包含由大豆和酵母的肽提取物的组合组成的协同trf2蛋白活化系统的化妆品组合物及其用途

包含由大豆和酵母的肽提取物的组合组成的协同trf2蛋白活化系统的化妆品组合物及其用途
【专利摘要】本发明涉及化妆品组合物，其包含在生理学可接受的介质中的协同TRF2蛋白活化系统，所述协同TRF2蛋白活化系统由大豆和酵母的肽提取物的组合组成。其特征在于所述大豆和酵母的肽提取物是通过水解原料总重量的至少80重量％的大豆和原料总重量的至多20重量％的酵母获得的。本发明还涉及本发明的化妆品组合物特别用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤的用途，其通过在不改变端粒末端转移酶的量和/或活性的情况下增加所述细胞中TRF2的量来限制端粒降解。本发明最后涉及用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤的美容处理方法，其包括在面部或身体的至少一部分皮肤上局部施用本发明的化妆品组合物。
【专利说明】包含由大豆和酵母的肽提取物的组合组成的协同TRF2蛋 白活化系统的化妆品组合物及其用途
[0001] 本发明涉及化妆品领域。其涉及包含由大豆和酵母的肽提取物（P印tidic soybean and yeast extract)的组合组成的协同TRF2蛋白活化系统的化妆品组合物，更具 体地，所述化妆品组合物旨在预防和/或治疗与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤及与老化 相关的皮肤体征（skin sign)。
[0002] 衰老（senescence)是影响"正常"构成人类的所有细胞的生物过程。所述衰老在 身体方面由人体的整体老化（无论是对皮肤细胞、毛发、器官等）来传达。
[0003] 已在科学上证明衰老尤其由端粒缩短（细胞复制性衰老）或者由对生理应激体征 如氧化性应激的急性或慢性暴露导致。探索用于限制细胞衰老并由此限制人类老化的手段 之一由对抗端粒缩短和/或限制对DNA的氧化性应激作用构成。
[0004] 端粒由TTAGGG序列的重复序列及特定蛋白形成。端粒位于染色体末端并提供其 稳定性。在与端粒结合的蛋白中，发现蛋白TRF1和TRF2(用于端粒结合因子的TRF)直接 与双链端粒DNA结合，或者蛋白P0T1与单链3'末端结合。在细胞分裂中，在复制期间的过 程中损失TTAGGG单元。这种端粒损失部分得到逆转录酶（即端粒末端转移酶）的补偿，所 述端粒末端转移酶重新进行预存的端粒的末端上的端粒重复序列的合成，由此确保最佳长 度。
[0005] 所出现的问题是这种端粒末端转移酶的活性在体细胞中极弱，导致在每次染色体 复制时端粒缩短。
[0006] 当前用于限制皮肤老化并由此限制其体征的策略之一由增加皮肤细胞的端粒末 端转移酶活性构成。然而，这涉及不期望的所述细胞永生化的风险，因为永生化细胞可能与 癌细胞相关。
[0007] 申请人:已探索另一种途径来尝试延迟细胞衰老，其通过调节与端粒相关的蛋白、 更具体是TRF2蛋白的量来进行。以此种方式， 申请人:已开发出适于增加与皮肤细胞中端粒 相关的蛋白的量的由大豆和酵母的肽提取物的组合组成的协同TRF2蛋白活化系统。
[0008] 此外，先前已提出调节TRF蛋白的化合物或端粒稳定剂，如专利申请 US20020076719、W09836066 或 W02004092395 中所公开的。
[0009] 此外，大豆或酵母肽提取物的美容用途（cosmetic use)已被描述为对皮肤具 有抗老化作用（专利申请 FR2915378、FR2915384、FR2915381、FR2887775、FR2887772、 FR2826576)，并且包含大豆、麦芽和酵母水性提取物的化妆品组合物已被描述为增加皮肤 弹性（KR2003045437)。
[0010] 然而，上述所引用的文献均未公开或提示如本专利申请所公开的由确定浓度的大 豆和酵母的肽提取物组成的协同TRF2蛋白活化系统，或者包含此类TRF2蛋白活化系统的 化妆品组合物用于预防和/或治疗与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤及皮肤体征的用途。 [0011] 本发明所用的TRF2蛋白活化系统特别提供了以下优点：
[0012]-其增加皮肤细胞中与端粒相关的蛋白（TRF)、特别是TRF2蛋白的量；
[0013]-其限制具有老化细胞表型的细胞中波形蛋白（细胞骨架蛋白）的增加和聚集；
[0014]-其限制用丙酮醛（methylglyoxal)处理的皮肤活组织切片中损伤的出现；
[0015]-其在不改变端粒末端转移酶的量和/或活性的情况下限制端粒的降解；以及
[0016] -其由此预防和/或治疗与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤及皮肤体征。
[0017] 本发明首先涉及化妆品组合物，其包含在生理学可接受的介质中的协同TRF2蛋 白活化系统，所述协同TRF2蛋白活化系统由大豆和酵母的肽提取物的组合组成，所述大豆 和酵母的肽提取物是通过水解原料总重量的至少80重量％的大豆和原料总重量的至多20 重量％的酵母获得的。
[0018] 本发明还涉及本发明的组合物用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA 损伤的美容用途，其通过在不改变端粒末端转移酶的量和/或活性的情况下增加所述细胞 中TRF2的量来限制端粒的降解。
[0019] 最后，本发明还涉及用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤的美 容处理方法，其包括在面部或身体的至少一部分皮肤上局部施用（topical application) 本发明的组合物。
[0020] 在阅读下文的描述和非限制性实施方案时会更清楚地理解本发明及其优点。
[0021] 本发明由此涉及化妆品组合物，其包含在生理学可接受的介质中的协同TRF2蛋 白活化系统，所述协同TRF2蛋白活化系统由肽提取物的组合组成，所述肽提取物是通过水 解各种所选原料（即大豆和酵母）而获得的。
[0022] 本发明的大豆肽提取物（peptidic soybean extract)优选通过水解大豆 (Glycine Max L.)而获得，并且，本发明的酵母肽提取物（peptidic yeast extract) 优选通过水解酵母属（Saccaromyces)的酵母（更特别是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))生物质而获得。
[0023] 优选地，大豆不经历预先发酵（prior fermentation)，并且酵母是冷冻干燥的。
[0024] 为了获得本发明的TRF2蛋白活化系统，可以分别获得大豆和酵母肽水解产物，然 后将其组合以形成本发明的大豆和酵母的肽提取物。
[0025] 优选地，大豆和酵母的水解同时（concomitantly)发生，例如根据实施例1的方 法。
[0026] 不管使用何种方法，以下述程度来保持本发明的TRF2蛋白活化系统的性质，即， 通过水解原料总重量的至少80重量％的大豆和原料总重量的至多20重量％的酵母来获得 大豆和酵母的肽提取物。
[0027] 例如，所述协同TRF2蛋白活化系统由大豆和酵母的肽提取物组成，所述大豆和酵 母的肽提取物是通过水解原料总重量的85重量％至92重量％的大豆和原料总重量的8重 量％至15重量％的酵母而获得的。优选地，通过水解原料总重量的90重量％的大豆和原 料总重量的10重量％的酵母来形成本发明的TRF2蛋白活化系统。
[0028] 定性和定量地分析形成本发明的TRF2蛋白活化系统的大豆和酵母的肽提取物的 物理化学特性和肽化合物；根据本领域技术人员熟知的常规技术来测定肽、氨基酸和蛋白 片段。
[0029] 本发明的优选的大豆和酵母的肽提取物基本包含低分子量肽化合物，S卩，有利地 仅含有低分子量肽。优选地，其基本包含分子量小于5kDa的肽化合物，S卩，有利地，本发明 的大豆和酵母的肽提取物仅包含分子量小于5kDa的肽化合物。
[0030] 此外，根据本发明的一个有利的实施方案，所述大豆和酵母的肽提取物包含以干 燥提取物重量计的16g/L至18g/L的肽化合物，优选地，本发明的大豆和酵母的肽提取物被 稀释至含有以干燥提取物重量计的〇. 5g/L至5. 5g/L的肽化合物。
[0031] 包含TRF2蛋白活化系统和生理学可接受的介质的本发明的化妆品组合物呈适于 在面部或身体的至少一部分皮肤上局部施用的形式。
[0032] 本发明的生理学可接受的介质特别意指适用于与人类皮肤或皮肤附件接触而没 有诸如毒性、不相容性、不稳定性或过敏反应的风险的介质。
[0033] 根据本发明的一个有利的实施方案，先将形成TRF2蛋白活化系统的大豆和酵母 的肽提取物溶解在一种或多种本领域技术人员常用的生理学可接受的溶剂中，所述溶剂例 如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、二甘醇的乙氧基化物或丙氧基化物、环状 多元醇、凡士林、植物油或这些溶剂的混合物。
[0034] 根据本发明的其他有利的实施方案，将本发明的大豆和酵母的肽提取物溶解在化 妆品载体如脂质体中，或吸附在有机聚合物粉末、矿物基质如滑石和膨润土上，且更常溶解 在任意生理学可接受的载体中或与其结合。
[0035] 优选地，意欲局部施用的本发明的组合物呈以下形式：乳膏剂、水包油乳剂或油包 水乳剂或复合型乳剂、溶液剂、混悬剂、微乳剂、含水或无水凝胶剂、浆液（serum)、或小泡分 散体（vesicular dispersion)、贴剂、喷雾剂、油膏剂（unguent)、软膏剂（ointment)、洗 齐LI、胶体（colloid)、乳液（milk)、棒（stick)或粉末。
[0036] 根据本发明的一个有利的实施方案，相对于最终组合物的总重量，所述大豆和酵 母的肽提取物以约〇. 〇〇〇 1 %至20 %的浓度、优选以约0. 05 %至5 %的浓度、更优选以约1 % 至3%的浓度存在于本发明的化妆品组合物中。
[0037] 更优选地，本发明的化妆品组合物还包含至少一种其他活性剂。其包括但不限于 以下成分类型：其他肽活性剂、植物提取物、治疗剂（healing agent)、抗老化剂、抗皱剂、安 抚剂、抗自由基剂、抗紫外线剂、刺激真皮大分子合成或能量代谢的药剂、保湿剂、抗菌剂、 抗真菌剂、抗炎剂、麻醉剂、调节皮肤的分化、色素沉着或色素脱失的药剂、刺激指甲或毛发 生长的药剂等。优选地，使用在抗皱领域中具有活性的药剂，例如抗自由基或抗氧化剂、或 刺激真皮大分子合成的药剂、或刺激能量代谢的药剂。更特别地，所述活性剂选自维生素、 植物留醇、类黄酮、DHEA和/或其任意前体或者其任意化学或生物衍生物、金属蛋白酶抑制 剂或维甲酸。
[0038] 此外，可以向本发明的组合物中加入添加剂，例如溶剂、稀释剂、着色剂、防晒 剂（sun filter)、自晒剂（self-tanning agent)、颜料、填充剂、防腐剂、气味吸附剂、增 稠剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂（emollient)、芳香剂、抗氧化剂、成膜剂、螯合剂、掩蔽剂 (sequestering agent)、调节剂。
[0039] 在任何情况中，本领域技术人员会确保选择这些添加剂及其比例以不妨碍本发明 的包含由大豆和酵母的肽提取物组成的TRF2蛋白活化系统的组合物所寻求的有利性质。 这些添加剂可以例如为所述组合物总重量的0.01%至20%。如果本发明的组合物是乳剂， 则相对于所述组合物的总重量，油相可以占5重量％至80重量％，优选5重量％至50重 量％。所述组合物中所用的乳化剂和助乳化剂可以选自相关领域中常用的那些。例如，相对 于所述组合物的总重量，所述乳化剂和助乳化剂可以〇. 3重量％至30重量％的比例使用。
[0040] 本发明的化妆品组合物（更特别是由大豆和酵母的肽提取物的组合组成的协同 TRF2蛋白活化系统，所述大豆和酵母的肽提取物是通过水解原料总重量的至少80重量％ 的大豆和原料总重量的至多20重量％的酵母获得的）通过增加其蛋白合成（通过直接或 间接调节基因表达）或通过其他生物过程（如信使RNA转录稳定化）增加了在皮肤细胞中 与端粒结合的TRF蛋白（TRF2和/或P0T1)、优选TRF2的量。
[0041] TRF2蛋白活化系统具有协同作用，因为相对于相同总量的100%大豆肽提取物 (以原料总重量计），通过水解原料总重量的至少80重量％的大豆和原料总重量的至多20 重量％的酵母获得的大豆和酵母的肽提取物的组合在增加培养的角质形成细胞和成纤维 细胞的TRF2表达方面，可以使活化系统的效力增加约20%。
[0042] 以此方式，本发明的另一目的涉及本发明的组合物用于预防和/或修复与老化相 关的皮肤细胞的DNA损伤的美容用途，其通过在不改变端粒末端转移酶的量和/或活性的 情况下增加所述细胞中TRF2的量来限制端粒的降解，这是重要的，因为由此没有细胞永生 化的风险。
[0043] 在人类中每天修复细胞DNA的损伤，但并不是完全地修复。未修复的损伤因此逐 年积累。因此必须预防并修复这种损伤。
[0044] 预防皮肤细胞的DNA损伤是指本发明的TRF2蛋白活化系统对皮肤细胞限制DNA 损伤的出现的保护作用。
[0045] 修复皮肤细胞的DNA损伤是指本发明的TRF2蛋白活化系统对皮肤细胞的先前损 伤的修复作用。
[0046] 本发明的皮肤细胞是指表皮和真皮的细胞，特别是角质形成细胞和成纤维细胞。
[0047] 本发明的皮肤细胞的DNA损伤是指由DNA碱基之间的光化学反应导致的损伤，例 如环丁烷的嘧啶二聚体的形成、DNA上的双链断裂、或在易于由环境产生的外部侵袭之后的 DNA的任何其他损伤。
[0048] 例如，其包括诸如污染的侵袭、导致氧化性应激的侵袭、例如与过度暴露于阳光相 关的UV辐射特别是UVB、或诸如表面活性剂、防腐剂或芳香剂的刺激性物质。
[0049] 本发明的化妆品组合物优选用于预防和/或修复在损伤之后皮肤细胞的DNA上出 现的双链断裂。实际上，在皮肤细胞损伤、特别是由UV辐射或氧化性应激产生的损伤之后， 所述皮肤细胞的DNA易受由双链断裂传达的损伤。本发明的由大豆和酵母的肽提取物的组 合形成的协同TRF2蛋白活化系统已证明其在此类损伤方面的DNA保护作用。
[0050] 本发明的化妆品组合物还用于预防和/或治疗老化的皮肤体征以及由UV辐射诱 导的光老化的皮肤体征。
[0051] 本发明的光老化是指由长期和累积的暴露于阳光而导致的皮肤过早老化。
[0052] 本发明的老化和光老化的皮肤体征包括但不限于由老化导致的皮肤上的任何可 见体征。这特别是指皱纹、深皱纹、纹路（lines)、龟裂、皮肤组织和皮下组织的松弛、皮肤弹 性损失和张力缺乏、硬度（firmness)和光度（tone)损失、以及真皮萎缩。
[0053] 本发明的化妆品组合物优选意欲预防和/或治疗皱纹、深皱纹、纹路、龟裂、皮肤 组织和皮下组织的松弛、皮肤弹性损失和张力缺乏、硬度和光度损失、以及真皮萎缩。
[0054] 最后，本发明的最后目的涉及用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA 损伤的美容处理（cosmetic treatment)方法，其包括在面部或身体的至少一部分皮肤上局 部施用本发明的组合物，其中在早晨施用所述组合物作为抗老化日间护理和/或在睡前施 用所述组合物作为修复夜间护理。当作为日间护理而施用时，所述组合物通过限制皮肤细 胞出现DNA损伤而特别保护皮肤免于环境侵袭，即UV辐射特别是UVB。作为夜间护理，所述 组合物更特别对日间皮肤的任何损伤具有修复作用。
[0055] 在本发明的美容处理方法的另一有利的实施方案中，在日光照射之前施用所述组 合物作为晒前护理（pre-sun care)和/或在日光照射之后施用所述组合物作为晒后护理 (after-sun care)，由此构成特别预防皮肤细胞的DNA损伤的优异晒前护理，和/或在日光 照射之后，作为更特别用于修复皮肤的任何DNA损伤的晒后护理。
[0056] 下列实施例描述和证明了本发明的协同TRF2蛋白活化系统的效力，但不应解释 为对本发明的限制。
[0057] 实施例1 :用于获得本发明的大豆和酵母的狀提取物的方法
[0058] 为了获得本发明的协同TRF2蛋白活化系统，将原料总重量的90重量％的之前经 研磨的大豆与原料总重量的10重量％的酵母生物质混合。将原料混合物以1:60的重量比 置于水溶液中，即，lkg原料混合物于60kg水中。将溶液的pH调节至7至7. 5的值。在调 节pH之后，向反应混合物中添加2 %菠萝蛋白酶和2 % P〇LYCLARK 1〇 (不溶性聚乙烯 吡咯烷酮-PVPP)。然后，将反应混合物在55°C加热2小时，并在80°C灭活2小时。使用过 滤步骤来收回由20g/L至25g/L的干燥物质、19g/L至22g/L的蛋白和2g/L至3g/L的糖组 成的滤液。
[0059] 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来证明该滤液的蛋白性质。对于该分析，使用 NuPAGE? IUs-Tris Pre-cast (Invitrogen)凝胶。将大豆和酵母的肽提取物的中间体 /l:NuPAGEE LDS样品配制缓冲液中于变性还原条件下加热至70°C，持续10分钟。将 NuPAGE?抗氧化剂溶液加入内部容器中，以预防经还原的蛋白在电泳期间的再氧化。在 NuPAGE? MES迁移缓冲液下进行肽化合物的迁移，并使用SeeBlue Plus2标准作为分子 量标记物。使用Coomassie Blue? R 250进行肽化合物的染色。所获得的肽曲线显示小于 6kDa的分子量分布。
[0060] 然后使用降低孔隙率（直至〇· 2 μ m)的Seitz-Orion压滤机，通过连续过滤来纯 化上述获得的大豆和酵母的肽提取物的中间体，从而获得有光泽且澄清的溶液。在该步骤 中，大豆和酵母提取物的特征为20-22g/kg的干重、18-20g/L的肽化合物含量和l-2g/L的 糖含量。
[0061] 然后，使用切向流过滤，通过除去分子量大于5kDa的肽化合物来纯化该溶液。对 此，经由装备有10kDa Biomax Pelliconu' 2盒的Pellicon?夹持器，在压力下泵送大豆和 酵母溶液。回收此第一滤液以用于经由其他5kDa Biomax Pellicon1' 2盒的后续过滤。
[0062] 在纯化结束时，获得有光泽且澄清的浅黄色大豆和酵母植物肽提取物。其特征为 18-20g/kg的干重、16-18g/L的肽化合物含量和0· 3-0. 5g/L的糖含量。
[0063] 然后进行灭菌过滤步骤以获得本发明最终的大豆和酵母的肽提取物，将其在30% 甘油中稀释至2. 35g/L的肽化合物。
[0064] 实施例2 :实施例1的大豆和酵母的狀提取物对通讨细朐复制件衰老老化的成纤 维细朐的作用的研究
[0065] 使用浓度为1 %或3 %的实施例1的大豆和酵母的肽提取物的每日施用，将人成纤 维细胞置于特定培养基中培养，并保持长期培养（持续多于17代）。在培养的第6代和第 17代细胞上进行波形蛋白免疫荧光检测实验。然后将细胞用PBS洗涤，用3. 7 %甲醛固定10 分钟，使用 〇· 2% Triton X-100 透化 10 分钟（Fisher Chemical)并用 1% BSA(Euromedex) 孵育15分钟。随后添加抗波形蛋白抗体（Tebu Santa Cruz)并在环境温度下以1:200度 稀释来孵育2小时。用PBS洗涤，然后以1:1000度稀释添加与Alexa Fluoi3 488标记物 结合的Donkey抗小鼠 IgG抗体，并在环境温度下保持孵育1小时。最后，用Fluoromount G(Electron Microscopy Science)安置切片，并用显微镜（Nikon Eclipse 80i,放大率 40X)检查。
[0066] 结果/结论:
[0067] 观察到与未处理的老化成纤维细胞相比，用实施例1的大豆和酵母的肽提取物处 理的老化成纤维细胞表达更少的波形蛋白。然而，波形蛋白的增加和聚集与伴随老化现象 的细胞骨架改性有关。因此可以得出以下结论：使用本发明的大豆和酵母的肽提取物的处 理可以限制由于成纤维细胞老化而产生的波形蛋白的增加和聚集。
[0068] 实施例3 :实施例1的大豆和酵母的狀提取物对俥用丙酮醛体外致#衰老的活鉬 织切片樽型的作用的研究
[0069] 通过使用丙酮醛（MG0)处理来向人皮肤活组织切片人工体外致使衰老。对此，将 6mm开孔的人皮肤活组织切片在空气-液体界面下于特定培养基中孵育。然后，将其用放置 在活组织切片表面上和培养基中的5mM或10mM的MG0 (Sigma)处理。随后用以下处理活组 织切片：
[0070] -条件 1 :20μ L 的 1XPBS，或
[0071] -条件2 :20 μ L的1 %的实施例1的大豆和酵母的肽提取物；或
[0072] -条件3 :20 μ L的3%的实施例1的大豆和酵母的肽提取物。
[0073] 将活组织切片固定并包含在石蜡中，然后使用切片机切割成4μπι切片。在先前经 切割的切片上进行苏木精/曙红（Η&Ε)免疫标记，并且通过显微镜（使用Nikon Eclipse E600,40 X透镜）观察来研究其形态和结构。
[0074] 结果/结论:
[0075] 在对照条件1 (即不添加本发明的肽提取物的情况）下，观察到MG0导致的对皮肤 活组织切片、更特别地对其结构的显著损伤。所导致的损伤是剂量依赖性的，因为对l〇mM MG0的量观察到更大损伤。
[0076] 当用实施例1的大豆和酵母的肽提取物处理活组织切片时，观察到对所述活组织 切片结构的损伤与对照条件下相比显著更小。观察到实施例1的大豆和酵母的肽提取物的 保护作用是剂量依赖性的，因为与1%剂量相比，对3%剂量观察到甚至更小的损伤。
[0077] 因此，可以得出以下结论：当细胞结构经受导致显著损伤和早期衰老的应激时，本 发明的大豆和酵母的肽提取物对所述结构具有保护作用。
[0078] 实施例4 :通讨用实施例1的大豆和酵母的狀提取物处理的人成纤维细朐中的 siRNA的TRF2蛋白表汰的研究
[0079] 为了量化本发明的肽提取物对人成纤维细胞群中的TRF2过表达的效力，使用 siRNA (沉默子RNA)来"消灭"编码TRF2的基因。
[0080] 方案:
[0081] 将成纤维细胞置于6-孔板中培养，直至60%汇合。在下述条件下，通过添加1 % 的实施例1的大豆和酵母的肽提取物来更新培养基。然后，逐孔逐滴小心添加1〇〇 μ L先前 制备的混合物，其包含最终含量为1〇ηΜ的TRF2siRNA和转染剂。将细胞培养板在37°C和 5% C02中孵育72小时。每2天更新一次培养基。建立4种条件：
[0082] -条件1 :不含siRNA且不含活性剂的对照
[0083] -条件2 :用siRNA转染的细胞，不含活性剂
[0084] -条件3 :非转染细胞，但用活性剂处理
[0085] -条件4 :用siRNA转染且用活性剂处理的细胞
[0086] 利用使用抗-TRF2并根据常规方案进行的常规免疫转移（immunotransfer)技术 (蛋白质印迹（Western Blot))来观察TRF2表达量化。为了分析由用siRNA转染的成纤维 细胞中的肽提供的补偿，相对于其中基因未被siRNA消灭的未处理成纤维细胞进行比较。
[0087] 结果/结论:
[0088] 在条件1和3之间，观察到与对照相比，添加实施例1的大豆和酵母的肽提取物导 致TRF2蛋白表达增加17%。在条件1和2之间，有效观察到siRNA对TRF2蛋白表达的作 用：实际上，该表达降低26%。然而，向用siRNA转染的细胞添加活性剂恢复了 TRF2表达， 并且由于存在siRNA而产生的表达的降低与对照条件相比仅为18%。
[0089] 总之，本发明的大豆和酵母的肽提取物可以补偿经处理的成纤维细胞中的TRF2 蛋白表达的降低（由特异性siRNA诱导的降低）。
[0090] 实施例5 :用实施例1的大豆和酵母的狀提取物处理的人角质形成细朐中的#用 siRNA的TRF2蛋白表汰的研究
[0091] 为了量化本发明的肽提取物对角质形成细胞群中的TRF2表达水平调节的效力， 使用siRNA来"消灭"编码TRF2的基因。
[0092] 方案:
[0093] 使用 Lipofectamine?RNAiMAX 转染技术（Invitrogen,编号：13778-075)，任选地 用最终浓度为25nM的特异性TRF2siRNA(定制siRNA，Qiagen)处理培养的人角质形成细 胞，并且任选地用最终浓度为1 %的该成分处理，持续48小时。
[0094] 建立4种条件：
[0095] -条件1 :不含siRNA且不含活性剂的对照
[0096] -条件2 :用siRNA转染的细胞，不含活性剂
[0097] -条件3 :非转染细胞，但用活性剂处理
[0098] -条件4 :用siRNA转染且用活性剂处理的细胞
[0099] 然后，将细胞洗涤，并在环境温度下用3. 7%甲醛固定10分钟。使用在环境温度下 用0. 2% Triton X-100孵育10分钟来进行细胞核的透化。用1% BSA (施用30分钟）阻 断非特异性位点。将细胞在TRF2的特异性单克隆小鼠抗体（Abeam，编号：abl3579)的存 在下孵育，然后在与荧光染料（Invitrogen,编号：A21202)结合的二级抗小鼠抗体的存在 下孵育。然后，用落射荧光显微镜（Nikon Eclipse E600显微镜）检查细胞。
[0100] 使用 Image-Pro Analyzer 6· 3 软件（MediaCybernetics, Inc.)分析并量化每一 条件的三张图像。然后，使用Student t检验对这些数据进行统计学分析。
[0101] 结果/结论:
[0102] 在条件1和3之间，观察到添加实施例1的大豆和酵母的肽提取物与对照相比导 致TRF2蛋白表达增加34. 4%。在条件1和2之间，有效观察到TRF2siRNA对TRF2蛋白表 达的作用：实际上，该表达降低32. 5%。然而，向用siRNA转染的细胞添加活性剂恢复了 TRF2表达，并且观察到与转染的未处理细胞相比增加75. 5%。
[0103] 总之，本发明的大豆和酵母的肽提取物可以补偿经处理的角质形成细胞中的TRF2 蛋白表达的降低（由特异性siRNA诱导的降低）。
[0104] 实施例6 :用实施例1的大豆和酵母的狀提取物处理目通讨人工诱导衰老而老化 的人成纤维细朐中的TRF2蛋白表汰的研究
[0105] 为了定量本发明的肽提取物对TRF2表达水平调节的效力，通过用F0X03a基因的 特异性siRNA处理细胞48小时来进行成纤维细胞群的衰老的人工诱导。
[0106] 方案:
[0107] 使用 Lipofectamine?RNAiMAX 转染技术（Invitrogen,编号：13778-075)，任选地 用最终浓度为25nM的特异性F0X03a siRNA(HSS177176, Invitrogen)处理培养的人成纤维 细胞，并且任选地用最终浓度为1 %的实施例1的大豆和酵母的肽提取物处理，持续48小 时。
[0108] 建立4种条件：
[0109] -条件1 :不含siRNA且不含活性剂的对照
[0110] -条件2 :用siRNA转染的细胞，不含活性剂
[0111] -条件3 :非转染细胞，但用活性剂处理
[0112] -条件4 :用siRNA转染且用活性剂处理的细胞
[0113] 然后，将细胞洗涤，并在环境温度下用3. 7%甲醛固定10分钟。使用在环境温度下 用0. 2% Triton X-100孵育10分钟来进行细胞核的透化。用1% BSA (施用30分钟）阻 断非特异性位点。将细胞在TRF2的特异性单克隆小鼠抗体（Abeam，编号：abl3579)的存 在下孵育，然后在与荧光染料（Invitrogen,编号：A21202)结合的二级抗小鼠抗体的存在 下孵育。然后，用落射荧光显微镜（Nikon Eclipse E600显微镜）检查细胞。
[0114] 使用 Image-Pro Analyzer 6. 3 软件（MediaCybernetics, Inc.)分析并量化每一 条件的三张图像。然后，使用Student t检验对这些数据进行统计学分析。
[0115] 结果/结论:
[0116] 在条件1和3之间，观察到添加实施例1的大豆和酵母的肽提取物与对照相比导 致TRF2蛋白表达增加22%。在条件1和2之间，有效观察到F0X03a-特异性siRNA对TRF2 蛋白表达的作用：实际上，该表达降低18.9%。然而，向用siRNA转染的细胞添加活性剂恢 复了 TRF2表达（条件4)，并且观察到与转染的未处理细胞相比增加26% (条件2)。
[0117] 总之，本发明的大豆和酵母的肽提取物可以补偿由F0X03a_特异性siRNA人工诱 导的TRF2蛋白表达的降低。
[0118] 实施例7 :用实施例1的大豆和酵母的狀提取物处理的人成纤维细朐的DNA保护 的研究
[0119] 彗星试验是适于量化细胞水平的对DNA导致的损伤的测试。
[0120] 方案:
[0121] 将人成纤维细胞处于培养中，并在第3代至第16代之间，每天一次用1%浓度的实 施例1的肽提取物处理。然后，以50mJ/cm 2的比率用UVB辐射对其辐射，然后在成纤维细 胞介质中再培养30分钟。
[0122] 在不用实施例1的肽提取物处理的情况下，制备对照培养物。
[0123] 然后，将细胞与其底物通过用胰蛋白酶处理而分离，从而对其浓缩并计数。
[0124] 然后，将确定量的细胞（25000个细胞）包含在0.75%低熔琼脂糖凝胶中，然后置 于先前用1 %琼脂糖涂覆的载玻片上。然后，将载玻片在4°c浸入细胞溶解液中，持续1小 时30分钟，然后在4°C浸入碱性溶液中，持续20分钟。由此溶解细胞并使DNA变性。将载 玻片浸泡在电泳液中，然后施加电场（20V - 250mA)。以此方式变性的DNA在4°C于琼脂糖 凝胶中经历迁移。施加荧光DNA染料（2 μ g/ml碘化丙啶）使得可以用显微镜观察到DNA。 受损的DNA (即以多个不同尺寸的片段分裂的）以扩散方式迁移并呈"彗星"形式。
[0125] 使用量化软件来测定平均尾矩（Tail Moment)，其随着DNA受损增加而增加。
[0126] 结果:
[0127] 当用实施例1的肽提取物处理成纤维细胞并使其经受UVB辐射时，尾矩为13. 9,而 其在辐射且未处理的条件下为49。由此计算的尾矩与经辐射的对照条件相比降低了 71% (统计学高度显著的降低），即，经受UVB辐射的细胞的DNA经受与对照条件下相比显著更 低的损伤，如图1所示。
[0128] 结论:
[0129] 1 %的实施例1的肽提取物非常显著地保护经受UVB辐射的正常人成纤维细胞的 DNA。
[0130] 实施例8 :防晒霜（sun cream)组合物
[0131]
【权利要求】
1. 化妆品组合物，其特征在于其包含在生理学可接受的介质中的协同TRF2蛋白活化 系统，所述协同TRF2蛋白活化系统由大豆和酵母的肽提取物的组合组成，所述大豆和酵母 的肽提取物是通过水解原料总重量的至少80重量％的大豆和原料总重量的至多20重量％ 的酵母获得的。
2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述大豆和酵母的肽提取物是通过水解原 料总重量的90重量％的大豆和原料总重量的10重量％的酵母获得的。
3. 如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述大豆和酵母的肽提取物是通过水 解大豆（Glycine Max L.)和酵母属（Saccaromyces)的酵母生物质获得的。
4. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于所述大豆和酵母的肽提取物是 通过同时水解大豆和酵母获得的。
5. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于所述大豆和酵母的肽提取物仅 包含分子量小于5kDa的肽化合物。
6. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于所述大豆和酵母的肽提取物包 含0. 5g/L至5. 5g/L的肽化合物。
7. 如上述权利要求中任一项所述的组合物，其特征在于其呈适于局部施用的形式，所 述形式选自：乳膏剂、水包油乳剂或油包水乳剂或复合型乳剂、溶液剂、混悬剂、微乳剂、含 水或无水凝胶剂、浆液、或小泡分散体、贴剂、喷雾剂、油膏剂、软膏剂、洗剂、胶体、乳液、棒 或粉末。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的组合物用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细 胞的DNA损伤的美容用途，其通过在不改变端粒末端转移酶的量和/或活性的情况下增加 所述细胞中TRF2的量而进行。
9. 如权利要求8所述的美容用途，其用于预防和/或修复皮肤细胞的DNA上的双链断 裂。
10. 如权利要求8或9所述的美容用途，其用于预防和/或治疗老化的皮肤体征。
11. 如权利要求10所述的美容用途，其用于预防和/或治疗由UV辐射诱导的光老化的 皮肤体征。
12. 如权利要求10或11所述的美容用途，其用于预防和/或治疗皱纹、深皱纹、纹路、 龟裂、皮肤组织和皮下组织的松弛、皮肤弹性损失和张力缺乏、硬度和光度损失、以及真皮 萎缩。
13. 用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤的美容处理方法，其包括在 面部或身体的至少一部分皮肤上局部施用如权利要求1至7所述的组合物，其中在早晨施 用所述组合物作为抗老化日间护理和/或在睡前施用所述组合物作为修复夜间护理。
14. 用于预防和/或修复与老化相关的皮肤细胞的DNA损伤的美容处理方法，其包括在 面部或身体的至少一部分皮肤上局部施用如权利要求1至7所述的组合物，其中在日光照 射之前施用所述组合物作为晒前护理和/或在日光照射之后施用所述组合物作为晒后护 理。
【文档编号】A61Q19/08GK104203206SQ201380015172
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2012年3月19日
【发明者】J-M·博托, N·东洛热, F·波尔托兰 申请人:Isp投资公司