专利名称：骨桥蛋白在牙用制剂中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及牙用制剂。尤其是本发明涉及骨桥蛋白(OPN)用于显著减少牙釉质上菌斑细菌生长的用途。
背景技术：
存在许多与牙齿护理相关的问题，美容上以及治疗上，如牙菌斑的形成，牙菌斑中细菌的生长，龋齿，牙垢(牙石)，牙周病和牙齿的脱矿质。
牙菌斑是累积在口腔中硬组织(牙齿)上的复合生物膜。尽管超过500种的细菌种构成菌斑，但移居遵循军团模式，初始的定居者粘附在釉质唾液表膜上，接着通过细菌粘附第二次移居。公知大量链球菌种属于早期的定居者。因此重要的是控制这些细菌的粘附。各种粘附素和分子的相互作用成为粘附相互作用的基础并引起菌斑形成，最终引起疾病如龋齿和牙周病。
牙釉质由羟磷灰石构成。口腔中存在着羟磷灰石之间的天然平衡，一方面，羟磷灰石从牙釉质中溶解出来，另一方面，羟磷灰石从唾液中天然产生的物质在牙齿之上或之中形成。当平衡使得羟磷灰石溶解时，出现生龋齿的情况，称之为脱矿质。
长期以来已知将氟化物离子引入釉质中来防止其脱矿质。因此，通常将氟化物掺入牙膏中，然而，氟化物会引起氟中毒，尤其是如果患者吞咽牙膏或另一种洁牙剂或口腔卫生产品，例如对于小孩经常是这样的情况。还可能产生的问题是一些区域的饮用水中具有相当高含量的氟化物。
本专利申请的目的是提出一种固有的乳蛋白-骨桥蛋白加入牙用制剂中来控制或抑制细菌在牙齿表面上生长并由此防止或减少菌斑形成和龋齿的用途。
存在两个专利描述了奶蛋白部分，即，酪蛋白的水解产物、Ca磷酸肽/CPP和来自奶的酶凝的葡糖巨肽/GMP用于釉质损害的修复的用途，假设它们起供给釉质无定形磷酸钙的作用。
-WO 03/059304提出了口腔护理组合物，含有氟化物离子源和CPP部分。该制剂稳定了以无定形形式加入口腔制剂中的磷酸钙，同时稳定了制剂中的氟化物含量。
-WO 00/07454描述了GMP，加入特殊的基于奶的食品制剂中，对大鼠具有防龋齿作用。
与CPP和GMP肽相比，OPN在口腔中引入新的维数(dimension)，通过其潜力在生物活性上影响了口腔微生物在釉质上的附着，并因此影响了龋齿的形成。和CPP和GMP一样，OPN也具有对唾液中可获得的用于牙齿修复的无定形磷酸钙含量的影响。
因此OPN在牙齿护理方面具有几个功能。
在例如牙膏和漱口水中使用OPN的巨大优势是，它是牛奶中的天然蛋白质成分并因此只需要有限的临床测试。
发明内容
现在令人惊讶地显示口腔制剂中所用的骨桥蛋白减少了细菌在釉质表面上的附着和生长。
本发明关于含有骨桥蛋白的口腔组合物，包括牙膏、漱口水和口香糖以及相关的组合物。
发明详述体外研究中，使用精细抛光的羟磷灰石(HA)圆盘的牙齿类似物，浸入OPN的稀释溶液中，在HA表面上形成了OPN的薄膜，用水不能洗掉。当使这样处理的圆盘接触人唾液时，令人惊讶地，我们发现OPN膜显著减少了细菌在类似牙齿表面上的附着和生长，使得显著降低了菌斑的形成。使用来自一群不同年龄和口腔菌丛患者的唾液样品进行该试验。这些结果暗示了OPN在口腔制剂如牙膏和漱口水中的潜在用途，而且还可以作为口香糖的配料。
因此，本发明涉及骨桥蛋白减少牙釉质上菌斑细菌生长的用途和含有骨桥蛋白的牙用制剂。
如在此所用的术语“骨桥蛋白”或“OPN”意思是从奶中获得的骨桥蛋白，包括天然产生的片段或通过奶中蛋白酶剪切源自OPN的肽，或如从WO 01/49741中所述方法可获得的基因剪接-、磷酸化-、或糖基化变体。奶可以是任何产奶动物的奶，如奶牛、骆驼、山羊、绵羊、单峰骆驼和美洲驼。然而，由于可获得性，优选来自牛奶的OPN。所有含量基于天然牛奶OPN，但可以容易地校正为其活性部分或另一来源的OPN的相应含量。也可以用遗传学方法制得OPN或其衍生物。
牙用制剂可以是任何洁齿剂或口腔卫生关联的相关产品，如牙粉、牙胶、牙用漱口水、口腔喷雾剂和口香糖。骨桥蛋白(OPN)是酸性的、高度磷酸化的、富含唾液酸的、钙结合蛋白。每摩尔OPN结合28摩尔磷酸盐和约50摩尔Ca。等电点约3.0。蛋白质存在于身体的许多组织中并起信号和调节蛋白的作用。它是生物矿化过程中的活性蛋白。通过多种细胞类型包括骨细胞、平滑肌细胞和上皮细胞来表达OPN。
OPN存在于牛奶中。通常浓度为每升20mg。例如从pH4.5的酸乳清通过阴离子色谱可以相对简单地分离OPN，如专利WO 01/497741A2或WO 02/28413中所述的。可以容易地获得高达90-95％的纯度。
骨桥蛋白的含量通常为每kg牙用制剂约50mg OPN至约1500mg骨桥蛋白。然而，较小含量也具有效果。可以使用较高含量，但是效果不会有实质性的提高。有用的含量是每kg 100-1000mg OPN，优选200-500mg，最优选约350mg。推定较大含量不会获得更好的结果，因此没有推荐，因为OPN是相当昂贵的配料。
本发明优选的组合物是已经提及的牙膏、牙胶和牙粉形式。这样的牙膏和牙胶的组分包括下列的一种或多种牙用磨料(约10％至约50％)、表面活性剂(约0.5％至约10％)、增稠剂(约0.04％至约0.5％)、湿润剂(约0.1％至约3％)、增香剂(约0.04％至约2％)、甜味剂(0.1％至约3％)、着色剂(约0.01％至约0.5％)和水(2％至45％)。抗龋齿剂含有0.001％至约1％的OPN。抗牙垢剂含有约0.1％至约13％的OPN。
当然，牙粉基本上不含所有的液体组分。
本发明其他的优选组合物是牙用漱口水，包括口腔喷雾剂。这样的漱口水和口腔喷雾剂的组分通常包括下列的一种或多种水(约45％至约95％)、乙醇(约0％至约25％)、润湿剂(约0％至约50％)、表面活性剂(约0.01％至约7％)、增香剂(约0.04％至约2％)、甜味剂(约0.1％至约3％)和着色剂(约0.001％至约0.5％)，包括OPN的抗龋齿剂，约0.001％至1％，和抗牙垢剂(约0.1％至约13％)。
第三个方面的应用一般是在各种组成的口香糖制剂中。
具体实施例方式
通过以下的实施例和实验来进一步说明本发明。
实施例背景该研究的目的是证明两件事。
OPN以稳定的方式结合于羟磷灰石表面。用水或缓冲液冲洗不能除去薄膜。
OPN影响细菌在牙齿类似表面上的粘附。
该研究中调查研究了OPN体外防止菌斑集结的能力，羟磷灰石(HA)圆盘用作牙釉质的模型。将圆盘浸入OPN溶液中，随后与唾液一起温育。在瑞典Malm大学的齿科学系以不同菌斑形成细菌菌株的细菌计数来研究在附着层上的生长。
作为OPN涂覆的HA表面的参照，使用非涂覆的和BSA(牛血清白蛋白)处理的HA圆盘。
如下所述对来自6名捐献者的充分表征的唾液样品进行了研究。
材料与方法化学品通过Arla Foods amba制得色谱纯度约为95％的骨桥蛋白(OPN)。从Sigma-Aldrich购得牛血清白蛋白(BSA)。从Sigma(St.Louis，MO，USA，L-6026)获得十二烷基硫酸钠(SDS)。所有其他化学品是分析级的，且所用的水是Milli-Q质量的。在含有0.01M磷酸盐和0.05M氯化钠的pH7的磷酸盐缓冲液中进行附着层的预处理和吸附实验。将所有玻璃器皿和移液管等以及缓冲液通过高压灭菌法灭菌。实验中所用的蛋白质溶液通过过滤灭菌(截留0.22μm)。
唾液样品在咀嚼一块石蜡后收集用于实验的受刺激唾液。受刺激唾液样品捐献者的概要显示于附录1中。
在收集前两小时不允许进食或饮水。
附着层从Swedish Ceramic Institute，Gtebor g购得直径10mm的羟磷灰石(HA)圆盘。将用于SEM研究的圆盘两面抛光，使得可以使用超声波清洁。在开始实验之前，用温和的去污剂溶液处理附着层(圆盘)并彻底地在水中漂洗。最后，将它们在乙醇和水中漂洗。在使用前将附着层保存于70％乙醇中，使用时用水冲洗并在氮气流中干燥。干燥后，将用于椭圆光度法测量中的附着层在低压残余气体中(10-30Pa)等离子体清洁，使用射频辉光放电装置(Harrick PDC 3XG，Harrick Scientific Corp.，Ossining，New York)。
细菌膜形成将附着层表面在蛋白溶液中37℃预温育1小时。然后用缓冲液冲洗附着层并在37℃温育40小时。在实验中的预处理和温育过程中进行搅拌。温育后，用缓冲液冲洗HA圆盘。
椭圆光度法OPN与唾液蛋白在HA附着层上的相互作用后进行椭圆光度法，其是测量在表面反射时光偏振改变的光学方法(3)。所用的仪器是Rudolph薄膜偏振光椭圆计，436型(Rudolph Research，Fairfield，N.J.)，配备滤光至4015的氙灯，并在Landgren和Jnsson(1993)所述的装置中操作。为了测定赤裸附着层的椭圆对称角，Δ和Ψ，确立强度最小的位置。根据吸附时Δ和Ψ的改变，按照McCrackin等(4)计算吸附蛋白膜的厚度和折射率，假定表面为均匀的膜。按照Cuypers等(5)计算吸附质量，Γ(mg/m2)。如这些作者所示的，在低表面覆盖度时，可以比膜厚度和折射率更精确地测定吸附质量，且在此已经呈现了这个推理。所用的摩尔量和摩尔折射率之间的比率值和微分比容的值各自为4.1g/m l和0.75ml/g。这些值通常用于蛋白质并且之前已经用于许多关于唾液成分吸附的研究中(参考文献(6，7))。将如以上附着层部分中所述制得的表面放入含有缓冲液的偏振光椭圆计的比色杯中。将比色杯在37℃恒温，除非另外指出，并用磁搅拌器搅拌溶液。当椭圆对称角稳定时，将唾液加入至终浓度10％(v/v)。测量吸附1小时，接着用12ml/分钟的连续的缓冲液流冲洗比色杯5分钟。然后接着脱附另外的25分钟。这是薄膜形成的标准程序。为了获得薄膜粘结性的测量，实验的特点是最后添加SDS。在标准实验中，加入17mM的浓度(两次水中的cmc和大约九次缓冲液中的cmc)，此后加入SDS，然后用缓冲液最终冲洗5分钟。
微生物学分析的方法培养基用于微生物分离的基础琼脂培养基是血液琼脂(8)、MitisSalivarius琼脂(MSA，Difco Lab.)、Mitis Salivarius-杆菌肽(MSB)琼脂(9)、根据Nickerson的假丝酵母选择性琼脂(Merck)、Mac Conkey琼脂(Difco Lab)和葡萄球菌培养基110(Difco Lab)。
唾液样品的培养程序将唾液样品运送至常规的VMG II(生存力保存)培养基中，收集24小时内涡旋混合，稀释并接种于血液、MSA和MSB琼脂上。将血液琼脂在厌氧室(氮气中10％氢气、10％二氧化碳)中培养4天，MSA琼脂在5％二氧化碳的大气中培养2天。借助于立体显微镜计数琼脂平板上菌落形成单位(CFU)的总数。
从圆盘上除去微生物使用1秒钟10个脉冲，通过在带有微尖的Sonics Vibracell中的超声处理除去附着于圆盘上的微生物。通过没有观察到微生物的生长证实了通过超声处理来除去细胞是有效的。
脱附样品的培养程序将脱附样品涡旋混合、稀释并接种到以下的培养基中血液琼脂、MSA、假丝酵母选择性琼脂、Mac Conkey琼脂和葡萄球菌培养基110。将血液琼脂在厌氧室(氮气中10％氢气、10％二氧化碳)中培养5天，MSA在5％二氧化碳的大气中培养2天，假丝酵母选择性琼脂、MacConkey琼脂和葡萄球菌培养基110需氧培养2天。借助立体显微镜计数琼脂上CFU的总数。分析MSA上的CFU，特别注意不同菌落类型的形态学、大小和数量。将每个形态类型的代表性菌落的细胞革兰氏染色并接种于血液琼脂上用于之后的鉴定。为了将来的表征，将生长于MSA上的分离物保存于-79℃脱脂奶(蒸馏水中10％的脱脂奶粉，w/v；Oxoid Lab.L31，Hampshire，UK)中。
葡萄球菌分离物的鉴定革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的成链的球菌被认为是葡萄球菌，且基于之前所述的特征将这些分离物鉴定至种和亚种水平(10)。
结果和讨论蛋白质相互作用的研究为了研究OPN和HA以及OPN和唾液之间的相互作用，进行了椭圆光度法研究。
图1中，显示了吸附温度的影响。从该图中可以看出OPN在HA表面上的吸附几乎是瞬时发生的。在较高温度(37℃)吸附较大量的OPN，尽管，在37℃冲洗导致一些脱附至每m21mg的稳定表面负载。为了模拟刷牙的化学效果，将SDS加入比色杯中5分钟，接着用缓冲液冲洗。该清洁步骤后，在两个温度下吸附量不存在显著差异。
获得的结果表明OPN提供了稳定的HA圆盘表面覆盖度，尽管在水冲洗和SDS处理后获得的膜厚度的减小。
细菌膜形成通过温和超声处理脱附的显示于表1和2中的细菌计数显示出分别用浓度0.1mg/ml和1mg/ml的OPN溶液处理的HA圆盘对细菌粘附的显著效果，对于所有的唾液捐献者以在血液琼脂和MSA琼脂平板上的总计数表示。用BSA或唾液处理的HA圆盘在表面上呈现更多的细菌。OPN涂覆圆盘上的微生物总计数比对照圆盘(唾液或BSA涂覆的)上的低10至1000倍。受刺激的唾液样品呈现高度不同的微生物组成，被认为是唾液微生物菌丛的常见特征。感兴趣的发现是移居在OPN涂覆圆盘上的葡萄球菌显著少于对照圆盘上的。
表1不同预处理后在受刺激唾液中培养的两面抛光的整个圆盘的细菌分析。厌氧培养的血液琼脂平板上的总计数(CFU)。
表2不同预处理后在受刺激唾液中培养的两面抛光的整个圆盘的细菌分析。兼性厌氧培养的Mitis Salivarious琼脂(MSA)上的总计数。
总结结果显示OPN预处理的HA圆盘在受刺激的唾液中培养后对细菌数量的明显影响。在用于浸泡牙齿类似物的所研究的0.1-1mg/ml的OPN溶液中，抗粘附效果看起来几乎与浓度无关。对于单层覆盖，需要小量的OPN。
有趣的是注意到与对照圆盘相比较，OPN涂覆的圆盘上葡萄球菌粘附显著减少。
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权利要求
1.骨桥蛋白用于减少或防止牙釉质上菌斑细菌生长的用途。
2.根据权利要求1的骨桥蛋白的用途，用于减少或预防龋齿。
3.根据权利要求1的骨桥蛋白的用途，用于减少或预防牙石。
4.根据权利要求1的骨桥蛋白的用途，用于减少或预防牙周病。
5.根据权利要求1的骨桥蛋白的用途，用于减少或预防牙齿的脱矿质。
6.含有骨桥蛋白的牙用制剂。
7.根据权利要求6的牙用制剂，呈牙膏、牙粉、牙胶、牙用漱口水、口腔喷雾剂或口香糖的形式存在。
8.根据权利要求7的牙用制剂，每kg制剂含有约5mg的骨桥蛋白至约1500mg的骨桥蛋白。
9.根据权利要求8的牙用制剂，每kg制剂含有约100mg的骨桥蛋白至约1000mg的骨桥蛋白。
10.根据权利要求9的牙用制剂，每kg制剂含有约200mg的骨桥蛋白至约500mg的骨桥蛋白。
11.根据权利要求10的牙用制剂，每kg制剂含有约350mg的骨桥蛋白。
12.骨桥蛋白用于制造治疗或预防龋齿、牙石或牙周病的药物组合物的用途。
13.防止或抑制牙釉质上菌斑细菌生长的方法，其是通过将有效量的骨桥蛋白给药于口腔中。
14.治疗或防止龋齿、牙石或牙周病的方法，其是通过给需要这样治疗的患者口服有效量的骨桥蛋白。
全文摘要
骨桥蛋白用于减少牙釉质上菌斑细菌生长的用途和含有骨桥蛋白的牙用制剂。
文档编号A61Q11/00GK1889922SQ200480035670
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月1日 优先权日2003年12月1日
发明者H·伯灵, E·S·索兰森, H·贝特尔森, A·S·约恩森, G·格拉沃霍尔特 申请人:阿尔拉食品公司