从微生物发酵的dha油脂中分离纯化dha乙酯的方法
【专利摘要】本发明涉及从微生物发酵生产的DHA油脂中分离纯化DHA的方法，包括如下步骤：（1）取DHA油脂，进行乙酯化；（2）采用尿素包埋—梯度冷冻结晶法对乙酯化的DHA油脂进行初分离；（3）对初分离的脂肪酸乙酯进行分子蒸馏再分离，制备高纯度的DHA乙酯。基于多种分离纯化手段耦合形成的本发明方法明显地提高了DHA纯化，以隐甲藻产的DHA油脂为原料，可制得纯度＞98%的DHA乙酯；以裂殖壶菌产的DHA油脂为原料，可制得DHA乙酯+DPA乙酯＞98%的产品。
【专利说明】从微生物发酵的DHA油脂中分离纯化DHA乙酯的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工领域，涉及从微生物生产发酵的DHA油脂中分离纯化制备DHA乙酯的方法。
【背景技术】
[0002]二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是一种重要的n_3长链多不饱和脂肪酸，俗称脑黄金，具有促进婴幼儿脑部及视力的发育、预防及治疗心脑血管疾病、防治老年痴呆、抑制肿瘤等生理功效。当前DHA主要应用于婴幼儿配方食品及相关保健品，基于其特殊生理功效的医药产品正处在火热的研究开发之中。这类药物多以DHA的衍生物、DHA与其他药物的结合药物为主。挪威普罗诺瓦生物医药公司研发出了 26种以上的DHA衍生物，并进行了相关的生理活效研究。关于DHA的羟基化衍生物以及DHA脂肪醇衍生物目前也相继被开发出来，它们作为医药前体的研究正在进行之中。鉴于DHA自身具有一定的抗肿瘤功效，且肿瘤细胞对它具有选择性摄取作用，因而可以作为靶向分子与抗肿瘤药物形成共轭药物用于肿瘤癌症的治疗，如DHA-紫杉醇、DHA-喜树碱、DHA-丝裂霉素、DHA-谷氨酸盐、DHA-多柔比星等。除此之外，DHA还可与抗精神失常类药物形成共轭药物，如DHA-氯氮平、DHA-多巴胺等。这类新型药物当中，已有部分已进入临床阶段，如DHA-紫杉醇进入III期，DHA-氯氮平进入I期。随着后续科学研究的深入，高纯度的DHA作为医药原料具有潜在的重大应用前景和市场需求。
[0003]制备高纯度的DHA，其原料来源也尤为关键。DHA的传统原料为深海鱼油，但是采用鱼油制备高纯度DHA具有如下缺点:1)鱼油成分繁杂，其中DHA和EPA的含量仅占10-25%，因此分离纯化工艺复杂，且产品收率低；2)鱼油加工时易发生氧化，产生较重的腥味，且氧化产物于人体健康`不利；3)资源有限，鱼油产量及其中的DHA/EPA含量会因鱼的种类、捕捞季节、气候和地点的影响而波动；4)由于海洋环境污染加剧，鱼油的安全正受到人们的质疑。除了鱼油外，海洋微藻作为生产DHA的新型资源，目前已被广泛应用于商业化生产DHA油脂。这类微藻有隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)和破囊壶菌(Traustochytrium)等。与鱼油相比,微生物分泌的混合油脂具有以下优点:1)DHA含量高，达40%以上，且有些微藻所产的不饱和脂肪酸成分单一，因此分离纯化工艺相对简单；2)产油微生物可通过大规模生物发酵技术培养，无资源紧缺之忧；3)从微生物中提取的多不饱和油脂没有鱼腥味，且氧化稳定性相对较好。因此，利用微生物分泌的混合油脂分离纯化制备高纯度的DHA更具有优越性。
[0004]油脂的分离纯化方法有尿素包埋法、低温冷冻结晶法、色谱分离法、超临界萃取分离法、分子蒸馏、AgN03络合法、脂肪酶法等，这些单一的分离技术通常不能有效或经济地实现多不饱和脂肪酸的分离，为此将两种或两种以上的分离技术耦合能到达更佳的分离效果。但是将分离纯化方法进行组合，从分离效果或经济的角度来说，需要考虑到由于不同方法、不同参数对不同分离对象适应性不同，处理后产生的油脂生化性质也不同，在对分离技术进行耦合时，必然需要对分离顺序、方法参数进行调整和优化，而这一过程需要大量人力、物力、资金投入。尤其是针对从微生物分泌的混合油脂这一新型原料来源中提纯DHA，需要考虑微生物在分泌过程中产生的特殊杂质，而这些特殊杂质很可能是在之前分离纯化中并未考虑去除的对象。因此，进行多种分离纯化方法耦合并不可能是简单的技术叠加，需要克服多种技术难题，也使得到目前为止，并没有公开报道通过尿素包埋法、低温冷冻结晶以及分子蒸馏工艺步骤从微生物分泌的多不饱和脂肪酸中分离纯化高纯度DHA的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种从微生物发酵生产的DHA油脂中分离纯化DHA乙酯的方法，解决了目前单一应用某一种分离纯化方法成本高，纯化效果不理想的技术问题。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，包括以下步骤(1)取DHA油脂，进行乙酯化；(2)采用尿素包埋一梯度冷冻结晶法对乙酯化的DHA油脂进行初分离；
(3)对初分离的DHA乙酯进行分子蒸馏再分离，制备高纯度DHA乙酯。
[0008]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，具体包括以下步骤:
[0009](I)DHA油脂的乙酯化:取DHA油脂与乙醇混合，以KOH为催化剂，在充氮保护的条件下，于50~70°C水浴中搅拌回流0.5~4小时；静置分层，取上层DHA乙酯进行减压蒸馏，回收乙醇；采用温水反复水洗蒸馏后的DHA乙酯至洗涤水呈中性，油水分离后，油相通过无水Na2S04过滤干燥，得到乙酯化的DHA油脂；
[0010](2)尿素包埋一梯度冷冻结晶法初分离:配制质量分数为20%~30%的尿素乙醇溶液，并于65~70°C水浴中加热回流至尿素全部溶解；取步骤I)中经过干燥后乙酯化的DHA油脂，与尿素乙醇溶液进行混合；在氮气保护下，60-80°C水浴加热回流混合溶液至澄清，冷却至室温；对上述澄清溶液进行密封，在温度范围为一 20°C~10°C进行分步降温结晶，实现固液分离；对固液分离后的液相部分采用正已烷萃取，正已烷萃取物通过无水Na2SO4过滤除水后，减压蒸馏，回收正已烷，蒸馏后的油脂即为初步纯化的DHA乙酯；
[0011](3)分子蒸馏分离:将步骤2)中经初步纯化的DHA乙酯在分子蒸馏装置中以蒸馏温度为70~80°C进行脱气处理，获得重组分，对重组分重复蒸馏I~5次；脱气后，将上述经过重复蒸馏的重组分进行一级分子蒸馏，蒸馏温度80~120°C，重复蒸馏I~5次；取经过一级分子蒸馏后的重组分进行二级分子蒸馏，蒸馏温度110~160°C，得到高纯度DHA乙酯产品。
[0012]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，步骤I)中DHA油脂乙酯化过程中，乙醇与DHA油脂的质量比为0.3-1:1 ；Κ0Η与DHA油脂的质量比为0.8~
1.5:100。
[0013]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，步骤I)中DHA油脂乙酯化过程中，乙醇与DHA油脂的质量比为0.3-0.5:1 ；Κ0Η与DHA油脂的质量比为I~
1.2:100 ;静置分层后对上层DHA乙酯减压蒸馏。
[0014] 从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，步骤2)中干燥后乙酯化的DHA油脂与尿素乙醇溶液按质量比为1:5~10进行均匀混合；水浴加热温度为60°C ;在降温结晶过程中，分别在10°C、0°C、一 10°C、一 20°C温度点进行梯度降温，每个温度点保持I~4小时。[0015]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，步骤2)降温结晶过程中温度点包括10°C、5°C、0°C、一 5°C、一 10°C、一 15°C、一 20°C，降温结晶过程重复1-3 次。
[0016]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，经过步骤2)初步纯化的DHA乙酯先预热使温度达到50~70°C后再进入分子蒸馏装置进行脱气处理，进入分子蒸懼装置的进料速率为0.lkg/h~2kg/h,系统绝压0.01~0.1Ombar,刮膜转子速率 100 ~300rpm。
[0017]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，步骤3)中经过脱气处理后的重组分先预热至80~120°C后再进行一级分子蒸馏，进入分子蒸馏装置的进料速率为0.lkg/h~2kg/h，蒸馏温度80~120°C，系统绝压0.001~0.03mbar,刮膜转子速率100~350rpm，收集重组分重复蒸馏I~3次。
[0018]从微生物发酵生产的DHA油脂分离纯化DHA乙酯的方法，作为改进，步骤3)中经过一级分子蒸馏后的重组分先预热至80~120°C后再进入二级分子蒸馏，进入分子蒸馏装置的进料速率0.lkg/h~2kg/h，蒸馏温度110~160°C，系统绝压0.001~0.03mbar,刮膜转子速率100~350rpm，收集重组分即为高含量的DHA乙酯
[0019]本发明中使用的DHA油脂产自隐甲藻或裂殖壶菌，并且在酯化和分离提纯前预先进行过脱胶、碱炼、脱色、脱臭一系列精炼工艺。
[0020]本发明具有如下优点:
[0021]1、本发明采用微生物发酵生产的DHA油脂作为分离纯化的原料，解决了传统用鱼油进行分离纯化存在的多种问题，优化了分离效果，提高了生产效率。
`[0022]2、本发明创造性地在分子蒸馏前将尿素包埋法和梯度冷冻结晶法进行耦合，两种基于不同原理有效地去除DHA油脂中的杂质，为后面的分子蒸馏减轻了分离负荷。本发明采用了多级分子蒸馏串联，明显地提高了 DHA纯化度。采用此种方法，以隐甲藻产的DHA油脂为原料，可制得纯度> 98%的DHA ；以裂殖壶菌产的DHA油脂为原料，可制得DHA+DPA >98%的产品。
[0023]3.尿素包埋法和低温冷冻结晶法工艺简单，设备投入低，分子蒸馏真空度高、受热时间短，可避免热敏物质遭受破坏，并能有效分离不同碳链的脂肪酸，通过这三种分离方法的耦合，达到了高质量低投入的效果。
[0024]4、本发明前期的乙酯化是在充氮保护的条件下进行，后续分离纯化工艺都是处在低温或高真空的条件下进行，整个工艺过程有效地避免了 DHA的氧化，从而保证了产品的品质。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体实施例对本发明。
[0026]实施例1:
[0027](I)DHA油脂的乙酯化:取4g KOH溶解在160g乙醇中，将500g隐甲藻发酵生产的DHA油脂(DHA占42.23%)与KOH-乙醇溶液充分混合后，在充氮的条件下，于60°C水浴中加热回流0.5h。充氮条件下冷却至室温，静置分层后取上层DHA乙酯于60°C、一 0.1Mpa条件下减压蒸馏回收乙醇后，采用40°C温水反复水洗至洗涤水呈中性，油水分离后，油相通过无水Na2SO4过滤干燥，得到乙酯化的DHA油脂464.15g。
[0028](2)尿素包埋一梯度冷冻结晶初分离:配制质量分数为20%的尿素乙醇溶液，于65°C水浴中加热回流至尿素全部溶解。将乙酯化的DHA油脂与20%的尿素乙醇溶液按质量比1:7混合均匀后，在氮气保护条件下60°C回流加热至溶液变澄清后，再氮气保护冷却至室温。密封后在10°C、0°C、一 10°C、一 20°C温度点进行梯度降温，每个温度点保持3小时，最后进行固液分离。液相部分采用正已烧萃取，正已烧萃取物通过无水Na2SO4过滤除水后，于30°C、一 0.1Mpa条件下进行减压蒸馏回收正已烷，即得到初步纯化的DHA乙酯198.5g，GC分析得出DHA含量为87.51%.[0029](3)分子蒸馏分离:将上步初步纯化的DHA乙酯在分子蒸馏装置中首先进行脱气处理，之后进行两级蒸馏:
[0030]脱气:DHA乙酯预热至70°C后进入分子蒸馏装置，进料速率lkg/h，蒸馏温度80°C，系统绝压0.06mbar,刮膜转子速率170rpm,收集重组分重复蒸懼I次。
[0031]一级蒸馏:脱气后，重组分预热至80°C进入分子蒸馏装置，进料速率0.8kg/h，蒸馏温度100°C，系统绝压0.0Imbar，刮膜转子速率160rpm，收集重组分重复蒸馏I次。
[0032]二级蒸馏:一级分子蒸馏后，重组分预热至100°C后进入二级分子蒸馏，进料速率0.8kg/h，蒸馏温度120°C，系统绝压0.005mbar,刮膜转子速率150rpm，收集重组分，即得高含量的DHA乙酯143.2g，GC分析得出DHA含量为97.8%，结果见表1。
[0033]实施例2:
[0034](I)DHA油脂的乙酯化:取7.5g KOH溶解在500g乙醇中，将500g隐甲藻发酵生产的DHA油脂(DHA占42.23%)与KOH-乙醇溶液充分混合后，在充氮条件下，于50°C水浴中加热回流4h。充氮条件下冷却至室温，静置分层后取上层DHA乙酯于60°C、一 0.1Mpa条件下减压蒸馏回收乙醇后，采用40°C温水反复水洗至洗涤水呈中性，油水分离后，油相通过无水Na2S04过滤干燥，得到乙酯化的DHA油脂472.lg。
[0035](2)尿素包埋一梯度`冷冻结晶初分离:配制质量分数为30%的尿素乙醇溶液，于70°C水浴中加热回流至尿素全部溶解。将乙酯化的DHA油脂与30%的尿素乙醇按质量比1:10混合均匀后，在氮气保护条件下80°C下加热回流至溶液变澄清后，再氮气保护下冷却至室温。密封后在10°C、5°C、0°C、一5°C、一 10°C、一 15°C、一 20°C温度点进行梯度降温，每个温度点保持4小时，最后进行固液分离。液相部分采用正已烷萃取，正已烷萃取物通过无水Na2SO4过滤除水后，于50°C、一 0.1Mpa条件下进行减压蒸馏回收正已烷，即得初步纯化的脂肪酸乙酯180.6g，GC分析得出DHA含量为90.02%.[0036](3)分子蒸馏分离:将上步初步纯化的脂肪酸乙酯在分子蒸馏装置中首先进行脱气处理，之后进行两级蒸馏:
[0037]脱气:脂肪酸乙酯在预热至50°C后进入分子蒸馏装置，进料速率2kg/h，蒸馏温度700C，系统绝压0.1mbar,刮膜转子速率300rpm，收集重组分重复蒸馏2次。
[0038]一级蒸馏:脱气后，重组分预热至120°C后进入分子蒸馏装置，进样速率2kg/h，蒸馏温度120°C，系统绝压0.0Olmbar,刮膜转子速率350rpm，收集重组分重复蒸馏2次。
[0039]二级蒸馏:一级蒸馏后，重组分预热至120°C进入分子蒸馏装置，进料速率2kg/h，蒸馏温度160°C，系统绝压0.03mbar,刮膜转子速率350rpm，收集重组分，即得高含量的DHA乙酯130.6g，GC分析得出DHA含量为98.5%，结果见表1。[0040]表1
[0041]
【权利要求】
1.从微生物发酵生产的DHA油脂中分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于包括以下步骤(I)取DHA油脂，进行乙酯化；(2)采用尿素包埋一梯度冷冻结晶法对乙酯化的DHA油脂进行初分离；(3)经过初分离的DHA乙酯进行分子蒸馏再分离，制备高纯度DHA乙酯。
2.权利要求1所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)DHA油脂的乙酯化:取DHA油脂与乙醇混合，以KOH为催化剂，在充氮保护的条件下，于50~70°C水浴中搅拌回流0.5~4小时；静置分层，取上层DHA乙酯进行减压蒸馏，回收乙醇；采用温水反复水洗蒸馏后的DHA乙酯至洗涤水呈中性，油水分离后，油相通过无水Na2SO4过滤干燥，得到乙酯化的DHA油脂； (2)尿素包埋一梯度冷冻结晶法初分离:配制质量分数为20%~30%的尿素乙醇溶液，并于65~70°C水浴中加热回流至尿素全部溶解；取步骤I)中经过干燥后乙酯化的DHA油月旨，与尿素乙醇溶液进行混合；在氮气保护下，60-80°C水浴加热回流混合溶液至澄清，冷却至室温；对上述澄清溶液进行密封，在温度范围为一 20°C~10°C进行分步降温结晶，实现固液分离；对固液分离后的液相部分采用正已烷萃取，正已烷萃取物通过无水Na2SO4过滤除水后，减压蒸馏，回收正已烷，蒸馏后的油脂即为初步纯化的DHA乙酯； (3)分子蒸馏分离:将步骤2)中经初步纯化的DHA乙酯在分子蒸馏装置中以蒸馏温度为70~80°C进行脱气处理，获得重组分，对重组分重复蒸馏I~5次；脱气后，将上述经过重复蒸馏的重组分进行一级分子蒸馏，蒸馏温度80~120°C，重复蒸馏I~5次；取经过一级分子蒸馏后的重组分进行二级分子蒸馏，蒸馏温度110~160°C，得到高纯度DHA乙酯产品O
3.权利要求2所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:步骤1)中DHA油脂乙酯化过程中，乙醇与DHA油脂的质量比为0.3-1:1 ；Κ0Η与DHA油脂的质量比为0.8~1.5:100。
4.权利要求3所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:步骤1)中DHA油脂乙酯化过程中，乙醇与DHA油脂的质量比为0.3-0.5:1 ;Κ0Η与DHA油脂的质量比为I~1.2:100 ;静置分层后对上层DHA乙酯减压蒸馏。
5.权利要求2所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:步骤2)中干燥后乙酯化的DHA油脂与尿素乙醇溶液按质量比为1:5~10进行混合；水浴加热温度为60°C;在降温结晶过程中，分别在10°C、(TC、一 IO0C,- 20°C温度点进行梯度降温，每个温度点保持I~4小时。
6.权利要求5所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:步骤2)降温结晶过程中温度点包括10°C、5°C、0°C、一 5°C、一 10°C、一 15°C、一 20°C，降温结晶过程重复1-3次。
7.权利要求1-6任一项所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:经过步骤2)初步纯化的DHA乙酯先预热使温度达到50~70°C后再进入分子蒸馏装置进行脱气处理，进入分子蒸馏装置的进料速率为0.lkg/h~2kg/h，系统绝压0.01~0.1Ombar,刮膜转子速率100 ~300rpmo
8.权利要求7所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:步骤3)中经过脱气处理后的重组分先预热至80~120°C后再进行一级分子蒸馏，进入分子蒸馏装置的进料速率为0.lkg/h~2kg/h，蒸馏温度80~120°C，系统绝压0.001~0.03mbar,刮膜转子速率100~350rpm,收集重组分重复蒸馏I~3次。
9.权利要求8所述的分离纯化DHA乙酯的方法，其特征在于:步骤3)中经过一级分子蒸馏后的重组分先预热至80~120°C后再进入二级分子蒸馏，进入分子蒸馏装置的进料速率0.lkg/h~2kg/h，蒸馏温度110~160°C，系统绝压0.001~0.03mbar,刮膜转子速率100~350rpm，收集重组分即为高 含量的DHA乙酯。
【文档编号】C11C3/04GK103864614SQ201410105842
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】赵光荣, 吴剑平, 邢光才, 周颖, 李维思 申请人:江苏中邦制药有限公司