身，但应该继续做在血管茎夹子解除前向全身或局部注入的实验。另外，应该还讨论适宜投入量，在确定了适宜投入量和最有效的投入方法(时机)后，有必要与已知的抗氧化剂(SOD、别嘌呤醇等)比较效果。今后的发展趋势是开发具有皮瓣保护作用的注射药及软膏。如果能开发出有效的预防皮瓣坏死的药剂，则有关皮瓣手术成功率将极大地提高。如果可以保存断肢，紧急手术时不需要进行再接手术，可以作为等待手术定期进行。
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实施例8(稀有糖对老鼠肾缺血再灌注障碍的效果)(1)目的对于伴有休克、肾缺血的手术等，急性肾衰竭是对病后健康带来严重影响的严重并发症之一。因此，至今为止对肾缺血性障碍而言，已经研究了ischemic preconditioning及各种药物的有效性。这一次用老鼠肾缺血再灌注障碍模型研究了稀有糖对肾缺血性障碍的效果。
(2)方法对象体重300g左右的雄性老鼠。
实验方法把老鼠用耐波他麻醉后制成肾缺血模型。
肾缺血把右肾摘除后，夹住左肾血管45分钟制作而成。
使用药剂D-阿洛糖、D-阿洛酮糖(均400mg/kg)，在肾缺血状态30分钟前注入到静脉。
测定项目对障碍性因子cytokine-induced neutrophilchemoattractant(CINC)-1mRNA(再灌注2小时后)的出现量的影响。
(3)结果(图22)RNA分析方法(ノ一ザンブロツテイグ)的结果如图22所示。再灌注2小时后，可以看出CINC-1mRNA的出现量与阿洛糖、阿洛酮糖一起减少。
(4)讨论本实施例8中，只是1次初步实验的结果，因此以后有必要进行多次重复的必要浓度等的效果的研究。不仅要研究CINC-1mRNA的出现量，还要研究对CINC-1蛋白的影响。只要能够证明稀有糖对引起肾缺血性的障碍因子的有效性，有望开发伴有休克、肾缺血等症状的手术等的新治疗药及输液制剂。
实施例9(对稀少糖的脑缺血保护作用的研究)(1)目的我们知道，暂时性的脑缺血将导致海马神经细胞的死亡。虽然还没有明确其原因，但已提出几种有可能的假说，现在许多人正在为证明这些假说而进行研究。我们也在用这些模型进行研究，但是已明确了D-阿洛糖的提前注入可抑制细胞死亡，而且明确了更加详细的用药量及作用机理的一部分。
(2)方法采用砂鼠，闭塞两侧总颈动脉5分钟。对一周后已死的砂鼠，根据常用方法，做成切片，用苏木精和曙红染色。在显微镜下数海马的神经细胞的数目并测算残存率。分别实验正常的对照组、仅缺血的组、缺血前注入200mg/kg的D-阿洛糖或D-阿洛酮糖的组，从而确定随着缺血而被大量排到细胞外的谷氨酸对神经细胞具有毒性。为了证明这一点，用脑定位固定装置把砂鼠固定后，将在海马中溶解氧化酶液体在微透析用中锦缎中回流，实时测定了海马神经细胞外的谷氨酸浓度。在缺血前，又进行了将D-阿洛糖和2-脱氧葡萄糖的注入实验，确定缺血带来的葡萄糖的代谢与D-阿洛糖的作用机理的关系。
(3)结果D-阿洛糖抑制了缺血导致的神经细胞的死亡。但没有发现D-阿洛酮糖的这一抑制效果(图23)。随着缺血，海马细胞中谷氨酸以二相性地分泌(图24)。第一个峰是缺血时出现，第二峰是缺血完后过回流时出现，这个过环流维持一个小时，发明人认为在这个过环流时期神经细胞受到障碍。缺血前注入时在第一个峰中虽然被抑制，但该抑制程度为25％左右，但是，第二峰是因D-阿洛糖的注入强烈抑制到90％左右(图24)。而且，观察到了与非代谢性的D-葡萄糖有关的2-脱氧葡萄糖也有同样的效果(图25)。
(4)讨论我们知道，D-葡萄糖是神经活动必须的，但过量会对细胞产生毒性。而且，像缺血这样给强烈负荷及断开活性氧供给的情况，会发挥强烈的细胞毒性，这可能就是随着活性氧的产生而带来的细胞障碍。可能是由于D-阿洛糖对D-葡萄糖产生有一定的影响，从而抑制了神经细胞的死亡。这可以通过非代谢性2-脱氧葡萄糖的注入也带来同样的效果而证明。脑缺血中D-葡萄糖的消耗不仅在神经细胞中发生，而且在星状神经胶质中也发生，显示了两者争夺D-葡萄糖的可能性。有报告指出在星状神经胶质中的D-葡萄糖的消耗的最终产物，与神经不同，蒹氧代谢系统起作用，放出乳酸。有原始数据显示，实际上可观察到缺血时的乳酸分泌，从而可以推测D-阿洛糖作用部位的一部分可能是星状神经胶质细胞。谷氨酸的第二个峰值有可能是活性氧所引起的。
实施例10(己酮糖对与动脉硬化恶化相关的趋化因子MCP-1分泌的抑制作用)将人体血管内皮细胞(HUVECs)用常用方法在培养液(DMEM+10％FBS)条件下进行细胞培养。HUVECs以70％的浓度分别注入96孔培养皿，提供于以下的实验。
(实验1)分别将浓度为0mM、5.6mM、11.2mM的D-阿洛酮糖加入HUVECs的培养液，培养24小时后，用ELISA(酶联免疫吸附测定)(Quantikine，R&D)工具测定培养液中的MCP-1，结果如图26所示。
(实验2)用可以刺激MCP-1的细胞因子、IL-1β(最大分泌刺激浓度lng/ml)及TNF-α(最大分泌刺激浓度10ng/ml)作用于HUVECs 1小时进行前处理，然后添加D-阿洛酮糖，浓度分别为0mM、5.6mM、11.2mM，在培养液中培养24小时后，用ELISA(酶联免疫吸附测定)工具测定MCP-1的浓度，结果如图27所示。由图26可知关于血管内皮细胞中的MCP-1的基础分泌，D-阿洛酮糖依赖浓度抑制MCP-1的分泌。细胞因子(TNF-α、IL-1β)刺激在血管内皮细胞中的MCP-1的分泌，最大刺激浓度分别为IL-1β 1ng/ml，TNF-α10ng/ml。由图27可知，用IL-1β(1ng/ml)刺激血管内皮细胞将会分泌MCP-1，并且可以知道，该分泌是因所添加的D-阿洛酮糖而依赖浓度地进行抑制。
一般来说，作为对各种血球成分具有游走活性的细胞因子的趋化因子之一的MCP-1对单球具有游走活性，生理上对炎症病原中的单球和巨噬细胞的聚集起到重要的作用。另外，在临床上的动脉硬化巢的形成中，出现血管内皮细胞障碍之后，对形成泡沫细胞的细胞成分的游走起着重要的作用。最近，有人指出在动脉硬化巢的免疫染色中，指出了动脉硬化病变中的MCP-1的过剩出现。
由以上实验可确定，从血管内皮细胞分泌的趋化因子MCP-1受到属于稀有糖的己酮糖的抑制。而且发现动脉硬化巢中的MCP-1的出现通过各种细胞因子而刺激，特别是IL-1β，TNF-α是重要因子。通过以上的实验暗示，属于稀有糖的己酮糖至少抑制了由IL-1β引起的MCP-1的分泌刺激。
已指出，MCP-1在动脉硬化病变形成中起着重要作用，属于稀有糖的己酮糖的对MCP-1分泌的抑制作用从预防动脉硬化的观点来看也重要，可以用于治疗动脉硬化的有益的物质(例如，动脉硬化治疗物质或预防物质)。
从这些结果可得出，属于稀有糖的己酮糖可利用于单独作为抑制MCP-1分泌的物质的用途。另外，如果研究其衍生物和配糖体，则暗示着可作为抑制MCP-1分泌的物质。另外，有指出MCP-1不仅与动脉硬化有关，还与其它疾病的发病有关的内容。例如，有指出引起慢性关节风湿病的在关节中的炎症与MCP-1有关。还有，在哮喘等肺疾病中也通过单球的游走以及单球和巨噬细胞的活性化与形成疾病有关。对于这种局部炎症及与单球和巨噬细胞有关的疾病，属于稀有糖的己酮糖可能控制其疾病的活动性，有望作为广泛的疾病的治疗药而应用。
实施例11(己酮糖对微神经胶质游走的抑制作用)实施例11涉及以属于稀有糖的己酮糖为有效成分的微神经胶质游走抑制物质。如果活体的内脏长时间血液不通而陷入缺血状态，就会坏死。缺血状态在内脏手术时暂时隔断血流手术完后再开始血流时必定发生。还有，在内脏器官移植中取出和保存内脏器官并移植内脏器官时也是如此。内脏器官保存方法有单纯冷却法、持续灌注法、冻结法等，现在临床中应用最多的为单纯冷却法。该方法是一种在内脏器管摘出时用保存液灌注、摘出后同样用冷却的保存液浸渍的方法。现在由Belzer们的Wisconsin大学外科组开发的University of Wisconsin(UW)液可将保存时间延长很多，成为主要使用的保存液。但是在对保存完的血液进行再注入时，会出现因活性氧、细胞外蛋白酶及细胞因子等引起内脏障碍性的变化。为了抑制这种现象为目的被提倡采用下述方法，将各种药剂(pyrazolotriazin衍生物药剂，nitric oxide(NO)分泌诱发剂等)添加到灌注液里，但在临床上还不是很充分(松本光司J NipponMed Sch第68卷第3号、2001年)。
因此，在实施例11中，通过确认属于稀有糖的己酮糖对微神经胶质游走的抑制效果来研究属于稀有糖的己酮糖对脑脏器官保存上的有用性及在临床上的应用可行性。
在以下的本实施例11中研究一下属于稀有糖的己酮糖对因缺血而出现微神经胶质的数量的影响。通过这一点暗示以下内容属于稀有糖的己酮糖通过使微神经胶质的出现量减少，由此在脑脏器官的有用性及脑治疗的临床应用上有效。属于稀有糖的己酮糖使用D-阿洛酮糖。作为脑缺血模型，使用体重约70g的雄性砂鼠，两侧总颈动脉结扎5分钟。在此模型中，脑的海马CAl领域的神经细胞特异地引起缺血性的细胞死亡。
对分成未进行缺血处理的对象(对照物Sham)、进行缺血+生理食盐水处理、进行缺血+D-阿洛酮糖处理的3个组进行了比较研究。
作为D-阿洛酮糖处理，在生理食盐水中溶解D-阿洛酮糖，做成200mg/ml的D-阿洛酮糖溶液，分别按200mg/kg的浓度在缺血前5分钟和缺血后立即经大腿静脉注入到缺血模型中。作为生理食盐水处理，仅用生理食盐水来代替使用D-阿洛酮糖液进行同样的注入操作。缺血后1周灌注固定，做成20μm厚的冻结切片，并进行苏木精和曙红染色。
结果如图28所示，炎症细胞微神经胶质的出现量随着D-阿洛酮糖的增加而减少，由此可知D-阿洛酮糖具有抑制微神经胶质游走的作用。这一缺血模型中，D-阿洛酮糖抑制了炎症细胞微神经胶质的游走。我们知道在暂时性脑缺血时，作为海马神经细胞死亡引起的症状，伴随有记忆障碍。关于脑缺血引起的神经细胞死亡中已指出有，即使用药剂及低体温疗法等来暂时抑制缺血性神经细胞死亡后，也会作为脑神经胶质细胞的一种的微神经胶质放出谷氨酸及活性氧，与治疗后的慢性细胞的死亡相关。因此，抑制这样的微神经胶质的作用也可以说对脑缺血的保护及移植时的保存有用。因此，有望通过D-阿洛酮糖与药剂和低体温疗法等的其他治疗法并用来提高该治疗效果。
实施例12(己酮糖的降血糖作用)本实施例涉及以属于稀有糖的己酮糖为有效成分的降低血糖作用的物质。如果包括耐糖能力异常，则糖尿病是其总人数远远超过1000万人的公民病。糖尿病的实际状态是因葡萄糖的特定胰岛素分泌不全，是一种因从胰脏分泌的胰岛素减弱和该作用不全而引起的代谢疾病。一般作为促进胰岛素分泌的药剂，有磺胺尿素药和苯丙氨酸衍生物等糖尿病治疗药，但存在着副作用大等问题。在本实施例12中研究了属于稀有糖的己酮糖对糖尿病的有用性及在临床应用上的可行性。首先，研究一下属于稀有糖的己酮糖对胰β细胞的胰岛素分泌刺激能力，以及在葡萄糖和属于稀有糖的己酮糖共存的条件下的、胰β细胞的分泌胰岛素动态。另外，因为葡萄糖是通过食物消化分解后肠道吸取而供给的，所以用肠道研究属于稀有糖的己酮糖在葡萄糖吸收的影响。通过下述内容属于稀有糖的己酮糖对胰岛素分泌有促进效果，特别通过与葡萄糖并用可以叠加地(增加性地)促进胰岛素的分泌，而且不影响糖代谢的、属于稀有糖的己酮糖能够抑制葡萄糖的吸收，由此暗示着属于稀有糖的己酮糖对糖尿病的预防或治疗有用。
根据常用方法在培养液(DMEM+10％FBS)的条件下对胰岛瘤的来源胰β细胞株INS-1进行细胞培养。把INS-1以70％的密度分别注入96孔培养皿，用于以下实验。属于稀有糖的己酮糖使用D-阿洛酮糖。
(实验1)使培养液中葡萄糖的浓度分别为2.8mM、5.6mM、11.2mM、16.7mM，经24小时培养后，用ELISA(レビス、インスリンキット)测定胰岛素的浓度。结果，胰岛瘤的来源胰β细胞株INS-1细胞与培养液中葡萄糖浓度进行反应而刺激了对胰岛素的分泌。这一分泌刺激在葡萄糖浓度为11.2mM时达到了稳定状态。
(实验2)将培养液中D-阿洛酮糖的浓度分别改变为0mM、2.8mM、5.6mM、11.2mM、16.7mM时，用ELISA法测定培养液中胰岛素的浓度，结果如图29所示。对胰β细胞株INS-1细胞用不同浓度的D-阿洛酮糖进行刺激，结果发现胰岛素分泌具有浓度依赖性。这一分泌刺激在D-阿洛酮糖的浓度为11.2mM时达到了稳定状态。
(实验3)将基于葡萄糖的胰岛素的分泌达到稳定状态时的葡萄糖浓度定为 11.2mM，再加入D-阿洛酮糖使阿洛酮糖的浓度分别为2.8mM、5.6mM、11.2mM、16.7mM，培养24小时。研究由胰β细胞株INS-1细胞分泌的胰岛素的状况，结果与图29一起显示。结果发现尽管基于葡萄糖的胰岛素分泌刺激达到最大时，如果增加D-阿洛酮糖的浓度，则进一步叠加地刺激培养液中胰岛素的分泌。
(实验4)为了研究D-阿洛酮糖对吸收葡萄糖的影响，用老鼠的肠管分析了D-阿洛酮糖对吸收葡萄糖的影响。葡萄糖的吸收，是通过借助根据葡萄糖氧化酶法的定量法隔开肠道粘膜测定外部与内部的浓度来进行分析。通过使D-阿洛酮糖与葡萄糖并存而测定葡萄糖的吸收怎样变化的情况。另外，用长时间注入D-阿洛酮糖的老鼠肠道同样地分析糖的吸收系统怎样变化的情况。
如图30所示，在含有葡萄糖的缓冲液中浸渍老鼠的反转肠道，过一段时间对浆膜侧溶液采样并测定葡萄糖的浓度。添加不同浓度的D-阿洛酮糖，研究D-阿洛酮糖对从粘膜侧到浆膜侧输送葡萄糖影响，结果如图31所示。
结果显示，如果在老鼠反转肠道中添加与葡萄糖同浓度的D-阿洛酮糖，则可有意地抑制浆膜侧葡萄糖浓度的上升。这暗示D-阿洛酮糖的添加有可能影响葡萄糖的输送系统。根据以上结果可确定，属于稀有糖的己酮糖对胰β细胞的胰岛素分泌有刺激作用。在得到胰岛素最大分泌刺激的葡萄糖浓度下，再添加属于稀有糖的己酮糖，可观察到有更多的胰岛素分泌。一般来说，糖尿病的实际状态是因葡萄糖的特定胰岛素分泌不全，在基于葡萄糖的胰岛素分泌不全的情况下，也有望通过属于稀有糖的己酮糖的作用有效地促进胰岛素的分泌。由此可知，属于稀有糖的己酮糖具有胰β细胞株分泌胰岛素的刺激作用和在高血糖状态下增强胰岛素分泌的作用，可将属于稀有糖的已酮糖作为至今为止未曾有过的、具有新作用机理的物质。另外，对临床中确诊为高血糖病的糖尿病患者来说，可期待属于稀有糖的己酮糖促进胰岛素的分泌，并改善其血糖值的情况。另外，经肠道注入的属于稀有糖的己酮糖能够抑制葡萄糖的吸收的情况和属于稀有糖的己酮糖不影响糖代谢的情况，可以抑制糖尿病中的饭后血糖过量的情况，可做成糖尿病的预防和治疗的有效药物。而且，在属于稀有糖的己酮糖中还确认了与糖尿病及其并发症有关的动脉硬化的预防效果，糖尿病致死的主要原因是动脉硬化，因此同时具有抑制动脉硬化作用的属于稀有糖的己酮糖有望成为改善血糖值和预防动脉硬化症的具有划时代意义的糖尿病治疗药。不仅如此，属于稀有糖的己酮糖还可成为有以上治疗效果和减肥功效等的健康补助食品。
实施例13(稀有糖注入对老鼠血糖的影响)(1)目的有报告指出，稀有糖尤其是D-阿洛酮糖的注入，可抑制在D-果糖的长期大量注入负荷下发生的高胰岛素血症。这次我们观察了正常老鼠的血糖值随着注入稀有糖的变化。
(2)方法1)稀有糖的注入对SD雄鼠(体重300g左右)进行20～24小时绝食后用于实验。把耐波他(58mg/kg B.W)投药到老鼠的腹腔内，在麻醉状态下切开颈部，在颈静脉放置硅管，在这管中接1ml注射器，注入稀有糖。
2)采血用1ml注射器从在颈静脉中插入的硅管中采血。采血是在注入稀有糖之前和注入的5，10，15，20，25，30，60，120，180，240分钟后分别进行的。
3)血糖测定采样血液中的血糖值，由小型电极式血糖测定器アントセンスII(バイエルメデイカル)来确定。
(3)结果1)在麻醉状态下注入生理食盐水的对血糖的影响(图32)先给3只老鼠仅静脉注入生理食盐水(0.7ml)，观察麻醉等对血糖值的影响。结果在仅注入生理食盐水中没有发现血糖值的很大的变化。
2)在麻醉状态下注入D-葡萄糖的对血糖值的影响(图33)把D-葡萄糖(200mg/kg BW)注入颈静脉，测定注入前后的血糖值(N＝2)。血糖值随着D-葡萄糖的注射有暂时性的上升，过60分钟左右后接近了正常值。
3)注入D-阿洛酮糖的对血糖值的影响(图34)将老鼠在麻醉状态下静脉内注入阿洛酮糖(200mg/kg BW)，测定血糖值(N＝4)。其中有两只的血糖值在注入稀有糖30～60分钟后减少，随后慢慢恢复。但其它两只在血糖降低状态过后，与初值相比升高或几乎无变化。
(4)讨论通过本实施例13中使用的正常老鼠麻醉状态下的实验体系，确认了用耐波他麻醉及生理食盐水注入于静脉内对D-葡萄糖负荷无影响。在本实施例13的实验中，半数的老鼠随着注入D-阿洛酮糖，其血糖值在注入后30～60分钟内降低，此后慢慢恢复。剩下的老鼠前期血糖降低此后是上升，或者是慢慢地降低。由此可知，虽然有个体差别，但是在正常老鼠中通过稀有糖(D-阿洛酮糖)起着轻度的降低血糖作用。有必要今后增加实验动物的数量，分析这些数据。而且还有必要研究对高血糖老鼠的作用。在同时进行的D-阿洛糖的实验中，没有发现血糖降低。
实施例14(酮糖对高血糖状态的改善效果)(1)目的如果包括耐糖能力异常，则糖尿病的总人数远远超过1000万人，成为公民病。糖尿病的实际状态是，因葡萄糖的特定胰岛素的分泌不全。因此这次我们研究了稀有糖，尤其是属于酮糖的D-阿洛酮糖对糖尿病的有用性及临床应用的可行性。到目前为止，对由醛糖引起的胰β细胞胰岛素的刺激能力用in vitro进行了研究。这一次的研究是采用没有麻醉没有限制的老鼠研究D-阿洛酮糖对胰岛素分泌能力和糖代谢的影响，本研究中用in vitro验证了醛糖的胰β细胞中的胰岛素的刺激作用以及在高血糖状态下醛糖对胰岛素的分泌增强作用。由此其目的在于，研究今后醛糖作为在糖尿病中的预防和治疗药物的可能性。
(2)方法1)颈静脉葡萄糖负荷实验(IVGTT)...用8周大的SD雄性老鼠在颈静脉处插入导管实施IVGTT。3只老鼠使用稀有糖，3只老鼠使用葡萄糖来进行实验。
原始数据1用0.5g/kg(0.5g/1000g＝500mg/1000g＝0.5mg/g)进行IV。
制备2ml的0.5g/ml(0.5g/1000ul＝500mg/1000ul＝0.5mg/ul)浓度的稀有糖与葡萄糖溶液。
对200g的老鼠静脉注射(IV)200ul该溶液。
对250g的老鼠静脉注射250ul该溶液。
IV后注入生理食盐水300ul。
取血150ul作为血液样本。
实验前进行16小时禁食处理，可以饮水。
取血时间为0、5、10、15、20、25、30、45、60分钟等9个点。
2)阿洛酮糖对高血糖的影响。
在8周大的雄SD老鼠的颈静脉中插入导管以20分钟的间隔注入50％葡萄糖，使其变成高血糖状态，用阿洛酮糖及脱氧葡萄糖实施IVGTT，一只使用稀有糖，一只使用葡萄糖。
原始数据2用0.5g/kg(0.5g/1000g＝500mg/1000g＝0.5mg/g)进行IV。
制备2ml的0.5g/ml(0.5g/1000ul＝500mg/1000ul＝0.5mg/ul)浓度的稀有糖与脱氧葡萄糖溶液。
对200g的老鼠静脉注射(IV)200ul该溶液。
对250g的老鼠静脉注射250ul该溶液。
IV后注入生理食盐水300ul。
取血150ul作为血液样本。
取血时间为0、5、10、15、20、25、30、45、60分钟等9个点。
(3)结果IVGTT，用葡萄糖做对照。如图35所示，如果加载葡糖则血糖值上升。即使静脉注入阿洛酮糖时也没有发现血糖值的上升。IVGTT时随时间测定血液中的insulin，发现加载葡萄糖的组随着血糖值的上升insulin也上升，但在注入阿洛酮糖组中可能因为血糖值没有上升而发现也没有影响insulin的分泌(图36)。
因为暗示在正常血糖水平下阿洛酮糖不会促进胰岛素分泌，下面研究了阿洛酮糖对连续注入葡萄糖达到高血糖状态老鼠的影响。用脱氧葡萄糖进行对照。与之相比，投入阿洛酮糖组的血糖值下降更快。并且随时测定的胰岛素的浓度也比对照增加了(图37)。
(4)讨论在本实施例14的in vivo中确定了D-阿洛酮糖不影响糖代谢，刺激胰β细胞分泌胰岛素。另外，在胰岛素分泌作用中，确定了虽然在高血糖时有胰岛素分泌作用，但一般血糖中几乎看不到胰岛素分泌促进作用，没有发现诱发低血糖的作用。糖尿病的实际状态是因葡萄糖的特定胰岛素分泌不全，但通过稀有糖在这种状态下也可以有效地促进胰岛素分泌，可将其作为具有全新作用机理的物质而期待。在临床方面对高血糖的糖尿病患者而言，D-阿洛酮糖可以促进胰岛素分泌，改善血糖值，可以作为糖尿病治疗中有益的医药品或健康辅助食品。
实施例15(稀有糖对蛋白质糖化的效果)(1)目的糖尿病中的持续高血压状态可以促进生物体内蛋白质的非酶糖附加反应(糖化)。这个反应经过amadory产物(前期生成物)等，最终形成后期反应生成物(advanced glycation endproductsAGE)，这种合成可以增大氧化负荷、引发糖尿病中的视网膜症、肾障碍等血管并发症。在本实施例15中研究稀有糖对高血糖中的糖化、氧化负荷的抑制效果。
(2)方法通过糖化白蛋白(GA)测定药剂(オリエンタル酵母公司制)蛋白酶将白蛋白制成氨基酸片断后，由酮胺氧化酶测定糖化赖氨酸(图38)。研究各种稀有糖引起的对人体白蛋白的糖化的影响。在PBS中加入3g/dl的纯人体白蛋白并加入各种稀有糖制成其最终浓度为55.5mM的样本。制成的溶液用0.25μm的过滤器过滤灭菌，在37℃下孵化7日。此过程当中每隔24小时准确地测定GA浓度(糖化赖氨酸浓度)。并且在白蛋白(最终浓度3g/dl)、葡萄糖(最终浓度55.5mM)溶液中添加各种稀有糖至最终浓度为55.5mM，进行同样的实验。
(3)结果1)糖化反应最显著的是D-阿洛糖，其糖化速度约为90μmol/day。然后是D-葡萄糖与D-甘露糖，糖化速度约为50μmol/day。其他的稀有糖(D-阿洛酮糖等)没有发现白蛋白的糖化(图39)。
2)在葡萄糖共存下的稀有糖的糖化作用...然后在白蛋白(最终浓度3g/dl)、D-葡萄糖(最终浓度55.5mM)溶液中添加各种稀有糖至最终浓度为55.5mM，测定糖化赖氨酸浓度。结果发现D-阿洛糖在D-葡萄糖存在的条件下也可以引起快速的糖化反应。其糖化反应速度与实验1结果相同，约为140μmol/day(D-葡萄糖+D-阿洛糖的糖化速度)。并且此时D-甘露糖的糖化速度与加上葡萄糖糖化速度相同，约为100μmol/day。但D-阿洛酮糖等其他各种稀有糖中没有发现糖化的抑制效果(图40)。
(4)讨论在生物体内发生蛋白质与葡萄糖等的非酶结合(glycation)。蛋白质的氨基酸基和醛基的反应在初期反应中很重要。这次研究结果发现具有白蛋白糖化作用的糖类(D-阿洛糖、D-葡萄糖、D-甘露糖)均属于醛糖类。醛糖不仅影响糖化反应，而且影响因醛糖还原酶的多羟基化合物的代谢。在临床检查中，HbAlc、糖化白蛋白等应用于糖尿病患者的血糖控制指标。任意一个指标都可以测定蛋白质的因葡萄糖引起的糖化反应生成物。糖化部位是血色素的球蛋白β链N末端缬氨酸、白蛋白的199，281，439，525号赖氨酸。这次稀有糖糖化反应研究中使用的白蛋白，比血色素糖化部位多，因此数据可以在短时间实验中获得。
对血红蛋白进行同样的研究中存在问题。由于糖化速度很慢，因此在孵化过程中蛋白质过度变性无法准确地测定。现在正在研究商业血红蛋白。
从实施例15的实验数据可知D-阿洛酮糖没有促进白蛋白糖化的作用。其他的如D-果糖等虽然没有糖化作用，但这些糖在体内具有代谢路径并大量存在，因此醛糖等也有所增加。在今后的实验中应该确定D-阿洛酮糖在人体内的代谢，至少可以确定即使服用大量的D-阿洛酮糖也不会促进糖化反应等带来的并发症。而且，由D-阿洛酮糖具有胰岛素分泌作用种可知，对糖尿病患者而言，D-阿洛酮糖有很大利用价值。另一方面，这次用白蛋白的实验中没有发现稀有糖的糖化抑制作用。但今后会进一步研究改变稀有糖浓度，进一步研究氧化抑制效果。
以上通过实施例说明了本发明。在这里，稀有糖与一般糖类不同，它不被身体同化或即使是同化其程度也非常小，并且从稀有糖对脂质代谢的影响中可期待稀有糖对身体脂肪蓄积具有抑制效果，由此通过本发明的公开，稀有糖可利用于各种药品，而且作为功能性食品可提高其附加价值。
产业上利用可行性由本发明可知，稀有糖、尤其是D-阿洛糖、D-阿洛酮糖在细胞中或作用于细胞使该细胞变化，因此稀有糖作为具有生理活性作用的物质可以有效地利用。
权利要求
1.一种稀有糖的生理活性作用的利用方法，其特征在于，将稀有糖作用于生理活性作用敏感性细胞，改变该细胞的功能。
2.如权利要求1所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述细胞为人体细胞。
3.如权利要求1或2所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，作为所述稀有糖采用了以稀有糖为有效成分配合的组合物。
4.如权利要求3所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述组合物为功能性食品、医药品或化妆品。
5.如权利要求1～4中任一项所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述稀有糖为属于醛糖及/或酮糖的稀有糖。
6.如权利要求5所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述醛糖为D-阿洛糖。
7.如权利要求6所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述细胞选自癌细胞增殖抑制作用敏感性细胞和活性氧产生抑制作用敏感性细胞。
8.如权利要求5所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述酮糖为D-阿洛酮糖。
9.如权利要求8所述的稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征在于，所述细胞选自趋化因子分泌抑制作用敏感性细胞、微神经胶质的游走抑制作用敏感性细胞以及血糖降低作用敏感性细胞。
10.一种以稀有糖为有效成分配合的组合物，该组合物被添加在生理活性作用敏感性细胞，具有改变该细胞的功能的作用。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述细胞为人体细胞。
12.如权利要求10或11所述的组合物，其特征在于，所述稀有糖为属于醛糖及/或酮糖的稀有糖。
13.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述醛糖为D-阿洛糖。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，所述细胞选自癌细胞增殖抑制作用敏感性细胞和活性氧产生抑制作用敏感性细胞。
15.如权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述酮糖为D-阿洛酮糖。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，所述细胞选自趋化因子分泌抑制作用敏感性细胞、微神经胶质的游走抑制作用敏感性细胞以及血糖降低作用敏感性细胞。
17.如权利要求10～16中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物为功能性食品、医药品或化妆品。
全文摘要
本发明涉及一种稀有糖生理活性作用的利用方法，其特征是将稀有糖作用于具有生理活性作用的敏感性细胞使其改变功能；以及一种以稀有糖为有效成分配合的组合物，该组合物被添加在生理活性作用敏感性细胞，具有改变该细胞的功能的作用，所述细胞为人体细胞，所述组合物为功能性食品、医药品或化妆品，所述稀有糖为属于醛糖及/或酮糖的稀有糖，所述醛糖为D－阿洛糖，所述细胞选自癌细胞增殖作用敏感性细胞及活性氧产生抑制作用敏感性细胞，所述酮糖为D－阿洛酮糖，所述细胞选自趋化因子分泌抑制作用敏感性细胞、微神经胶质游走抑制作用敏感性细胞及血糖降低作用敏感性细胞。
文档编号A61Q19/00GK1668735SQ0381723
公开日2005年9月14日 申请日期2003年5月22日 优先权日2002年5月22日
发明者何森健, 德田雅明, 板野俊文, 宫本修, 石田俊彦, 村尾孝儿, 田坂大象, 宗内严, 山口文德, 田中辉和, 穆罕默德·阿克拉姆·侯赛因, 植木正明, 广冈一行, 田港朝彦, 津﨑桂二, 高桥武雄, 永田充宏, 石田丰 申请人:国立大学法人香川大学, 株式会社林原生物化学研究所, 隆祥产业株式会社