寡肽酪氨酸酶抑制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了可抑制酪氨酸酶活性的肽及其制剂，以及利用所述肽来减少皮肤色素沉着的制剂的方法，和在局部制剂(topical?formulation)中施用这些抑制性肽的方法。所公开的肽序列包括KFEKKFEK和YRSRKYSSWY。
【专利说明】寡肽酪氨酸酶抑制剂及其应用
[0001] 发明人：Basil M. Hantash
[0002] 本申请是基于申请日为2008年6月25日， 优先权日:为2007年6月27日，申请号 为200880104997. 8(PCT/US2008/068181)，发明名称为："寡肽酪氨酸酶抑制剂及其应用" 的专利申请的分案申请。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请主张2007年6月27日提交的美国临时专利申请No. 60/937, 392的优先权， 并援引并入其全部内容。
[0005] 政府支持声明
[0006] 无
[0007] 对序列表、计算机程序或光盘的援引
[0008] 申请人:声明，序列表的纸质拷贝与随附的计算机磁盘上的计算机可读格式中的序 列表相同。 申请人:援引并入序列表的全部内容。
[0009] 发明背景 发明领域
[0010] 本发明涉及酪氨酸酶抑制剂领域，并涉及抑制该酶的处理方法和组合物。
[0011] 相关技术
[0012] 本发明涉及新型生物作用剂，具体地说，涉及可降低酪氨酸酶活性的寡肽。这些作 用剂可用作基础科学研究和诊断应用中的研发工具，用作治疗以色素沉着为特征的皮肤病 的药妆品（cosmeceutical)，和用作治疗依赖酪氨酸酶活性促进其肿瘤发生的病理状态的 治疗剂。
[0013] 黑色素对于保护人体免于紫外线的有害影响起重要作用。黑色素还是医学和美容 学中的一种重要因子。已知黑色素在皮肤组织中形成或合成。黑色素过多导致皮肤变黑， 黑色素分布不均匀导致黄褐斑和雀斑，它们都是皮肤疾病。黑色素的生物合成涉及酪氨酸 催化轻基化为L-3, 4-二轻基苯丙氨酸（L-D0PA)及L-D0PA转变成多巴色素（dopachrome)。 抑制黑色素合成的一种有效方法是阻断酪氨酸的羟基化。
[0014] 氢醌（HQ)从1950年代起即被用于可商购的非处方皮肤美白产品，从1960年代 起即用作可商购的医药品。它还被用于化妆品，例如染发剂和美甲产品。从2001年开始， 在欧盟国家HQ已不被许可用于化妆用皮肤美白制剂，尽管含有熊果苷（一种HQ类似物） 的产品和植物性药材（botanicals)，包括天然含有HQ和熊果苷的植物，仍然存在于欧洲 国家的市场上° 另见 Matsubayashi 等，"Pharmaceutical and clinical assessment of hydroquinone ointment prepared by extemporaneous nonsterile compounding,，'Biol Pharm Bull.2002Jan;25(l):92-6。如该文公开的，在日本已经模仿在美国和欧盟可商 购的皮肤美白霜（skin lightening cream)利用即时无消毒的配合法（extemporaneous nonsterile compounding)制备皮肤脱色剂氢醌（HQ)的软膏。然而，已经发现了多种问题， 包括HQ软膏的色差、相对较大的效力差异和不良的副作用，尽管它们较为温和。HQ的公开 IC50 大约为 700μΜ。
[0015] 含有氢醌的疗法在亚洲国家已经被法律禁止，使得许多受这种疾病困扰的人们无 法接受常规HQ治疗。实际上，美国FDA已经发布一项声明表示其也可能禁止在国内使用氢 醌。而且，氢醌与内脏恶性肿瘤有关，选择长期局部给药的治疗方式可能带来潜在的危害。 在最佳条件下，氢醌仅能部分地减轻色素沉着过度。一些药妆品制剂包含其它活性成分， 例如曲酸（kojic acid)、熊果苷和维生素 C，但是由于化学品的不稳定性和不能将活性输 送到合适的皮肤层等问题，迄今为止，效果仍然令人失望。尽管采用了更高的浓度，但是患 者经常由于皮肤刺激而中断治疗。为此，人们添加局部类固醇来减轻活性成分例如视色素 A和氢醌造成的刺激。因为黑斑病（melasma)和其它色素沉着过度（hyperpigmentary)疾 病经常需要数月到数年的治疗，所以，以对抗活性成分刺激效果所需的强度对面部局部使 用类固醇，不可能不会导致局部类固醇诱发的副作用。当对面部连续局部使用中等或更高 的效力的类固醇超过数周时，通常会出现皮肤萎缩（skin atrophy)、变脆和毛细血管扩张 (telengiectasia)。这种副作用是不可接受的，特别是在面部等区域。
[0016] 红外激光器的使用已经获得了一些成功。它们一般对于将色素定位于较深层皮肤 区域（例如真皮）的疾病效果较好。为了有效地处理表皮，通常采用切除治疗（ablative treatment)。该治疗伴随着患者长期停工（downtime),包括造成二度烧伤（second-degree bum)或者糜烂（erosion),使患者容易被感染。此外，激光治疗是一个昂贵的治疗选项，许 多患者承担不起。在极端的情形，当漂白剂不成功时，有人采取皮肤脱色（depigmentation) 的手段。很多病理状态会导致色素异常沉积在皮肤内。例如，众所周知，激素失调会导致面 部和肢端色素沉着过度，这最常见于妇女怀孕期间或产后。这种色素沉着过度往往会影响 到容貌，导致自尊心问题和社交尴尬。黑斑病经常影响Fitzpatrick型IV-VI皮肤的个体。 这些人占世界人口的相当大一部分。
[0017] 很多具有Fitzpatrick型IV-VI皮肤的个体是亚裔。
[0018] 根据Fitzpatrick皮肤类型尺度（scale)，基于对阳光照射的外观和皮肤反应测 试，个体可大体上被如下分类：
[0019] I型：肤色很浅（Very fair skin tone)，白肤金发碧眼（blond)或红发 (redhead)，
[0020] II型：肤色浅（Light skin tone)，可晒成棕色（tan)，但是经常晒黑（burns)，
[0021] III型：肤色白到橄榄色，有时晒黑，
[0022] IV型：肤色中等棕色，很少晒黑，
[0023] V型：肤色暗棕，非常少晒黑，
[0024] VI型：肤色黑，眼睛很黑，不易晒黑（burn resistant)。
[0025] 除了黑斑病之外，在粉刺和酒糟鼻等病症所导致的炎症等之后可能在容易影响外 貌的区域（例如面部）发生高色素沉着。这些状况也会导致严重的心理不适。在美国，每 年有130亿美元用于药妆品消费。由于美国市场上对氢醌禁用的预期，加上市场上现有的 其它非药物制剂仍然存在稳定性（维生素 C)或输送（熊果苷、曲酸等）方面的问题，寡肽 抑制剂可能为这种亟待解决的巨大需求提供一条解决之道。
[0026] 具体的专利和出版物
[0027] Scot 等，"Production of cyclic peptides and proteins in vivo,，'Proc. Nat. Acad. Sci. Vol. 96, Issue24, 13638-13643, November23, 1999，公开了在细菌中产生 环状八氨基酸酪氨酸酶抑制剂（cyclic, eight-amino acid tyrosinase inhibitor) pseudostellarin F〇
[0028] Verma 等，"Modulation of agonist binding to human dopamine receptor subtypes by L-prolyl-L-leucyl-glycinamide and a peptidomimetic analog, ，'J Pharmacol Exp Ther.200roec;315(3):1228-36.Epub2005Aug26,公开了下丘脑三肽 L-脯 氨酰-L-亮氨酰-甘氨酰胺（PLG)及其构象约束模拟物（conformationally constrained analog) 3 (R)_ [(2 (S)_吡咯烷基羰基）氨基]-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺（ΡΑ0ΡΑ)在调节激动 剂与人多巴胺（DA)受体亚型的结合中的作用。
[0029] 于2000年12月26日授权公告的授予Yamada等的US6, 165, 982,标题为"Use of sericin as antioxidants and tyrosinase inhibitors，'的专利，公开了一种可用 作抗氧化剂或酪氨酸酶活性抑制剂的组合物，其包含作为活性成分的、足够量的丝胶蛋白 (sericin)以发挥抗氧化能力。丝胶蛋白是丝绸的一种高分子量、天然、可溶糖蛋白组分。 丝胶蛋白与皮肤和毛发的角蛋白结合，形成保护性膜。
[0030] 于1992年6月30日公告的授予Takeuchi等的US 5, 126, 327,标题为 "Melanocyte-stimulating hormone inhibitor and external preparation containing the same"的专利，公开了一种促黑激素抑制剂，其具有一定的氨基酸序列，一个具有1-12 个碳原子的酰基，一个氨基酸残基，或其具有1-12个碳原子的酰基化衍生物，具有2-40个 氨基酸残基的肽残基或其酰基化衍生物。
[0031] 于 2006 年 4 月 11 日公告的授予 Arquette 的 US 7, 025, 957,标题为"Composition and method to whiten skin"的专利，公开了一种可有效作为皮肤增白剂的组合物。该组 合物包括 Simmondsin，一种从加州希蒙得木粉（jojoba meal) (Simmondsia chinensis)提 取出的苷。在某些实施方案中，该组合物包括加州希蒙得木（Simmondsia chinensis)提取 物。该组合物通过向个体局部涂施可有效美白皮肤的量的制剂，其中该组合物包括加州希 蒙得木提取物。
[0032] 于2006年8月 1 日公告的授予Fotinos等的US 7, 083, 781，标题为"Film forming polymers, methods of use, and devices and applications thereof，'的专利，公开了用于 向受试者的皮肤输送活性剂的组合物和方法，包括聚合物、活性成分和溶剂，该组合物能够 通过滚压（rolling)、涂布（spreading)、喷雾（aerosol)或以液滴形式进行输送，并且能够 形成与皮肤接触的膜。该成膜组合物中可以掺入本领域已知的化妆活性剂，用于改善皮肤 外观。用于制衡该症候的典型抗色素沉着过度剂包括酪氨酸酶抑制剂，例如肽混合物和植 物提取物、发酵产物，和抗氧化剂，例如氢醌、曲酸、抗坏血酸衍生物、氢醌的合成或天然衍 生物和氢醌的前体。在该发明的优选实施方案中，抗色素沉着过度剂是Pentharm公司（巴 塞尔，瑞士）的Melawhite ;Coletica(法国）的 BiowhiteTM;Sederma(法国）的 Etioline ; Kelesima (意大利）的 Arbossa;Gattefosse (法国）的 Gatuline whitening;Exsymol (摩 纳哥）的Ascorbocilan C和Alps Pharm(日本）的曲酸。
[0033] 于 2006 年 10 月 24 日公告的授予 Lee 的 US 7, 125, 572,标题为 "Tyrosinase inhibitor extract"的专利，公开了来自朽1檬皮的酪氨酸酶抑制剂提取物。该酪氨酸酶抑 制剂提供了有利的皮肤美白效果。根据该发明，该发明的酪氨酸酶抑制剂提取物在280nm 具有主吸收。这表明，该酪氨酸酶抑制剂提取物含有某种蛋白或肽。人们认为这种蛋白质 或肽是抑制酪氨酸酶的主要活性成分。提取物的其它成分可能提供额外的效果，例如抗老 化和抗氧化。酪氨酸酶抑制剂提取物可以被制备成多种形式，包括护肤液（lotions)、乳胶、 乳霜（creams)、软膏、贴剂（sticks)、溶液、包剂（pack)和凝胶。酪氨酸酶抑制剂提取物可 以和任何化妆品中通常使用的成分混合，例如油性物质、保湿剂、增稠剂、防腐剂、乳化剂、 药物成分、香料、乳化稳定剂等。
[0034] 授予Ramaiah的US 6，143,723教导，根据下文的￥1?序列的肽可提高而非降低皮 肤色素沉着，这一点在本文中也得到了证明。
[0035] 各种其它的专利和出版物公开了无关的肽。见例如US 5,789,382，其公开 TyrArgSerArgLysTyrSerSerTrpTyr 作为 FGF 受体的阻断肤。
【发明内容】
[0036] 下面的简述不意图包括本发明的全部特征和方面，也不意味着本发明必须包含在 本简述中讨论的全部特征和方面。
[0037] 本发明涉及某些肽序列，例如：
[0038] >1SEQ ID N0:1
[0039] KFEKKFEK (KF 肽）
[0040] >2SEQ ID NO :2
[0041] YRSRKYSSWY (YR 肽）
[0042] 本发明进一步涉及含有本发明肽的套盒和组合物，和治疗涉及酪氨酸表达的病症 的方法，其中局部施用本发明肽，用于治疗涉及皮肤中黑素细胞活性的病症。其它的制剂可 用于处理身体的其它区域中的酪氨酸酶活性，并可以体内施用。
[0043] 因此，在某些方面中，本发明涉及一种纯化的肽，其与氨基酸序列KFEKKFEK具有 至少63%的同一性，并且对酪氨酸酶的1C小于大约10禮。该肽实际上可以在最多达3个 位置处被替换，包括缺失。我们给出了关于进行此类改变以及测试其抑制效力的指导。在 一些情况下，肽的IC50小于大约5mM，或者更低。在一些情况下，本发明包括用R或F替换 残基，因为这些残基有助于提高肽与酪氨酸酶的结合。因此，优选地，被R或F替换的残基 不是F ;如果是，应当用R替换。类似地，在YRSRKYSSWY情况下，被替换的残基优选地不是 R。有1-3个残基可以替换成V、A、L、M或I，因为这些残基有助于提高抑制功能。此外，可 以用L或R替换K ;用W或Y替换F ;用D替换E，因为已知这些残基是相似的。在一些实施 方案中，让两个带电氨基酸毗邻是有利的。在某些方面中，本发明包括使用D氨基酸作为一 些或全部的氨基酸。肽可以和如下文定义的调节基团，例如棕榈酸或酯相连。权利要求1 的肽具有两个毗邻的带电氨基酸。
[0044] 在某些方面中，本发明的替换可以用表格形式提供：
[0045]
【权利要求】
1. 一种皮肤医学可接受的制剂，其包含第二处理剂和与YRSRKYSSWY的序列基本上相 同的肽。
2. 权利要求1的制剂，其中该肽具有至少两个毗邻的带电荷氨基酸。
3. 权利要求1的制剂，其中所述肽的浓度小于IC50浓度的大约2倍。
4. 权利要求1的制剂，其中所述肽的浓度是IC50浓度的2-100倍。
5. 权利要求1的制剂，其基本上没有HQ。
6. 权利要求1的制剂，其中第二处理剂是肽，从而存在两种具有不同结构的权利要求1 中的肽。
7. 权利要求1的制剂，进一步包括选自下组的材料：保湿制剂、抗氧化制剂和自由基清 除剂。
8. 权利要求1的制剂，其中所述肽包含在脂质体中。
9. 一种用于处理皮肤的方法，包括施用与YRSRKYSSWY的序列相同的肽，其中所述肽的 施用可充分地抑制酪氨酸酶以减轻皮肤色素沉着。
10. 权利要求9的方法，其中该施用包括施用局部制备物。
11. 权利要求9的方法，其中该施用包括与第二处理产品一起施用。
12. 权利要求9的方法，其中该施用包括与微晶皮肤磨削过程联合进行的施用。
13. 权利要求9的方法，其中该施用与微晶皮肤磨削过程同时进行。
14. 权利要求9的方法，其中该施用与辐射处理联合进行。
15. 权利要求9的方法，其中该施用与物理处理联合进行，该物理处理是通过磨削装 置、微针、电穿孔装置、或离子电渗装置进行的。
16. -种用于实施皮肤美白程序的套盒，包括：纯化的肽，其对酪氨酸酶的IC50小于大 约10mM，并且选自下组：具有与YRSRKYSSWY的序列相同的序列的肽；皮肤医学可接受的载 体；第二处理产品；和使用说明。
17. 权利要求16的套盒，其中肽和载体是预先组合的。
【文档编号】A61Q19/08GK104083752SQ201410319956
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2008年6月25日 优先权日:2007年6月27日
【发明者】巴锡尔.M.汉塔什 申请人:里兰斯坦福初级大学理事会