专利名称：血管成熟化、正常化或稳定化剂以及皱纹防止和/或改善剂的制作方法
技术领域：
本发明提供包含来源于樟(Cinnamomum)属植物、特别是肉桂(Cinnamomum cassia Blume)种植物的提取物的血管成熟化、正常化或稳定化剂、Tie2(含Ig和EGF同源结构域 的酪氨酸激酶，Tyrosine Kinase with Ig and EGF Homology Domain 2)活化剂(Tie2 磷 酸化剂)以及皱纹防止和/或改善剂。
背景技术：
在血管中，来自血管内皮细胞的外腔面的总称为血管壁细胞的血管平滑肌细胞和 /或周细胞介由细胞外基质或直接与血管内皮细胞粘着。根据血管直径大小不同，内皮细 胞与壁细胞的粘着比率也不同，在大血管系统中，1层内皮细胞附着有多层壁细胞，在中、小 血管中，1个内皮细胞往往附着1个壁细胞，此外，在直径更细的血管中，1个壁细胞与多个 内皮细胞粘着。因此，壁细胞对血管内皮细胞的附着对于血管在结构上的“成熟化”过程是 重要的。此外，通过血管内皮细胞彼此粘着，形成了使得血管内环境因子(细胞和体液因 子)不容易漏出到血管外的内皮细胞间的粘着斑，这对于功能性血管的“成熟化”过程是重 要的。而且，根据组织的氧和/或营养成分需要，特别是在它们不足时，血管通过扩大管腔 进行调节，以便增加血流，并将氧、养分充分输送到组织中。即，“血管成熟化”的定义如下 通过血管内皮细胞彼此形成粘着斑来控制渗透性，通过血管内皮细胞与壁细胞的附着而使 结构稳定化，将血管腔控制为大中小。此外，在各种病态下，构建了血管结构紊乱的血管，内皮细胞彼此的粘着被抑制、 和/或形成了壁细胞与内皮细胞的粘着缺损的不成熟的血管。由于这会导致血管渗透性无 秩序地增强，因此组织内与血管内的体液因子和/或细胞的运输变得异常。如果渗透性增 强，则会发生组织浮肿，并造成组织功能不全，而且由于炎症细胞的浸润无秩序地发生而会 导致炎症。此外，由于壁细胞会抑制由现存血管芽生出血管，因此由没有壁细胞的血管过量 地芽生出血管，而诱导出无秩序的血管芽生，从而导致病态恶化。这样的现象可在以糖尿病 性视网膜病变和/或肿瘤、炎症为代表的病态中观察到。即，“血管正常化”的定义如下通 过提高内皮细胞彼此的粘着，促进壁细胞与内皮细胞的附着，将血管渗透性被破坏了的血 管和/或导致血管无秩序增生那样的异常血管变成正常状态。此外，上述那样的异常血管 可由于如下原因触发糖尿病、高血脂症、高血压等造成的血流内外环境因子的变化对内皮 细胞和/或壁细胞产生损伤(细胞死亡等)；或者癌症和/或炎症造成血管新生促进因子 过度产生。“血管稳定化”的定义如下当发生上述的病态时，抑制对现存血管的损伤并抑制 内皮细胞彼此解离、抑制内皮细胞与壁细胞解离。此外，该稳定化还包括抑制内皮细胞的细 胞死亡的机制。血管新生是指由现存血管形成新血管网的现象，其与肿瘤、慢性类风湿性关节 炎、糖尿病性视网膜病变、高血脂症、高血压等以血管病变为主体的疾病密切相关。以 VEGF(vascular endothelial growth factor 血管内皮细胞生长因子)的分子克隆为开
3端，作为特异性地在血管形成中发挥作用的因子，已经相继鉴别出了 VEGF家族和促血管生 成素(angiopoietir^Ang)家族的分子。VEGF及其受体参与从被称为脉管形成的从血管初 生到后来的血管新生的非常广范围的血管形成。另一方面，Ang在脉管形成后，在伴有血管 内皮细胞的芽生、分枝、嵌入、萎缩等细胞现象的管腔形成中发挥作用。Ang介由在血管内 皮细胞中表达的受体型酪氨酸激酶Tie (含Ig和EGF同源结构域的酪氨酸激酶，tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain)_2来控制血管内皮细胞与周皮细胞(周细胞) 和/或血管平滑肌细胞等血管壁细胞的粘着，在血管结构的稳定化中发挥作用(实验医学 Vol. 20，No. 8 (2002) pp. 52-57 非专利文献 1)。迄今为止，已知Ang-1 4这4个异构体，Ang_l、Ang-2在人、小鼠中均存在，而 Ang-3在小鼠中存在，Ang-4在人中存在。从壁细胞分泌出的Ang-1、Ang_4刺激Tie_2， 引起细胞内酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化，随着整联蛋白的活化、粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的活化、PI3K/Akt (phosphatidylinositol-3-kinase (磷脂酰肌 醇-3-激酶)，PI3K ；serine-threonine kinase (丝氨酸-苏氨酸激酶):Akt)的活化，诱 导内皮细胞与壁细胞粘着。在正氧状态下，内皮细胞通过壁细胞正常分泌的Ang-1、Ang-4 来维持内皮细胞-壁细胞之间的粘着，但是如果局部产生低氧状态，则作为Ang-l、Ang-4的 拮抗物的Ang-2、Ang-3的产生会提高，暂时抑制Tie2活化，抑制内皮细胞与附着于该内皮 细胞的壁细胞粘着。而且，由于壁细胞的解离，内皮细胞增殖并开始芽生式血管新生，从而 形成新血管网。Tie2活化通过诱导内皮细胞与壁细胞粘着，有助于血管结构稳定化，而且 可促进内皮细胞彼此粘着并控制血管渗透性。此外，已知Tie2活化可抑制内皮细胞的细胞 死亡(Cho CH, Kammerer RA, Lee HJ, Yasunaga K, Kim KT, Choi HH, Kim ff, Kim SH, Park SK, Lee GM, Koh GY. Designed angiopoietin-1variant, COMP—Angl, protects against radiation-induced endothelial cell apoptosis (设计白勺i^ifl管生成素 $异体 COMP-Angl，保护细胞不受辐射诱导的内皮细胞凋亡).Proc Natl Acad Sci U S A. 2004Apr 13 ；101 (15) =5553-8.非专利文献2)，因此针对细胞内外的各种破坏血管结构的环境因 子，可以诱导Tie2活化，抑制血管的不稳定化，从而使血管稳定化和正常化。此外，在血管 再生医疗中，可以对由血管内皮细胞构建而得的血管，通过诱导Tie2活化来诱导内皮细胞 与壁细胞粘着，从而使血管成熟化。此外，在肿瘤和/或糖尿病性视网膜病变等中观察到 的、由于壁细胞不粘着于内皮细胞而导致无秩序的血管增生那样的疾病中，通过Tie2活化 可以使壁细胞粘着于内皮细胞，使血管正常化。此外，根据文献(Thurston G，Suri C, Smith K,McClain J, Sato TN,Yancopoulos GD,McDonald DM. Leakage-resistant blood vessels in mice transgenically overexpressing angiopoietin_l (转基因过度表达促血管生 成素-1的小鼠中的抗渗漏血管).Science. 1999Dec 24 ；286 (5449) :2511_4.非专利文献 3)，已经报告了 Tie2活化可扩大血管腔，在血管狭窄化或血管扩大化被抑制而导致的缺血 性疾病中，可以通过Tie2活化来扩大血管腔，从而改善病态。此外，最近发现了具有作为Ang的结构上的特征的卷曲螺旋(coiled-coiled)结 构域和纤维蛋白原样(fibrinogen-like)结构域的多个分子。这些分子均不显示与Tie_l 受体、Tie-2受体的结合能力，因此被认为是与现存Ang家族不同的分子群，被命名为促血 管生成素样因子(Angiopoietin -like protein, Angptl),才艮告了 Angptl—1、Angptl—2、 Angptl-3、Angptl-4、Angptl-5、Angptl-6、Angptl-7。所有 Angptl 都是目前未鉴定出受体的孤儿配体，对它们也可期待显示多种作用。 已知在除了血管内皮细胞以外的细胞中，Tie2活化诱导细胞的静止状态。根 据迄今为止的报告，报告了造血干细胞上的Tie2活化诱导造血干细胞静止(Arai F， Hirao A, Ohmura M, Sato H, Matsuoka S, Takubo K, I to K, Koh GY, Suda T. Tie2/ angiopoietin-lsignaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche (Tie2/促血管生成素-1信号调节造血干细胞在骨髓龛中静 止).Cell.2004Jul 23 ；118(2) 149-61.非专利文献4)。即，通过诱导Tie2活化，可以 维持造血干细胞长期在体外生存。此外，根据迄今为止的报告，可知Tie2活化通过活化 整联蛋白等粘着因子来诱导细胞与细胞外基质等粘着(Takakura N, Huang XL, Naruse T, Hamaguchi I, Dumont DJ, Yancopoulos GD, Suda T. Critical role of the TIE2 endothelial cell receptor in the development of definitive hematopoiesis (TIE2 内皮细胞受体在永久造血中的关键作用).Immunity. 1998Nov ;9 (5) =677-86.非专利文献 5)。认为通过这样诱导细胞粘着，可以利用Tie2活化而在生物体内外诱导造血干细胞的 贴壁依赖性生存维持。此外，根据近年来的报告，暗示Tie2在存在于癌组织中的被认为恶 性度最高、与癌症复发相关的癌干细胞中表达(Lee OH, Xu J, Fueyo J, Fuller GN，Aldape KD, Alonso MM, Piao Y, Liu TJ, Lang FF, Bekele BN, Gomez-Manzano C. Expression of the receptor tyrosine kinase Tie2 in neoplastic glial cells is associated with integrin betal-dependent adhesion to the extracellular matrix(受体酷M酸—Bl Tie2在肿瘤性胶质细胞中的表达同整联蛋白与细胞外基质的0-1依赖性粘着相关).Mol Cancer Res. 2006 Dec ；4(12) =915-26.非专利文献6)。正如Tie2活化可以使造血干细胞 的细胞周期进入静止状态那样，通过活化在癌干细胞中表达的Tie2，也可以抑制癌干细胞 的增殖。
发明内容
本发明的课题是提供新的血管成熟化、正常化、稳定化剂，以及Tie2活化(磷酸 化)剂。本发明者详细研究了受到紫外线B照射后的皮肤组织中的行为。由于紫外线B的 照射而显著地引起了表皮肥厚和皮肤血管形成，并引起了皱纹形成。发现在这样的受到了 光老化的皮肤组织中Ang-1的表达显著降低，Ang-2的表达相对于Ang_l增加。此外，由皮 肤组织切片观察到了由于紫外线照射而壁细胞从血管内皮细胞剥离的状态。这些认识暗示 了 通过紫外线照射可诱导内皮细胞与壁细胞的粘着被抑制、Tie2磷酸化被抑制即Tie2活 化被抑制的状态。并且，由采用强制表达Tie2的Baf3造血细胞和人脐带静脉内皮细胞株 HUVEC、使各种生药提取物发挥作用而进行研究的实验发现，来源于樟(Cirmamomum)属植 物的提取物具有活化Tie2的作用。此外，在由于紫外线B的照射而引起了光老化的小鼠皮 肤上涂布桂枝提取物，结果是通过涂布该提取物而具体地表现出改善作用。因此，发现了该 提取物通过Tie2磷酸化来改善、促进内皮细胞-壁细胞之间的粘着，并形成稳定的血管结 构，进而恢复UVB诱导性的皮肤损伤和皱纹形成，从而完成了本发明。因此，本申请包含下述发明(1) 一种血管成熟化、正常化或稳定化剂，包含来源于樟属植物的提取物。
5
(2)根据(1)所述的血管成熟化、正常化或稳定化剂，所述提取物来源于肉桂种植 物。(3)根据(2)所述的血管成熟化、正常化或稳定化剂，所述提取物来源于桂枝或桂皮。(4)根据⑴ (3)的任一项所述的血管成熟化、正常化或稳定化剂，所述提取物 是水提取物。(5) 一种Tie2活化(磷酸化)剂，包含来源于樟属植物的提取物。(6)根据(5)所述的Tie2活化(磷酸化)剂，所述提取物来源于肉桂种植物。(7)根据(6)所述的Tie2活化(磷酸化)剂，所述提取物来源于桂枝或桂皮。(8)根据(5) (7)的任一项所述的Tie2活化(磷酸化)剂，所述提取物是水提 取物。(9) 一种皱纹防止和/或改善剂，其配合有(1) (4)的任一项所述的血管成熟 化、正常化或稳定化剂。(10) 一种皱纹防止和/或改善剂，其配合有(5) (8)的任一项所述的Tie2活化 (磷酸化)齐U。
图1显示Baf3细胞中由桂枝提取物和Angl产生的Tie2磷酸化的结果。图2显示由桂枝提取物和桂皮提取物产生的Tie2磷酸化的结果。图3显示HUVEC细胞中由桂枝提取物和Angl产生的Tie2磷酸化的结果。图4显示管腔形成的染色图像。图5以管腔形成的长度为指标显示桂皮提取物的血管新生抑制作用。图6以管腔形成的面积为指标显示桂皮提取物的血管新生抑制作用。
具体实施例方式樟属是樟目(Lauraceae)、樟科(Lauraceae)的植物，存在300以上种，已知例如 肉桂(Cinnamomum cassia Blume)、樟(C. camphora)、圆叶肉桂(C. daphnoides)、柴肉桂 (C. doederleinii)、天竺桂(C. japonicum)、圆叶薮肉桂(C. pseudo-pedunculatum)、日本 肉桂(C. sieboldii)、锡兰肉桂(C. verum)、锡兰肉桂(C. zeylanicum)。作为本发明中的血 管成熟化、正常化或稳定化剂、Tie2活化剂(磷酸化剂)和/或血管新生抑制剂，优选使用 来源于肉桂(Cinnamomum cassia Blume)，特别是肉桂嫩枝的桂枝(肉桂枝)或桂皮(肉桂 皮)的提取物。已知来源于作为肉桂的树皮的桂皮的提取物作为例如生发剂的有效成分是 有用的(特开平10-265350号公报)，但是完全不知道该提取物具有血管成熟化、正常化、稳 定化和/或Tie2活化(磷酸化)活性、血管新生抑制活性等。上述提取物可以通过常规方法来获得，例如可以将作为其来源的植物与提取溶剂 一起在常温或加热下浸渍或加热回流，然后进行过滤、浓缩而获得。作为提取溶剂，只要是 通常提取中使用的溶剂就可以任意使用，可列举例如，水性溶剂，例如水、生理盐水、磷酸缓 冲液、硼酸缓冲液，或有机溶剂，例如乙醇、丙二醇、1，3_ 丁二醇、甘油等醇类，含水醇类、氯 仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等，这些溶剂可以分别单独使用或组合使用。优选使用水作为溶剂。用上述溶剂提取得到的提取物可以直接使用，或使用通过例如冷冻 干燥等使其浓缩后的提取物，还可以根据需要使用采用吸附法、例如离子交换树脂除去杂 质后的提取物，和/或用多孔聚合物(例如7、"一’ ^卜XAD-2)的柱进行吸附、然后用 所需溶剂溶出、再浓缩后的提取物。Tie2活化是指可以通过使Tie2磷酸化而将其转化成活性体(磷酸化Tie2)的能 力。作为Tie2活化剂，已知促血管生成素1等作为活化Tie2的物质。本发明的血管成熟化、正常化或稳定化剂和/或Tie2活化(磷酸化)剂可以作为 对预防、改善血管的结构变化所致的各种疾病和老化有效的药品或化妆品来利用。本发明 的Tie2磷酸化剂通过诱导血管的正常化、稳定化而在各种炎症性疾病和/或免疫疾病、成 人病等疾病中作为能够改善伴随血管新生和/或血管损伤的全身的病变部位的药品来利 用，所述疾病例如，各种传染病、癌症、类风湿性关节炎、痛风、高血压、糖尿病、动脉硬化症、 特应性皮炎等。此外，可以通过抑制血管渗透性，而作为改善下述症状的药品或化妆品来利 用，所述症状有包括皮肤的脏器、器官、各种组织内的浮肿，例如炎症性疾病和/或免疫疾 病、成人病引起的血管浮肿，和/或紫外线暴露和/或虫叮咬、变态反应等引起的血管渗透 性增强所导致的浮肿和/或发痒等。Tie2磷酸化剂还可以作为能够抑制由各种原因诱导 的内皮细胞的细胞死亡、并抑制血管不稳定化的药品或化妆品来利用，所述细胞死亡例如， 炎症性疾病和/或免疫疾病、成人病等例如各种传染病、癌症、类风湿性关节炎、痛风、高血 压、糖尿病、动脉硬化症、或放射线损伤、各种药剂和/或紫外线引起的内皮细胞的细胞死 亡。Tie2磷酸化剂可以通过血管成熟化和/或血管腔扩大化，来促进外伤、褥疮等创伤治 愈，使血管再生医疗中的血管成熟化，作为缺血性疾病、例如脑梗塞和/或心肌梗塞的改善 剂，从而在药品中利用，此外还可以利用血流改善效果而作为针对腰痛症、冻伤、脱发症等 的内服和外用药品来利用。在增大脑血流方面，也可以应用于痴呆症。针对脱发症，也可以 作为化妆品使用。此外，对于癌症，可以作为诱导癌细胞静止的治疗药使用，对于干细胞，可 以作为其在生物体内外的维持药使用。光老化一般是指作为反复曝露于日光的结果而观察到的皮肤的外观和功能的变 化。作为日光的构成要素的紫外线(UV)，特别是其中的UV (称为UVB，波长为290-320nm)主 要引起光老化。引起光老化所需的UVB的曝露量现在还未知。然而，反复曝露于引起红斑 和/或晒斑的水平的UVB，通常与光老化相关。在临床上，光老化可以作为肌肤粗糙、皱纹形 成、斑着色、苍白化、松弛形成、毛细管扩张症发作、黑痣产生、紫癜病发作、容易受伤、萎缩、 纤维化病的色素去除区域产生、前期恶性肿瘤和恶性肿瘤的发作等来特定。光老化通常在 脸、耳、头、颈和手等经常曝露于日光的皮肤上发生。在皮肤的老化中，对皮肤病和/或暴露 于紫外线所引起的光老化是主要原因，本Tie2磷酸化剂可以通过抑制造成光老化的血管 疾病来用于改善光老化。本发明的血管成熟化、正常化或稳定化剂或者Tie2磷酸化剂可以根据其使用目 的来适当决定用量、用法、剂型。例如，本发明的血管新生抑制剂或Tie2磷酸化剂的给药形 态可以为口服、非口服、外用等。作为剂型，可以列举例如，片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、浸 膏剂、糖浆剂等口服给药剂，或注射剂、点滴剂或栓剂等非口服给药剂，软膏、乳膏、乳液、洗 剂、面膜()、y ” )、浴用剂等外用剂。在本发明的血管成熟化、正常化或稳定化剂或者Tie2活化(磷酸化)剂中，用于抑制血管新生的、来源于樟属植物的提取物的配合量可以根据用途来适当决定，一般在抑 制剂总量中作为干燥物为0. 0001 20. 0质量％，优选为0. 0001 10. 0质量％。此外，在本发明的血管成熟化、正常化或稳定化剂或者Tie2活化(磷酸化)剂中， 除了上述来源于樟属植物的提取物以外，可以根据需要适当配合例如，通常在食品和/或 药品中使用的赋形剂、防潮剂、防腐剂、增强剂、增稠剂、乳化剂、抗氧化剂、甜味料、酸味料、 调味料、着色料、香料等，通常在化妆品等中使用的美白剂、保湿剂、油性成分、紫外线吸收 剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、着色剂、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。此外，在使用本发明的血管成熟化、正常化或稳定化剂或者Tie2活化(磷酸化) 剂作为皮肤外用剂时，也可以适当配合在皮肤外用剂中常用的助剂，例如乙二胺四乙酸二 钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属螯合剂，咖啡因、单 宁、维拉帕米(Verapamil)、凝血酸(Tranexamic Acid)及其衍生物、甘草提取物、光甘草定 (Glabridin)、木瓜果实的热水提取物、各种生药、乙酸生育酚、甘草酸及其衍生物或其盐等 药剂，维生素C、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂，葡萄糖、果糖、甘 露糖、蔗糖、海藻糖等糖类，视黄酸、视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯等维生素A类寸。实施例接下来，根据实施例更详细地说明本发明。另外，本发明不限于此。配合量以质
量％表示。桂枝热水提取干燥残余成分的调制在400. 7g桂枝(肉桂:Cinnamomum cassia Blume的枝部分)中加入2L水，加热 提取3小时，过滤。在所得的残渣中加入2L水，重复同样的操作，再进行2次加热提取。将 所得的滤液冷冻干燥，从而获得39. 7g热水提取干燥残余成分。将该样品作为桂枝热水提 取物。桂枝提取物HP-20柱处理将上述获得的热水提取物10g进样到义^ ^ > HP_20(三菱化学制)柱中，用 含水乙醇体系使其溶出，获得50%乙醇溶出流分作为目标溶出流分。桂皮热水提取干燥残余成分的调制在20. 12g桂皮(肉桂:Cinnamomum cassia Blume的树皮部分)中加入200ml水， 加热提取3小时，过滤，在所得的残渣中加入200ml水，重复同样的操作，再进行2次加热提 取。将所得的滤液冷冻干燥，从而获得1.35g的热水提取物干燥残余成分。将该样品作为 桂皮热水提取物。Tie2磷酸化评价方法将强制表达野生型(WT) Tie2的Baf3造血细胞在RPMI1640培养基中、在 IL-3 (BI0S0URCE,PMC0034)U0% FCS存在下进行孵育。在细胞刺激的前一天，在除去了 FCS 的状态下，采用6孔板以2X 106个细胞/l. 5mL/孔来接种并孵育一晚。将上述热水提取干 燥残余成分的DMS0溶液、作为阳性对照的促血管生成素-1 (R&D system, 923-AN)或作为阴 性对照的DMS0分别添加至孔中使得各自的最终浓度为100ppm、0. 5ppm、lOOOppm，孵育10 分钟，然后将细胞在冰上冷却，用冷PBS洗涤。在包含蛋白酶抑制剂(LeUpeptin(亮抑酶 肽)、Aprotinin(抑肽酶)、P印statin (抑胃肽)、PMSF、Na3V04)的RIPA缓冲液中，对细胞进行超声波破碎。加入样品缓冲液(0. 2M Tris-HCl(pH6. 8)，4% SDS，20%甘油，5mM EDTA， 0. 01% BPB)，在以下条件下进行SDS-PAGE(7. 5%聚丙烯酰胺凝胶，12孔，NPU-7. 5L，了卜一 (株))凝胶7. 5%丙烯酰胺凝胶(NPU-7. 5L T卜一株式会社制)电泳条件40mA (75分钟，凝胶2片)Tie2 抗体sc_324(Santa Cruz Biotechnology 制)磷酸化Tie2 抗体#4221 (Cell Signaling 制)接下来，通过蛋白质印迹法(Western blotting，20V，4°C，过夜)向PVDF膜进行 转印。通过5%脱脂奶粉/TBST进行封闭(1小时)，然后加入Tie-2(Santa Cruz,sc-324) 或磷酸化Tie2(Cell Signaling，#4221)，在4°C下放置过夜。接着，加入山羊抗兔Ig’ s HRP(BI0S0URCE ALI3404)，在室温下放置1小时。通过化学发光检测(ECL)来检测蛋白质 条带。图1显示桂枝热水提取物的Tie2磷酸化的评价结果。观察到桂枝提取物与Ang-1 同样地引起Tie2磷酸化。因此，桂枝热水提取物显示Tie2磷酸化效果，暗示其有助于血管 成熟化、正常化、稳定化，其结果可以抑制血管新生。图2显示桂枝热水提取物和桂皮热水 提取物两者的Tie2磷酸化的评价结果。观察到与桂枝热水提取物同样地，桂皮热水提取物 也引起Tie2的磷酸化。2)采用正常人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)，同样地评价Tie2磷酸化评价。在 细胞刺激前3小时，将培养基由Humedia换成RPMI1640，接下来与Baf3细胞同样地进行评 价。其结果示于图3。与Baf3的结果相同，桂枝热水提取物与Ang-1同样地引起Tie2磷酸 化。另外，在添加了作为阴性对照的DMS0体系中，未观察到显著的Tie2磷酸化(图中未示 出)。皱纹防止和/或改善效果试验光老化皱纹改善试验采用Hr-1 (Skh-1)无毛小鼠(星野实验动物；6周龄 10周龄)，将Schwarz等人 的方法(Haratake A. et al.，J. Invest. Dermatol.，108，769-775，1997)部分改变,依据反 复照射 UVB 的方法(Naganuma M. et al. , J. Dermatol. Sci.，25，29-35，2001，Schwartz E.， J. Invest.，Dermatol.，91，158-161，1988)来形成皱纹。即，对个体背部照射UVB (光源东 芝二 >々卜U 7々制东芝FL-20SE荧光灯)，每周3次，照射10周。开始后的照射量为36mJ/ cm2/次，第2周以后逐渐增加，第10周为216mJ/Cm2/次。总照射量为4. 6J/cm2。紫外剂量 采用以UV辐射计(UVR-305/365D(II)，株式会社卜” 二 >制)测定得到的值。停止紫外线照 射，拍摄背部照片，利用将Bissett等人的方法(Bissett DL. et al.，Photochemistry and Photobiology 46,367-378,1987)部分改变而得的方法，依据下述所示判定基准对皱纹的 产生程度进行评分，仅使用形成了评分为7以上的皱纹的个体，涂布实施例1(配合桂枝提 取物、即上述热水提取物干燥残余成分)或实施例2 (配合桂枝提取物的HP-20柱50%乙醇 溶出流分)。皱纹的评分操作由3名测定者分别进行，通过协商来决定评分。另外，在评价时，遵守动物爱护管理法及其相关条例，基于获得公司内部动物实验 审议会承认的计划来实施。实施例1的组合物；
9
(成分)桂枝提取物化妆品用乙醇纯化水实施例2的组合物；(成分)桂枝提取物的HP-20柱50%乙醇溶出流分化妆品用乙醇纯化水
1. 0 30. 0
1. 0 30. 0
配合量(质量％)
配合量(质量％)评分判定基准0 未观察到皱纹。1 与评分2相比，皱纹更浅、更短或数量更少。2 观察到浅皱纹。3 与评分2相比，皱纹更深或更长。且与评分4相比，皱纹更浅、更短或数量更少。4 整体观察到浅皱纹。5 与评分4相比，皱纹更深或更长。且与评分6相比，皱纹更浅或更短。6 观察到深且长的皱纹。7 与评分6相比，深且长的皱纹增加。且与评分8相比，皱纹更浅或更短。8 整体观察到深且长的皱纹。将评分为7以上的无毛小鼠分成2组，每组5只，且使两组的评分相同，在各组个 体的整个背部皮肤上分别按照100 i!l、l天1次、一周5次、连续6周的方式涂布显示上述 组成的实施例1和实施例2处方。涂布结束后，拍摄背部的照片，根据上述所示的判定基准，在隐藏动物组名的状态 下由3名测定者分别对皱纹的程度进行评分，通过协商来决定评分。此外，用在实施例1的组合物中除去了桂枝提取物的比较例1进行同样的试验。比较例1的组合物；(成分)配合量(质量％)化妆品用乙醇30.0纯化水残余皱纹的改善度如下求出。即，按照“皱纹的改善度”=“样品溶液涂布前的评分”"“涂布样品溶液6周后的评分”的式子来计算。在下述表中作为各组的平均值显示按照上述式得到的皱纹改善度(皱纹改善变 化量)。[表 1]
权利要求
一种血管成熟化、正常化或稳定化剂，包含来源于樟属植物的提取物。
2.根据权利要求1所述的血管成熟化、正常化或稳定化剂，所述提取物来源于肉桂种 植物。
3.根据权利要求2所述的血管成熟化、正常化或稳定化剂，所述提取物来源于桂枝或桂皮。
4.根据权利要求1 3的任一项所述的血管成熟化、正常化或稳定化剂，所述提取物是 水提取物。
5.一种Tie2活化剂，包含来源于樟属植物的提取物。
6.根据权利要求5所述的Tie2活化剂，所述提取物来源于肉桂种植物。
7.根据权利要求6所述的Tie2活化剂，所述提取物来源于桂枝或桂皮。
8.根据权利要求5 7的任一项所述的Tie2活化剂，所述提取物是水提取物。
9.一种皱纹防止和/或改善剂，其配合有权利要求1 4的任一项所述的血管成熟化、 正常化或稳定化剂。
10.一种皱纹防止和/或改善剂，其配合有权利要求5 8的任一项所述的Tie2活化剂。
全文摘要
本发明提供包含来源于樟(Cinnamomum)属植物的提取物的血管成熟化、正常化或稳定化剂，或Tie2活化剂。
文档编号A61Q19/08GK101980716SQ20098011175
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者大田正弘, 小林孝次, 常长诚, 草苅健, 高仓伸幸 申请人:株式会社资生堂