稳定储藏的葡糖氧化酶的制作方法

专利名称：：稳定储藏的葡糖氧化酶的制作方法
技术领域：
：本发明提供方法和包含至少一种葡糖氧化酶的组合物，其中葡糖氧化酶具有改善的储存稳定性。在一些优选的实施方案中，葡糖氧化酶在暴露于高温后仍是稳定的。在一些备择的优选实施方案中，葡糖氧化酶在液体制剂中具有改善的储存稳定性。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供方法和包含从曲霉属物种(/^/wg/"附w)获得的葡糖氧化酶的组合物。在一些更特别优选的实施方案中，从黑曲霉(A"/gw)获得葡糖氧化酶。发现本发明可用于涉及清洁的应用中。在一些特别优选的实施方案中，发现本发明可用于个人护理产品和应用中。
背景技术：
：葡糖氧化酶(E.C.1.1.3.4)是用氧催化葡萄糖氧化的酶，由此形成D-葡糖酸和过氧化氢。这些酶具有大量的工业用途，包括但不限于卵的脱糖及从饮料以及湿食品、调味品和密封食品包装中去除氧。也将这些酶用于检测和消除工业溶液和体液(如血和尿)中的葡萄糖。然而，已发现这些酶在多种条件下不稳定。因此，尽管这些酶已经用于各种工业和大量产品中，本领域仍然需要在这些工业中的通常条件下稳定的葡糖氧化酶。实际上，用于稳定该酶的方法的大多数^l道均涉及在生物传感器中使用固定化的葡糖氧化酶。因此，仍然需要用于其他工业用途的能稳定储存的葡糖氧化酶。发明概述本发明提供方法和包含至少一种葡糖氧化酶的组合物，其中葡糖氧化酶具有改善的储存稳定性。在一些优选的实施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高温后仍是稳定的。在一些备择的优选实施方案中，葡糖氧化酶在液体制剂中具有改善的储存稳定性。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供方法和包含从曲霉属物种获得的葡糖氧化酶的组合物。在一些更特别优选的实施方案中，从黑曲霉获得葡糖氧化酶。发现本发明可用于涉及清洁的应用中。本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的纟且合物。在一些实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该至少一种或两种增强储存稳定性的化合物选自葡糖酸盐、偏亚硫酸氢盐、抗坏血酸、葡萄糖或焦磷酸四钾。在一些实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该增强储存稳定性的化合物包含含18.5%氯化钠、1.3。/。磷酸二氢钠二7jC合物及2.5%柠檬酸三钠二水合物的溶液以及至少一种另外的增强储存稳定性的化合物，其选自焦磷酸四钾、硫酸铵、酒石酸铵或焦砩酸四钠。在一些实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中在大约4ox:储存大约io周后该组合物保留至少大约15%的初始活性。在另外的实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中在大约40'C储存大约10周后该组合物保留至少大约30%的初始活性。在另外的实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中在大约40'C储存大约10周后该组合物保留至少大约50%的初始活性。6在另外其它的实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中在大约40"C储存大约10周后该组合物保留至少大约70%的初始活性。本发明进一步提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该组合物是个人护理组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该组合物储存在pH范围为大约5.0至大约7之后是稳定的。在一些实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该組合物储存在大约pH7之后是稳定的。在另外其它的实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该组合物储存在温度范围为大约4'C至大约50"C之后是稳定的。在一些实施方案中，本发明提供包含葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物，其中该组合物储存在温度范围为低于大约4'C至大约4(TC之后是稳定的。本发明也提供用于稳定组合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶组合物。在一些实施方案中，本发明提供用于稳定组合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶組合物，其中该至少一种增强储存稳定性的化合物选自葡糖酸盐、偏亚石危酸氢盐、抗坏血酸和葡萄糖。在另外的实施方案中，本发明提供用于稳定组合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶组合物，其中该组合物包含至少两种增强储存稳定性的化合物，且其中至少一种所述增强储存稳定性的化合物选自葡糖酸盐、偏亚疏酸氢盐、抗坏血酸、葡萄糖和焦磷酸四钾。在一些实施方案中，本发明提供用于稳定組合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶组合物，其中该组合物包含含18.5%氯化钠、1.3%磷酸二氩钠二水合物及2.5%柠檬酸三钠二水合物的溶液以及至少一种另外的增强储存稳定性的化合物，其选自焦磷酸四钾、硫酸铵、酒石酸铵和焦磷酸四钠。在一些实施方案中，本发明提供用于稳定组合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶组合物，其中该组合物在大约40r储存大约10周是稳定的。在一些实施方案中，本发明提供用于稳定组合物中的葡糖氧化酶的方法，其包含提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶组合物，其中该組合物是个人护理组合物。图1:提供了显示相对于储存于4。C的OXYGOHPL5000的活性，当储存于40。C时在20mM柠檬酸盐、20mM磷酸盐pH6.0中的葡糖氧化酶样品的活性的图。实线代表由数据最佳拟合为等式1所确定的活性值。在第IO周时测定残余活性值，以利于与其他样品的稳定性的功能比较。图2:提供了显示相对于储存于4匸的OXYGOHPL5000的活性，当储存于40匸时以BaseA配制的葡糖氧化酶样品的活性的图。实线代表由数据最佳拟合为等式1所测定的活性值。在第10周时测定残余活性值，以利于与其他样品的稳定性的功能比较。图3:提供了显示相对于储存于4匸的OXYGOHPL5000的活性，当储存于40。C时用2.4%焦磷酸四钾和BaseA配制的葡糖氧化酶样品的活性的图。实线代表由数据最佳拟合为等式l所测定的活性值。在第10周时测定残余活性值，以利于与其他样品的稳定性的功能比较。图4:提供了显示相对于储存于4'C的OXYGOHPL5000的活性，当储存于40。C时配制于33%葡萄糖酸钠中的葡糖氧化酶样品的活性的图。实线代表从数据最佳拟合为等式1所测定的活性值。在第10周时测定残余活性值，以利于与其他样品的稳定性的功能比较。图5A和图5B:提供了显示40'C储存10周后残余活性值的百分比的图，该值计算自非线性最小二乘法回归分析拟合的等式1所测定的速率常数k的值。发明详述本发明提供方法和包含至少一种葡糖氧化酶的组合物，其中葡糖氧化酶具有改善的储存稳定性。在一些优选的实施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高温后是稳定的。在一些^^择的优选实施方案中，葡糖氧化酶在液体制剂中具有改善的储存稳定性。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供方法和包含从曲霉属物种获得的葡糖氧化酶的组合物。在一些更特别优选的实施方案中，从黑曲霉获得葡糖氧化酶。本发明发现了在涉及清洁的应用中的用途。在一些特别优选的实施方案中，本发明发现了在个人护理产品和应用中的用途。除非另外指明，本发明的实施涉及分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、制剂开发等学科中通常使用的常规技术，其在本领域技术人员所掌握的技术之内。所有本文上下文中提及的专利、专利申请、文章和出版物在此通过明确地引用而合并于本申请。此外，本文提供的标题并不限制本发明的各个方面或实施方案，它们可以通过整体参考"i兌明书而获得。因此，通过整体参考说明书而更全面地限定下面紧接着的术语。然而，为了利于理解本发明，下文定义了许多术语。定义除非本文另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的意思相同的意思。例如，SingletonandSaiiisbury，Z)/",V""ry6>/M/m6/o/ogvflficfMo/ec"/"r5/0/6^v，第二版，JohnWileyandSons,NY(1994)和HaleandMarham，7TieHar戸Co///wsZ)/"/ow，必/o/柳，HarperPerennial,NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般性词典。尽管发现了类似于或等同于本文公开的方法和材料的任何方法和材料可用于实施本发明，但是本文公开了优选的方法和材料。因此，通过整体参考说明书而更全面地限定下面紧接着的术语。同样，除非上下文清楚地另外指明，如本文所用的单数形式的术语"一"和"该"涵盖复数形式。除非另外指明，核酸以5，到3，的方向从左到右书写，M酸序列以氛基到氛基的方向从左到右书写。应理解，本发明不限于公开的具体方法学、操作方案和试剂，本领域技术人员可根据它们所用的上下文而改变它们。本说明书中给出的每一个最大数值限定均旨在包括每一个较小的数值限定，就如同本文明确书写了该较小的数值限定一样。本说明书中给出的每一个最小数值限定均包括每一个较大的数值限定，就如同本文明确书写了该较大的数值限定一样。本说明书中给出的每个数值范围将包括落入该较宽数值范围内的每个较窄的数值范围，就如同本文明确书写了该较窄的数值范围一样。在相关部分引用的所有文档均通过引用整合于本文；引用的任何文档并不被解释为认可其为关于本发明的现有技术。如本文所用，"OXYGO"和"OXYGOHPL5000"指可以名称"OXYGOHPL5000"从Genencor商业购买的包含纯化的葡糖氧化酶的产品。该酶是高度纯化的黑曲霉葡糖氧化酶，其源自经遗传修饰的黑曲霉菌林。如本文所用，术语"葡糖氧化酶活性单位"指以每ml的滴定单位("Titr.U"或"U")表达的葡糖氧化酶活性。一个滴定单位将在15分钟内将3.0mg葡萄糖氧化为葡糖酸，测定条件为pH5.1，35"C。将获得的OXYGOHPL5000的值用作下面提供的测定的校准标准。如本文所用，术语"增强稳定性的化合物"指赋予组合物中的葡糖氧化酶稳定性和/或改善的稳定性的化合物。在特别优选的实施方案中，该术语用于指在大约40。C储存大约10周时提供改善的稳定性的化合物。然而，这并非指本发明将限于这些条件，因为该术语旨在包括与缺少该化合物时的葡糖氧化酶相比提供给葡糖氧化酶改善的稳定性的化合物。如本文所用，"化妆品组合物"指可用于化妆品中的组合物。本文使用"食品、药品和化妆品法案(TheFoodDrugandcosmeticAct(FD&CAct))"的定义。因此，按化妆品预期的用途将其定义为经擦涂、倾倒、喷洒或喷射、导入或其它施用到人体的方式而用于清洁、美化、提高魅力或改变外表的物品。这些组合物提供非治疗性益处并且不作为药物进行管理。然而，在一些情况下，将化妆品组合物合并入药物组合物中以提供化妆的益处(如治疗皮肤或毛发疾病的产品，但其也包含用于提供其色彩或其他益处的化妆品组合物)。并且，本发明旨在包括在除人外的动物上使用的化妆品。如本文所用，术语"个人护理组合物"和"个人护理产品"指应用到皮肤、毛发、指甲、口腔及相关的膜上而用于改善、清洁、美化、处理和/或护理这些表面和膜的目的的组合物和/或产品。在一些特别优选的实施方案中，在人上4吏用这些产品，而在其他实施方案中，这些产品在非人动物上使用(如在兽医应用中)。除非另外指明，如本文所用的"清洁组合物"和"清洁制剂"指用于从待清洁的物项如织物、盘皿、隐形眼镜、其他固体衬底上去除不希望有的化合物的组合物。该术语包括为目标清洁组合物的特定类型及该产品的形式(如液体、凝胶、颗粒或喷雾組合物)选择的任何物质/化合物，只要该组合物与该组合物中使用的葡糖氧化酶和其他酶相容。如本文所用，术语"相容，，指清洁组合物物质不降低葡糖氧化酶的酶ii活性到在正常使用情况过程中所期望的无效的程度。在下文详细列举了特定的清洁组合物物质。如本文所用，"有效量的酶"指获得在特定应用(如个人护理产品、清洁组合物等)中所需的酶活性所必需的酶量。本领域普通技术人员可容易地确定这样的有效量并且这样的有效量基于许多因素，如使用的特定酶变种、清洁应用、清洁组合物的特定组成及是否需要液体的或干的(如颗粒、棒)组合物等。如本文所用，"非织品清洁组合物"包括硬表面清洁组合物、洗碗组合物、个人护理清洁组合物和适用于纸浆和造纸工业的组合物。如本文所用，术语"酶促转化"指通过将底物或中间产物与酶接触将底物修饰为中间产物或将中间产物修饰为终产物。在一些实施方案中，通过将底物或中间产物直接暴露到适当的酶完成接触。在其他实施方案中，接触包含将底物或中间产物暴露于生物体，所述生物体表达和/或分泌该酶，和/或分别代谢目标底物和/或中间产物为目标中间产物和/或最终产物。如本文所用，短语"对蛋白水解的稳定性"指蛋白质(如酶)抵抗蛋白水解的能力。该术语并不旨在局限于使用任何特定葡糖氧化酶以评价蛋白质的稳定性。如本文所用，"抗氧化性"指蛋白质在氧化性条件下孵育后仍起作用的能力。如本文所用，"pH稳定性，，指蛋白质在特定pH孵育后仍起作用的能力。在一些优选的实施方案中，本发明的葡糖氧化酶在暴露到大约5至大约7的pH范围后仍能起作用。然而，本发明并不旨在局限于任何特定pH稳定性水平也不局限于pH范围。如本文所用，"热稳定性，，指蛋白质在特定温度孵育后起作用的能力。在一些优选的实施方案中，本发明的葡糖氧化酶能在暴露到大约4'C至大约50匸的温度范围后仍能起作用。在一些特别优选的实施方案中，本发明的葡糖氧化酶能在暴露到从低于大约4'C至大约40。C的温度范围后仍起作用。然而，本发明并不旨在局限于任何温度稳定性水平也不局限于温度范围。如本文所用，术语"化学稳定性"指蛋白质(如酶)在暴露到负性影响蛋白质活性的化学品后的稳定性。本发明并不旨在局限于任何特定化学稳定性水平也不局限于化学稳定性的范围。如本文所用，"表面性质"用于指蛋白质表面所呈现的静电荷以及如疏水性和/或亲水性的性质。如本文所用，术语"纯化，，和"分离"指从样品去除污染物。例如，通过去除溶液或制备物中不是葡糖氧化酶的污染蛋白质和其他化合物而纯化了葡糖氧化酶。在一些实施方案中，重组葡糖氧化酶在细菌或真菌宿主细胞中表达，通过去除其他宿主细胞成分纯化这些重組葡糖氧化酶；借此增加了样品中重组葡糖氧化酶多肽的百分比。在特别优选的实施方案中，如通过SDS-PAGE或其他本领域公知的标准方法所测定的，将本发明的葡糖氧化酶基本上纯化到蛋白质组分至少大约99%的水平。在一些备择的优选实施方案中，本发明的葡糖氧化酶包含组合物至少大约99%的葡糖氧化酶组分。仍是在备择的实施方案中，葡糖氧化酶以总蛋白的大约至少90-95%的范围存在。然而，本发明并不旨在局限于特定纯度水平的葡糖氧化酶。例如，在一些实施方案中，使用所需的纯度水平处于大约75%至大约80。/。的范围。因此，在一些实施方案中，本发明的葡糖氧化酶在非常低的纯度水平有用。在一些备择的实施方案中，由于组合物中的过氧化氢酶浓度足够低到不破坏葡糖氧化酶反应的产物(即H202)，因此葡糖氧化酶是"纯化"的。如本文所用，"目标蛋白质"指分析、鉴定和/或修饰的蛋白质(如酶或"目标酶")。天然发生的以及重组的蛋白质均可用于本发明。如本文所用，"蛋白质"指任何由氨基酸组成并被本领域技术人员认为是蛋白质的組合物。在本文中，可替换地^f吏用术语"蛋白质，，、"肽，，和"多肽"。其中肽是蛋白质的一部分，本领域技术人员将理解在上下文中使用的该术语。如本文所用，认为功能上和/或结构上相似的蛋白质是"相关蛋白质"。在一些实施方案中，这些蛋白质源自不同的属和/或种，包括生物的纲之间的差异(如细菌蛋白质和真菌蛋白质)。在一些实施方案中，这些蛋白质源自不同的属和/或种，包括生物的纲之间的差异(如细菌酶和真菌酶)。在其他实施方案中，^M目同种提供相关蛋白质。实际上，本发明并不旨在局限于来源于任何特定来源的相关蛋白质。此外，术语"相关蛋白质"包括三级结构同源物和一级序列同源物(如本发明的葡糖氧化酶)。在其他实施方案中，该术语包括具有免疫交叉活性的蛋白质。发明详述本发明提供方法和包含至少一种葡糖氧化酶的组合物，其中葡糖氧化酶具有改善的储存稳定性。在一些优选的实施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高温后是稳定的。在一些备择的优选实施方案中，葡糖氧化酶在液体制剂中具有改善的储存稳定性。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供方法和包含从曲霉属物种获得的葡糖氧化酶的组合物。在一些更特别优选的实施方案中，从黑曲霉获得葡糖氧化酶。发现本发明可用于涉及清洁的应用中。在一些实施方案中，葡糖氧化酶在一些个人护理产品中作为活性成分的使用需要证明该酶在高温(如大约4ox:)延长的时期内储存是稳定的。食品和药物管理局(FDA)基于如通过稳定性试赵参见例如21C.F.R.211)所测定的活性成分的稳定性设立了产品保质期的要求。因此，在一些特别优选的实施方案中，符合了FDA提出的活性成分稳定性的储存稳定性要求。然而，这并非指本发明局限于任何特定储存温度。葡糖氧化酶活性的丧失能起因于多种酶的损伤。然而，在研发本发明时，据测定，还原性试剂(如偏亚硫酸氢盐、P-巯基乙醇和抗坏血酸)的加入连同过氧化氢酶的加入改善了葡糖氧化酶的稳定性。在一些实施方案中，据认为，还原性试剂和过氧化氢酶的组合提供的协同益处提供了协同效果。也发现加入高浓度葡糖酸盐稳定了葡糖氧化酶活性。此外，其他多元醇也具有稳定效应，包括但不限于聚乙二醇、山梨醇、甘油和过氧化氬酶的组合(参见例如下面的表l)。在优选的实施方案中，使用至少一种多元醇来稳定本发明的葡糖氧化酶。在本发明中发现有用的多元醇的例子包括但不限于聚环氧烷类(PAO)、聚(亚烷基)二醇类(PAG)、聚亚甲基二醇类、聚乙二醇类(PEG)、甲氧基聚乙二醇类(mPEG)、聚丙二醇类、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯-共-马来酸酸酐、聚苯乙烯-共-苹果酸酸酐、葡聚糖类(如羧甲基-葡聚糖类)、纤维素类(如曱基纤维素、羧曱基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素及羟丙纤维素)、壳聚糖水解物、淀粉类(如羟乙基淀粉类和羟丙级淀粉类)、糖原、琼脂糖及其衍生物、瓜尔胶、出芽短梗霉聚糖、菊粉、黄原胶、角叉菜聚糖、果胶(pectinc)、藻酸水解物、生物聚合物类、山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、古洛糖、木糖、苏糖、山梨糖、果糖、甘油、麦芽糖、纤维二糖、蔗糖、淀粉酶、支链淀粉和单丙烯乙二醇(mono-propyleneglycol);葡糖酸盐(如葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钾)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含至少一种聚合物和/或糖。合适的聚合物包括但不限于聚环氧烷(PA)、聚(亚烷基)二醇(PAG)和聚丙二醇。在一些其他实施方案中，本发明的组合物包含至少一种其他成分。在一些实施方案中，该其他成分选自抗微生物剂、pH调节剂、分散剂、粘度调节剂和抗氧化剂。如本文所用，"抗微生物剂"指杀死、抑制或阻止微生物生长的化合物，所述微生物包括细菌、真菌、病毒和寄生虫。在一些实施方案中，抗微生物剂包括化学制剂，其包括但不限于苯甲酸钠、山梨酸钾和对羟苯甲酸类。该术语也包括任何合适的抗生素(即微生物产生的抗菌剂及此类合适抗生素的合成类似物)。如本文所用，"M剂"是帮助预防或延迟经^*的固体物质的分离(如沉淀)的化合物。合适的*剂包括但不限于某些精细分开的粘土(如高岭土、白陶土、皂粘土、漂白土等)以及"解絮凝聚合物，，和阴离子聚合物类型的两性物质。如本文所用，"pH调节剂"指当将本发明的组合物与水性介质接触时，帮助调整和/或维持(即緩冲)介质的pH以便提供与该组合物的对pH敏感的成分相容的pH值的化合物。合适的pH调节剂包括但不限于各种无水的无机和有机盐(如磷酸二氢郜、碳酸氩钠、乙酸钾、乙酸钠和柠檬酸二氢钾)、甘氨酸緩冲剂和Tris-钠緩冲剂。如本文所用，"抗氧化剂"指能保护本发明一些实施方案中组合物的对氧化敏感的成分抗氧化(例如通过大气氧)的化合物。然而，在一些实施方案中，氧化也能通过制剂的其他成分由11202或由11202产生的氧自由基而发生。合适的抗氧化剂包括但不限于甲硫氨酸和卵鳞脂。在本发明研发的过程中，将低浓度的化学品加到BaseA中的葡糖氧化酶和BaseB中的葡糖氧化酶(参见下文)。这些化学品包括表面活性剂、螯合剂、聚合物、离液盐、緩沖剂、还原剂、慢底物(slowsubstrate)、最终产物、过氧化氢酶及这些试剂的组合。此外，将聚合物类、糖醇类、糖类和葡萄糖酸钠用作葡糖氧化酶制剂中的赋形剂。发现这些方法的一些提供了葡糖氧化酶的稳定性益处。尽管在本发明研发过程中使用了OXYGO⑧中的葡糖氧化酶，这并非指本发明局限于该特定的葡糖氧化酶，因为发现本发明可用于任何葡糖氧化酶。此外，据认为将发现本发明可用于稳定其他结合葡萄糖的酶中，所述酶包括但不限于寡葡萄糖(glucooligosaccharide)氧化酶、己糖氧化酶、乳糖氧化酶和吡喃糖氧化酶。此外，据1^人为将发现本发明用于稳定山梨醇氧化酶。实际上，本发明将并不旨在局限于任何特定的酶。在一些特别优选的实施方案中，发现葡糖酸盐在稳定多种酶的活性位点中有用，从而增加了在高温中维持了延长时期的酶的稳定性。然而，本发明并不旨在局限于任何特定的反应机理。实施例为了证明并进一步举例说明本发明的一些优选实施方案和方面提供了下述实施例，不应将其解释为限制本发明的范围。在下面实验公开中使用了下述缩写形式1C(摄氏度度)；rpm(每分钟转数)；H20(水)；HC1(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；gm(克)；jig和ug(微克)；mg(毫克)；ng(納克)；nl和ul(微升)；ml(毫升)；mm(毫米)；nm(纳米)；iim和um(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；nM和uM(微摩尔)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；hr(小时)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；OD28。(在280nm处的光密度)；OD卿(在600nm处的光密度)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；EtOH(乙醇)；PBS(磷酸緩冲盐溶液[150mMNaCl，lOmM磷酸钠緩冲剂，pH7,2j);SDS(十二烷基磺酸钠)；Tris(三(羟曱基)氛基甲烷)；Genencor(Genencor，PaloAIto，CA);MolecularDevices(MolecularDevices,Corp.,Sunnyvale,CA);Amersham(AmershamLifeScience,Inc.,ArlingtonHeights,IL);Corning(CorningInternational,Corning,NY);ICN(ICNPharmaceuticals,Inc.,CostaMesa,CA);Pierce(PierceBiotechnology,Rockford,IL);Amicon(Amicon,Inc.,Beverly,MA);ATCC(美国典型培养物中心(AmericanTypeCultureCollection)，Manassas,VA);BectonDickinson(BectonDickinsonLabware，LincolnPark,NJ);Perkin-Elmer(Perkin-Elmer，Wellesley，MA);Waters(Waters,Inc.,Milford，MA);PerseptiveBiosystems(PerseptiveBiosystems,Ramsey,MN);Difco(DifcoLaboratories,Detroit,MI);GIBCOBRL或GibcoBRL(LifeTechnologies,Inc.,Gaithersburg，MD);Novagen(Novagen，Inc.,Madison,WI);Novex(Novex，SanDiego,CA);Sigma(Sigma-AldrichChemicalCo"St.Louis,MO);DuPontInstruments(Asheville,NY);GlobalMedicalInstrumentation或GMI(GlobalMedicalInstrumentation;Ramsey,MN);Agilent(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA)。在下述实施例中，使用了在OXYGOHPL5000(Genencor)中发现17的黑曲霉葡糖氧化酶。通过和20mM磷酸盐、2mM柠檬酸盐緩冲剂pH6.0的交换的充分透析(extensivedialysis)从酶中去除盐。然后将该透析后物质浓缩到大约15000单位/ml。或者直接将稳定组分加到OXYGOHPL5000中至给定浓度以使OXYGOHPL5000的稀释不超过15%,或者将其加到上述透析后的葡糖氧化酶浓缩物中以使最终的酶浓度为大约5000单位/ml。将这些新配制的样品和最初的OXYGOHPL5000(在1.5ml微量离心管中的lml体积)置于40X:并孵育确定的时间。以大约一周、两周、四周和八周的时间间隔获取这些样品的小的等份样(17nl)。将这些等份样连续稀释14641倍到含0.05%TWEEN-20的100mM礴酸盐緩冲剂pH7.0中并立即测量葡糖氧化酶的活性。葡糖氧化酶活性的方案每日制备试剂混合物，其含2.74mg/mlABTS(2，2，-连氮-双-(3-乙基苯并噢唑啉-6-磺酸)，SigmaA1888-5g)、100mM磷酸盐緩冲剂(pH7.0)、50mM葡萄糖和2.5红掊酚单位/ml的辣根过氧化物酶(Sigma)。通过用100mM磷酸盐緩冲剂(pH7.0)将OXYGOHPL5000从5000U/ml稀释到0.4-0.5U/ml并包括緩冲剂空白制备了葡糖氧化酶标准品。将酶样品稀释到标准曲线范围内的预期浓度。将SpectraMax250分光光度计(MolecularDevices)设置为动力学分析，在取样前混合并在405nm处读取。为了读取，将95ul的反应混合物转移到清洁的平底96孔微孔板(MTP)。然后，将5ul稀释的酶样品或葡糖氧化酶标准品加到MTP中的反应混合物中。然后将MTP置于分光光度计中并在室温以30秒时间间隔读取5分钟。将吸光度数据归纳为作为时间函数的吸光度改变的斜率。利用4X:(即已经显示保持100%残余活性的条件)储存的OXYGOHPL5000的线性<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表l受试的组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表l受试的组合物<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表l受试的组合物样品编号组成40匸储存10周保留的百分比561.9%偏亚石危酸氬钠和BaseA4.85740%丙二醇、1%十二烷基磺酸钠、2mM维生素E2.7582mM抗坏血酸和BaseB1.85934%丙二醇、20mM柠檬酸盐、20mM磷酸盐pH6.01.86010%葡糖酸盐、2.4%焦磷酸四钾1.76140%蔗泮唐1.762lOOmM山梨糖和BaseA1.56340%丙二醇、1%2(3)小丁基-4-羟基苯甲醚、2mMD-曱硫氨酸1.26440%甘油0.76540%麦芽糖0.66640%木糖0.46740%山梨糖醇0.26840%山梨糖醇、3%葡萄糖0.16944%聚乙二醇600、14mM裤酸氢二钠、77mM磷酸二氢钾0.170500mM柠檬酸铵和BaseA0.0471含400mM柠檬酸盐的40%山梨糖醇0.00272BaseB0.07310。/。葡糖酸内酯和BaseA0.022"BaseA"含18.5%氯化钠、1.3%磷酸二氩钠二7片合物和2.5%柠檬酸三钠二7jC合物。"BaseB，，含43%山梨糖醇、3%甘油、5g/1的氯化钠和50mM磷酸二氢钾，调节pH至5.4。于各个孵育时间储存于40。C的每个样品经测量的活性值除以各自相应孵育时间的储存于4'C的所有OXYGOHPL5000样品经测量的平均活性值。在该分析中，值'T，表明没有活性损失(即100%残余活性)，而低于'T，的值表明样品具有活性损失。相对于储存于4"C的样品将储存于40。C的样品的活性值拟合为简单的指数式衰减(等式l):A—。一htK")在等式1中，"A"代表在40X:储存的样品经测量的活性，"Ao"代表在4。C储存的样品经测量的活性，"k"代表描述活性损失的速率常数，及"t"代表储存在40"C的样品的孵育持续时间。图1、图2、图3和图4通过使用本领域公知的非线性最小二乘法回归分析提供了拟合为等式1的数据。根据在测试期内收集的所有数据，通过使用等式1和非线性最小二乘法回归分析测定了每个样品的速率常数"k"的值。根据测定的速率常数的值计算了IO周时残余活性的百分比。在图5A和5B中提供了表l中描述的样品在40'C储存10周后残余活性的百分比。这些结果清楚地表明葡萄糖酸钠提供了所有受试組合物极好的储存稳定性，尽管偏亚石危酸氢盐和抗坏血酸、过氧化氢酶、葡萄糖和葡糖酸盐的组合以及其他组合提供也提供了储存稳定性益处。权利要求1、包含至少一种葡糖氧化酶和至少一种或两种增强储存稳定性的化合物的组合物。2、权利要求l的组合物，其中所述至少一种或两种增强储存稳定性的化合物选自葡糖酸盐、偏亚硫酸氢盐、抗坏血酸、葡萄糖和焦磷酸四钾。3、权利要求1的組合物，其中所述增强储存稳定性的化合物包含18.5%氯化钠、1.3%磷酸二氢钠二水合物及2.5%无水柠檬酸三钠的溶液以及至少一种另外的增强储存稳定性的化合物，其选自焦磷酸四钾、硫酸铵、酒石酸铵和焦磷酸四钠。4、权利要求1的组合物，其中所述组合物在大约40'C储存大约10周后保留了其初始活性的至少大约15%。5、权利要求1的组合物，其中所述组合物在大约40"C储存大约10周后保留了其初始活性的至少大约30%。6、权利要求1的组合物，其中所述组合物在大约40"C储存大约10周后保留了其初始活性的至少大约50%。7、权利要求1的组合物，其中所述组合物在大约40X:储存大约10周后保留了其初始活性的至少大约70%。8、权利要求l的组合物，其中所述组合物是个人护理组合物。9、权利要求1的组合物，其中所述組合物在大约5.0至大约7的pH范围储存后是稳定的。10、权利要求l的组合物，其中所述组合物在大约pH7储存后是稳定的。11、权利要求l的组合物，其中所述組合物在大约4。C至大约50'C的温度范围储存后是稳定的。12、权利要求l的组合物，其中所述组合物在低于大约4。C至大约40°C的温度范围储存后是稳定的。13、稳定组合物中葡糖氧化酶的方法，其包含a)提供葡糖氧化酶和至少一种增强稳定性的化合物；及b)组合所述葡糖氧化酶和所述至少一种增强稳定性的化合物以产生稳定化的葡糖氧化酶组合物。14、权利要求13的方法，其中所述至少一种增强储存稳定性的化合物选自葡糖酸盐、偏亚硫酸氢盐、抗坏血酸和葡萄糖。15、权利要求13的方法，其中所述组合物包含至少两种增强储存稳定性的化合物，其中至少一种所述增强储存稳定性的化合物选自葡糖酸盐、偏亚硫酸氢盐、抗坏血酸、葡萄糖和焦磷酸四钾。16、权利要求13的方法，其中所述组合物包含18.5%氯化钠、1.3%磷酸二氢钠二水合物及2.5%柠檬酸三钠二水合物的溶液以及至少一种另外的增强储存稳定性的化合物，其选自焦磚酸四钾、硫酸铵、酒石酸铵和焦磷酸四钠。17、权利要求13的方法，其中所述组合物在大约40'C储存大约10周是稳定的。18、权利要求13的方法，其中所述组合物是个人护理组合物。全文摘要本发明提供包含至少一种葡糖氧化酶的方法和组合物，其中葡糖氧化酶具有改善的储存稳定性。在一些优选的实施方案中，葡糖氧化酶在暴露到高温后是稳定的。在一些备择的优选实施方案中，葡糖氧化酶在液体制剂中具有改善的储存稳定性。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供包含从曲霉属获得的葡糖氧化酶的方法和组合物。在一些更特别优选的实施方案中，从黑曲霉获得葡糖氧化酶。发现本发明可用于涉及清洁，包括个人护理应用的应用中。文档编号A61Q90/00GK101558153SQ200780046498公开日2009年10月14日申请日期2007年12月18日优先权日2006年12月20日发明者B·R·凯莱门,S·E·兰茨申请人:丹尼斯科美国公司