具有改变的特性的α-淀粉酶变体的制作方法

专利名称：具有改变的特性的α-淀粉酶变体的制作方法
具有改变的特性的α-淀粉酶变体序列表 本文附带包含SEQ ID NO :1_30的序列表，其中所述每个序列通过引用的方式完整 并入本文。与相关申请的交叉参照本文要求2007年11月5日提交的美国临时申请60/985，619、2008年2月6日提 交的美国临时申请61/026，579、2008年3月31日提交的美国临时申请61/041，075和2008 年6月6日提交的美国临时申请61/059，411的权益，每份文件的公开内容均通过引用方式 完整地并入本文用于全部目的。本公开的领域本公开涉及新的α -淀粉酶。特别地，它涉及使用某些变体α -淀粉酶的活性以 及其掺合物用于污渍去除和作为洗涤剂组合物的组分用于洗涤。
背景技术：
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. 1. 1)构成一组催化淀粉 及相关的线型或分支1，4_糖苷寡糖和多糖水解的酶。淀粉酶可以用于各种目的。例如，淀粉酶商业地用于淀粉加工的初始阶段(例如， 液化)中；湿磨工艺中；和从糖类生产醇中。它们也用作洗涤剂基质中的清洁剂或辅料，在 纺织工业中用于淀粉退浆；用在焙烘用途中；用于饮料工业；用于油田的钻井工艺中；用于 再循环过程，例如用于纸张脱墨，和用于动物饲料中。已经试图构建具有针对特定用途如淀粉液化和纺织品退浆的改良特性的α “淀 粉酶变体。需要创造和改善这样的淀粉酶，所述淀粉酶例如为包括商业退浆以及清洁/洗 涤和污渍或淀粉去除过程的多种用途提供了优于工业标准酶(例如来自地衣芽孢杆菌 (Bacillus Iicheniformis))的制造和/或性能优点。还需要包含改良的淀粉酶和额外组 分如表面活性剂、螯合剂等的洗涤剂和清洁助剂或制剂。发明简述在一个方面，本公开尤其涉及亲本α _淀粉酶(如AmyS样α -淀粉酶)的新α -淀 粉分解酶变体，特别是展示在清洁或洗涤过程或去除淀粉(例如织造材料退浆中)方面有 利的改变特性的变体。例如，与亲本AmyS样α -淀粉酶或参考淀粉酶相比，该变体在以下任意一个或多 个特性方面改变净电荷、底物特异性、底物切割、底物结合、热稳定性、在一个或多个PH处 的活性、在一个或多个PH处的稳定性、氧化条件下的稳定性、Ca2+需求、比活性、催化速率、 催化效率、在螯合剂存在下的活性、在螯合剂存在下的热或PH稳定性、退浆用途或清洁过 程的用途、或在蛋白质表达系统中的表达量和其他目的特性。例如，一个或多个改变可以产 生这样的变体，其与亲本α-淀粉酶(如AmyS样淀粉酶)相比较具有降低的Ca2+依赖性和 /或改变的PH/活性特征和/或改变的热稳定性。在一个方面，本文提供了亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus) α -淀粉酶的变体，其中该变体具有与亲本嗜热脂肪土 芽孢杆菌α -淀粉酶具有至少约95%同源性并包含第242位氨基酸替换的氨基酸序列，其 中肽序列中的氨基酸位置相对于参考淀粉酶(例如SEQ ID Ν0:1或2)进行编号，并且其中 该变体具有α-淀粉酶活性。
在另一方面，提供了组合物，其包含a)至少一种变体α-淀粉酶，其包含与亲本 AmyS样α-淀粉酶的氨基酸序列至少约95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第 242位置相对应的氨基酸位置处具有替换，所述变体具有可检测的α-淀粉酶活性，和b)至 少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、碱化剂、过氧化 物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。在优选的实施方案中，参考淀 粉酶是SEQ ID NO :1或2，并且该组合物是用于衣物、餐具或硬表面清洁、退浆、或者织物或 污渍处理的产品的组分。在一个实施方案中，该组合物包含额外的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、 过氧化物酶、氧化酶、果胶酶、裂合酶、角质酶、漆酶、或它们的组合。在多个实施方案中，表面活性剂是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性离子的。 变体 α -淀粉酶优选地是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、 S242Q或S242T变体。在一些实施方案中，该变体具有针对氧化作用的改变稳定性并且该变 体α-淀粉酶还包括一个或多个甲硫氨酸残基的缺失或替换，包括位于亲本AmyS样α-淀 粉酶第8、9、96、200、206、284、307、311、316和438氨基酸位置处的残基，其中参考α -淀粉 酶是 SEQ ID NO :2ο在其他实施方案中，该变体α-淀粉酶还在与参考α-淀粉酶第97、179、180、193、 319、349、358、416、428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处包含序列修 饰。仍在其他实施方案中，该变体包含一个或多个在如下位置处的替换在第349氨基酸位 置处的半胱氨酸、在第428氨基酸位置处的半胱氨酸、在第97氨基酸位置处的谷氨酸、在第 97氨基酸位置处的精氨酸、在第319氨基酸位置处的谷氨酸、在第319氨基酸位置处的精氨 酸、在第358氨基酸位置处的谷氨酸、在第358氨基酸位置处的精氨酸、在第443氨基酸位 置处的谷氨酸或在第443氨基酸位置处的精氨酸。在本文中也有用的是这样的变体α -淀粉酶，其包含附93或V416或这二者的替 换，例如，N193F或V416G或这二者的替换。在某些实施方案中，该变体以一个或多个氨基 酸(例如在位置？178、附79、6180、1181、6182和1(183处氨基酸)的缺失为特征。优选地，在某些实施方案中，该变体α -淀粉酶在不存在添加的钙或在螯合剂存 在下具有改变的金属离子依赖性或改变的稳定性或活性。变体α-淀粉酶优选地与SEQ ID NO 2具有至少95%、98%或99%或甚至更多同 源性，并且相对于包含SEQ ID Ν0:1的参考α-淀粉酶中的编号而言包含第242位氨基酸 替换，并且其中该变体α-淀粉酶具有α-淀粉酶活性。在一个实施方案中，亲本AmyS样α-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、 12、15或16，并且参考α-淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。优选地，该变体α -淀粉酶相对于亲本AmyS样α -淀粉酶在ρΗ >约8的洗涤过 程中具有改善的性能。该变体α-淀粉酶可以在多个实施方案中以a) Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、 Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g) Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的
成组替换为特征。 在本公开几个方面的另一个方面，本公开提供了作为洗涤剂或清洁制剂的组合 物，所述组合物包含至少一种变体淀粉酶，所述变体淀粉酶包含与亲本AmyS样α -淀粉酶 的氨基酸序列至少约95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨 基酸位置处具有替换，其中所述变体具有可检测的α-淀粉酶活性；其中参考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在一些实施方案中，该变体是至少包含S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 替换的 S242 变体。在本公开几个方面的另一个方面，本公开提供了织造工艺后织造材料退浆的方 法，所述方法包括织造材料与变体α-淀粉酶接触，所述变体α-淀粉酶包含与亲本AmyS 样α-淀粉酶的氨基酸序列至少约95%同一的氨基酸序列并在与参考α-淀粉酶第242位 置相对应的氨基酸位置处具有替换。该变体优选地具有可检测的α-淀粉酶活性。接触过 程在有效用于至少部分地从织造材料去除浆料的条件和时间下进行。在多个实施方案中，与亲本AmyS样α -淀粉酶或参考α-淀粉酶相比较，该变体 α-淀粉酶在以下任意一个或多个方面改变(a)净电荷、(b)底物特异性、(c)底物切割、 (d)底物结合、(e)热稳定性、(f)在一个或多个pH处的活性、(g)在一个或多个pH处的稳 定性、(h)氧化条件下的稳定性、(i)Ca2+需求、(j)比活性、(k)催化速率、(1)催化效率、 (m)在螯合剂存在下的活性、(η)在螯合剂存在下的热或PH稳定性、(ο)退浆效能或(ρ)在 蛋白质表达系统中的表达量。在多个实施方案中，亲本AmyS样α-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、 12、15或16，并且参考α-淀粉酶是SEQ ID NO :1或2。优选地，该变体α -淀粉酶是S242A、 S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。在某些实施方案中，该α-淀粉酶变体还包含一个或多个在如下位置处的替换 在第349位置处的半胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处的谷氨酸、在第97 位置处的精氨酸、在第319位置处的谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、在第358位置处的 谷氨酸、在第358位置处的精氨酸、在第443位置处的谷氨酸或在第443位置处的精氨酸， 其中参考α -淀粉酶是SEQ ID NO 1或2。也提供了洗涤或清洁的方法。所述方法包括将待洗涤或清洁的一个或多种物品与 包含变体α -淀粉酶的组合物接触，其中所述变体α -淀粉酶包含与亲本AmyS样α -淀粉 酶的氨基酸序列至少约95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的 氨基酸位置处具有替换。接触过程在有效用于至少部分地洗涤或清洁所述一种或多种物品 的条件和时间下进行。该变体具有可检测的α-淀粉酶活性。在示例性方法中，至少一种 物品用至少一种含淀粉材料弄脏，所述含淀粉材料的去除受变体淀粉酶辅助。在这些方法 的多个实施方案中，该组合物还包含一种或多种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、 螯合剂、氧化剂、酸化剂、碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织 物调理剂。在所述方法的一个实施方案中，亲本AmyS样α-淀粉酶是SEQ ID N0:l、2、6、7、 8、9、10、11、12、15或16，并且参考α-淀粉酶是SEQ IDN0:1或2。优选地，该变体α-淀粉酶是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变 体。在多个实施方案中，该变体α -淀粉酶相对于亲本AmyS样α -淀粉酶在ρΗ >约 8的洗涤过程中具有改善的性能 。在一个实施方案中，该α-淀粉酶变体包含一个或多个在如下位置处的替换在 第349氨基酸位置处的半胱氨酸、在第428氨基酸位置处的半胱氨酸、在第97氨基酸位置 处的谷氨酸、在第97氨基酸位置处的精氨酸、在第319氨基酸位置处的谷氨酸、在第319氨 基酸位置处的精氨酸、在第358氨基酸位置处的谷氨酸、在第358氨基酸位置处的精氨酸、 在第443氨基酸位置处的谷氨酸或在第443氨基酸位置处的精氨酸。在其他实施方案中，该 变体 α _ 淀粉酶包含 a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b) Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、 Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ； h)Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的成组替换。该方法也可以包括在位置F178、R179、G180、1181、G182或K183处包含一个或多 个氨基酸缺失的变体α-淀粉酶的用途。在某些实施方案中，该变体α-淀粉酶在不存在添加的钙或在螯合剂存在下具有 改变的金属离子依赖性或改变的稳定性或活性。本文中也提供了试剂盒，其包含a) —种或多种变体α _淀粉酶，所述变体α -淀 粉酶包含与亲本AmyS样α -淀粉酶的氨基酸序列至少约95%同一的氨基酸序列并在与参 考α-淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换，所述变体具有可检测的α-淀 粉酶活性，和b)至少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化 剂、碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。在一个实施方案中，该试剂盒还包含使用说明书，例如，在织造材料退浆或洗涤或 清洁用含淀粉物质弄脏的一种或多种物品的方法中使用该试剂盒组分的使用说明书。在下文更详细地描述本公开的这些和其他特征。附图简述

图1显示用于本文中的几种候选亲本α -淀粉酶(AmyS样淀粉酶)之间氨基酸 序列的比对结果。可以轻易地确定与来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的淀粉酶(SEQ ID NO 1) 的任意氨基酸位置(例如1至520)相对应的位置。SEQID NO :1，来自嗜热脂肪土芽孢 杆菌“BSG”的α-淀粉酶；SEQ ID NO :2，来自嗜热脂肪土芽孢杆菌的截短淀粉酶(AmyS， SPEZYME XTRA) ；SEQID NO :3，嗜热脂肪土芽孢杆菌(S242A 变体淀粉酶)；SEQ ID NO 4, 嗜热脂肪土芽孢杆菌(S242Q变体淀粉酶)；SEQ ID NO :5，嗜热脂肪土芽孢杆菌(S242E变 体淀粉酶)；SEQ ID NO 6, Yamane 707 淀粉酶；SEQ ID NO :7，成熟的 LAT 淀粉酶；SEQ ID NO :8，地衣芽孢杆菌野生型淀粉酶[TERMAMYL(NOVOZYMES) =TO 02/10355A2中的SEQ ID NO 8] ；SEQ ID NO :9，解淀粉芽孢杆菌淀粉酶，BAN ;SEQ ID NO 10，STAINZYME =作为 WO 0060060 中 SEQ ID NO :2 或 US 6，528，298 中 SEQID NO :24 的 AA560 ;SEQ ID NO: 11，盐 敏芽孢杆菌(B. halmapalus)淀粉酶(NATALASE) ；SEQ ID NO 12, KSM_1378(KA0 CORP., ΕΡ1199356 中的 SEQ ID NO 3) ；SEQ ID NO :13，芽孢杆菌属某些物种 KSM-K38 (ΚΑ0 CORP.， US 6，403，355B1 中的 SEQ ID NO 4) ；SEQ ID NO 14，芽孢杆菌属某些物种 KSM-K36 (ΚΑ0 CORP.，US 6，403，355B1 中的 SEQID NO 2) ；SEQ ID NO :15，LIQU0ZYME SC (N0V0ZYMES)；禾口SEQID N0:16，亲本α-淀粉酶共有序列#1。图 2 显示 pHPLT-AmyS 质粒。 图3显示S242变体在95°C热应激30分钟后的残余活性百分数。变异位置P、S、 W和γ丢失并且被野生型AmyS(Spezyme xtra(标记“ζ”))替代。还显示了具有羧基 端截短29个氨基酸的Δ 179-180的嗜热脂肪土芽孢杆菌阳性对照(即SEQ ID NO 2)。线 指示在野生型酶的残余活性百分数的标准差之上2倍和3倍。S242A和S242Q清晰地显示 比野生型更高的残余活性。图4 图4Α、B、C、D、Ε、F、G、H和I分别显示来自图1的几个序列的逐对比对结果 和共有序列及特征，分别显示共有序列2、3、4、5、6、7、8、9和10或SEQ ID NO :22、23、24、25、 26、27、28、29 和 30。图5显示在没有钙添加的情况下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。图6显示在2mM添加的钙存在下野生型和淀粉酶变体的热熔融曲线和熔点。图7显示Spezyme Xtra和两种变体相对于Liquozyme SC在4、10和20分钟的活 性断面图。图8显示4种变体相对于S242Q变体在3个时间点的活性断面图。图9是这样的图，其描述使用S242Q组合电荷文库，在20°C于2倍Tide中清洁稻 淀粉微量样品时，S242Q(实心圆圈)及其变体(空心圆)在北美洗衣条件下稻淀粉微量样 品测定法中作为电荷之函数的性能。参考实施例10。图10是这样的图，该图描述了使用TS23t组合电荷文库，在40°C于Persil中清洁 稻淀粉微量样品时，具有以下突变Q98R、M201L、S243Q、R309A、Q320R、Q359E和K444E的芽 孢杆菌属物种截短TS-23淀粉酶(实心圆)及其电荷变体(空心圆)(见2008年6月6日 提交的共同待决美国专利申请PCT/US2008/007103)在西欧洗衣条件下稻淀粉微量布样测 定法中作为电荷之函数的性能。参考实施例10。图11是这样的图，该图描述S242Q(实心圆)及其变体(空心圆)在BODIPY-淀粉 测定法中作为电荷之函数的性能。S242Q组合电荷文库(CCL)、对BODIPY-淀粉的比活性、 标准测试条件参考实施例10。图12 图片A是描述作为相对振摇管表达之函数的相对BODIPY-淀粉水解作用 (即相对BODIPY-淀粉水解作用与相对振摇管表达)的图；图片B是描述作为相对振摇管 表达之函数的相对微量样品_淀粉水解作用(即相对微量样品_淀粉水解与相对振摇管表 达)的图。参考实施例13。图13 图片A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图；图片B是描述作为 电荷之函数的相对BODIPY-淀粉水解作用的图。参考实施例13。图14 图片A是描述作为电荷之函数的相对振摇管表达的图；图片B是描述作为 电荷之函数的相对微量样品清洁活性的图。参考实施例13。图15显示与LAUNDER-0-METER中85°C持续30分钟的条件下0. Olppm有效蛋白质 的Ethyl和Xtra的退浆性能相比，添加的Ca2+对变体S242Q的退浆性能的影响。退浆过程 在存在0或5ppm CaCl2下进行。见实施例14。图16显示与LAUNDER-0-METER中97°C持续30分钟的条件下0. Olppm有效蛋白质 的Ethyl和Xtra的退浆性能相比，添加的Ca2+对变体S242Q的退浆性能的影响。退浆过程在存在O或5ppm CaCl2下进行。见实施例14。发明详述
1.定义和缩写根据该公开，以下缩写和定义适用。应当指出如本文中所用，单数形式“一个”、“一 种”和“该”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地说明。因此，例如，对“一种多肽”的提及 包括多种此类多肽，并且对“该制剂”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种制剂 和其等同物的提及等。除非另外定义，本文中所用的全部技术及科学术语具有与本领域普通技术人员通 常所理解的相同意义。下文提供了以下术语。1. 1.缩写除非另外说明，使用以下缩写AATCC美国纺织化学师与印染师协会；ADff 自动餐具洗涤；AE 脂肪醇乙氧基化物；AEO 脂肪醇乙氧基化物；AEOS 乙氧基化脂肪醇醚硫酸盐；AES 乙氧基化脂肪醇醚硫酸盐；AFAU 酸性真菌α -淀粉酶单位；AGU 葡糖淀粉酶活性单位；AOS α-烯基磺酸盐；AS醇硫酸盐；BAA 细菌α -淀粉酶；V摄氏度；CCL 组合电荷文库；cDNA 互补性 DNA ；CMC 羧甲基纤维素；dE 如CIE-LAB颜色空间所定义的总色差；dH20 去离子水；dIH20 Milli-Q 过滤去离子水；DE 右旋糖当量；DNA 脱氧核糖核酸；dNTP 三磷酸脱氧核糖核苷酸；DO 溶解氧；DP3 具有3个亚单元的聚合程度；DPn 具有η个亚单元的聚合程度；DS (或ds)干固体含量；DSC 差示扫描量热法；DTMPA 二乙三胺五乙酸；EC 酶分类酶学委员会；
EDTA乙二胺四乙酸；EDTMPA 乙二胺四甲叉膦酸；EO环氧乙烷； eq当量；ETOH乙醇；F&HC织物和家居用品护理FTU“植酸酶(fitase)”单位，植酸盐水解单位；g (或 gm)克；GAU葡糖淀粉酶单位；gpg格令/加仑；g/Ι克 / 升；Genencor Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA ；H2O7jC ；HDG重垢颗粒洗涤剂；HDL重垢液体洗涤剂；HFCS高果糖玉米糖浆；HFSS基于高果糖淀粉的糖浆；HPAEC-PAD具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱；hr小时；IKA北卡莱罗纳州威尔明顿SE North Chase公园大街2635号IKA Works Inc ；IPTG异丙基β -D-硫代半乳糖苷；JPN日本；kg千克；LALuria 琼月旨；LAS直链烷基苯磺酸盐；LBLuria 肉汤；LU脂肪酶单位；M摩尔；MBD培养基基于MOPS的定义培养基；MES2-(N-吗啉基)乙磺酸mg毫克；min分钟；mL (或 ml)毫升；mm毫米；mM毫摩尔；MOPS3- (N-吗啉基)-丙磺酸MW分子量；NA北美洲；
Ncm牛顿厘米；NEO新霉素；ng纳克； nm纳米；NOBS壬酰氧苯磺酸盐；N正常；NTA氨三乙酸；PAHBAH对羟基苯甲酰胼；PCR聚合酶链反应；PEG聚乙二醇；pi等电点；ppm每百万之···份；PVA聚(乙烯醇)；PVP聚(乙烯吡咯烷酮)；RAU参考淀粉酶单位；RMS均方根；RNA核糖核酸；rpm转 / 分钟SAPU分光光度酸性蛋白酶单位；SAS仲烷基磺酸盐；IX SSC0. 15M NaCl，0. 015M 柠檬酸钠，pH 7.0;sec秒；%SRI百分污渍去除指数；SSF同时糖化和发酵；TAED四乙酰乙二胺；TfflDSC曲线的热中点或蛋白质的熔融温度；TNBS三硝基苯磺酸；μ g微克；μ1，(μυ 微升;μ Nm微牛顿米；μπι微米；μπι微摩尔；U单位；V/V体积比体积；WE西欧；wt %重量百分数；w/v (或W/V)重量 / 体积；w/v (或w/w)重量 / 重量；wt野生型。
1.2.定义在一些方面，本公开依赖于遗传工程和分子生物学中使用的常规技术和方法。以 下资源包括对根据本文中所公开内容有用的一般方法学的描述=Sambrook等人，MOLECULAR CLONING :A LABORATORYMANUAL (第二版，1989) ；Kreigler, GENE TRANSFER ANDEXPRESSION ； A LABORATORY MANUAL (1990)和 Ausubel 等人，编著.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(1994)。 这些通用参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。除非本文另外定 义，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同 意义。Singleton等人，DICTIONARY OFMICROB10L0GY AND MOLECULAR BIOLOGY，第2版，John Wileyand Sons, New York(1994)禾口 Hale 与 Markham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向技术人员提供了本公开中所使用的众多术语的通 用字典。“分离的”意指分离的物质(例如一种化合物或序列)借助人工相对于如自然界中 存在的该化合物或序列而言被修饰。例如，分离的序列至少部分地不含或甚至基本上不含 如自然界中存在的与该序列天然关联的至少一种其他组分。当用来描述材料或物质时，“纯化的”意指该材料或物质处于相对纯的状态，例如， 至少约90%纯度，至少约95%纯度、至少约98%纯度或至少约99%纯度。如本文中所用，术语“淀粉”指包含复杂多糖的任意糖组合物，其包含具有式 (C6H10O5) x的直链淀粉和/或支链淀粉，其中X可以是任意数字。优选地，淀粉指在包括但不 限于谷粒、牧草、根状茎或根的植物中天然存在并且更具体来自小麦、大麦、谷物、燕麦、稻、 高粱、木薯(cassava)、谷子、马铃薯、甘薯和木薯的任意碳水化合物。淀粉也可以指合成性 淀粉或改性淀粉，如用作酶测定法的可检测底物的化学改性淀粉或者旨在改善一种或多种 使用特性的化学改性或酶改性淀粉。如本文中所用，“植酸”(或肌醇六磷酸(IP6))是磷在多种植物组织如麸、种子等 中的主要贮藏形式。植酸在本文中也称作“植酸盐”，尤其处于盐形式时。多种其他肌醇磷 酸如肌醇五磷酸(IP5)、肌醇四磷酸(IP4)和肌醇三磷酸(IP3)在本文中也称作植酸盐。植 酸盐通常是人和大多数单胃动物可消化的。降解植酸盐的酶在本文中称作“植酸酶”或“植酸酶(fytase)，，并且一般是六 磷酸肌醇磷酸水解酶。植酸酶活性定义为植酸酶单位(FTU或U)，其中一个FTU定义为 在pH 5.5和37°0每分钟从0.0015!1101/1植酸钠中释放1微摩尔无机磷的酶量。该定义 提供了对植酸酶活性量的有用测量并代表一种简单的基准度量。已经鉴定并表征了酵母 (例如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)、异常毕赤酵(Pichia anomala)、 Arxulaadeninivorans)、革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌 属的物种(Pseudomonas spp.)、克雷伯菌属某些物种(Klebsiella spp.))和革兰氏阳性 (例如芽孢杆菌属的某些物种(Bacillus spp.))的植酸盐降解酶。来自许多植物和来自 丝状真菌如青霉属某些物种(Penicillium spp.)、曲霉属某些物种(Aspergillus spp.)、 木霉属某些物种(Trichoderma spp.)、梨形毛霉(Mucor piriformis)和枝孢霉属某些物 种(Cladosporium spp.)的植酸酶也是已知的。已经根据启动水解的位点表征了 3-植酸 酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。另外，植酸酶已经基于它们的“最适pH”表征为酸性(最适PH约5)或碱性(最适pH约9)。多种商业植酸酶是可获得的，包括 ROVABIO(Genencor International)。 “淀粉酶”指能够催化淀粉底物的切割，从而导致淀粉降解或部分降解的 酶。淀粉酶通常是切割淀粉中糖苷键的水解酶。如本文中所用，淀粉酶包括任意的葡 糖淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶，例如芽孢杆菌属的某些物种、尤其地衣芽孢杆菌 (B. Iicheniformis)的野生型 α -淀粉酶。通常，α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1 ； α _D_(1 —4)-葡 聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内部—4)0-糖苷键的内切 作用酶。相反，外切作用解淀粉酶，如β-淀粉酶(EC 3.2. 1.2;和a-D-(l —4)-葡聚糖 麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 133)从非 还原末端切割底物淀粉分子。β-淀粉酶、α-葡糖苷酶(EC 3. 2. 1. 20 ； a-D-葡糖苷葡 萄糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ;a -D-(1 — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特 异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽低聚糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的野生型α -淀粉酶或“AmyS”淀粉酶在本文中有时候称作XTRA或 SPEZYME XTRA，它们是来自 GenencorInternational 的商业 AmyS 产物。如本文中所用，“AmyS样α -淀粉酶”用作本文中的亲本淀粉酶。AmyS样α-淀 粉酶基于它们之间存在的实质同源性而构成本文中的一类α-淀粉酶。“AmyS样α _淀粉 酶”意图指在氨基酸水平针对本文中具有SEQ ID NO :2中所示氨基酸序列的α-淀粉酶显 示实质同一性的α-淀粉酶类，特别地指芽孢杆菌属α-淀粉酶，尤其指嗜热脂肪土芽孢杆 菌(Geobaci 1 lusstearothermophilus) ct-淀粉酶。从 Genencor 分公司 Danisco US Inc 可商业地获得Spezyme Xtra0嗜热脂肪土芽孢杆菌已经在文献中称作嗜热脂肪芽孢杆菌并 且这二者可以在本文中互换地使用。具有本文中分别作为SEQ IDNO :1、6、7、8、9、10、11、12、 15和16所提供的氨基酸序列的全部α-淀粉酶视为AmyS样α-淀粉酶并且因而适合作为 亲本α-淀粉酶。AmyS样α -淀粉酶也包括这样α-淀粉酶，其i)具有与SEQ ID NO=U 6、7、8、9、10、11、12、15和16中所示氨基酸序列至少约之一具有至少约60 %同源性(同一 性)，如至少约70 %、至少约75 %或至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95 %、至 少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%同一性的氨基酸序列和/或ii)由这样 的DNA序列编码，其中所述DNA序列与编码以上所述任意α -淀粉酶的DNA序列或明显来自 W006/002643 的 SEQ ID NO :9 (BAN)、5 (BSG)、3 (SP722)、1 (SP690)、7 (LAT)、11 (ΑΑ560)中或 本说明书的那些DNA序列杂交，其编码本文分别在SEQ ID NO :1、6、7、8、9、10、11、12、15和 16中所示的任意氨基酸序列。用作AmyS样α -淀粉酶并因而用作产生本文变体的亲本酶 的其他同源α-淀粉酶还包括由EP 0252666中描述的地衣芽孢杆菌菌株产生的α -淀粉 酶和WO 91/00353和WO 94/18314中鉴定的α -淀粉酶；商业AmyS样α -淀粉酶被包含于 在以下商品名下出售的产品Spezyme AA和ultraphlow(从Genencor分公司 Danisco US Inc 可获得)和 Keistase (从 Daiwa 可获得)和 LIQUEZYME SC (从丹麦 Novozymes 可 获得)。本文以下1.5部分提供了关于AmyS样淀粉酶的进一步信息。其中的表A提 供了几种有用AmyS样α-淀粉酶的名单以及比较彼此之间氨基酸序列同一性的便利方法。 技术人员会理解可以对其他α-淀粉酶构建相似表格以确定它们作为亲本酶在本文中的 适用性。如本文中所用，“分光光度酸性蛋白酶单位”(“SAPU”)是蛋白酶酶活性的单位，其中ISAPU是在测定法的条件下每分钟从酪蛋白底物中释放1微摩尔酪氨酸的蛋白酶酶活性
的量。 “葡糖淀粉酶单位”(“GAU”)是解淀粉活性的度量，其定义为在pH 4. 2和60°C每 小时将从可溶性淀粉底物产生Ig还原性糖(计算为葡萄糖)的酶活性的量。本文中所用，术语“变体”可以与术语“突变体”互换地使用。“变体”可以指多肽 或核酸。变体包括相对于参考序列在一个或多个位置处替换、插入、缺失、截短、颠换和/或 倒位。变体核酸包括与能够同本文中所呈现核苷酸序列杂交的序列互补的序列。例如，本 文的变体核酸序列可以与能够同本文中所呈现核苷酸序列在严格条件(例如50°C和0. 2X SSCdX SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M柠檬酸钠，pH 7.0))下杂交的序列互补。更优选地，术 语“变体”包括与能够在高度严格条件(例如65°C和0. IX SSC)下同本文中所呈现核苷酸 序列杂交的序列互补的序列。当用来描述酶时，“热稳定的”意指该酶比参考酶更为热稳定。在本申请中，如果 α -淀粉酶变体在相同实验条件(例如相同的温度、底物浓度等)下特定时间间隔后具有相 对更高的酶活性，则该变体比野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉酶更为热稳定。备选地，与参考 酶相比，更为热稳定的酶具有由差示扫描量热法确定的更高热容量。多肽的“熔融温度”(Tm)是该多肽的构象发生可测量的温度依赖性变化的温度。蛋 白质构象和Tm可以例如通过圆二色谱法(一种最通用和最基础的研究蛋白质折叠的工具) 分析。圆二色谱测量圆偏振光的吸收。在蛋白质中，结构如α螺旋和β折叠通常具有手 性并且因而吸收圆偏振光。光吸收作用提供了蛋白质折叠程度的度量。这种吸收作用的变 化作为温度或变性剂浓度的函数可以用来研究蛋白质的平衡解折叠过程。这种类型的光谱 学也可以与装置如截流混合仪(stopped flow mixer)组合来测量蛋白质折叠/解折叠的 动力学。“钙依赖的”意指特定酶需要钙以实质地展示催化活性。一般如本文中所用，”钙 依赖的”包括严格要求双价金属离子以展示催化活性的任何酶的特性并且也包括在钙或另 一种双价阳离子存在下实质(例如超过20% )提高其催化活性的酶。如本文中所用，”pH稳定的”就酶而言可以涉及酶活性或酶的蛋白质构象。在第一 种意义下，“PH稳定的”意指酶在特定pH或在特定pH范围内保留催化活性。在第二种意义 下，酶可以视为在该蛋白质没有不可逆变性的PH处是“稳定的”。在这种情况下，该酶在回 转至能够支持催化活性的PH时会变得有催化活性。pH稳定性也可以以相对或比较性方式 使用，如相对于参考酶。在本申请中，α-淀粉酶变体可以比野生型地衣芽孢杆菌α-淀粉 酶更为PH稳定，当该变体比野生型具有相对更高的活性时，例如当维持在给定的pH处或在 包括PH在内的相同条件下分析时。最感兴趣的pH—般是实际使用的条件或是处在或接近 该酶保持催化活性的天然能力的界限或极限处的ΡΗ。“pH范围”意指pH值的范围，例如，从更酸至更碱或反之亦然。就酶活性而言，pH 范围表明该酶展示特定活性水平(例如最小活性、特定百分数的最大活性或特定水平的底 物转化或产物形成)的PH值上限和下限。当涉及细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，“重组” 是导入异源序列或改变天然序列的结果或已经因导入异源序列或改变天然序列而被修饰 的细胞、核酸、蛋白质或载体，或细胞从如此修饰或改变的细胞衍生。因而，例如，重组细胞 可以表达在该细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因或可以表达本来差异性表达(例如不足表达或过量表达)、异常表达或根本不表达的天然基因。
如本文中所用，“核苷酸序列”或“核酸序列”指两个或更多个核苷酸、核糖核苷酸 等或其衍生物的任意序列。核苷酸序列包括寡核苷酸和多核苷酸序列，以及其变体、片段、 同源物和衍生物。核苷酸序列可以是单链、双链或多链的。核苷酸序列可以来自任何来源 或起源，例如是基因组的、合成的或重组的，并且包括基因组DNA，cDNA、合成DNA和RNA等 以及其杂合体。核苷酸序列可以包含一个或多个密码子并且可以编码一种或多种多肽。核 苷酸序列可以偏好地采取一种或多种能量优选的三维结构。“载体”指经常用于体外实验用途或用于将核酸导入一种或多种细胞类型的核苷 酸序列。载体包括克隆载体、体内或体外表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、粘粒、噬菌体颗
粒、盒等ο如本文中所用的“表达载体”意指包含与适宜调控序列有效连接的DNA序列的DNA 构建体，其中所述的调控序列能够引起该DNA在合适宿主中的表达。此类调控序列可以包 括实施转录的启动子、控制转录的任选操纵基因序列、编码mRNA上的合适核糖体结合位点 的序列、增强子和控制转录及翻译终止的序列。多核苷酸或多肽与另一个序列具有某个序列同一性百分数(例如至少约80%、 85%、90%、95%或99% )意指当比对时，在比较的这两个序列中碱基或氨基酸残基是相 同的时的百分数。可以使用本领域已知的任意合适软件程序例如⑶RRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. Μ.等人(编著)1987，附录30，第7. 7. 18部分)中描述的那些软 件程序确定这种比对结果和同源性或同一性百分数。此类程序可以包括GCGPileup程序、 FASTA (Pearson 等人(1988) Proc. Natl，Acad. Sci USA 85:2444-2448)和 BLAST (BLAST Manual，Altschul 等人，Natl Cent. Biotechnol. Inf. , Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)， Bethesda，Md.和 Altschul 等人，(1997) NAR 25:3389-3402)。另一种比对程序是使用默认 参数的 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)。可使用的另一种序列 软件程序是在序列软件包6. 0版(Sequence Software PackageVersion 6. 0)(威斯康星州 麦迪逊威斯康辛大学Genetics Computer Group)中可获得的TFASTA数据搜索程序。本领域技术人员会认识到由本公开包括的序列也可以通过严格条件下与所例举 的amyS序列(例如WO 06/002643的SEQ ID NO 5)杂交的能力进行定义。当单链形式的 核酸可以在适宜的温度和溶液离子强度条件下与另一种核酸复性时，则该核酸可与另一种 核酸序列杂交。杂交和洗涤条件是本领域熟知的(见，例如上文的Sambrook (1989)，尤其第 9和11章)。在一些实施方案中，严格条件对应于65 "CWTn^no. 1XSSC，0. 1% SDS0“基因”指参与产生多肽并包括在编码区之前及之后的区域以及各个编码区段(外 显子)之间间插序列(内含子)的DNA区段。就多核苷酸或蛋白质而言，“异源的”指不天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋 白质。在一些实施方案中，该蛋白质是商业重要的工业用蛋白质。意图该术语包括由天然 存在基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。就多核苷酸或蛋白质而言，“内源的”指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白 质。如本文中所用，术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”就细胞而言使用时， 意指该细胞包含至少一种非天然(例如异源的)核酸序列。稳定转化的细胞包含至少一种这样的核酸序列，所述核酸序列整合到细胞的基因组或整合在经多个世代仍保留的附加型 质粒中。如本文中所用，“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录 和翻译。 “信号序列”意指与蛋白质的氨基端部分共价结合的氨基酸序列，所述氨基酸序列 促进该蛋白质的运输，例如促进该蛋白质的成熟形式分泌到细胞外。信号序列的定义是功 能性的。胞外蛋白的成熟形式缺少(例如在分泌过程期间)被切除的信号序列。如本文中所用，术语“衍生的”包括术语“源自”、“从......获得”或“从......可
获得”和“从......分离”。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换地使用。本文中使用氨基酸残基的常规单 字母或三字母代码。“启动子”是参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的调节序列。启动子可以是诱导 型启动子或组成型启动子。例如，可以在本文中使用来自里氏木霉(Trichoderma reesei) 的一种诱导型启动子cbhl。“有效连接的”指这样的接近，其中诸元件处在允许它们功能性地联系的排列中， 甚至没有紧密的物理靠近。例如，如果一个启动子能够控制编码序列并且在对于该序列为 允许或诱导的条件下控制该序列转录，则该启动子与此编码序列有效连接。“选择标记”指这样的基因，该基因能够在宿主中表达并允许选择表达该标记基因 的那些宿主。选择标记的例子包括但不限于提供对抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素 或氯霉素)抗性改变的基因和/或赋予宿主细胞代谢选择性如营养优势(如在作为唯一碳 水化合物来源的特定底物上生长)的基因。在核酸序列插入细胞的上下文中，“导入”意指“转染”、“转化”或“转导”并且包 括对核酸序列掺入真核或原核细胞的谈及，其中所述核酸序列可以掺入该细胞的基因组 (例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，被转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的 mRNA)ο“宿主”、“宿主菌株”或“宿主细胞”意指在其中安置包含多核苷酸(例如编码变 体α-淀粉酶的多核苷酸)的表达载体或DNA构建体的合适细胞。宿主菌株优选地是细菌 细胞。在一个优选的实施方案中，“宿主细胞”意指从微生物株(例如芽孢杆菌属的某些物 种)的细胞产生的细胞和/或原生质体。术语“培养”指在合适的条件下在能够支持这种生长的培养基中培育微生物细胞 群体。在一个实施方案中，培养指将含有颗粒淀粉的淀粉底物发酵性生物转化成终产物 (一般在容器或反应器中)。术语“酶转化”一般指通过酶作用修饰底物。如本文中所用的该术语也指通过酶 的作用修饰淀粉底物。如本文中所用，术语“糖化”指淀粉经酶转化成葡萄糖。术语“聚合程度(DP) ”指给定糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DPI的例子是 单糖类，如葡萄糖和果糖。DP2的例子是二糖类，如麦芽糖和蔗糖。DP > 3指具有大于3的 聚合程度的聚合物。技术人员会理解具有更大DE的化合物是更为聚合的。“终产物”或“所需终产物”指酶反应的任意预期产物，例如从淀粉底物以酶方式转化而来的淀粉衍生分子。术语“残余淀粉”指含淀粉的底物发酵后组合物中留下的任何残留(可溶性或不 可溶性)淀粉。 如本文中所用，“比活性”意指一种酶单位，其定义为在特定条件下每单位时间由 酶制剂转换成产物的底物的摩尔数。比活性表示为单位(U)/单位重量的蛋白质，一般是U/ mg蛋白质。“产量”指使用本公开的方法所产生的终产物或所需终产物的量。在一些实施方案 中，该产量大于使用本领域已知方法所产生的产量。在一些实施方案中，该术语指终产物的 体积，并且在其他实施方案中，该术语指终产物的浓度。如本文中所用，“生物学活性的”指对生物系统例如细胞、器官或生物具有可测量 的影响的化合物或序列。“ATCC”指位于弗吉尼亚州Manassas 20108的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。“NRRL”指美国伊利诺伊州皮奥里亚县，国家农业应用研究中心，农业研究培养物 保藏中心(并且以前称为USDA北部地区研究实验室)。本文中所用，“食物”意指向包括人在内的动物提供营养价值的任意成分、组分或 组合物。如本文中所用，按惯例，当描述蛋白质和编码它们的基因时，用于该基因的术语一 般用斜体(例如，编码amyL(地衣芽孢杆菌AA)的基因可以表示为amyL)。用于蛋白质的术 语一般不用斜体并且首字母通常大写(例如，由amyL基因编码的蛋白质可以表示为AmyL 或amyL)。除非另外说明，分别地，核酸从左至右以5’至3’方向书写，并且氨基酸序列从左
至由以氨基至羧基方向书写。如本文中所用术语“包含”及其关联词以其包含......在内的意义使用；即，等同
于术语“包括”及其对应的关联词。数字范围包括定义该范围的数字在内。本文中提供的标题不限制所公开的多个方面或实施方案。尽管可以在实施或检验所公开的内容中使用与本文中所述的那些方法和材料相 似或等同的任意方法和材料，然而描述了某些当前优选的方法和材料而不意图使实施者限 于所描述的任何具体方法、方案和试剂，因而这些可以变动。通过引用的方式明确并入本文 中所参考的全部专利和出版物，包括此类专利和出版物中公开的全部序列。2.命名在本说明书和权利要求书中，使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。出于 引用方便，α-淀粉酶变体通常地由以下命名描述原始氨基酸位置替换的氨基酸根据这种命名，例如将第242位置处用丙氨酸替换丝氨酸显示为Ser242Ala 或 S242A将第30位置处的丙氨酸缺失显示为Ala30*或 A30*或 ΔΑ30并且将额外氨基酸残基如赖氨酸的插入显示为Ala30AlaLys 或 A30AK。氨基酸残基连续区段(如氨基酸残基30-33)的缺失显示为(30-33) *或Δ (Α30-Ν33)。在特定α-淀粉酶与其他α-淀粉酶相比含有“缺失”并且在该位置内产生插入 的情况下，对于在第36位置插入天冬氨酸而言，这表示为* 36Asp or * 36D对于在笫36位置插入天冬氨酸而言。 多个突变由加号隔开，即Ala30Asp+Glu34Ser 或 A30N+E34S代表在30和34位置中将丙氨酸和谷氨酸分别替换为天冬氨酸和丝氨酸的突变。当可以在给定位置插入一个或多个备选氨基酸残基时，它表示为A30N, E 或备选地，A30N 或 A30E。另外，当本文中鉴定到适合修饰的位置而不指出任何具体的修饰时，应当理解任 意氨基酸残基可以替换该位置内存在的氨基酸残基。因而，例如，当提到修饰在第30位置 处的丙氨酸，但不具体说明时，应当理解该丙氨酸可以缺失或替换为任何其他氨基酸，即， 以下任一氨基酸R、N、D、A、C、Q、E、G、H、I、L、K、Μ、F、P、S、Τ、W、Y、V。另夕卜，“Α30Χ”意指以下的任一替换A30R、A30N、A30D、A30C、A30Q、A30E、A30G、 A30H、A30I、A30L、A30K、A30M、A30F、A30P、A30S、A30T、A30W、A30Y 或 A30V ；或简写为A30R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y、V。如果用于编号的亲本酶已经在该位置处具有建议替换的所讨论氨基酸残基，则在 例如N或V之一存在于野生型中的情况下使用以下命名“X30N”或“X30N，V”。这表明其他相应的亲本酶在位置30被替换成“Asn”或“Val”。3.氨基酸残基的特征带电荷的氨基酸Asp、Glu、Arg、Lys、His带负电荷的氨基酸(负电荷最多的残基排在首位)Asp、Glu带正电荷的氨基酸(正荷最多的残基排在首位)Arg、Lys、His中性氨基酸Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp、Met、Cys> Asn、Gin、Ser> Thr> Pro疏水性氨基酸残基(疏水性最强的残基排在最后)Gly、Ala、Val、Pro、Met、Leu、lie、Tyr、Phe、Trp，亲水性氨基酸(亲水性最强的残基排在最后)Thr> Ser> Cys> His、Glu、Gin、Asn、Asp、Lys> Arg4. α-淀粉酶和AmyS样淀粉酶4. 1多种α _淀粉酶的氨基酸同一性由芽孢杆菌属某些物种产生的多种α -淀粉酶在氨基酸水平是高度同源(同一) 的并且可以用作本文中的亲本酶。可以在下表A中找到多种已知芽孢杆菌α-淀粉酶相互 之间的同一性百分数(基于氨基酸序列)。表A 几种已知芽孢杆菌α -淀粉酶的氨基酸序列同一性
技术人员会理解可以从文献或通过本文中公开的或本领域已知的任意方法确定 同一性百分数。例如，已经发现地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(LAT) (SEQ ID NO 7)与解淀 粉芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 9)约81 %同源并且与嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀 粉酶(BSG) (SEQ ID Ν0:1)约65%同源。额外同源α -淀粉酶包括WO 95/26397中公 开的 SP690 禾口 SP722，及由 Tsukamoto 等人，Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988)，第25-31页描述的从芽孢杆菌属某些物种衍生的#707 α -淀 粉酶(SEQ ID NO 6)。KSM ΑΡ1378 α -淀粉酶在WO 97/00324中公开(来自KAO公司)。4. 2亲本α -淀粉酶如上文定义的AmyS样α _淀粉酶可以作为亲本α -淀粉酶使用。在一个优选的实 施方案中，亲本α -淀粉酶从嗜热脂肪土芽孢杆菌(例如上文引用的那些嗜热脂肪土芽孢 杆菌之一)衍生，如具有SEQ ID NO :1或2中所示氨基酸序列的嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀 粉酶。4. 3亲本杂合α -淀粉酶亲本α -淀粉酶(即主链α -淀粉酶)也可以是杂合α -淀粉酶，即包含从至少 两种α-淀粉酶衍生的部分氨基酸序列的组合的α-淀粉酶。亲本杂合α-淀粉酶可以是一种这样的α-淀粉酶，其中可以基于(如上文所定 义的)氨基酸同源性(同一性)和/或DNA杂交确定所述α -淀粉酶属于上文描述的AmyS 样α-淀粉酶家族。在这种情况下，杂合α-淀粉酶一般由AmyS样α-淀粉酶的至少一个 部分和选自微生物(细菌或真菌)和/或哺乳动物来源的AmyS样α -淀粉酶或非AmyS样 α-淀粉酶的一种或多种其他α-淀粉酶的部分组成。因而，亲本杂合α -淀粉酶可以包含从至少两种AmyS样α -淀粉酶或从至少一种 AmyS样和至少一种非AmyS样细菌α -淀粉酶或从至少一种AmyS样和至少一种真菌α-淀 粉酶衍生的部分氨基酸序列的组合。衍生部分氨基酸序列的AmyS样α-淀粉酶可以是本文中所引用的任意的特定AmyS样α-淀粉酶。例如，亲本α -淀粉酶可以包含从地衣芽孢杆菌菌株衍生的α _淀粉酶的羧基端 部分和从嗜热脂肪土芽孢杆菌菌株或从嗜热脂肪土芽孢杆菌(BSG)菌株衍生的α _淀粉酶 的氨基端部分。
5.同源性(同一性)同源性可以作为两个序列之间的同一性程度确定，表示彼此之间的关系，例如，第 一序列从第二序列衍生或反之亦然。同源性可以通过视检或手工计算确定，不过更便利地 借助本领域已知的计算机程序如在(上文描述的)GCG程序包中提供的一种程序GAP确定。 因而，可以使用Gap GCGvS，例如采用同一性的默认评分矩阵和以下默认参数对于核酸序 列比较而言，空位创建罚分5. 0和空位延伸罚分0. 3，并且对于蛋白质序列比较而言，空位 创建罚分 3.0 和空位延伸罚分 0. 1。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch，(1970), J. Mol. Biol. 48 443-453的方法以产生比对结果并计算同一性。在Spezyme Xtra(SEQ ID NO 2)与例如另一种α -淀粉酶之间的结构性比对结果 可以用来鉴定其他AmyS样α-淀粉酶中的等同/对应位置。获得所述结构性比对结果的 一种方法将是使用来自GCG软件包的Pile Up程序，利用空位罚分的默认值，S卩，空位创建 罚分3. 0和空位延伸罚分0. 1。其他结构性比对方法包括疏水簇分析法(Gaboriaud等人， FEBS Lett. 224 149-155，1987)和反向穿线法(reverse threading) (Huber,T ；Torda,AE, Protein Sci. 7(1) 142-149,1998) 6.杂交在表征以上AmyS样α _淀粉酶中使用的寡核苷酸探针可以基于所讨论α -淀粉 酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列适宜地制备。评估杂交的合适条件涉及在5Χ SSC中预浸泡并在40°C于20%甲酰胺，5Χ Denhardt溶液，50mM磷酸钠，pH 6. 8和50mg超声处理的变性小牛胸腺DNA的溶液中预杂 交1小时，随后在40°C于补充有IOOmMATP的相同溶液中杂交18小时，随后在40°C (低 严格性)、优选地在50°C (中等严格性)、更优选地在65°C (高严格性)、甚至更优选地在 750C (非常高严格性)于2X SSC，0.2% SDS中洗涤滤膜3次，30分钟。关于杂交方法的 更多细节可以在 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory ManuaL，第 2 版，Cold Spring Harbor, 1989 中找到。在本上下文中，“从......衍生”不仅意图指由所讨论的生物菌株产生或可产生
的α "淀粉酶，还指由分离自该菌株的DNA序列编码并在用所述DNA序列转化的宿主生物 中产生的α-淀粉酶。最后，该术语意图指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有 所讨论α-淀粉酶的鉴别性特征的α-淀粉酶。该术语意图表明亲本α-淀粉酶可以是天 然存在α-淀粉酶的变体，即这样的变体，它是修饰(插入、替换、缺失)天然存在α-淀粉 酶的一个或多个氨基酸残基的结果。7.变体α -淀粉酶中的一般突变在一个实施方案中，除了上文概述的那些修饰之外，本文中所述的变体还可以包 含一个或多个修饰。因而，可能有利的是将被修饰的α-淀粉酶变体的部分中存在的一个 或多个脯氨酸残基(Pro)替换为非脯氨酸残基，其中所述的非脯氨酸残基可以是可能的、 天然存在的非脯氨酸残基中的任一氨基酸残基，并且优选地是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸。类似地，在一个实施方案中，可以将亲本α-淀粉酶中存在的一个或多个半胱氨 酸残基替换为非半胱氨酸残基，如丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
应当理解本公开包括掺入两个或更多个上文所概述修饰的变体。另外，可能有利的是在一个或多个以下位置(使用SEQ ID NO 7用于编号)导入 突变M15、V128、A111、H133、W138、T149、M197、N188、A209、A210、H405、T412，尤其以下 的单一、二重或三重或多重突变M15X，尤其 M15T，L ；V128X，尤其 V128E ；H133X，尤其 H133Y ；N188X，尤其 N188S，T，P ；M197X,尤其 M197T，L ；A209X，尤其 A209V ；M197T/W138F ；M197T/138Y ；M15T/H133Y/N188S ；M15N128E/H133Y/N188S ；E119C/S130C ；D124C/R127C ；H133Y/T149I ；禾口 / 或G475R, H133Y/S187D ；H133Y/A209V。在亲本α-淀粉酶具有SEQ ID No. 7中所示氨基酸序列的情况下，可以被缺失 或替换以改善氧化稳定性的相关氨基酸残基包括SEQ ID NO :2中的单一半胱氨酸残基 (C363)和位于 Μ8、Μ9、Μ96、Μ200、Μ206、Μ284、Μ307、Μ311、Μ316 和 Μ438 位置内的甲硫氨酸残基。就提高α -淀粉酶变体相对于其亲本α _淀粉酶的热稳定性而言，似乎特别希望 在SEQ ID NO :2中所示的氨基酸序列中缺失至少一个并且优选地缺失2个或甚至3个以下 氨基酸残基F178、R179、G180、1181、G182 和 K183。特别感兴趣地，这种类型的成对缺失是R179 * +G180 * ；和1181 * +G182 * (分别是 SEQ ID NO 16或15)(或在满足本公开上下文中亲本α-淀粉酶要求的另一个α -淀粉酶 中这些成对缺失的等同物)。其他目的残基包括SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的N193F和V416G。8.变体的改变特性8. 1 概述以下部分描述突变之间的关系，其中所述突变存在于本文中所述的变体中并且是 可以从其产生(相对于亲本AmyS样α-淀粉酶的那些特性而言)想要的特性改变。本文中描述了具有改变特性的AmyS样α -淀粉酶。本文中具体构思的亲本α -淀 粉酶是AmyS样α -淀粉酶和亲本杂合AmyS样α -淀粉酶。在一个实施方案中，使用嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO 2)作为起 点，即，亲本淀粉酶，但是在其他实施方案中，可以使用SP722、BLA、BAN、AA560、SP690、KSM AP1378、#707和其他芽孢杆菌属α-淀粉酶。据此轻易地确定与SEQ ID NO :2中的位置相
对应的氨基酸位置。技术人员会了解尽管出于编号/鉴定特定变体中已修饰及待修饰的氨基酸残基的目的，可能使用任意亲本α-淀粉酶作为参考淀粉酶，然而SEQID Ν0:1是目前为此目的 优选序列，因为它是本文目前可获得的最长嗜热脂肪芽孢杆菌序列。在一个方面，本公开涉及了具有改变特性(例如，如上所述特性)的变体。 在其几个方面之一，本公开提供了亲本嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶的变体， 该变体在选自(使用例如SEQ ID Ν0:1用于氨基酸编号的)以下位置的一个或多个位置处 包含改变P17、D19、T21、N28、S51、G72、V74、A82、Q86、Q89、A93、G95、Q97、W115、D117、P123、 S124、D125、N127、I130、G132、Q135、P145、G146、G148、S153、Y159、W166、S169、K171、W187、 P209、N224、S242、G256、D269、N271、T278、N281、G302、A304、R308、T321、Q358、P378、S382、 K383、T398、H405、T417、E418、P420、G421、P432、W437、G446、G454、S457、T459、T461、S464、 G474、R483，其中(a)所述改变独立地是在占据该位置的氨基酸下游插入氨基酸；(ii)缺失占据该 位置的氨基酸；或(iii)用不同的氨基酸替换占据该位置的氨基酸，(b)该变体具有α -淀粉酶活性，并且(c)每个位置对应于亲本淀粉酶(例如嗜热脂肪土芽孢杆菌α -淀粉酶(例如具 有SEQ ID Ν0:2中所示的氨基酸序列))的氨基酸序列的位置，所述亲本淀粉酶例如是作为 来自Genencor的SPEZYME XTRA可商业获得的截短α -淀粉酶。本文中具体构思了S242A、S242Q、S242N 和 S242E。额外地，选择残基R179、G180、I181、G182、K183以探索钙-钠结合区中突变的作 用并且因为在α -螺旋中央的脯氨酸是不寻常的，故选择Ρ245。可以通过如上所述的比对，例如，如与图4中比对结果中所示的那些序列比对找 到其他亲本AmyS样α-淀粉酶中的对应位置。因而，本文中构思了在以上列举的位置(使 用例如SEQ ID NO :1用于比较性氨基酸编号)处包含改变的亲本AmyS样α -淀粉酶的变 体。8. 2改变的特性稳定性在本文中所述变体的上下文中，就实现改变的稳定性、尤其改善的稳定性(即更 高或更低)，在尤其高的温度(即约70-120°C)和/或极端ρΗ(即低或高ρΗ，即分别是ρΗ 4-6或ρΗ 8-11)，尤其在低于60ppm的游离(即未结合的，因而溶液中的)钙浓度而言，重 要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变。可 以如下文“方法”部分中所述确定稳定性。8. 3改变的特性Ca2+稳定性改变的Ca2+稳定性意指已经相对于亲本酶而改善酶在Ca2+耗竭下的稳定性，S卩，更 高或更低的稳定性。在本文中所述变体的上下文中，就实现改变的Ca2+稳定性、尤其改善的 Ca2+稳定性，S卩，更高或更低的稳定性，尤其在高ρΗ(即ρΗ 8-10.5)而言，重要的突变(包 括氨基酸替换和缺失)包括在“改变的特性”部分中所列出的任意突变。8. 4改变的特性比活性在又一方面，就获得变体而言，重要的突变(包括氨基酸替换和缺失)包括在“改 变的特性”部分中所列出的任意突变，其中所述的变体展示改变的比活性，尤其提高或降低的比活性，尤其在约10-60°C的温度、优选约20-50°C、尤其约0-40°C。可以如下文“方法” 部分中所述确定比活性。8. 5改变的特性氧化稳定性 与亲本α-淀粉酶相比，所描述的变体可以具有改变的氧化稳定性，尤其是更高 的氧化稳定性。提高的氧化稳定性在例如洗涤剂组合物中是有利的，并且降低的氧化稳定 性可能在意图用于淀粉液化的组合物中是有利的。可以如下文“方法”部分中所述确定氧 化稳定性。8. 6改变的特性改变的ρΗ谱就获得变体而言，重要的位置和突变包括靠近活性中心残基存在的氨基酸残基的 突变，其中所述变体具有改变的PH谱，特别地在尤其高的ρΗ(即ρΗ 8-10. 5)或低的ρΗ(即 PH 4-6)时改善的活性。优选的特定突变/替换包括上文在“改变的特性”部分中对所讨论位置列出的那 些突变/替换。在下文“方法”部分中描述合适的测定法。8. 7改变的特性洗涤性能就获得变体而言，重要的位置和突变包括上文在“改变的特性”部分中对所讨论位 置列出的特定突变/替换，其中所述变体在尤其高的ΡΗ(即ρΗ8. 5-11)时具有改善的洗涤 性能。可以如下文“方法”部分中所述测试洗涤性能。9.制备α-淀粉酶变体的方法如用于α -淀粉酶编码性DNA序列的克隆方法那样，用于导入突变至基因中的方 法是本领域已知的。将在下文讨论此类方法，包括用于在α-淀粉酶编码序列内部特定位 点处产生突变的方法。9. 1克隆编码α -淀粉酶的DNA序列编码亲本α -淀粉酶的DNA序列可以使用本领域熟知的各种方法从产生所讨论 α-淀粉酶的任意细胞或微生物分离。首先，应当使用来自产生待研究α-淀粉酶的生物的 染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果该α -淀粉酶的氨基酸序列 是已知的，则可以合成并使用同源的标记寡核苷酸探针以从基因组文库鉴定编码α-淀粉 酶的克隆，其中所述的基因组文库从所讨论生物制备。备选地。可以使用含有与已知α -淀 粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针作为探针来鉴定编码α"淀粉酶的克隆，例如使 用低严格性的杂交和洗涤条件。用于鉴定编码α _淀粉酶的克隆的另一种方法是基于将基因组DNA片段插入表达 载体如质粒，用所得基因组DNA文库转化α -淀粉酶阴性细菌并将转化的细菌涂布在含有 α -淀粉酶底物的琼脂上，因而允许轻易地鉴定表达α -淀粉酶的克隆。备选地，编码所述酶的DNA序列可以通过已建立的标准方法合成地制备，例如 S. L. Beaucage 禾口 Μ. H. Caruthers,Tetrahedron Letters 22 1859-1869 (1981)描述的亚磷 酰胺法或Matthes等人，EMBO J. 3 :801_895 (1984)描述的方法。在亚磷酰胺方法中，将寡 核苷酸合成，例如在自动DNA合成仪中，纯化、复性、连接和在适宜载体中克隆。最后，DNA序列可以是混合来源的，包含例如根据标准技术，通过连接合成的、基因 组的或cDNA来源的片段(根据需要，与整个DNA序列的多个部分相对应的片段)制备的基 因组序列和合成序列、合成序列和cDNA序列或基因组序列和cDNA序列。DNA序列也可以通过使用特异性引物的聚合酶链反应(PCR)，例如在美国专利号4，683，202或R. K. Saiki等人 EMBO J. 3 =801-895(1988)中所述的 PCR 制备。9. 2位点定向诱变 一旦已经分离编码α -淀粉酶的DNA序列并鉴定了用于突变的所需位点，则可以 使用合成的寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有分布在所需突变位点侧翼的核苷酸序 列；将突变核苷酸在寡核苷酸合成期间插入。在一个具体方法中，在携带α-淀粉酶基因 的载体中产生跨接编码α-淀粉酶的序列的DNA单链缺口。随后，携带所需突变的合成性 核苷酸与单链DNA的同源部分复性。剩余缺口随后用DNA聚合酶I (克列诺片段)补平 并使用Τ4连接酶连接构建体。这种方法的具体例子在Morinaga等人Biotechnology 2 636-639(1984)中描述。美国专利号4，760，025公开了通过表达盒的微小改变而导入编码 多重突变的寡核苷酸。然而，可以通过Morinaga方法在任一时间导入甚至更多种类的突 变，原因在于可以导入长度各异的许多寡核苷酸。在Nelson 和 Long, Analytical Biochem.，180 147-151，1989 中描述了将突变导 入编码α-淀粉酶的DNA序列的另一种方法。该方法涉及含有所需突变的PCR片段的3-步 骤生成，其中所需突变通过使用化学合成的DNA链作为PCR反应中的引物之一导入。携带 突变的DNA片段可以从PCR生成的片段通过用限制性核酸内切酶切割进行分离并重新插入 表达质粒。技术人员会了解许多备选方法可用于提供或获得本文中的变体。例如，基因改 组，例如，如 WO 95/22625 (来自 Affymax Technologies N. V.)或 WO 96/00343 (来自 Novo Nordisk A/S)中所述，或产生包含所讨论突变例如替换和/或缺失的杂合酶的其他相应技 术。9.3α-淀粉酶变体的表达可以使用表达载体以酶形式表达编码由上文所述方法或由本领域已知的任意备 选方法产生的变体的DNA序列，其中所述表达载体一般包括编码启动子、操纵基因、核糖体 结合位点、翻译起始信号和任选地阻遏基因或多种激活基因的调控序列。携带编码用于本文中的α -淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以任意载 体，其可以便利地经历重组DNA过程，并且载体的选择经常取决于待导入该载体的宿主细 胞。因而，载体可以是自主复制型载体，即作为其复制不依赖染色体复制的染色体外实体存 在的载体，例如，质粒、噬菌体、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。备选地，载体可以 整合到宿主细胞基因组中并随已经整合有该载体的染色体一起复制。在载体中，所述DNA序列应当有效连接于合适的启动子序列。该启动子可以是在 所选宿主细胞中显示转录活性的任意DNA序列并可以从编码与该宿主细胞同源或异源的 蛋白质的基因衍生。用于指导编码用于本文中的α-淀粉酶变体的DNA序列转录、尤其在 细菌宿主中转录的合适启动子的例子是大肠杆菌Iac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌琼脂 糖酶基因dagA的启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子、嗜热脂肪土芽孢 杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α -淀粉酶(amyQ)的启动子、 枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。对于真菌宿主中的转录，有用启动子的例子 是从编码稻曲霉(A.oryZae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白 酶、黑曲霉(A.niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根毛霉脂肪酶、稻曲霉碱性蛋白酶、稻曲霉磷酸三糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙 酰胺酶的基因衍生的那些启动子。用于本文中的表达载体也可以包含合适的转录终止子和在真核生物中与编码 α -淀粉酶变体的DNA序列有效连接的多腺苷酸化序列。终止序列和多腺苷酸化序列可以 适宜地从与启动子相同的来源衍生。 载体可以还包含能够使该载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。此类序列 的例子是质粒 pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl 和 pIJ702 的复制起点。载体也可以包含选择标记，例如其产物弥补宿主细胞中缺陷的基因，如来自枯草 芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素 或四环素抗性的基因。另外，该载体可以包含曲霉属选择标记如amdS、argB、niaD和sC、产 生潮霉素抗性的标记，或可以通过共转化实现选择，例如，如WO 91/17243中所述。尽管胞内表达可以在一些方面是有利的，例如当使用某些细菌作为宿主细胞时， 然而通常优选表达是胞外的。通常，本文中提到的芽孢杆菌属α-淀粉酶包含允许所表达 的蛋白酶分泌到培养基中的前区域。根据需要，这种前区域可以被不同的前区域或信号序 列替换，便利地通过替换编码各自前区域的DNA序列实现。本领域技术人员熟知用来连接分别编码α -淀粉酶变体、启动子、终止子和其他 元件的DNA构建体并将这些DNA构建体插入含有复制必需信息的合适载体的方法(参参 见例如 Sambrook 等人，MOLECULARCLONING :A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor,1989)。用于本文中的细胞，例如包含如上文定义的DNA构建体或表达载体的细胞，可以 在α-淀粉酶变体的重组产生中用作宿主细胞。细胞可以用编码变体的DNA构建体转化， 便利地通过在宿主染色体中整合(一个或多个拷贝的)DNA构建体。通常认为这种整合是 有利的，因为DNA序列更有可能稳定地维持于细胞中。可以根据常规方法例如通过同源或 异源重组将DNA构建体整合到宿主染色体中。备选地，细胞可以用与不同类型宿主细胞有 关的如上所述表达载体转化。用于本文中的细胞可以是高等生物如哺乳动物或昆虫的细胞，但优选地是微生物 细胞，例如细菌细胞或真菌(包括酵母)细胞。合适细菌的例子是革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆 菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环 形芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌或变 铅青链霉菌或鼠灰色链霉菌；或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。细菌的转化可以例如通过原 生质体转化或通过使用感受态细胞以本身已知的方式实施。在被用于表达的情况下，酵母可以有利地选自酵母属(Saccharomyces)或裂殖酵 母属(Schizosaccharomyces)物种，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。丝状真菌 可以有利地选自曲霉属物种，例如稻曲霉或黑曲霉。真菌细胞可以通过涉及原生质体形成 和原生质体转化随后细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属宿主细胞 的合适方法在EP238023中描述。在又一方面，本公开涉及产生α-淀粉酶变体的方法，所述方法包括在促进变体 产生的条件下培育如上文所述的宿主细胞并从细胞和/或培养基回收该变体。
用来培育细胞的培养基可以是适于生长所讨论的宿主细胞并获得α -淀粉酶变 体表达的任何常规培养基。合适的培养基是从商业供应商可获得的或可以根据公开(例 如，如ATCC目录中所述)的配方制备。 从宿主细胞分泌的α -淀粉酶变体可以通过已知方法从培养基回收，所述的已知 方法包括通过离心或过滤将细胞与培养基分离并借助盐(如硫酸铵)析出培养基的蛋白质 组分，随后使用层析方法如离子交换层析、亲和层析等。9. 4用于表征和筛选变体的方法9. 4. 1滤纸筛选测定法以下测定法可以用来筛选在高或低ρΗ和/或在Ca2+耗竭条件下与亲本酶和AmyS 样α-淀粉酶相比具有改变的稳定性的AmyS样α _淀粉酶变体。9. 4. 2高ρΗ滤纸测定法将芽孢杆菌文库涂布在含10 μ g/mL卡那霉素的TY琼脂平板上的乙酸纤维素 滤纸(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德国)和硝化纤维素滤纸(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dassel，德国)的夹层上，在37°C持续至少21小时。乙酸纤维素层 位于TY琼脂平板上面。在涂布后，但在温育前，用针专门标记每个滤纸夹层，目的在于能够定位滤纸上 的阳性变体，并将硝化纤维素滤纸连同结合的变体转移至具有甘氨酸-NaOH缓冲液，ρΗ 8. 6-10. 6的容器并在室温(可以从约10-60°C变化)温育15分钟。将带有菌落的乙酸纤 维素滤纸在室温贮存于TY-平板上，直至使用。温育后，在ρΗ 8. 6-10. 6甘氨酸-NaOH缓冲 液中含有琼脂糖，0.2%淀粉的平板上检测残余活性。将带有硝化纤维素滤纸的测试平 板以与滤纸夹层相同的方式标记并在室温温育2小时。在取出滤纸后，测试平板用10%路 戈尔碘液染色。检测到淀粉降解变体作为深蓝色背景上的白点并且随后在贮存平板上鉴定 它们。阳性变体在与第一次筛选相同的条件下重新筛选2次。9. 4. 3低钙滤纸测定法将芽孢杆菌文库涂布在含相关抗生素例如卡那霉素或氯霉素的TY琼脂平板 上的乙酸纤维素滤纸(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel，德国)和硝化纤维素滤纸 (Protran-Ba 85，Schleicher&Schuell，Dassel，德国)的夹层上，在 37°C持续至少 21 小时。 乙酸纤维素层位于TY琼脂平板上面。在涂布后，但在温育前，用针专门标记每个滤纸夹层，目的在于能够定位滤纸上的 阳性变体，并将硝化纤维素滤纸连同结合的变体转移至具有碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液约PH 8. 5-10并具有不同EDTA浓度(约0. OOlmM至约IOOmM)的容器。滤纸在室温温育1小时。 将带有菌落的乙酸纤维素滤纸在室温贮存于TY-平板上，直至使用。温育后，在碳酸盐/碳 酸氢盐缓冲液约PH 8. 5-10中含有琼脂糖，0.2%淀粉的平板上检测残余活性。将带有 硝化纤维素滤纸的测试平板以与滤纸夹层相同的方式标记并在室温温育约2小时。在取 出滤纸后，测试平板用约10%路戈尔碘液染色。检测到淀粉降解变体作为深蓝色背景上的 白点并且随后在贮存平板上鉴定它们。阳性变体在与第一次筛选相同的条件下重新筛选2 次。9. 4.4低ρΗ滤纸测定法将芽孢杆菌文库涂布在含10 μ g/mL氯霉素的TY琼脂平板上的乙酸纤维素滤纸(0E 67，Schleicher&Schuell, Dassel,德国)和硝化纤维素滤纸(Protran-Ba 85， Schleicher&Schuell，Dassel，德国)的夹层上，在37°C持续至少21小时。乙酸纤维素层 位于TY琼脂平板上面。在涂布后，但在温育前，用针专门标记每个滤纸夹层，目的在于能够定位滤纸上的 阳性变体，并将硝化纤维素滤纸连同结合的变体转移至具有柠檬酸盐缓冲液，PH4. 5的容器 并在80°C温育20分钟(当筛选野生型主链中的变体时)或在85°C温育60分钟(当筛选 亲本a-淀粉酶的变体时)。将带有菌落的乙酸纤维素滤纸在室温贮存于TY-平板上，直至 使用。温育后，在PH 6.0柠檬酸盐中含有琼脂糖，0.2%淀粉的测试平板上检测残余活 性。将带有硝化纤维素滤纸的测试平板以与滤纸夹层相同的方式标记并在50°C温育2小 时。在取出滤纸后，测试平板用10%路戈尔碘液染色。检测到淀粉降解变体作为深蓝色背 景上的白点并且随后在贮存平板上鉴定它们。阳性变体在与第一次筛选相同的条件下再筛 选2次。9. 4. 5 二次筛选在重新筛选后，将阳性转化体从贮存平板挑出并在二次平板测定法中测试。阳性 转化体在37°C于5mL LB+氯霉素中生长22小时。在90°C于pH 4. 5柠檬酸盐缓冲液中温 育每个阳性转化体和作为对照的表达相应主链的克隆的芽孢杆菌培养物并且在0、10、20、 30,40,60和80分钟取得样品。将3 y L样品滴在测试平板上。测试平板用10%路戈尔碘 液染色。改良变体视为比主链具有更高残余活性的变体(检测为测试平板上的晕圈)。通 过核苷酸测序确定改良的变体。9. 4. 6未纯化变体的稳定性测定法变体的稳定性可以如下测试将表达待分析变体的芽孢杆菌培养物在37°C在 10mL LB+氯霉素中生长21小时。将800 u L培养物与200微升柠檬酸盐缓冲液pH 4. 5混 合。在PCR管中制得与样品时间点编号相对应的许多70 y L等份试样并在PCR仪中在70°C 或90°C温育多个时间段(一般5、10、15、20、25和30分钟)。0分钟样品不在高温上温育。 如下文“ a -淀粉酶活性测定法”中所述，通过转移20 y L至200 y L a -淀粉酶PNP_G7底物 MPR3((Boehringer Mannheim目录号1660730)测量样品中的活性。结果作为活性(相对于 0时间点)百分数对时间作图或表述为温育某段时间后的残余活性百分数。9.4.7a-淀粉酶变体的发酵和纯化携带相关表达质粒的枯草芽孢杆菌菌株可以如下发酵和纯化将菌株从-80°C贮 藏物划线于含有10 U g/mL卡那霉素的LB-琼脂平板上并在37°C过夜生长。将菌落转移至 500mL摇瓶中补充有10 u g/mL氯霉素的100mLPS-l培养基。PS-1培养基的组成珍珠糖100g/L大豆粕40g/LNa2HP04,12H2010g/LPluronic PE 6100 0.lg/LCaC035g/L培养物在37 °C以270转/分钟振摇5日。通过以4500转/分钟离心20-25分钟从发酵肉汤除去细胞和细胞碎片。此后，过滤上清液以获得完全清亮的溶液。将滤液浓缩并在UF-滤器(10000截止值膜)上洗涤并且 将缓冲液换成PH 5. 5的20mM乙酸盐缓冲液。在S-SEPHAROSE F. F.上施加UF-滤液并通过 逐步洗脱法用相同缓冲液中的0. 2M NaCl实施洗脱。洗脱液对pH 9. 0的10mM Tris透析 并施加在Q-SEPHAROSE F. F.上并且用从0_0. 3M NaCl的线型梯度经6个柱体积洗脱。汇 集含有(由PHADEBAS测定法测量的)活性的级分，将pH调节至pH 7.5，并且通过用0.5% w/v活性碳处理5分钟除去剩余颜色。9. 4. 8比活性测定使用PHADEBAS 测定法(Magle Life Sciences)，可以测定比活性为活性/ mg酶。遵循制造商说明实施(也见下文“ a -淀粉酶活性测定法”)。9. 4. 9等电点的确定pi 由等点聚焦法(例如，使用 Pharmacia, Ampholine，pH 3. 5-9. 3)确定。9. 4. 10稳定性的确定可以使用如下方法测量淀粉酶稳定性在相关条件下温育酶。样品在各个时间点取得，例如在0、5、10、15和30分钟后， 并在测试缓冲液(50mM Britton缓冲液，pH 7.3)中稀释25倍(相同稀释度用于全部取得 的样品)并使用PHADEBAS测定法(MagleLife Sciences)在标准条件pH 7. 3，37°C下测量活性。使用在温育前(0分钟)测量的活性作为参考(100% )。将下降百分数计算为温 育时间的函数。表显示了在例如温育30分钟后的残余活性。9. 4. 11a-淀粉酶活性测定法1. PHADEBAS 测定法a -淀粉酶活性由使用PHADEBAS 小片作为底物的方法确定。PHADEBAS小 片(PHADEBAS 淀粉酶试验，由Magle Life Sciences供应)含有交联的不溶性蓝颜 色淀粉聚合物，该聚合物已经与牛血清白蛋白及缓冲物质混合并造片。对于每个单一测量，将一个小片悬浮在含有5mL的50mMBritton-Robinson缓冲液 (50mM乙酸，50mM磷酸，50mM硼酸，0. lmMCaCl2，用NaOH调节pH至目的值)的管中。试验在 目的温度的水浴中进行。在50mM Britton-Robinson缓冲液中稀释待测试的a -淀粉酶。 将lmL这种a -淀粉酶溶液添加至5mL的50mM Britton-Robinson缓冲液。淀粉被a -淀 粉酶水解，产生可溶性蓝色片段。以分光光度方式在620nm测量的所得蓝色溶液的吸光度 是a-淀粉酶活性的函数。重要的是在温育10或15分钟(测试时间)后测量的620nm吸光度在620nm处 的0. 2至2. 0吸光度单位范围内。在这个吸光度范围内，活性与吸光度之间存在线性关系 (Lambert-Beer定律)。因而必须调整的酶的稀释度以符合这个标准。在指定的条件集合 (温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，lmg给定的a-淀粉酶会水解某个量的底物，并且蓝 颜色会产生。在620nm测量颜色强度。测量的吸光度与给定条件集合下所讨论的a -淀粉 酶的比活性(活性/mg纯a -淀粉酶蛋白)直接成比例。2.备选方法a -淀粉酶活性由使用PNP_G7底物的方法确定。作为对硝基苯基- a，D_麦芽 庚糖苷缩写的PNP-G7是可以被内切淀粉酶切割的嵌段低聚糖。切割后，该试剂盒中包含的a-葡糖苷酶消化此底物以释放具有黄颜色并因而可以通过可见光分光光度法在入= 405nm (400-420nm)测量的游离PNP分子。含有PNP_G7底物和a -葡糖苷酶的试剂盒由 Boehringer-Mannheim 制造(目录号 1054635)。为制备试剂溶液，如制造商推荐，将10mL底物/缓冲液添加至50mL酶/缓冲液。 通过转移20P L样品至96孔微量滴定平板并在25°C温育实施该测定法。添加预平衡至 25°C的200 u L试剂溶液。将溶液混合并预温育1分钟并且在ELISA读数仪中在0D 405nm 在4分钟范围内每隔30秒测量吸收。时间依赖性吸收曲线的斜率与给定条件集合下所讨论的a -淀粉酶的活性直接 成比例。9. 4. 12LAS敏感性的确定变体在40°C与不同浓度的LAS (直链烷基苯磺酸盐；Nansa 1169/P)温育10分钟。使用PHADEBAS 测定法或利用pnp-G7底物的备选方法确定残余活性。在0. 1M磷酸盐缓冲液pH 7. 5中稀释LAS。使用以下浓度500ppm、250ppm、100ppm、50ppm、25ppm 和 lOppm 直至无 LAS。将变体在不同LAS缓冲液中稀释成10mL总体积中的0. 01_5mg/l浓度并在温控水 浴中温育10分钟。通过转移小等份试样至冷的测试缓冲液中停止温育。重要的是在活性测 量期间，las浓度低于lppm，目的是不影响活性测量。使用上文提及的PHADEBAS 测 定法或备选方法一式两份确定残余活性。在扣除空白后测量活性。无LAS的活性是100%。10.使用淀粉酶变体的方法工业应用本文中呈现的a-淀粉酶变体具有允许在清洁过程和污渍去除中的多种工业应 用的有价值特性。本文中所述的一种或多种变体酶或组合物也可以在洗涤剂，尤其衣物洗 涤剂组合物和餐具洗涤用洗涤剂组合物、硬表面清洁组合物中使用。所述变体也可以如上 所述在用于纺织品、织物或服装退浆的组合物、用于产生纸浆和纸张、发酵醪制备、乙醇生 产和淀粉转化工艺的组合物使用。本文中的变体也可以用于纺织品、织物或服装退浆(参见例如在此引入作为参考 的W0 95/21247、美国专利号4，643，736和EP 119，920)、发酵醪制备或酿造、以及用于纸浆 和纸张生产或相关工艺中。10. 1纸浆和纸张生产变体碱性a -淀粉酶也可以用在从淀粉强化废纸和纸板产生木素纤维素材料如 纸浆、纸张和纸板中，尤其当再浆化在高于约7的pH处发生并且淀粉酶通过降解强化淀粉 而促进废弃材料分解的情况下。a“淀粉酶变体尤其在从淀粉包层的印刷纸张产生造纸纸 浆的方法中有用。方法可以如W0 95/14807中所述进行，包括以下步骤a)使纸张分解以产生纸浆，b)在步骤a)之前、期间或之后用淀粉降解酶处理，和c)在步骤a)和b)之后，将油墨颗粒与纸浆分开。a -淀粉酶也可以在淀粉改性中非常有用，其中酶改性的淀粉连同碱性填料如碳 酸钙、高岭土和粘土一起用于造纸中。采用碱性a-淀粉酶变体，有可能在填料存在下将淀 粉改性，从而允许更简单的集成工艺。10. 2纺织品、织物和服装的退浆
a-淀粉酶变体也可以在纺织品、织物或服装退浆中非常有用。在纺织品加工 工业中，a-淀粉酶在退浆工艺中常规地用作辅料以促进除去含淀粉的浆料，所述浆料在 织造期间在纬纱上起到保护性涂层的作用。在织造后彻底除去浆料涂层对于确保后续工 艺中的最佳结果是重要的，在所述后续工艺中将织物洗刷、漂白和染色。酶法淀粉分解 是优选的，因为它不涉及对纤维材料的任何有害影响。为降低加工成本并提高研磨通量 (millthroughput)，退浆工艺有时候与洗刷和漂白步骤合并。在这类情况下，一般使用非酶 助剂如碱或氧化剂来分解淀粉，因为常规的a “淀粉酶非常不兼容于高PH水平和漂白剂。 淀粉浆料的非酶分解由于所用的相当具侵入性的化学品而确实造成一些纤维损伤。因而， 使用a-淀粉酶变体将是受欢迎的，因为它们具有在碱性溶液中的改良性能。在含有纤维 素的织物或纺织品退浆时，a “淀粉酶可以单独使用或与纤维素酶组合使用。退浆和漂白工艺是本领域熟知的。例如，此类工艺在在此引入作为参考的W0 95/21247、美国专利号 4，643，736 和 EP 119，920 中描述。用于退浆的市售产品包括来自Genencor的OPTISIZE FLEX。10. 3清洁过程和洗涤剂组合物本文中所述的变体a -淀粉酶可以添加至用于多种清洁或洗涤过程(包括衣物和 餐具洗涤)的洗涤剂组合物中并因而变成其组分。本文中提供的洗涤剂组合物可以例如配制为手工或机器用衣物洗涤剂组合物，包 括适于预处理染色织物的洗衣添加组合物和漂洗添加的织物软化组合物，或配制为用于一 般家居硬表面清洁操作的洗涤剂组合物或配制用于手工或机器用餐具洗涤操作。在一个特定的方面，本文中提供了包含本文中所述变体酶的洗涤剂添加物。该洗 涤剂添加物以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其他酶如蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、 另一种淀粉分解酶(例如另一种a “淀粉酶)、葡糖淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶、CGTase和/ 或纤维素酶、甘露聚糖酶(如来自Genencor分公司Danisco US Inc的MANNASTAR ))、果 胶酶、果胶裂合酶、角质酶和/或漆酶。通常，所选酶的特性应当兼容于所选择的洗涤剂(即，最适pH，与其他酶成分和非 酶成分的兼容性等)并且所述酶应当以有效量存在。蛋白酶合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。优选微生物 来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白 酶，优选地是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草蛋白酶，尤 其从芽孢杆菌属衍生的那些枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯 草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在W0 89/06279描述)。胰蛋白酶样蛋 白酶的例子是(例如猪或牛来源的)胰蛋白酶和在W0 89/06270与W094/25583中描述的 镰刀菌属(Fusarium)蛋白酶。有用蛋白酶的其他例子可以在W098/23732、W099/20770、W0 92/19729, W0 98/20115、W098/20116 和 W0 98/34946 中找到。优选的市售蛋白酶酶包括‘ALCALASE .SAVINASE 、PRIM ASE 、 DURALASE 、ESPERASE 和 KANNASE (来自 Novozymes A/ s)、MAXATASE 、maxacal、MAXAPEM 、PROPERASE 、 PURAFECT 、PURAFECT OXP 、FN2 、FN3 、FN4 (Genencorlnternational Inc.) 0
脂肪酶合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或 蛋白质工程化的突变体。有用脂肪酶的例子包括来自腐质霉属(Humicola)(同义词嗜 热真菌(Thermomyces))的脂肪酶，例如，如EP 258068和EP 305 216中所述的来自柔毛 腐质霉(H. lanuginosa) (T. lanuginosus)或如 TO 96/13580 中所述的来自 H. insolens 的 脂肪酶，假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(P. alcaligenes)或 类产碱假单胞菌(P. pseudoalcaligene) (EP 218272)、洋葱假单胞菌(P. cepacia) (EP331 376)、斯氏假单胞菌(P. stutzer) (GB 1，372，034)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)、假 单胞菌属(Pseudomonas spp.)菌株 SD 705 (W0 95/06720 和 W0 96/27002)、威斯康星假 单胞菌(P.wisconsinensis) (W0 96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌 (Dartois 等人(1993)，Biochemicaet Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢 杆菌(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B. pumilus) (W0 91/16422)。其他例子是脂肪酶 变体，如 W092/05249、W0 94/01541、EP 407225、EP 260105、W0 95/35381、W096/00292、W0 95/30744、W0 94/25578、W0 95/14783、W0 95/22615、W0 97/04079 和 W0 97/07202 中描述 的那些脂肪酶变体。优选的市售脂肪酶包括LIP0LASE 和 LIP0LASE ULTRA (Novozymes A/S)。淀粉酶也可以包括一种或多种额外的淀粉酶。合适的淀粉酶(a和/或0 )包 括细菌或真菌来源的那些淀粉酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括 例如从芽孢杆菌属、例如从GB 1，296，839中更详细描述的地衣芽孢杆菌的特定菌株获得 的a-淀粉酶。有用a-淀粉酶的例子是在W0 94/18314、W0 96/39528、W0 94/02597、W0 94/18314、W096/23873 和 W0 97/43424 中描述的变体。市售的a -淀粉酶是 DURAMYLtm、L1QUEZYMEtm、TERMAMYtm、NATALASEtm、FUNGAMYL 和 BAN (Novozymes A/S)、RAPIDASE 和 PURASTAR (来自 Genencor)。纤维素酶合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学修饰 的或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、木霉属 (Trichoderma)、腐质霉属、镰刀菌属、草根霉属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的 纤维素酶，例如在美国专利号4，435，307、美国专利号5，648，263、美国专利号5，691，178、 美国专利号5，776，757和W0 89/09259中公开的从Humicola insolens、嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila)禾口尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维 素酶。里氏木霉纤维素酶在美国专利号4，689，297、美国专利号5，814，501、美国专利号 5，324，649、W0 92/06221 和 W0 92/06165 中公开。市售的纤维素酶包括CELLUZYME 和CAREZYME (NovozymesA/ s)、 CLAZINASE 禾口 PURADAX HA (Genencor International Inc.)禾口 KAC-500 (B) (Kao Corporation)。过氧化物酶/氧化酶合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的 那些过氧化物酶/氧化酶。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用过氧化物酶的 例子包括来自鬼伞属(Coprinus)，例如，来自灰盖鬼伞(C. cinereus)的过氧化物酶和其变 体，如在W0 93/24618、W0 95/10602和W0 98/15257中描述的那些变体。市售的过氧化物酶包括GUARDZYME (Novozymes A/S)。洗涤剂酶可以通过添加含有一种或多种酶的独立添加物或通过添加包含全部这些酶的合并添加物被包含于洗涤剂组合物中。洗涤剂添加物(例如独立添加物或合并添加 物)可以配制为例如颗粒剂、液体剂、浆液剂等。优选的洗涤剂添加物制剂是颗粒剂，尤其 无尘颗粒剂，液体剂，尤其稳定化液体剂或浆液剂 。无尘颗粒剂可以如美国专利号4，106，991和4，661，452中所公开那样产生并且 可以任选地由本领域已知的方法包衣。蜡质包衣材料的例子是平均摩尔重量约1000至约 20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化 壬基苯酚；其中醇含有12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单位的乙氧基 化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸单酰甘油和二酰甘油和三酰甘油。在GB 1483591中 给出适用于流化床技术的成膜包衣材料的例子。液体酶制品可以根据建立的方法例如通过 添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸稳定化。可以根据EP 238，216中所述的方法 制备受保护的酶。洗涤剂组合物可以是任何便利的形式，例如，棒剂、片剂、粉剂、颗粒剂、糊剂或液 体剂。液体洗涤剂可以是含水的，一般含有多达约70%的水和0至约30%有机溶剂，或是 非含水的。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的、半 极性的、阴离子的、阳离子和/或两性离子的。表面活性剂一般以约0. 至约60%重量的 水平存在。当包含于洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有从约至约40%的阴离子表面活性剂 如直链烷基苯磺酸盐、α -烯基磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、乙氧基化脂肪醇醚硫 酸盐、仲烷基磺酸盐、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基或链烯基丁二酸或皂。当包含于洗涤剂中时，洗涤剂通常将含有从约0. 2%至约40%的非离子表面活性 剂如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚聚氧乙烯醚、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂 肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍 生物(“葡糖酰胺”)。洗涤剂可以含有0至约65%的洗涤剂增效助剂或络合剂，如沸石、二磷酸盐、三磷 酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙三胺五乙酸、烷基或链烯基 丁二酸、可溶性硅酸盐或分层硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、 聚(乙二醇)、聚乙烯醇、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸 酯、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗涤剂可以含有漂白系统，所述漂白系统可以包含H2O2源，如可以与形成过酸的 漂白激活物如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸盐组合的过硼酸盐或过碳酸盐。备选地，该漂 白系统可以包含过氧酸，例如酰胺型、亚酰胺型或砜型过氧酸。可以使用常规稳定剂，例如，多元醇，如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼 酸衍生物，例如芳族硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯硼酸稳定化洗涤剂组合物的 酶，并且该组合物可以如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。洗涤剂也可以含有其他常规洗涤剂成分，例如织物调理剂，包括粘土，泡沫促进 齐U，抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、抗污渍再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶助长剂、晦 暗抑制剂或香料。
目前构思的是在洗涤剂组合物中，可以添加任意酶，尤其本文中所述的一种或多 种变体酶，例如，以每升洗液约0. Olmg至IOOmg酶蛋白。在一个实施方案中，使用每升洗液 约0.055mg酶蛋白。在其他实施方案中，使用每升洗液约0. Img至约1. Omg酶蛋白。 本文中所述的一种或多种变体酶可以额外地掺入在并入本文作为参考的WO 97/07202中公开的洗涤剂制剂。10. 4餐具洗涤用洗涤剂组合物所述酶也可以用于餐具洗涤用洗涤剂组合物中，所述组合物包括1)粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂 0.4-2.5%硅酸钠0-20%二硅酸钠3-20%三磷酸钠20-40%碳酸钠0-20%过硼酸钠2-9%四乙酰乙二胺(TAED)1-4%硫酸钠5-33%酶0.0001-0.1%2)粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂1-2%(例如，脂肪醇乙氧基化物)二硅酸钠2-30%碳酸钠10-50%膦酸钠0-5%二水合柠檬酸三钠9-30%次氮基三乙酸钠(NTA)0-20%一水合过硼酸钠5-10%四乙酰乙二胺(TAED)1-2%聚丙烯酸酯聚合物6-25%(例如马来酸/丙烯酸共聚物)酶0.0001-0.1%香料0. 1-0. 5%/K5-10%3)粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂0.5-2.0%二硅酸钠25-40%柠檬酸钠30-55%碳酸钠0-29%碳酸氢钠0-20%一水合过硼酸钠0-15%
四乙酰乙二胺(TAED)0-6%马来酸/丙烯酸共聚物0-5%粘土1-3%
聚氨基酸0-20%聚丙烯酸钠0-8%酶0.0001-0.1%4)粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂1-2%沸MAP15-42%二硅酸钠30-34%柠檬酸钠0-12%碳酸钠0-20%一水合过硼酸钠7-15%四乙酰乙二胺(TAED)聚合物0-3%0-4%马来酸/丙烯酸共聚物0-5%有机膦酸盐0-4%粘土1-2%酶0.0001-0.1%硫酸钠平衡5)粉末自动餐具洗涤组合物非离子表面活性剂1-7%二硅酸钠18-30%柠檬酸三钠10-24%碳酸钠12-20%单过硫酸盐15-21%(2KHS05. KHSO4. K2SO4)漂白稳定剂0.1-2%马来酸/丙烯酸共聚物0-6%二乙烯三胺五乙酸五钠盐 0-2.5%酶0.0001-0.1%硫酸钠，水平衡6)具有清洁表面活性剂系统的散剂和液体餐具洗涤组合物非离子表面活性剂0-1.5%二水合N-氧化十八烷基二甲胺0-5%二水合N-氧化十八烷基二甲胺与二水合N-氧化 0-4%十六烷基二甲胺的80 20重量C18/C16掺合物无水N-氧化十八烷基二(羟乙基)胺与无水N-氧化 0-5%十六烷基二(羟乙基)胺的70 30重量C18/C16掺
合物具有平均乙氧基化度3的C13-C15烷基乙氧基硫酸 0-10%酯具有平均乙氧基化度3的C12-C15烷基乙氧基硫酸 0-5 %酉旨
具有平均乙氧基化度12的C13-C15乙氧基化醇0-5%具有平均乙氧基化度9的C12-C15乙氧基化醇的掺 0-6. 5%合物具有平均乙氧基化度30的C13-C15乙氧基化醇的0-4%掺合物二硅酸钠0-33%三聚磷酸钠0-46%柠檬酸钠0-28%柠檬酸0-29%碳酸钠0-20%一水合过硼酸钠0-11.5%四乙酰乙二胺(TAED)0-4%马来酸/丙烯酸共聚物0-7. 5%硫酸钠0-12.5%酶0.0001-0.1%7)非含水液体自动餐具洗涤组合物液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)2. 0-10. 0%碱金属硅酸盐3.0-15.0%碱金属磷酸盐20.0-40.0%选自高级二醇、聚二元醇、多氧化物、25.0-45.0%二元醇醚的液体载体稳定剂(例如，磷酸与C16-C18链烷醇的偏酯)0. 5-7. 0%抑泡剂(例如硅氧烷)0-1.5%酶0.0001-0.1%8)非含水液体餐具洗涤组合物液体非离子表面活性剂(例如脂肪醇乙氧基化物)2. 0-10. 0%硅酸钠3.0-15.0%碱金属碳酸盐7.0-20.0%柠檬酸钠0.0-1.5%稳定系统(例如，精细分散的硅氧烷0.5-7.0%与低分子量二烷基聚二元醇醚的混合物)低分子量聚丙烯酸酯聚合物5.0-15.0%粘土凝胶增稠剂(例如膨润土 )0.0-10.0%羟丙基纤维素聚合物0.0-0.6%
酶0.0001-0.1%选自高级二醇、聚二元醇、多氧化物、平衡二元醇醚的液体载体9)触变的液体自动餐具洗涤组合物C12-C14 脂肪酸0-0.5%嵌段共聚物表面活性剂1.5-15.0% 柠檬酸钠0-12%三聚磷酸钠0-15%碳酸钠0-8%三硬脂酸铝0-0.1%枯烯磺酸钠0-1.7%聚丙烯酸酯增稠剂1.32-2.5%聚丙烯酸钠2.4-6.0%硼酸0-4.0%甲酸钠0-0.45%甲酸钙0-0.2%正癸基二苯醚二磺酸钠0-4.0%单乙醇胺(MEA)0-1. 86%氢氧化钠(50%)1. 9-9. 3%1，2_ 丙二醇0-9.4%酶0.0001-0.1%抑泡剂、染料、香料、水平衡10)液体自动餐具洗涤组合物脂肪醇乙氧基化物0-20%脂肪酸磺酸酯0-30%十二烷基硫酸钠0-20%烷基多苷0-21%油酸0-10%一水合二硅酸钠18-33%二水合柠檬酸钠18-33%硬脂酸钠0-2.5%一水合过硼酸钠0-13%四乙酰乙二胺(TAED)0-8%马来酸/丙烯酸共聚物4-8%酶0.0001-0.1%11)含有受保护的漂白剂颗粒的液体自动餐具洗涤组合物硅酸钠5-10%焦磷酸四钾15-25%三磷酸钠0-2%
碳酸钾4-8%受保护的漂白剂颗粒，例如，氯 5-10%高分子型增稠剂0.7-1.5%氢氧化钾0-2%酶0.0001-0.1%
水平衡12)如1)、2)、3)、4)、6)中所述的自动餐具洗涤组合物，其中过硼酸盐被过碳酸盐替代。13)如1)_6)中所述的自动餐具洗涤组合物，其额外地含有锰催化剂。所述锰催 化剂可以例如是“用于低温漂白作用的高效锰催化剂”(〃 Efficientmanganese catalysts for low-temperature bleaching" )，Nature 369:637-639(1994)中所述的化合物之一。
14)高级HDL液体洗涤剂配方Bio-Soft S-101 直链烷基苯磺酸Steol CS-330 月桂基聚氧乙烯醚硫酸钠Bio-soft N25-7 具有7摩尔EQ的直链烷基乙氧基化物Stepanate SXS 二甲苯磺酸钠15)超级液体洗涤剂配方Tionopal CBS-X 荧光增白剂Alpha-step MC-48 α-磺基甲酯钠Makon TD-6十三烷醇乙氧基化物11.包含变体α -淀粉酶的组合物在本公开的几个方面之一，本公开提供了组合物，其包含a)至少一种变体α-淀粉酶，其包含与亲本AmyS样α -淀粉酶的氨基酸序列至 少95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替 换，该变体具有可检测的α-淀粉酶活性，和b)至少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、 碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。在优选的实施方案中，与亲本AmyS样α -淀粉酶或参考淀粉酶相比，该变体在可 能改变其对于某些应用(例如本文中所述的商业过程)的用途或性能的一种或多种特方面 改变。改变的特性可以包括任意特性，例如，净电荷、底物特异性、底物切割、底物结合、热稳 定性、在一个或多个PH处的活性、在一个或多个ρΗ处的稳定性、氧化条件下的稳定性、Ca2+ 需求、比活性、催化速率、催化效率、在螯合剂存在下的活性、在螯合剂存在下的热或PH稳 定性、退浆用途或清洁过程的用途、或在蛋白质表达系统中的表达量。如技术人员会理解， 这些改变的特性优选地对淀粉酶的终端用户或生产者有用。可以使用序列已知或轻易确定的多种淀粉酶作为参考淀粉酶。在多个实施方案 中，参考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在一些实施方案中，亲本淀粉酶和参考淀粉酶可以是 相同的淀粉酶。在某些实施方案中，该组合物是用于衣物、餐具或硬表面清洁、退浆、或者织物或 污渍处理的产品的组分。例如，该组合物可以是作为液体剂、半固体剂、固体剂等使用的餐具洗涤用洗涤剂的部分，或它可以是颗粒或液体衣物洗涤剂制剂。该组合物包含对预期应 用所需要的额外组分。本文中提供了许多此类制剂的例子并且还有其他例子将是本领域技 术人员熟悉的。在一个实施方案中，该组合物包含额外的酶，所述额外的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀 粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶、果胶酶、裂合酶、角质酶、漆酶或其它有用酶。技术人 员将熟悉这些酶和连同本文中提供的变体淀粉酶一起使用的其他酶。对于给定应用，可以 经验地确定有用的酶的量，然而，本文中提供了指南，例如，在实施例中。在多个实施方案中，该组合物包含一种或多种表面活性剂。该表面活性剂是非离 子的、阴离子的、阳离子的或两性离子的、或它们的组合。在一个实施方案中，该淀粉酶变体优选地是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T变体。对于某些用途，如在洗涤和清洁实施方 案中的用途，对氧化作用的稳定性和对螯合剂或改变的金属离子浓度的稳定性是有用的。 因此，在多个实施方案中，该变体淀粉酶具有针对氧化作用的改变稳定性并且该变体还包 括一个或多个甲硫氨酸残基的缺失或替换，包括位于亲本淀粉酶第8、9、96、200、206、284、 307、311、316和438氨基酸位置处的残基，其中参考淀粉酶是SEQ ID N0:1或2。变体淀粉 酶还可以在与参考淀粉酶(其优选地是SEQ ID而1或2)第97、179、180、193、319、349、 358、416、428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸序列修饰。
在多个实施方案中，该变体包含或还包含一个或多个在如下位置处的替换在第 349氨基酸位置处的半胱氨酸、在第428氨基酸位置处的半胱氨酸、在第97氨基酸位置处的 谷氨酸、在第97氨基酸位置处的精氨酸、在第319氨基酸位置处的谷氨酸、在第319氨基酸 位置处的精氨酸、在第358氨基酸位置处的谷氨酸、在第358氨基酸位置处的精氨酸、在第 443氨基酸位置处的谷氨酸或在第443氨基酸位置处的精氨酸。另外，在一个实施方案中，该变体包含附93或V416或这二者的替换，例如，作为 N193F或V416G或这二者的替换。其他实施方案包括进一步的修饰，如在位置F178、R179、 G180、1181、G182和K183处的一个或多个氨基酸缺失。如本文中其他地方所描述，当以成 对方式或更多方式提供时，此类缺失可以是甚至更有用的。优选地，在此类实施方案中，该 变体在不存在添加的钙或在螯合剂存在下或在不存在添加的钙和在螯合剂存在下的组合 情况下具有改变的金属离子依赖性或改变的稳定性或活性。此类变体也可以在清洁和洗涤 过程中具有极好的应用。在一个实施方案中，该变体淀粉酶与SEQ ID NO 2具有至少95%同源性并且相对 于包含氨基酸序列SEQ ID NO :1的参考淀粉酶中的编号而言包含第242位氨基酸替换。如 同本文中所述的其他实施方案那样，该变体优选地具有可检测的α-淀粉酶活性，尤其在 使用条件下。在某些目前优选的实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、 11、12、15或16，并且参考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在多个实施方案中，该变体淀粉酶在非常低和非常高的ρΗ的洗涤过程中具有改 善的性能。在一个实施方案中，洗涤性能在PH >约8相对于亲本淀粉酶被改善。更优选的 是在约PH 8.5至约？!1 11以上具有改良洗涤性能的那些变体。在一个实施方案中，相对于参考淀粉酶(例如SEQ ID NO :1或2淀粉酶序列)，该变体包含 a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、 Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的成组替换。在本公开的另一方面，提供了包含至少一种变体淀粉酶的洗涤剂或清洁制剂，所 述的变体淀粉酶包含与亲本AmyS样α -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列。 所述淀粉酶变体在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换并具有可 检测的α-淀粉酶活性。优选地，参考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。该洗涤剂或清洁制剂优选地包含淀粉酶变体，所述淀粉酶变体是至少包含S242A、 S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 替换的 S242 变 体。如同上文所提供的组合物那样，该变体可以包含任一本文中所公开的变体特征和改变 或者包含它们的组合。在本公开几个方面的另一个方面，本公开提供了试剂盒。该试剂盒的一个实施方 案包含
a) 一种或多种变体α -淀粉酶，所述变体α -淀粉酶包含与亲本AmyS样α -淀粉 酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的氨 基酸位置处具有替换，该变体具有可检测的α -淀粉酶活性，和b)至少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、 碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。在一个实施方案中，该试剂盒还包含在用于织造材料退浆或洗涤或清洁用含淀粉 物质弄脏的一种或多种物品的方法中使用该试剂盒的说明书。技术人员还会理解也提供了用于制备所述α -淀粉酶的试剂盒。所述试剂盒提供 了用作亲本α-淀粉酶和参考淀粉酶的代表性序列例如氨基酸序列和/或从其衍生的核酸。12.在退浆和洗涤/清洁过程中使用淀粉酶变体在另一方面，本公开提供了在织物或其他织造材料的退浆和在洗涤或清洁过程中 使用变体α-淀粉酶的方法。在一方面，本公开提供了织造工艺后退浆织造材料的方法。所述方法通常地包含 将织造材料与变体α“淀粉酶在有效用于至少部分地从织造材料去除浆料的条件和时间 下接触。该变体包含与亲本AmyS样α -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列 并在与参考α-淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换。该变体具有可检测的 α-淀粉酶活性。与亲本AmyS样α -淀粉酶或参考淀粉酶相比，该变体优选地在一个或多个物理或 酶学特性上改变。在多个实施方案中，该淀粉酶在以下一个或多个特征方面改变净电荷、 底物特异性、底物切割、底物结合、热稳定性、在一个或多个PH处的活性、在一个或多个ρΗ 处的稳定性、氧化条件下的稳定性、Ca2+需求、比活性、催化速率、催化效率、在螯合剂存在下 的活性、在螯合剂存在下的热或PH稳定性、退浆效能或在蛋白质表达系统中的表达量。上文讨论了参考淀粉酶，并且在该方法的一个实施方案中，参考淀粉酶是SEQ ID NO :1 或 2。在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16，并且参考淀粉酶是SEQ ID N0:1或2。在某些实施方案中，所述变体是S242A、S242D、 S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。该淀粉酶变体可以还包含一个或多个在如下位置处的替换在第349位置处的半 胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处的谷氨酸、在第97位置处的精氨酸、在 第319位置处的谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、在第358位置处的谷氨酸、在第358位置 处的精氨酸、在第443位置处的谷氨酸或在第443位置处的精氨酸，其中参考淀粉酶是SEQ ID NO 1 或 2。在另一方面，本文中提供了洗涤或清洁的方法。尽管洗涤和清洁操作经常可以得 益于包含一种或多种酶活性，然而洗涤或清洁过程可以使酶(包括淀粉酶)经历极端条件 并对酶活性的极限提出挑战。因此，所提供的方法包括将待洗涤或清洁的一个或多种物品 与包含变体α “淀粉酶的组合物接触，其中所述变体α “淀粉酶包含与亲本AmyS样α -淀 粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并在与参考α -淀粉酶第242位置相对应的 氨基酸位置处具有替换。该变体优选地具有可检测的α-淀粉酶活性，并且接触步骤在有 效用于至少部分地洗涤或清洁所述一种或多种物品的条件和时间下进行。优选地，一种或 多种物品中的至少一种物品用至少一种含淀粉材料弄脏，所述含淀粉材料的去除受变体淀 粉酶辅助。
在一个实施方案中，该组合物还包含洗涤剂组合物或清洁制剂的至少一种组分。 例如，该组合物包含一种或多种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、 酸化剂、碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。在一个实施方案中，亲本α-淀粉酶可以是任一 SEQ ID NO 1、2、6、7、8、9、10、11、 12、15或16，并且参考淀粉酶是SEQ ID Ν0:1或2。在某些实施方案中，亲本α -淀粉酶便 利地是SEQ ID NO :1、2、15或16，而在其他实施方案中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO :6、7、 8、9、10、11 或 12。在目前优选的实施方案中，该变体是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、 S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T变体。在某些实施方案中，该参考淀粉酶是SEQ ID NO :1 或 2，并且该变体是 S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、 S242Q 或 S242T 变体。在多个实施方案中，例如，当该变体是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、S242H、 S242L、S242M、S242N、S242Q或S242T变体的情况下，该变体还在与参考淀粉酶第97、179、 180、193、319、349、358、416、428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处包含 序列修饰。更特别地，在多个实施方案中，该变体包含一个或多个在如下位置处的替换在 第349位置处的半胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处的谷氨酸、在第97 位置处的精氨酸、在第319位置处的谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、在第358位置处的 谷氨酸、在第358位置处的精氨酸、在第443位置处的谷氨酸或在第443位置处的精氨酸。 Ν193或V416或这二者的替换，如N193F或V416G或这两者的替换也用于某些变体中。在其他实施方案中，该变体包含在任一特定位置F178、R179、G180、1181、G182和 Κ183处的一个或多个氨基酸的缺失。在此类实施方案中，变体优选地在不存在添加的钙或 在螯合剂存在下具有改变的金属离子依赖性或改变的稳定性或活性。如同其他修饰那样， 前述氨基酸缺失也可以单独地或与任意的前述改变组合地使用。
该变体一般相对于亲本淀粉酶在洗涤过程中例如在如pH >约8的条件下具有改 善的性能。在一个目前优选的实施方案中，所述方法包括使用变体，其中所述变体包含a) Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b)Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、 Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g)Q97E、Q443E ；h)Q319R、Q358E、 Q443E ；或 i)Q319R、Q358R、Q443E 的成组替换。本公开在后续实施例中包括进一步细节，所述实施例不意图以任何方式限制所要 求的范围。附图是所提供说明书和描述的必要部分。所引用的全部参考文献通过引用方式 在本文中对其中所述的全部那些内容特别地并入。因而提供了以下实施例以说明，但不用 于限制所要求保护的内容。
实施例实施例1-变体的构建 使用位点定向诱变法构建在AmyS的成熟序列第S242位置处的变异。用于 诱变的模板是来自New England Biolabs (马萨诸塞州)的使用dam甲基化酶的甲基 化 pHPLT-AmyS (见图 2)。在 Operon (Huntsville，AL)合成简并引物(S242F(正向)和 S242R(反向)，下文分别给出)并稀释至10 μ M，互补性正向和反向序列均含有用于反应 中连接的5’磷酸酯基团。亲本α-淀粉酶的序列(SEQ ID NO 2)附于本申请中。使用在 靶位置处以NN(G/C)随机化的寡核苷酸引物，以Stratagene Quik-Change 多位点试剂盒 (Stratagene，La Jolla CA)创建文库。所选择的氨基酸(即S242)随机地用全部19种可 能备选物替换。用于诱变的S242引物S242 F 5，[PhosjGTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG 3，SEQ ID NO 17S242 R 5，[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3，SEQ ID NO 18反应如下进行QUIK-CHANGE 反应该反应由18μ L无菌蒸馏水、2. 5μ L来自该试剂盒的IOx缓冲液、1 μ L来自该 试剂盒的dNTP、1.25yL正向引物(10 μ M母液)、1· 25 μ L反向引物(10 μ M母液)、lyL pHPLT-AmyS质粒DNA作为模板(约70ng)和1 μ L来自该试剂盒的酶掺合物组成，总计 26. 5 μ L0循环条件循环条件是95°C 1分钟，进行一次，随后95°C 1分钟、55°C 1分钟、65°C 10分钟， 25个循环。将1 微升 Dpn I (lOU/μ L)添加至 Multi-Site Quik-Change 反应混合物并在 37°C温育18小时，并随后添加另一份0. 5 μ L Dpn I温育额外3小时。使用1微升DpnI消化的反应物作为采用TEMPLIPHI扩增试剂盒(Amersham Biosciences, Piscataway，NJ)的滚环复制的模板并且根据Amersham方案进行反应。将1微升滚环DNA转化至100 μ L枯草芽孢杆菌感受态细胞(2种蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌菌 株(AaprE, AnprE, amyE: xylRPxylAcomK-phIeo))并在 37°C振摇 1 小时。随后将全部 转化物涂布在LA+10ppm新霉素+1%不溶性淀粉平板(一个平板上涂布25 μ L，另一个平 板上涂布75 μ L)并在37°C温育过夜。用96针复制工具将过夜平板印在一个大LA+10ppm Neo+1%不溶性淀粉平板上并提交至Quintara Biosciences (Berkeley, CA)用于菌落PCR 和测序。在确定变体序列后，将变体挑入含有125 μ L LB+10ppm Neo的96孔微量滴定平 板，将所述变体排列成带对照的四重样式(quad format)。排列的微量滴定平板在37°C 和250转/分钟培育6小时。利用复制器(荷兰莱顿Enzyscreen)，使用微量滴定培养 平板来来接种含有150 μ 1用于蛋白质表达的MBD培养基(G. Vogtentanz等人，产生大 豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的枯草芽孢杆菌融合蛋白系统(“A Bacillus subtilis fusion proteinsystem to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor"),Prot. Expr.&Purif. ,55 =40-52,2007)并补充有用于蛋白质表达的5mM CaCl2的一个新微量滴定 平板(微量滴定平板和平板盖来自荷兰莱顿Enzy screen)。将表达平板在37 °C、250转/分 钟和70%湿度培育64小时。随后，表达培养物经微滤板(0. 22 μ m，Mi 11 ipore,Billerica, ΜΑ)过滤并筛选改善的热稳定性(见实施例3)。实施例2-变体的表达、纯化和表征 将菌落从实施例1的微量滴定平板划线到具有IOppm新霉素的淀粉平板。平板 在37°C温育过夜并挑取单菌落并用来接种含有培养基(见下文)和20ppm新霉素的摇 瓶(250mL，具有25mL培养基)。培养物在37°C，275转/分钟培育约8小时(直至达到 0D(600nm)2.0)。将培养物肉汤与50%甘油以2 1比率混合，置入分别标记的培养小瓶并 冷冻于-80°C。随后从这些甘油贮藏物产生所选择的α-淀粉酶。α -淀粉酶发酵在500mL摇瓶内37°C培育含有1 % (w/v)大豆胨的极限MOPS培养 基(Neidhardt 等人，J. Bacteriol. 119(3) :736_747，1974)60 小时实施。使用如下疏水性 相互作用层析从发酵肉汤纯化酶将肉汤浓缩10倍，随后用含有IM硫酸铵的50mM MES, 2mM CaCl2, pH 6. 8稀释复原至其原始体积，随后使用玻璃纤维滤器无菌过滤。样品随后上载到 用同一种缓冲液预平衡的苯基SEPHAR0SE FF高密度柱(20x95mm ；Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden)上。用10个柱体积的无硫酸铵的相同缓冲液，随后用5个柱体积的 水除去非淀粉酶蛋白质。用含有40%丙二醇的50mM MES,2mM CaCl2, pH 6. 8洗脱目的酶。用标准定量SDS PAGE凝胶光密度测定法；或者使用来自Megazyme (Wicklow， Ireland)的标准淀粉酶测定试剂盒，利用活性测定法确定蛋白质浓度。利用纯化淀粉酶 (芽孢杆菌属707淀粉酶；SEQ ID NO 6)生成的标准曲线用于比较所测定数据。实施例3-确定改变的特性热应激本实施例显示本文中所述的变体可以相对于亲本α -淀粉酶具有改变的特性。实 施嗜热脂肪土芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)变体的高通量热稳定性筛选。在初步研究后，如下选择热应激条件，使得野生型酶在热应激后大致显示40%初 始(应激前)活性(即，(热应激后活性)/(热应激前活性)大致是0. 4)。一式四份筛选 突变体文库并且将潜在胜出者鉴定为热应激后显示比野生型酶的平均残余活性高至少2 个标准差的残余活性的那些突变体。
淀粉酶表达在表达平板的培养上清液中是大约lOOppm。在37°C于加湿摇床(250 转/分钟和70%r相对湿度)中生长60-65小时后，使用滤板澄清培养上清液以除去细胞物 质。将澄清的上清液 10 倍稀释到含有 50mMNa0Ac/2. 6mM CaCl2/0. 002% Tween_20，pH 5. 8 的缓冲液中，至终浓度大约lOppm。将每种上清液的一个等份试样进一步稀释成0. 02ppm， 以使用荧光标记的谷物淀粉底物如下文所述确定酶变体的活性。每种上清液的第二等 份试样在热循环仪中经历95°C热应激30分钟，随后在50mMNa0Ac/2. 6mM CaCl2/0. 002% Tween-20,pH 5. 8中稀释成0. 02ppm，并使用下文所述荧光底物和测定法测定残余活性。使 用淀粉酶ENZCHECKULTRA AMYLASE测定试剂盒基本上如制造商(Invitrogen，San DiegoCA) 所述确定淀粉酶活性。该测定法中淀粉酶的终浓度是大约0.02ppm。测试缓冲液是50mM Na0Ac/2. 6mM CaCl2/0. 002% Tween-20, pH 5.8。底物是 BODIPY 荧光染料缀合的来自谷 物的 100yg/mL DQ 淀粉(Invitrogen, Eugene, OR)。使用 SpectraMAX M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)测量表示淀粉酶活性的增加的荧光。用记录动态模式的仪器在室 温监测反应5分钟。激发波长是485nm ；用515nm的截止滤光片在520nm监测发射。野生 型AmyS(Xtra)在经历95°C热应激30分钟后显示33-43%残余活性。AmyS变体S242A和 S242Q在相同热应激条件后仍分别保留55-65%和70-80%残余活性。见图3和表3_1。这 些残余活性量值表明这两种变体比野生型α-淀粉酶更热稳定。表3-1 每种变体的残余活性百分数。野生型(SPEZYME XTRA)。如所示，每块平板 包括 SPEZYME ETHYL 和 SPEZYME XTRA 作为对照。
实施例4-确定改变的特性DSC使用疏水性相互作用层析法从摇瓶发酵肉汤(见实施例2)纯化Spezyme Xtra, S242A、S242E 和 S242Q。使用含有 40%丙二醇和 2mMCaCl2 的 50mM MES, pH 6. 8 从该柱以 纯化的形式洗脱蛋白质。使用超敏感扫描高通量微量量热器VP-CAP DSC (MicroCal, Inc. , Northampton, ΜΑ)测量过量热容量曲线。已经公开了 DSC测量的标准方法和该技术的理论(E. Freire，“差 示扫描量热法(Differential ScanningCalorimetry)，”Methods. Mol. Biol. 41，191-218， 1995)。在30-120°C温度范围扫描大约500 μ L的0. 5mg/mL野生型嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀 粉酶或变体S242A、S242E和S242Q (均在2mM氯化钙不存在和存在时)。随后再扫描相同 样品以检查该过程的可逆性。对于α-淀粉酶，热解折叠过程是不可逆的。使用的缓冲液 是IOmM乙酸钠，pH 5. 5。使用200°C /小时扫描率来使本来可能因聚集引起的任何人造物 最小化。使用DSC曲线的热中点(Tm)作为所测试蛋白质的热稳定性的指示。表4-1显示 所测试淀粉酶蛋白质的热熔点。图5中显示野生型和变体淀粉酶的热熔融曲线和熔点。与野生型的熔点相比时，淀粉酶变体S242A、S242E和S242Q在2mM氯化钙不存在 和存在下的热解折叠过程显示变体的熔点明显提高。在不存在添加的氯化钙的情况下，野 生型淀粉酶具有100. 8°C热熔点，而S242A、S242E和S242Q的Tm分别是106. 5°C >107. 8°C和110. 1°C。因而，S242替换为A引起Tm提高5.7°C;S242替换为E引起Tm提高7°C;并且 S242替换为Q引起Tm提高9. 3°C。在2mM氯化钙存在下，野生型淀粉酶显示106. 8°C的热熔点，而S242A、S242E和 S242Q的Tm分别是111. 8°C、112. 2°C和113. 8°C。因而，相对于钙不存在下的量值，在2mM 氯化钙存在下，全部4种蛋白质具有提高的Tm值。野生型和S242A变体在钙存在下的Tm提 高分别是6°C和5.3°C。S242E变体的Tm提高是4.4°C。S242Q变体的Tm提高是3. 7°C。这 提示S242Q变体更少地被钙稳定化，或就稳定性而言，该变体更少依赖于钙。在氯化钙存在 下S242A、S242E和S242Q相对于野生型的Tm提高分别是5°C、5. 4°C和3°C。这提示所述变 体的热动力学特性不同于野生型或Spezyme Xtra的那些热动力学特性。这个观察结果与 应用研究中其增强的性能相一致(见实施例5)。表4-1由DSC确定的多种淀粉酶的Tm(°C ) 实施例5-活性特征该实施例显示所测试变体不仅相对于亲本α -淀粉酶，还相对于工业标准酶具有 改变的活性特征。在纯化样品或平板样品上进行蛋白质确定。基于相等蛋白质浓度分别测 试变体和标准α-淀粉酶。使用ρΗ 5. 6苹果缓冲液，将平板变体或纯化变体稀释成大约20ppm。底物由相同 50mM苹果酸缓冲液，ρΗ 5. 6中的15%谷物淀粉组成。将400微升淀粉混悬液平衡至70°C 持续2. 5分钟。将七(7) μ L稀释的酶以约0. 36ppm蛋白质终浓度迅速添加至平衡的淀粉。 反应混合物随后置入预热至85°C的振摇加热器并以300转/分钟混合。反应用50μ L的 125mM NaOH在预定时间间隔猝灭。将反应管离心并将上清液按10倍稀释到IOmMNaOH中， 以通过HPAEC-PAD分析DP谱。在4、10和20分钟建立反应。4分钟反应提供产物至底物的酶初始转化过程的指 示；10分钟反应提供酶热活性的指示并且20分钟反应提供酶热稳定性的指示。将从DP2至HPLC运行结束的总面积集成并除以总蛋白质和反应时间。结果在图 6和7中提供。实施例6-额外的方法在实施例中使用以下测定法。在实施例中通常显示了对下文所提供方案的偏离。在这些实验中，使用分光光度计来测量反应期间所形成产物的吸光度。A.蛋白质含量确定BCA(双喹啉-4-羧酸 Mcinchoninic acid))测定法使用BCA(Pierce)测定法在微量滴定平板(MTP)规格上确定样品中的蛋白质浓 度。使用的化学品和试剂溶液是BCA蛋白质测定试剂和Pierce稀释缓冲液(50mM MES, pH 6. 5,2mM CaCl2,0. 005 %TWEEN - 80) 设备包括 SpectraMAX (340 型；Molecular Devices)MTP 读数仪。MTP 从 Costar 获得(9Ol7 型)。将二百(200) μ 1 BCA试剂移入各孔，随后移入20 μ 1稀释的蛋白质。彻底混合 后，MTP在37°C温育30分钟。除去气泡，此后在562nm处读取孔中溶液的光密度(OD)。为 确定蛋白质浓度，从样品读数中扣除背景读数。对蛋白质标准物(纯化的酶)标出OD562以 产生标准曲线。从该标准曲线内推样品的蛋白质浓度。Bradford测定法使用Bradford染料试剂(Quick Start)测定法在MTP规格上 确定样品中的蛋白质浓度。使用的化学品和试剂溶液是快速启动Bradford染料试剂 (BIO-RAD 目录号 500-0205)、稀释缓冲液(IOmM NaCl,0. ImM CaCI2,0. 005%TWEEN -80)。使用的设备是 Bionmek FXRobot (Beckman)和 SpectraMAX(340 型)MTP 读数仪。MTP 来自 Costar (9017 型)。将二百(200) μ 1 Bradford染料试剂移入各孔，随后移入15 μ 1稀释缓冲液。添 加10 μ 1滤过的培养肉汤至诸孔。彻底混合后，MTP在室温温育至少10分钟。吹去气泡并 且在595nm处读取每孔的0D。为测定蛋白质浓度，从样品读数中扣除背景读数(即来自非 温育孔的读数)。所获得的OD595值提供了样品中蛋白质含量的相对量值。B.用于测试酶性能的微量样品测定法在本测定法中使用的洗涤剂不含酶或已经通过如本文件中其他地方所述的热灭 活法摧毁商业洗涤剂中存在的酶。使用的设备包括Eppendorf热混合仪和SpectraMAX (340 型)MTP读数仪。MTP从Costar获得(9017型)。洗涤剂制备(AATCC HDL ；美国条件)将Milli-Q水调节至6gpg水硬度(Ca/Mg = 3/1)，并添加无增白剂的1.5g/l AATCC 2003标准参考液体洗涤剂。剧烈地搅拌洗涤剂溶 液至少15分钟。然后，添加5mM HEPES (无酸)并调节pH至8. 0。用于测试淀粉酶性能的稻淀粉微量样品测定法如本文件中其他地方所述制备试 验洗涤剂。使用的设备包括New Brunswick Innova 4230摇床/恒温箱和SpectraMAX (340 型)MTP读数仪。MTP从Corning获得(3641型)。具有橙色色素样品的老化稻淀粉(CS-28) 从(荷兰弗拉尔丁恩)试验材料中心(Center for Test Materials)获得。在切成0. 25 英寸圆形微量样品前，该织物用水洗涤。将两份微量样品置于96孔微量滴定平板的每个孔 中。在20°C (北美)或40°C (西欧)平衡试验洗涤剂。将190 μ L洗涤剂溶液添加至MTP 的含有微量样品的每个孔。向该混合物添加10 μ L稀释的酶溶液。MTP用粘性箔密封并置 于恒温箱中1小时，同时在所需的试验温度(通常20°C或40°C )以750转/分钟混合。温 育后，从每个孔转移150 μ L溶液至一个新鲜MTP中并在488nm处使用SpectraMAX MTP读 数仪读数以量化清洁作用。还包括空白对照以及含有微量样品和洗涤剂但不含酶的对照。酶性能的计算所获得的吸光度值对空白值校正(即在无酶时温育微量样品后获得的吸光度值)。所得吸光度是水解活性的量值。
C.通过抗体滴定确定淀粉酶浓度在一些情况下，通过用抑制性多克隆抗体滴定确定α-淀粉酶的浓度和比活性。 发现针对嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(AmyS)产生的多克隆抗体强烈地抑制AmyS和来自 芽孢杆菌物种TS-23的α -淀粉酶(例如，结合牢固足以产生活性丧失的线性滴定)。因 而，这种抗体可以用来测量酶浓度，后者转而用来计算比活性。简而言之，测量了由抗体的几个已知浓度引起的酶抑制作用的量。从这个信息外 推出完全抑制作用所需的抗体浓度，该抗体浓度等价于样品中的酶浓度。使用产生荧光的 BODIPY-淀粉测定法测量α -淀粉酶活性和抑制作用。缓冲液是含有0. 005% Tween-80的 pH 7. 0 的 50mM MOPS。针对纯化AmyS的多克隆抗体在兔中产生并由标准方法纯化。通过测量对比活性 已知的AmyS样品的抑制作用，确定了抗体贮存液的经验性“表观浓度”值。抗体样品用来 确定AmyS和TS23t变体的浓度和比活性。使用这些值来产生归一化96孔酶贮存平板，其 中将全部变体稀释至常见浓度。D.天然蛋白凝胶电泳使用PHASTGEL系统(GE Healthcare)在7. 5%或12. 5%浓度的预制天然聚丙烯 酰胺凝胶(PHASTGEL Homogeneous)上测量变体蛋白质样品的电泳迁移率。使用缓冲带 (PHASTGEL Native)并且它由0. 88M L-丙氨酸，0. 25M Tris缓冲液中的pH 8. 8组成。一 般运行条件由400V持续12. 75分钟，阳极至阴极距离3. 7cm组成。备选地，通过选择合适缓冲系统，在多个pH值(即5. 8、8. 0和10. 0)的Imm厚度 0. 5-1. 5%琼脂糖凝胶上测量变体蛋白质样品的电泳迁移率。电泳在非变性条件下实施。阴 极-阳极长度是13. 9cm。1-2 yg蛋白质样品与5%甘油+0. 05%溴酚蓝混合并加到每个泳 道上。凝胶一般在100V运行1小时。凝胶用溶解在10%乙酸中的Louiseville蓝染料染色并用10%甲醇和10%%酸 性酸水溶液脱色。根据使用的天然凝胶系统，同时加载12种至20种蛋白质变体。结果，相 对于在相同凝胶上加载的电荷标准物梯，可以立即评估蛋白质变体的电泳迁移率。E.洗涤剂热失活商业洗涤剂配方的热失活起到摧毁任意蛋白质组分的酶活性而保留非酶组分特 性的作用。因而，这种方法适于制备商业购买的洗涤剂或用于测试酶变体。对于北美(NA) 和西欧(WE)重垢液体衣物(HDL)洗涤剂，通过将(玻璃瓶子中)预称重的液体洗涤剂置于 95°C水浴中2小时进行热失活。用于热失活北美(NA)和日本(JPN)重垢颗粒衣物(HDG) 洗涤剂的温育时间是8小时而西欧(WE)HDG洗涤剂的该温育时间是5小时。用于热失活NA 和WE自动餐具(ADW)洗涤剂的温育时间是8小时。所述洗涤剂从本地超市商店购买。在 溶解洗涤剂至精确测定失活百分数的5分钟范围内测试未加热过和加热过的洗涤剂。酶活 性由suc-AAPF-pNA测定法测试。为在热失活的洗涤剂中测试酶活性，从热失活的母液制备洗涤剂的工作溶液。添加适宜量的水硬度(6gpg或12gpg)和缓冲液至该洗涤剂溶液以匹配想要的条件(表6-1)。 通过旋转或颠倒瓶子而混合溶液。 缩写Procter&Gamble(P&G)禾口 Reckitt Benckiser (RB)。F.用于清洁性能确定的TERG-0-T0METER测定法使用了用于评估蛋白质和糖污渍清洁作用的标准方案，其中在标准条件下清洁之 前和之后测量织物样品上的污渍水平。织物样品由以玉米淀粉、稻淀粉或血液、乳和炭黑 混合物弄脏的织造棉质织物组成。样品从Testfabrics，Inc. (West Pittiston，PA)购买。 玉米淀粉(EMPA 161)和血液、乳及炭黑(EMPA 116)技术性污渍由EMPA试验材料AG (St. Galle，瑞士)产生。稻淀粉(CFT CS-28)污渍由试验材料中心BV (荷兰弗拉尔丁恩)产生。 使用设置成D65 (6500° K)标准照明的Minolta光反射仪CR-410，通过光反射率在处理之 前和之后测量每种污渍。将L、a、b值的差异转化成总色差(dE)，如CIE-LAB颜色空间所定 义。通过取得洗涤之前和之后的颜色差异之间的比率并比较该比率与未洗涤过的污渍(洗 涤之前)对未弄脏织物的差异，将污渍的清洁作用表述为百分污渍去除指数(％ SRI)。清洁实验在配备6 个 2L 不锈钢罐的 TERG-0-T0METER(UnitedStates Testing Co.，Hoboken, NJ)中实施，其中所述不锈钢罐配有悬臂式搅拌器。每个处理在由6格令/ 每加仑3 1(钙镁)水硬度或12格令/每加仑水硬度组成的IL总体积中实施。洗涤 实验中使用的洗涤剂是具有PH 8的5mM HEPES缓冲液的1. 5g/L AATCC HDL WOB 2003液体洗涤剂、0. 7g/L AATCC HDD WOB 1993颗粒洗涤剂、具有过硼酸盐和TAED漂白剂的8g/L IEC A* 60456颗粒洗涤剂，或5g/L Persil Power凝胶液体洗涤剂。将酶直接添加至洗涤 溶液并随后通过添加40g/L或200g/L的脏污织物和陪洗织物(ballast fabric)启动反应。 洗涤反应以100转/分钟在201、251、301、401或501搅拌10、15或40分钟。清洁后， 样品在自来水中漂洗3分钟，在滚筒洗衣机中以1000转/分钟甩干以除去多余水并在干燥 器中以低热在恒压循环上干燥大约45分钟。污渍去除程度的比较结果由反射测量术评估 并表述为％污渍去除指数(％ SRI)。对照条件不含有酶并且阳性对照由多种剂量的基准商 业酶组成。G.用于确定淀粉酶活性的Bodipy-淀粉测定法使用EnzChek 超级淀粉酶测定试剂盒(E33651，Invitrogen)实施B0DIPY-淀 粉测定法。通过将含有冻干底物的小瓶的内容物溶解于PH 4. OWlOOyL 50mM乙酸钠缓 冲液中制备DQ淀粉底物的lmg/mL母液。将小瓶涡旋混合约20秒并置于室温黑暗中，偶尔 混合直至溶解。添加900 μ L测试缓冲液(50mM乙酸钠，含2. 6mM CaCl2,pH 5. 8)并且将小 瓶通过涡旋混合约20秒。该底物溶液贮存在室温于黑暗中直至待用或贮存在4°C。对于该 测定法，从测试缓冲液中的lmg/mL底物溶液制备100 μ g/mL DQ底物工作溶液。将190 μ L 100 μ g/mL底物溶液添加至平底96孔微量滴定平板中的各孔。添加IOyL的每种酶样品至 各孔，使用热混合仪以800转/分钟混合30秒。在测定法中包括仅含有缓冲液和底物的空 白样品(无酶空白)。在25°C于荧光微量滴定平板读数仪中测量荧光强度变化率(激发 485nm，发射520nm)5 分钟。H.测量对大分子底物的酶结合作用实施结合测定法以确定淀粉酶(AmyS)电荷阶梯变体(电荷改变=相对于野生型 AmyS的-12至+12)与谷物秸秆和甘蔗渣的底物结合作用。使用的底物包括甘蔗渣(来自 巴西的甘蔗渣，由国家再生能源实验室(NationalRenewable Energy Laboratory)稀酸预 处理、洗涤并缓冲于PH 5)、AFEX(氨纤维膨胀谷物秸秆)和PCS (稀硫酸预处理的谷物秸 秆，洗涤并调节至PH 5)。使全部底物在利用前达到想要的固体百分数。淀粉酶结合作用将淀粉酶电荷阶梯变体纯化并稀释至200ppm用于测试。在硼酸 盐缓冲液(40mM，pH 8. 5,0. 016% Tween80)中制备纤维素甘蔗渣溶液。将150 μ L甘蔗 渣溶液添加至微量滴定过滤平板中的各孔。将150 μ L硼酸盐缓冲液添加到充当对照的一 组独立的孔中。将10 μ L淀粉酶电荷阶梯变体添加至过滤板，每种条件一式两份。该平板 在室温温育2小时。收集滤液并通过BODIPY-淀粉测定法测量上清液中的淀粉酶活性。测量对微量样品的酶结合作用；α-淀粉酶变体在标准洗涤条件下与或不与 CS-28稻淀粉微量样品温育30分钟。游离酶的量由BODIPY-淀粉测定法测量。与微量样 品结合的酶的部分计算如下结合的部分=(样品不存在时的酶活性-样品存在时的酶活 性)/(样品不存在时的酶活性)。实施例7-在枯草芽孢杆菌中的淀粉酶产生在本实施例中，描述了在枯草芽孢杆菌中产生突变截短形式的嗜热脂肪芽孢杆菌α淀粉酶(具有S242Q突变和从羧基端的29个氨基酸缺失，本文中也称作S242Q)及其变 体。转化如本领域已知那样(见，例如W002/14490)进行。简而言之，将编码亲本淀粉酶的 基因克隆到PHPLT表达载体中，其中所述pHPLT表达载体含有LAT启动子(PLAT)、编码LAT信号肽的序列(preLAT)，后接PstI和HpaI限制性位点用于克隆。下文显示LAT信号肽的编码区atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttcttgctgcctc attctgcagc ttcagca(SEQ ID NO 19).下文显示LAT信号肽的氨基酸序列MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA(SEQ ID NO 20)使用带有以斜体显示的替换氨基酸的成熟截短S242Q淀粉酶的氨基酸序列作为 制备本文中所述变体文库的基础AAPFNGTMMQ YFEffYLPDDG TLffTKVANEA NNLSSLGITA LffLPPAYKGTSRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYADVVFDHKGGA DGTEffVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAffT KFDFPGRGNTYSSFKffRffYH FDGVDffDESR KLSRIYKFRG IGKAffDffEVD TENGNYDYLMYADLDMDHPE VVTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FQFFPDffLSYVRSQTGKPLF TVGEYffSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASKSGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPffFKPLAYAFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQHDYLDHSDIIG WTREGVTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFYDLTGNRSDTV TINSDGffGEF KVNGGSVSVff VPRKTT(SEQ ID NO :21)。使用来自Qiagen的QIAQUIK柱纯化PCR产物并将该产物重悬于50 μ L去离子水 中。用HpaI (Roche)和PstI (Roche)消化50 μ L纯化的DNA并将所得DNA重悬于30 μ L去离 子水中。利用PstI和HpaI克隆位点，将10-20ng/ μ L所述DNA克隆到质粒pHPLT中。连接混 合物直接转化至感受态枯草芽孢杆菌细胞(基因型Avpr，AwprA, Ampr-ybfJ, AnprB)。 该枯草芽孢杆菌细胞具有置于木糖诱导型启动子下的能力基因(competencygene) (comK), 从而使用木糖来诱导对DNA结合和摄取的能力(见Hahn等人，Mol. Microbiol. ,21 763-775，1996)。质粒pHPLT-AmyS的元件包括pUB110 =来自质粒pUBllO的DNA片段 (McKenzie 等人，Plasmid 15 :93_103，1986)。质粒特征包括ori_pUB110 =来自 pUBllO 的 复制起点；neo =来自pUBllO的新霉素抗性基因；Plat =来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的转录 启动子；Pre LAT =来自地衣芽孢杆菌淀粉酶的信号肽；SAMY 425ss =截短AmyE基因序列 的编码区(由本研究中所表达的每种截短AmyE变体的编码区替代)；和终止子=来自地衣 芽孢杆菌淀粉酶的转录终止子。实施例8-酶变体的表达本实施例描述了用来表达前述实施例的经转化枯草芽孢杆菌的多种重组酶的方法。α -淀粉酶表达-2mL规模含有S242Q (或其变体)表达载体的枯草芽孢杆菌克隆用钢制96孔复制器从甘油贮藏物复制到含有150 μ 1 LB培养基+10 μ g/mL新霉素的96孔 培养平板(BD，353075)中，于加湿箱中在37°C，220转/分钟培育过夜。来自过夜培养物的 100 μ L等份样用来接种5mL塑料培养管中的2000 μ L确定成分培养基+10 μ g/mL新霉素。 该培养基是基于MOPS缓冲液的半定义丰富培养基，以脲作为主要氮源，葡萄糖作为主要碳 源并且补充有大豆胨和5mM钙，用于稳健细胞生长。培养管在37°C以250转/分钟温育72小时。温育后，培养肉汤以3000xg离心10分钟。将上清液倾析至15mL聚丙烯锥形 管；每个样品80 μ L分配至96孔平板用于蛋白质定量。实施例9-酶变体的产生本实施例描述酶电荷阶梯和组合电荷文库的产生酶电荷阶梯涵盖目的物理特性范围的多种蛋白质变体选自现存文库或通过如本 领域已知的位点定向诱变技术(见例如授予Genencorlnternational的美国专利申请系列 号10/576，331、11/581，102和11/583, 334)生成。随后在目的试验中测试这种定义的探针
蛋白质集合。示例性淀粉酶电荷阶梯变体在下表中显示并如本文中所述测试。在这些表格中， 电荷改变是相对于亲本酶而言的。
酶组合电荷文库(CCL)嗜热脂肪芽孢杆菌AmyS-S242Q CCL的产生。AmyS_S242Q质粒DNA从转化的枯草芽孢杆菌菌株(基因型AaprE，AnprE, amyE: xylRPxylAcomK-phleo)分离并发送至 DNA2. 0 Inc.作为模板用于 CCL 构建。要求 DNA2. OInc. (Mountain View, CA)在 9_2 表中 所示AmyS-S242Q(S242Q)淀粉酶中4个位点的每个位点处生成位置文库。变体作为96孔 平板中的甘油贮藏物提供。
通过鉴定以下4 个残基 Gln97、Gln 319、Gln 358 和 Gln 443 设计出 AmyS S242Q 组合电荷文库。通过在每个位点处产生三种可能性野生型、精氨酸或天冬氨酸的全部组 合，产生一个4位点、81个成员的CCL。
实施例10-酶洗涤性能本实施例描述在微量样品测定法中于可变离子强度下的AATCCHDL洗涤剂或5mM HEPES缓冲液中测试1. 0 u g/mL S242Q变体。使用在实施例6中提供的方法(见，“用于测 试淀粉酶性能的稻淀粉微量样品测定法”和“谷物粉水解”)。对于AATCC HDL洗涤剂中酶的清洁性能，存在最佳净电荷改变。测量性能为稻淀 粉微量样品活性测定法中观察到的相对清洁性能。约1的值显示在本测定法中的顶级清洁 性能。这是优化蛋白质物理属性(例如净电荷)以改善给定结果或益处(例如在液体衣物洗涤剂中的清洁性能)的例子。用这种有限的探针蛋白集合鉴定的最佳电荷与测量整个电 荷组合文库时所观察到的最佳电荷相一致。探针蛋白质的使用因而预测整个文库的特性。根据Debye-Hiickel 理论(Israelachivili, Intermolecular and SurfaceForces， 第 2 片反With Applications to Colloidal and Biological Systems,Academic Press第 2版[1992])，静电相互作用主要由恒定电势或恒定电荷上的相互作用种类(酶、底、织物和 洗涤剂)之间的双层力量强度、这些物质的尺寸和周围介质的介电常数决定。为了表征复 杂介质如洗涤剂制剂中粒子的静电特性，这些粒子在拥有相同Debye筛选长度的还原性环 境中的相互作用是充分的。这通过选择在洗涤条件下使PH和导电性与洗涤剂的pH和导电 性匹配的缓冲液实现。对于这种测试适宜的缓冲液是具有可变量的不同电解质如NaCl的 PH 8.0的5福HEPES缓冲液。添加2. 5mMNaCl至这种缓冲液匹配了常见北美洗涤条件的 PH和导电性。添加更高浓度的NaCl代表日本和欧洲洗涤条件，所述日本和欧洲洗涤条件一 般在离子强度上因水硬度和洗涤剂浓度提高而更高。图10显示正电荷S242Q电荷变体对于北美洗衣条件下清洁稻淀粉微量样品是优 异的。同样，负电荷TS23t变体对于西欧洗衣条件下清洁稻淀粉微量样品是优异的(图11)。图12说明正电荷S242Q变体展示出颗粒谷物淀粉底物水解的更高比活性。实施例11-热稳定性本实施例描述了确定蛋白质电荷与热稳定性之间的关系。α -淀粉酶测定法基于 加热培养上清液之前和之后的BODIPY淀粉水解作用。使用的相同化学品和试剂溶液如实 施例6中描述。α -淀粉酶的热稳定性测定法过滤的培养上清液在具有0. 002% Tween的50mM乙 酸钠+2mM CaCl2pH 5. 8中连续稀释。测试10 μ L每种稀释的培养上清液以通过BODIPY淀 粉测定法确定初始淀粉酶活性。50 μ L每种稀释的培养上清液置于VWR低特性的PCR 96孔 平板中。将30 μ L矿物油作为密封剂添加至各孔。平板在BioRad DNA引擎Peltier热循 环仪器中在95°C根据亲本酶的稳定性温育30分钟或60分钟。温育后，将平板冷却至4°C 持续5分钟并随后保持在室温。添加10 μ L每份样品至一块新平板并测试，以通过如实施 例1中所述的BODIPY淀粉测定法确定最终淀粉酶活性。热稳定性的计算。样品的残余活性表述为最终吸光度与初始吸光度之比，其中两 种吸光度均用空白校正。更高的比数指示热稳定更大的变体。这是优化蛋白质物理属性 (在这种情况下，净电荷)以改善液体衣物应用中酶热稳定性的例子。表11-1 :S242Q CCL-热稳定性胜出者 实施例12-酶性能本实施例说明酶性能可以受电荷影响。使用如上文实施例6中描述的热失活洗涤剂评估酶性能。胜出者定义为具有大于 1的性能指数(PI)的那些变体。PI是突变体残余活性对亲本(即S242Q)残余活性的比率。 结果在图12-1和12-2中显示。表12-1 :S242Q CCL_CS_28稻淀粉微量样品胜出者，2倍Tide (如实施例6中描述 的北美条件)。表12-2 :S242Q CCL_CS_28稻淀粉微量样品胜出者，Persil (西欧条件)也使用如本文中提供的BODIPY淀粉水解测定法测量了活性。结果在表12_3中显
示。对这种淀粉底物(谷物淀粉)的大于1的相对比活性表明该变体比S242Q亲本具有更
高的比活性。相对ppm是表现滴度(expressiontiter)，大于1表示比S242Q亲本更高的滴 度(在振摇管中)。表12-3 :S242Q CCL-滴度和/或B0DIPY-淀粉胜出者 实施例13-平衡对淀粉酶活性和表达的突变影响本实施例说明可以通过导入多个氨基酸替换同时优化两种独立的酶特性，甚至其 中所述特性是负相关的，例如负相关的原因在于对立地关联于蛋白质的电荷特征。在实验期间确定AmyS_242Q的中位数表达随增加的正电荷而减少。然而，特异性 BODIPY淀粉水解作用随增加的正电荷而提高。增强的重组淀粉酶表达和淀粉水解作用在例 如适用于燃料乙醇工业中淀粉液化或洗涤剂应用中清洁的AmyS-242Q的工程化变体中是 受欢迎的。然而，这些特性明显是冲突的特征。使用本发明中提供的方法，有可能通过选择 性组合单一突变来产生更高度表达的淀粉酶变体，同时并不严重损害淀粉水解作用。本文 中所述的策略成功地用来产生和选择多重替换的AmyS-242Q变体，其中所述AmyS_242Q变 体具有第一特性(例如作为主要特性的表达)上的改良，同时改善了或并未牺牲第二特性 (例如作为次要特性的淀粉水解作用)。此外，与AmyS_242Q变体的中位值表达相反，谷物淀粉微量样品清洁作用随增加 的正电荷而提高。增强的重组淀粉酶表达和清洁性能是在AmyS-242Q的工程化变体中受欢 迎的。然而，这些特性明显也是冲突的特性。使用本发明中公开的方法，有可能通过选择性 组合单一突变来产生更高度表达的淀粉酶变体，同时并不严重损害清洁性能。本文中所述 的策略成功地用来产生和选择多重替换的AmyS-242Q变体，所述AmyS_242Q变体具有第一 特性(例如作为主要特性的表达)上的改良，同时改善了或并未牺牲第二特性(例如作为 次要特性的稻淀粉微量样品清洁作用)。特别地，测试了含80种成员的一个AmyS_S242Q电荷组合文库(CCL)的振摇管表 达、BODIPY-淀粉水解作用和稻淀粉清洁活性，其中所述AmyS-S242Q电荷组合文库包含具 有1至4个带电荷残基替换组合的变体。在表13-1和13-2中显示AmyS-S242Q胜出者。 重要地，与亲本酶相比，表13-1的多重替换变体具有相等同或改善的表达和相等或改良的B0DIPY-淀粉水解作用。类似地，与亲本酶相比，表13-2的多重替换变体具有相等或改善的 表达和相等或改良的稻淀粉清洁活性。表13-1. AmyS-S242Q表达和B0DIPY-淀粉水解胜出者 表13-1. AmyS-S242Q表达和B0DIPY-淀粉水解胜出者 表13-2. AmyS-S242Q表达和稻淀粉水解胜出者 总之，因为酶活性和酶产生具有不同的电荷依赖性(见图13Α、13Β、14Α和14Β)，故 它们是负相关的(见图12Α和12Β)。然而，存在表达和活性方面均改善的众多变体，并且以 这种方式对所述文库的分析允许鉴定到这些变体。尽管以淀粉酶进行了说明，然而本方法可应用于其他酶类，如蛋白酶、脂肪酶、纤 维素酶、转移酶和果胶酶。另外，可以同时分析两种或多种特性的任何组合，如表达、活性、 结合作用、热稳定性、在一种或多种洗涤剂存在下的稳定性和螯合剂稳定性。实施例14-淀粉酶的退浆性能在本实施例中，在85°C和97°C在几种钙浓度存在下将变体S242Q的退浆性能与 Ethyl 禾口 Xtra 比较。通过添加不同量的CaCl2母液至pH约6. 5的Milli Q水，每个试验的CaCl2浓度 从0-20ppm变化。在每个试验以O.Olppm有效蛋白质使用Ethyl、Xtra和变体S242Q。使用 50 1的浴比在LAUNDER-0-METER中进行该测定法。在稻淀粉染色的织物样品上实施性能 测试，所述织物样品具有与淀粉结合的指示染料(TestFabrics目录号CS-28 ；TestFabrics Inc.)。使用3份CS-28样品(6cmx8cm)和4份本色印花布样品(Testfabrics，型号400R ；3英寸x4英寸)作为每个试验的底物。将具有Milli Q水/Ca的LAUNDER-0-METER的温度 预调节至85°C或97°C，此后添加酶和样品。反应实施30分钟，此后将样品在水中漂洗并干 燥，随后读数。通过使用CIE颜色空间的反射测量术进行测量。每种可察觉的颜色可以 由该颜色空间中的坐标代表。“L*”代表纯黑至纯白0至100级别的亮度或灰阶 值。“a*代表深红色至绿色的迁移，其中大的正值代表非常深红色调而大的负值代表非常绿 色调。“b*代表黄至蓝的迁移，其中大的正值代表非常黄色调而大的负值代表非常蓝色调。 当a *和b *值均是0时，缺少颜色，留下纯灰色，其亮度由L *值定义。具有D 65光源的CIE Lab颜色空间中的Minolta色度仪CR200用于测量退浆性 能。为量化退浆性能，淀粉酶处理后，从每个CS-28样品取得四个CIE L*读数(即，2读数 分别来自样品的正面和反面)。较高的CIE L*值表明较好的退浆性能。如图15和图16中所示，与Ethyl和Xtra相比，S242Q变体在测试的条件下明显 地显示退浆性能的较低钙依赖性。在以上说明书中提到的全部出版物和专利在此引入作为参考。虽然公开的方法和 酶已经在一些情况下与具体或优选的实施方案联系加以描述，然而应当理解由所附权利要 求书所覆盖的内容将不限于此类具体或优选的实施方案。实际上，所公开方法和酶的多种 修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的并且用于实施已公开内容的所述方法的多 种修改和变化被包含于后续权利要求书的范围内。
权利要求
组合物，包含a)至少一种变体α-淀粉酶，其包含与亲本AmyS样α-淀粉酶的氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列并在与参考α-淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换，所述变体α-淀粉酶具有可检测的α-淀粉酶活性，和b)至少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。
2.权利要求1的组合物，其中变体a-淀粉酶与亲本AmyS样a -淀粉酶或参考a -淀 粉酶相比较在以下一个或多个特征上被改变(a)净电荷、(b)底物特异性、(c)底物切割、 (d)底物结合、(e)热稳定性、(f)在一个或多个pH处的活性、(g)在一个或多个pH处的稳 定性、(h)氧化条件下的稳定性、(i)Ca2+需求、(j)比活性、(k)催化速率、(1)催化效率、 (m)在螯合剂存在下的活性、(n)在螯合剂存在下的热或pH稳定性、(o)退浆用途或清洁过 程的用途、或(P)在蛋白质表达系统中的表达量。
3.权利要求1的组合物，其中参考a-淀粉酶是SEQ ID NO :1或2。
4.权利要求1的组合物，其是用于衣物、餐具或硬表面清洁、退浆、或者织物或污渍处 理的产品的组分。
5.权利要求1至4任一项所述的组合物，其中额外的酶是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维 素酶、过氧化物酶、氧化酶、果胶酶、裂合酶、角质酶、漆酶、或它们的组合。
6.权利要求1至5任一项所述的组合物，其中表面活性剂是非离子的、阴离子的、阳离 子的或两性离子的。
7.权利要求1至6任一项所述的组合物，其中变体a-淀粉酶是S242A、S242D、S242E、 S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。
8.权利要求7的组合物，其中变体a-淀粉酶具有针对氧化作用的改变稳定性并且 该变体a “淀粉酶还包括一个或多个甲硫氨酸残基的缺失或替换，包括位于亲本AmyS样 a -淀粉酶第8、9、96、200、206、284、307、311、316和438氨基酸位置处的残基，其中参考 a -淀粉酶是SEQ ID NO :2。
9.权利要求7的组合物，其中变体a-淀粉酶还在与参考0-淀粉酶第97、179、180、 193、319、349、358、416、428或443氨基酸位置相对应的一个或多个氨基酸位置处包含序列 修饰。
10.权利要求9的组合物，其中变体a-淀粉酶包含一个或多个在如下位置处的替换 在第349氨基酸位置处的半胱氨酸、在第428氨基酸位置处的半胱氨酸、在第97氨基酸位 置处的谷氨酸、在第97氨基酸位置处的精氨酸、在第319氨基酸位置处的谷氨酸、在第319 氨基酸位置处的精氨酸、在第358氨基酸位置处的谷氨酸、在第358氨基酸位置处的精氨 酸、在第443氨基酸位置处的谷氨酸或在第443氨基酸位置处的精氨酸。
11.权利要求7-10任一项所述的组合物，其中变体a-淀粉酶包含附93或V416或这 二者的替换。
12.权利要求11的组合物，包含N193F或V416G或这二者的替换。
13.权利要求7至12任一项所述的组合物，还包含一个或多个在位置F178、R179、 G180、1181、G182和K183处的氨基酸缺失。
14.权利要求13的组合物，其中变体a-淀粉酶在不存在添加的钙或在螯合剂存在下具有改变的金属离子依赖性或者改变的稳定性或活性。
15.权利要求1的组合物，其中变体a-淀粉酶与SEQID NO :2具有至少95%同源性 并且相对于包含SEQ ID N0:1的参考a-淀粉酶中的编号而言包含第242位氨基酸替换， 并且其中该变体a-淀粉酶具有a-淀粉酶活性。
16.权利要求1的组合物，其中亲本AmyS样a-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16，并且参考a-淀粉酶是SEQIDN0:1或2。
17.权利要求1的组合物，其中变体a-淀粉酶相对于亲本AmyS样a-淀粉酶在pH > 约8的洗涤过程中具有改善的性能。
18.权利要求10的组合物，其中变体a-淀粉酶包含a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b) Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、 Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g) Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的 成组替换。
19.洗涤剂或清洁制剂，包含权利要求1-18任一项所述的组合物或至少一种变体 a-淀粉酶，所述变体a-淀粉酶包含与亲本AmyS样a -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同 一的氨基酸序列并在与参考a “淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换，所述 的变体a “淀粉酶具有可检测的a “淀粉酶活性；其中参考淀粉酶是SEQ ID NO :1或2。
20.权利要求19的洗涤剂或清洁制剂，其中变体a-淀粉酶是至少包含S242A、S242D、 S242E、S242F、S242G、S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 替换的 S242 变体 a -淀 粉酶。
21.织造工艺后退浆织造材料的方法，包括将织造材料与权利要求1至18任一项所述 的组合物或变体a“淀粉酶在有效用于至少部分地从织造材料去除浆料的条件和时间下 接触，所述变体a-淀粉酶包含与亲本AmyS样a-淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨 基酸序列并在与参考a “淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换，所述的变体 a-淀粉酶具有可检测的a-淀粉酶活性。
22.权利要求21的方法，其中变体a-淀粉酶与亲本AmyS样a-淀粉酶或参考a-淀 粉酶相比较在以下一个或多个特性上被改变(a)净电荷、(b)底物特异性、(c)底物切割、 (d)底物结合、(e)热稳定性、(f)在一个或多个pH处的活性、(g)在一个或多个pH处的稳 定性、(h)氧化条件下的稳定性、(i)Ca2+需求、(j)比活性、(k)催化速率、(1)催化效率、(m) 在螯合剂存在下的活性、(n)在螯合剂存在下的热或pH稳定性、(0)退浆效能、或(p)在蛋 白质表达系统中的表达量。
23.权利要求21的方法，其中亲本AmyS样a-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、11、12、15或16，并且参考a-淀粉酶是SEQIDN0:1或2。
24.权利要求21的方法，其中变体a-淀粉酶是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。
25.权利要求24的方法，其中变体a-淀粉酶还包含一个或多个在如下位置处的替换 在第349位置处的半胱氨酸、在第428位置处的半胱氨酸、在第97位置处的谷氨酸、在第97 位置处的精氨酸、在第319位置处的谷氨酸、在第319位置处的精氨酸、在第358位置处的 谷氨酸、在第358位置处的精氨酸、在第443位置处的谷氨酸或在第443位置处的精氨酸， 其中参考a -淀粉酶是SEQ ID NO 1或2。
26.洗涤或清洁的方法，包括将待洗涤或清洁的一个或多种物品与权利要求19的洗涤 剂或包含变体a“淀粉酶的组合物在有效用于至少部分地洗涤或清洁所述一种或多种物 品的条件和时间下接触，所述变体a-淀粉酶包含与亲本AmyS样a-淀粉酶的氨基酸序列 至少95%同一的氨基酸序列并在与参考a -淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有 替换，所述的变体a-淀粉酶具有可检测的a-淀粉酶活性。
27.权利要求26的方法，其中至少一种物品用至少一种含淀粉材料弄脏，所述淀粉污 渍的去除受变体a-淀粉酶辅助。
28.权利要求26的方法，其中组合物还包含一种或多种以下物质额外的酶、洗涤剂、 表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合 物、稳定剂或织物调理剂。
29.权利要求26的方法，其中亲本AmyS样a-淀粉酶是SEQ ID NO :1、2、6、7、8、9、10、 11、12、15或16，并且参考a-淀粉酶是SEQ IDN0:1或2。
30.权利要求29的方法，其中变体a-淀粉酶是S242A、S242D、S242E、S242F、S242G、 S242H、S242L、S242M、S242N、S242Q 或 S242T 变体。
31.权利要求30的方法，其中变体a-淀粉酶相对于亲本AmyS样a-淀粉酶在pH > 约8的洗涤过程中具有改善的性能。
32.权利要求30的方法，其中变体a-淀粉酶包含一个或多个在如下位置处的替换 在第349氨基酸位置处的半胱氨酸、在第428氨基酸位置处的半胱氨酸、在第97氨基酸位 置处的谷氨酸、在第97氨基酸位置处的精氨酸、在第319氨基酸位置处的谷氨酸、在第319 氨基酸位置处的精氨酸、在第358氨基酸位置处的谷氨酸、在第358氨基酸位置处的精氨 酸、在第443氨基酸位置处的谷氨酸或在第443氨基酸位置处的精氨酸。
33.权利要求32的方法，其中变体a-淀粉酶包含a)Q97E、Q319E、Q358E、Q443E ；b) Q97E、Q319R、Q358E、Q443R ；c)Q97E、Q319R、Q358E ；d)Q97E、Q319R、Q443E ；e)Q97E、Q319R、 Q443R ；f)Q97E、Q358R ；g) Q97E、Q443E ；h) Q319R、Q358E、Q443E ；或 i) Q319R、Q358R、Q443E 的 成组替换。
34.权利要求30的方法，其中变体a-淀粉酶包含一个或多个在位置F178、R179、 G180、1181、G182或K183处的氨基酸缺失。
35.权利要求34的方法，其中变体a-淀粉酶在不存在添加的钙或在螯合剂存在下具 有改变的金属离子依赖性或改变的稳定性或活性。
36.试剂盒，包含a)一种或多种变体a -淀粉酶或权利要求1至18任一项所述的组合物，其中所述变 体a-淀粉酶包含与亲本AmyS样a -淀粉酶的氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列并 在与参考a-淀粉酶第242位置相对应的氨基酸位置处具有替换，所述的变体a-淀粉酶 具有可检测的a-淀粉酶活性，和b)至少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、碱化 剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。
37.权利要求36的试剂盒，还包含在用于织造材料退浆或者洗涤或清洁用含淀粉物质 弄脏的一种或多种物品的方法中使用该试剂盒的说明书。
全文摘要
公开了包含α-淀粉酶变体的组合物，所述α-淀粉酶变体具有α-淀粉酶活性并且相对于衍生这些变体的亲本AmyS样α-淀粉酶而言展示改变的特性。所述组合物通常包含至少一种以下物质额外的酶、洗涤剂、表面活性剂、螯合剂、氧化剂、酸化剂、碱化剂、过氧化物源、硬度源、盐、洗涤络合剂、聚合物、稳定剂或织物调理剂。还公开了包含所述变体的洗涤剂制剂。公开了使用组合物用于织造材料退浆和洗涤或清洁物品如餐具或衣物的方法。还提供了与之相关的试剂盒。
文档编号C11D3/386GK101848986SQ200880114762
公开日2010年9月29日 申请日期2008年11月3日 优先权日2007年11月5日
发明者M-Y·润 申请人:丹尼斯科美国公司