专利名称：基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组融合蛋白，特别是碱性成纤维细胞生长因子与胶原蛋白融合蛋白。
背景技术：
喊性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF),是成纤维生长因子家族中的一员，最初是从牛脑垂体中提取得到的，因其能促进成纤维细胞增殖，且等电点为9. 6，故将其称之为碱性成纤维细胞生长因子。碱性成纤维细胞生长因子由155个
氨基酸组成，分子量约为18kD，对热不稳定，易被蛋白酶降解，它广泛存在于来源于中胚层及神经外胚层的细胞及多种肿瘤细胞中，是一种能促进中胚层及神经外胚层细胞增殖的多肽生长因子。在生物进化上，碱性成纤维细胞生长因子具有很强的保守性，人和牛的碱性成纤维细胞生长因子只有两个氨基酸不同，其氨基酸同源性高达98. 7%。碱性成纤维细胞生长因子的活性半衰期只有几个小时，在体内作用的发挥，需持续长时间与靶细胞上的高亲和力受体结合。成纤维细胞生长因子受体是一类具有自主性磷酸化活性的跨膜糖基化受体，碱性成纤维细胞生长因子与之结合后激活受体细胞内酪氨酸激酶活性区，从而引起一系列信号传递。碱性成纤维细胞生长因子发挥作用还离不开低亲和力受体，即硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的辅助，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖具有促进碱性成纤维细胞生长因子与成纤维细胞生长因子受体结合、增强碱性成纤维细胞生长因子稳定性、调节碱性成纤维细胞生长因子活性等生物学作用。碱性成纤维细胞生长因子是一种具有广泛生物活性的生长因子，实验证实，碱性成纤维细胞生长因子能有效促进新生血管的形成如毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增生和胶原的合成等；能通过趋化作用和促细胞迁移作用引导巨噬细胞、间充质细胞、内皮细胞、成纤维细胞等向创伤部位聚集，启动创伤愈合过程，从而促进软组织损伤的修复；能促进软骨细胞产生硫酸软骨蛋白聚糖、II型胶原，使其维持分化形态，从而促进骨组织损伤的修复；也能促进神经轴突生长，延长神经细胞的存活期，营养神经，从而修复神经组织损伤；还能促进肢体再生。体内实验证明，碱性成纤维细胞生长因子对去神经支配的两栖动物类肢体再生胚基有促进作用。近些年来，重组碱性成纤维细胞生长因子还被广泛应用于临床治疗创伤、溃疡及神经系统等疾病,但表达量普遍低下而使其生产成本相对较高。胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，其对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用。另外，胶原蛋白具有良好的细胞粘附性，与细胞结合对细胞迁移、胶原分解代谢以及血小板凝聚具有一定的作用。鉴于胶原蛋白固有的生物兼容性、生物降解性和吸收性以及促细胞形成等诸多功能，在生物医用材料、组织工程、化妆品等领域具有广泛的应用价值。碱性成纤维细胞生长因子作为一种临床上治疗各种创伤、烧烫伤、溃疡等的有效药物，与胶原蛋白结合制成的新型生物活性材料，具有快速止血、力口速创面愈合和促进组织修复等功能，其在重度渗血创面的止血愈合、妇科宫颈糜烂的治疗及牙周组织再生等临床试验中取得显著效果。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种用途广、使用效果好的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的基因重组人型活性 碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法。本发明还要解决的还有一个技术问题在于为基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白提供一种新用途。解决上述技术问题采用的技术方案是该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为I型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN721 TYRSRKYTSff YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS本发明的柔性肽段的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。上述基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法包括下述步骤I、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建I. I基因的获得从离体的人胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，根据I型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子基因序列，设计PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I , EcoRI、Not I和信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，碱性成纤维细胞生长因子上游添加柔性肽序列 GGAGGAAGCGGAGGAAGC。I型人胶原蛋白(C0L600)的引物序列为F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的引物序列为
F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATCR:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子基因。I. 2载体pPIC9K与I型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子的连接对pPIC9K及I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L600 d#pPIC9K-C0L600质粒与碱性成纤维细胞生长因子分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-C0L600-6P-bFGF ;该重组DNA序列如下PPIC9K载体购置于Invitrogen公司。该重组DNA序列如下I CTCGAGMAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGMGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGM421 CMGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GMGCAGGCA MCCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTMGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGMTGCC TGGTGAACGT721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAMGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGMTCTGGA
、
1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT
1801 GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC1861 ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG1921 GACCCCMGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC1981 CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGM2041 GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGM2101 GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG2161 GMTCTMTA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAMTACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG2221 AMCGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTA·TACTT2281 TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GC2、毕赤酵母电转化将10 ii g经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-C0L600-6P_bFGF质粒，与80 ii L毕赤酵母GSl 15感受态细胞混匀，其它毕赤酵母感受态细胞也可使用，如SMDl 168、KM71，转至0. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30°C倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落。毕赤酵母GS115购买于西安依科西安依科生物技术有限公司。3、多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，G418购买于西安依科生物技术有限公司，30°C培养，筛选获得转化子。4、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的发酵将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30°C振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，温度设定为30°C，pH值为5.0，培养16 20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C，诱导温度29°C, pH值为5. 5，溶氧控制在20% 30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为1:0. 25，诱导发酵36 42小时；5、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的纯化发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液用截留分子量为100KD中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤过液，再用截留分子量为20KD的中空纤维超滤系统进行超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，制备成基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白。6、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的检测将纯化前、纯化后的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法进行检测。基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途。基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，所制备的IOOg化妆品由下述质量配比的原料按化妆品水剂常规方法制成规人型诉性碱性成纤维_瞻生K因子融合蛋S0,01 0. (Mg
卄油2.0 l(U)g
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水溶性霍霍巴_0. 2-0. 7g
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水加个:IOOg.基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中使用，所制备的IOOg化妆品由下述最佳质量配比的原料按化妆品水剂常规方法制成
■对遺组人型丨甜養性成纤维细胞屮长W P融介进「I0.02g
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水加至IOOg=采用本发明方法所制备的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，检测其生物活性，表明基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白与碱性成纤维细胞生长因子标品具有相似的促细胞增殖的活性；经皮肤致敏性试验，表明基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白无致敏性。
图I是实施例I中重组表达载体pPIC9K-C0L600-6P_bFGF的质粒图谱。图2是实施例I中I型人胶原蛋白与碱性成纤维细胞生长因子基因的PCR产物电泳图。图3是实施例I中pPIC9K-C0L600-6P_bFGF质粒双酶切鉴定电泳图。图4是实施例I中基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图5是实施例I中基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的MTT细胞增殖活性图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I本实施例的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的全长762个氨基酸，氮端为I型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN721 TYRSRKYTSff YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS上述的柔性肽段的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。上述基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法包括下述步骤I、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建构建载体的质粒图谱见图1，基因序列如下I CTCGAGAAAC GAGAAGCTGG TGTTGCTGGT CCCAAGGGTC CCGCTGGTGA ACGTGGTTCT61 CCTGGCCCTG CTGGCCCCAA AGGATCTCCT GGTGAAGCTG GTCGTCCCGG TGAAGCTGGT121 CTGCCTGGTG CCAAGGGTCT GACTGGAAGC CCTGGCAGCC CTGGTCCTGA TGGCAAAACT181 GGCCCCCCTG GTCCCGCCGG TCAAGATGGT CGCCCCGGAC CCCCAGGCCC ACCTGGTGCC241 CGTGGTCAGG CTGGTGTGAT GGGATTCCCT GGACCTAAAG GTGCTGCTGG AGAGCCCGGC301 AAGGCTGGAG AGCGAGGTGT TCCCGGACCC CCTGGCGCTG TCGGTCCTGC TGGCAAAGAT361 GGAGAGGCTG GAGCTCAGGG ACCCCCTGGC CCTGCTGGTC CCGCTGGCGA GAGAGGTGAA421 CAAGGCCCTG CTGGCTCCCC CGGATTCCAG GGTCTCCCTG GTCCTGCTGG TCCTCCAGGT481 GAAGCAGGCA AACCTGGTGA ACAGGGTGTT CCTGGAGACC TTGGCGCCCC TGGCCCCTCT541 GGAGCAAGAG GCGAGAGAGG TTTCCCTGGC GAGCGTGGTG TGCAAGGTCC CCCTGGTCCT601 GCTGGTCCCC GAGGGGCCAA CGGTGCTCCC GGCAACGATG GTGCTAAGGG TGATGCTGGT661 GCCCCTGGAG CTCCCGGTAG CCAGGGCGCC CCTGGCCTTC AGGGAATGCC TGGTGAACGT
721 GGTGCAGCTG GTCTTCCAGG GCCTAAGGGT GACAGAGGTG ATGCTGGTCC CAAAGGTGCT781 GATGGCTCTC CTGGCAMGA TGGCGTCCGT GGTCTGACTG GCCCCATTGG TCCTCCTGGC841 CCTGCTGGTG CCCCTGGTGA CAAGGGTGAA AGTGGTCCCA GCGGCCCTGC TGGTCCCACT901 GGAGCTCGTG GTGCCCCCGG AGACCGTGGT GAGCCTGGTC CCCCCGGCCC TGCTGGCTTT961 GCTGGCCCCC CTGGTGCTGA CGGCCMCCT GGTGCTAAAG GCGAACCTGG TGATGCTGGT1021 GCTAAAGGCG ATGCTGGTCC CCCTGGCCCT GCCGGACCCG CTGGACCCCC TGGCCCCATT1081 GGTAATGTTG GTGCTCCTGG AGCCAMGGT GCTCGCGGCA GCGCTGGTCC CCCTGGTGCT1141 ACTGGTTTCC CTGGTGCTGC TGGCCGAGTC GGTCCTCCTG GCCCCTCTGG AAATGCTGGA1201 CCCCCTGGCC CTCCTGGTCC TGCTGGCAAA GAAGGCGGCA AAGGTCCCCG TGGTGAGACT1261 GGCCCTGCTG GACGTCCTGG TGAAGTTGGT CCCCCTGGTC CCCCTGGCCC TGCTGGCGAG1321 AMGGATCCC CTGGTGCTGA TGGTCCTGCT GGTGCTCCTG GTACTCCCGG GCCTCAAGGT1381 ATTGCTGGAC AGCGTGGTGT GGTCGGCCTG CCTGGTCAGA GAGGAGAGAG AGGCTTCCCT1441 GGTCTTCCTG GCCCCTCTGG TGAACCTGGC AAACMGGTC CCTCTGGAGC AAGTGGTGM1501 CGTGGTCCCC CTGGTCCCAT GGGCCCCCCT GGATTGGCTG GACCCCCTGG TGAATCTGGA1561 CGTGAGGGGG CTCCTGGTGC CGAAGGTTCC CCTGGACGAG ACGGTTCTCC TGGCGCCAAG1621 GGTGACCGTG GTGAGACCGG CCCCGCTGGA CCCCCTGGTG CTCCTGGTGC TCCTGGTGCC1681 CCTGGCCCCG TTGGCCCTGC TGGCAAGAGT GGTGATCGTG GTGAGACTGG TCCTGCTGGT1741 CCCGCCGGTC CTGTCGGCCC TGTTGGCGCC CGTGGCCCCG CCGGACCCCA AGGCCCCCGT1801 GGTGACMGG GTGAGACAGA ATTCGGAGGA AGCGGAGGAA GCGCAGCCGG GAGCATCACC1861 ACGCTGCCCG CCTTGCCCGA GGATGGCGGC AGCGGCGCCT TCCCGCCCGG CCACTTCAAG1921 GACCCCMGC GGCTGTACTG CAAAAACGGG GGCTTCTTCC TGCGCATCCA CCCCGACGGC
1981 CGAGTTGACG GGGTCCGGGA GAAGAGCGAC CCTCACATCA AGCTACAACT TCAAGCAGM2041 GAGAGAGGAG TTGTGTCTAT CAAAGGAGTG TGTGCTAACC GTTACCTGGC TATGAAGGM2101 GATGGAAGAT TACTGGCTTC TAAATGTGTT ACGGATGAGT GTTTCTTTTT TGAACGATTG2161 GMTCTMTA ACTACAATAC TTACCGGTCA AGGAMTACA CCAGTTGGTA TGTGGCACTG2221 AMCGAACTG GGCAGTATAA ACTTGGATCC AAAACAGGAC CTGGGCAGAA AGCTATACTT2281 TTTCTTCCAA TGTCTGCTAA GAGCTGAGCGGCC GCI. I基因的获得从离体的人胎盘组织中提取总RNA,采用GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录，获得cDNA, GeneCopoeiaFirst-Strand cDNA synthesisKit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。根据I型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子基因序列，设计PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I、EcoR I、Not I和信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，碱性成纤维细胞生长因子上游添加柔性肽序列GGAGGAAGCGGAGGAAGC。I型人胶原蛋白(C0L600)的引物序列为F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的引物序列为F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATC
R:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA251^反应体系中含有13.31^灭菌的双蒸水、2.511110\ 0 buffer，3. 5 ii L2m mol/LdNTP Mix, 2. 5 u L MgCl2,1 u LlO u mol/L Primer F, I u LlO u mol/L Primer R,0. 2u L 0. 5U/ii LTaq 酶，I ii L cDNA 模板。反应条件为95 °C 5min，94 °C 30s，56 °C 30s，72°C 60s, 30 个循环，72°C 10min,4°C lOmin，利用 PCR 仪进行扩增。I型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子的PCR扩增结果见图2。I. 2载体pPIC9K和I型人胶原蛋白的双酶切对pPIC9K和I型人胶原蛋白PCR产物利用Xho I和EcoR I内切酶进行双酶切。双酶切体系如下
权利要求
1.一种基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于该融合蛋白全长762个氨基酸,氮端为I型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸,碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接，该融合蛋白氨基酸序列如下I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFGGSGGSAA GSITTLPALP EDGGSGAFPP GHFKDPKRLY CKNGGFFLRI HPDGRVDGVR661 EKSDPHIKLQ LQAEERGVVS IKGVCANRYL AMKEDGRLLA SKCVTDECFF FERLESNNYN721 TYRSRKYTSff YVALKRTGQY KLGSKTGPGQ KAILFLPMSA KS
2.根据权利要求I所述的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述的柔性肽段的氨基酸序列为Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser。
3.—种权利要求I基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的制备方法，其特征在于它包括下述步骤 (I)基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建 I. I基因的获得 从离体的新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，根据I型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子基因序列，设计PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I , EcoRI、Not I和信号肽切割位点AAACGAGAAGCT，碱性成纤维细胞生长因子上游添加柔性肽序列 GGAGGAAGCGGAGGAAGC ； I型人胶原蛋白的引物序列为F:CGCTCGAGAAACGAGAAGCTGGTGTTGCTGGTCCCAR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG碱性成纤维细胞生长因子的引物序列为F:GCGAATTCGGAGGAAGCGGAGGAAGCGCAGCCGGGAGCATCR:ATGCGGCCGCTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAA 采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白和碱性成纤维细胞生长因子基因； I. 2载体pPIC9K与I型人胶原蛋白及碱性成纤维细胞生长因子的连接对pPIC9K及I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L600 d#pPIC9K-C0L600质粒与碱性成纤维细胞生长因子分别进行EcoR I及Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-C0L600-6P-bFGF ;该重组DNA序列 如下
4.权利要求I的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途。
5.根据权利要求4所述的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途，其特征在于所制备的IOOg化妆品由下述质量配比的原料按化妆品水剂的常规方法制成 基因靈組入遲生长_子Bi合蛋Sa Oi ~(), 03g IIlllf2,0 10. Og 山梨糖醇3. 0 6. Og1.0-4. Og 水溶性 崔巴油0. 2~(). Ig 遞_质酸_0.05-0.2g iiw候醇1基氨￥觀_0. (I I (I. OSg氢化蓮麻_0.卜0. 2g水加个:IOOg0
6.按照权利要求5所述的基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白在制备化妆品中的用途，其特征在于所制备的IOOg化妆品由下述质量配比的原料按化妆品水剂的常规方法制成
全文摘要
一种基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白，该融合蛋白全长762个氨基酸，氮端为Ⅰ型人胶原蛋白500-1099肽段共600个氨基酸，碳端为人碱性成纤维细胞因子共154个氨基酸，两个肽段之间用谷氨酸和苯丙氨酸以及一个含6个氨基酸的柔性肽段连接。制备方法包括基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白表达载体的构建、毕赤酵母电转化、多拷贝插入重组子的筛选、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的发酵、基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白的纯化步骤。基因重组人型活性碱性成纤维细胞生长因子融合蛋白用于制备化妆品。
文档编号A61Q19/00GK102675473SQ201210139430
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者侯增淼, 李哲, 李晓颖, 赵金礼, 高恩 申请人:西安华澳丽康生物工程有限公司