用于取样齿龈代谢物的方法与流程

本发明涉及在特定部位处非侵入性地收集齿龈样品，提取和分析代谢物；使用代谢物诸如瓜氨酸、鸟氨酸、琥珀酸来监测齿龈的健康状态的方法。
背景技术：
：牙周病，诸如齿龈炎和牙周炎，涉及由微生物群落和宿主免疫应答引起的齿龈组织中的慢性炎症。它们是世界上最普遍的疾病之一，并且仍然是当今世界牙齿脱落的最常见原因，并且可以影响全世界高达90％的人口。根据fda专论(12cfrpart356，第68卷，第103期(2003))将齿龈炎定义为“最常由牙菌斑引起的齿龈的炎性病变。齿龈炎的特征在于组织肿胀和发红、点彩(正常状态，其中健康齿龈的表面由小叶构成)丧失、有光泽的表面和增加的组织温度。齿龈也可能在轻微刺激(诸如刷牙)时出血或可能自发出血。齿龈炎通常不会疼痛。”在健康的齿龈中，微生物群落与宿主处于稳态平衡，并且宿主免疫系统限制细菌过度生长并中和有毒产物，诸如脂多糖(lps)和脂磷壁酸(lta)。随着细菌在齿龈边缘或龈下缝隙中过度生长，宿主和细菌之间错综复杂的平衡被破坏。来自宏基因组学研究的最新数据显示，在龈上和龈下菌斑中菌种增加，诸如苍白普雷沃菌(prevotellapallens)、中间普雷沃菌(prevotellaintermedia)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis)和龈沟产线菌(filifactoralocis)。虽然齿龈炎和牙周炎的病因仍然难以捉摸，但有一点是清楚的；与临床确定的疾病部位相比，牙菌斑的组成在健康部位显著不同。这一观察结果，以及使用基因组学、蛋白质组学和代谢组学中新开发的工具表征宿主和细菌相互作用的进展，导致注意到齿龈炎和牙周炎是宿主和多微生物群落之间破坏的稳态的结果(lamontrj和hajishengallisg.polymicrobialsynergyanddysbiosisininflammatorydisease.gtrendsmolmed.2015；21:172-83)。牙菌斑中的多微生物群落产生各种毒力因子；例如，许多细菌产生消化酶(诸如透明质酸酶)以分解将宿主细胞粘合在一起的多糖、溶解血凝块的纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶和降解结缔组织中胶原蛋白的胶原酶。革兰氏阴性细菌分泌内毒素，也称为lps，而革兰氏阳性细菌产生lta和肽糖。此外，一种病原菌可以产生多种毒力因子；例如，据报道，牙龈卟啉单胞菌(p.gingivalis)产生多种毒力因子，这些因子参与牙周组织的炎性和破坏性事件。这些影响因子包括荚膜、外膜、其相关的lps、菌毛、蛋白酶和选定的酶。lps是所有革兰氏阴性细菌的整体组分，并且存在于外膜层中。牙龈卟啉单胞菌lps具有显著量的含有四酰化和五酰化结构的异质性。它们中的一些已被纯化。lps1690是高毒性的，而lps1435/1449相对温和。从化学上讲，lps由亲水性多糖和被称为脂质a的疏水脂质部分组成。后者是lps分子的实际毒性部分，并含有显示对其促炎活性必不可少的磷酸根基团。从机制上讲，lps首先结合到lps结合蛋白(lbp)，然后将lbp-lps复合体转移至膜结合的cd14，从而能够与细胞膜上的toll样受体(tlr)4相互作用。lps与细胞膜上的tlr4的结合激活tirap-myd88依赖性nfkb和tram-trif依赖性irf3或irf7两者信号转导途径，并随后刺激促炎细胞因子和趋化因子(诸如干扰素(ifn)γ、肿瘤坏死因子-α(tnfα)、白细胞介素(il)-1β、il-6、il-8和il-12)的产生。此外，诱导产生一氧化氮、前列腺素、白三烯和蛋白水解酶。重要的是，据报道lps在小鼠和大鼠中引起牙周炎。牙龈卟啉单胞菌还分泌外毒素和酶，在它们释放后会对宿主造成损伤。这些酶包括蛋白酶、凝固酶和纤维蛋白溶酶。值得注意的是，牙龈卟啉单胞菌产生肽基精氨酸脱亚胺酶，其可以将游离的或肽结合的精氨酸修饰为瓜氨酸。瓜氨酸化蛋白质特别有害，因为它们会引起自身免疫应答，并被假设为类风湿性关节炎的罪魁祸首。此外，牙龈卟啉单胞菌还产生两种类型的牙龈蛋白酶、赖氨酸特异性(kgp)和精氨酸特异性(rgps)。牙龈蛋白酶在激活牙周组织中的炎症和组织破坏中起主要作用。肽聚糖是所有革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌共有的细胞壁组分。它是由糖和氨基酸组成的聚合物，这些糖和氨基酸在质膜外形成网状层。糖组分由β-(1,4)连接的n-乙酰葡糖胺和n-乙酰胞壁酸的交替残基组成。三至五个氨基酸的肽链交联到n-乙酰胞壁酸。肽链还可以交联到另一条肽聚糖链的肽链，以编织成3d网状层。在革兰氏阳性细菌(20纳米至80纳米)中的肽聚糖层比在革兰氏阴性细菌(7纳米至8纳米)中厚得多。肽聚糖占革兰氏阳性细菌的干重的约90％，但仅占革兰氏阴性菌株的约10％。因此，高水平肽聚糖的存在是将细菌表征为革兰氏阳性的主要决定因素。通过激活宿主先天免疫细胞和细胞内信号转导受体(诸如核苷酸结合寡聚化结构域或nod1和nod2)的细胞膜上的tlr2，已显示肽聚糖和lta两者均充当炎性介体。结合到tlr2激活nf-κb信号转导途径，随后导致促炎细胞因子和趋化因子(诸如il-1α、il-1β、il-6、il-8、ifny和tnf-α)的产生和释放。革兰氏阴性和阳性细菌以及毒力因子(lps、肽聚糖和lta)两者均诱导一氧化氮合酶的诱导型同种型的产生。后者催化从l-精氨酸产生一氧化氮(no)。no是一种重要的细胞信号转导分子，可促进血管扩张和许多细胞功能。no也是具有不成对电子的自由基，并且据报道可杀死细菌。一氧化氮合酶的诱导型同种型由lps和其他细菌毒素诱导，并且是先天免疫应答的一部分。由于l-精氨酸被一氧化氮合酶转化为no，因此副产物瓜氨酸再生。瓜氨酸是一种不在遗传密码中编码的氨基酸，因此在翻译过程期间不会掺入蛋白质中。它的名字来源于citrullus，拉丁语中的西瓜。瓜氨酸也是尿素循环的关键中间体，尿素循环是哺乳动物排泄氨的途径。瓜氨酸由尿素循环中的鸟氨酸和氨甲酰磷酸合成，其中尿素在一系列反应中产生。反应中的一些在线粒体基质中进行，而其他反应在胞质溶胶中进行。尿素循环反应的主要代谢物是游离氨基酸，诸如精氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和精氨异琥珀酸。精氨酸是尿素循环和no产生中的关键中间体。它被胞质酶精氨酸酶裂解，从而产生尿素和鸟氨酸。在胞质溶胶中形成的鸟氨酸经由鸟氨酸转位酶的作用转运至线粒体基质。在线粒体中，鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)催化鸟氨酸与氨甲酰磷酸的缩合，从而产生瓜氨酸。伴随着鸟氨酸转运到线粒体中的是瓜氨酸向胞质溶胶的输出，其中发生了循环的剩余反应。随后，瓜氨酸与天冬氨酸缩合形成精氨琥珀酸，由胞质精氨琥珀酸合成酶催化。精氨酸和富马酸由精氨琥珀酸通过胞质酶精氨琥珀酸裂解酶(也称为精氨琥珀酸酶)产生。将富马酸再转化为天冬氨酸，用于精氨琥珀酸合成酶反应中。在尿素循环的最后步骤中，精氨酸酶将精氨酸分解成尿素和鸟氨酸。再生的胞质鸟氨酸被转运至线粒体基质以用于另一轮的尿素合成。人有两种精氨酸酶基因，被鉴定为arg1和arg2基因。arg1编码的精氨酸酶同种型是一种胞质酶，主要在肝脏中表达并且起尿素循环酶的作用。arg2编码的精氨酸酶(精氨酸酶-2)是在非肝组织(主要是肾)中表达的线粒体定位的酶。精氨酸酶-2同种型被认为与一氧化氮和多胺代谢有关，然而，该酶的确切作用尚未明确定义。更广泛地说，鸟氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸和精氨酸的生物学功能尚未在牙周健康中得到很好的理解。目前通过临床量度诸如牙龈发红、牙龈出血或袋深度来实现对人的齿龈炎和牙周炎的严重度的评估。虽然这些量度基于专业开发的量表，但实际值可能因审查员的不同而变化。需要量化齿龈炎的严重度以及口腔卫生产品对减少炎性应答的有效处理程度。期望从没有人为误差的仪器获得客观读数。唾液中的转录组学、蛋白质组学和代谢组学测量已被用于诊断齿龈炎，并监测处理进展。但是存在与唾液相关的缺点，在于唾液的组成将根据收集的时间而变化。应该显而易见的是，该领域需要只要志愿者出现在牙医诊所、或临床环境或家中，就更灵敏、准确和一致的测试。技术实现要素：提供一种用于非侵入性收集齿龈样品的方法，该方法包括使用平行于特定牙齿的牙龈线定向的收集装置；以及收集装置的一部分与收集装置分离并置于容器中。提供一种从齿龈刷样品提取的方法，该方法包括使用平行于特定牙齿的牙龈线定向的收集装置；收集装置的一部分与收集装置分离并置于含有提取缓冲液的容器中；从容器移除收集装置；以及提取生物标志物。附图说明图1示出了关于齿龈和颊样品的收集的说明。图2示出了描绘临床测量的线图。图3为在方案处理的6周期间，龈上菌斑中细菌和宿主dna的量的变化。图4包括显示龈上菌斑中细菌丰度降低的线图。图5为显示颊刷样品中瓜氨酸浓度降低的线图。图6为显示颊刷样品中蛋白质结合的鸟氨酸减少的线图。图7示出了概述鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸循环中的酶的图。图8示出了说明合成和鸟氨酸、瓜氨酸和精氨酸的基因表达变化的点图。图9示出了说明颊刷样品中瓜氨酸浓度增加的线图。图10示出了说明颊刷样品中蛋白质结合的瓜氨酸减少的线图。图11示出了说明颊刷样品中蛋白质结合的鸟氨酸浓度增加的线图。图12示出了说明颊刷样品中总瓜氨酸浓度增加的线图。图13示出了说明颊刷样品中蛋白质结合的精氨酸浓度降低的线图。图14示出了说明颊刷样品中总精氨酸浓度降低的线图。具体实施方式本发明包括确定上皮健康状态的方法，特别是齿龈和口腔粘膜。方法可包括测定齿龈中一组生物标志物的水平。该组生物标志物可包括一种或多种代谢物、蛋白质或信使rna(mrna)。已经显示这些代谢物在处理期的特定阶段或在用不同毒力因子或人牙菌斑处理的体外模型中丰度的变化。因此，可量化该组代谢物生物标志物以确定齿龈是否具有炎症，齿龈是否处于氧化应激或能量不平衡，以及齿龈是否具有细胞损伤或受损。本发明证明了代谢物生物标志物在不同阶段用作齿龈炎的指标，以及由不同侵害(诸如氧化应激、高细菌负荷、促炎性侵害、能量不平衡或细胞受损)引起的齿龈损伤的指标的作用。本文所述的方法证明，多种代谢物的升高或降低水平可用作精确表征齿龈质量(诸如齿龈炎)的工具。如本文所用，术语“生物标志物”是指客观测量并评价为正常生物过程、致病过程、对化学试剂的处理应答或机械仪器的指示物的物质。如本文所用，生物标志物包括但不限于代谢物、蛋白质和信使rna(mrna)。如本文所用，术语“代谢物”是指客观测量并评价为正常生物过程、致病过程、对化学试剂的处理应答或机械仪器的指示物的物质；其中所述代谢物包括但不限于由脂质代谢、蛋白质代谢、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、核酸代谢或氧化磷酸化产生的化合物。如本文所用，术语“蛋白质”是指客观测量并评价为正常生物过程、致病过程、对化学试剂的处理应答或机械仪器的指示物的物质；其中蛋白质是由多于三个氨基酸组成的聚合物，包括但不限于细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞和细胞外蛋白质。如本文所用，术语“mrna”是指为四种核糖核苷酸(腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶)的聚合物的物质，信使rna(mrna)分子将遗传信息从dna传递至核糖体，其中它们指定基因表达的蛋白质产物的氨基酸序列。如本文所用，术语“样品”是指从个体分离的生物材料；其中齿龈样品是从齿龈分离的，而颊样品是从口腔粘膜分离的。如本文所用，术语“牙龈敏感性”是感觉上的感觉，其由激活感觉神经元上的瞬时受体电位通道(trp)v1和/或trpa1引起。由于炎症，牙龈敏感性是常见的症状，并且可影响覆盖一个或多个牙齿的区域。当人们吃或饮用热、冷、甜或酸的东西时，经常会注意到牙龈敏感性；并且可体验为隐痛或剧痛。疼痛可突然开始并深深地感觉到牙齿的神经末梢。已知某些多不饱和脂肪酸(pufa)，诸如亚油酸、花生四烯酸、羟基十八碳二烯酸(hode)和羟基二十碳四烯酸(hete)，可激活或敏化trpv1和trpa1。某些氧化脂质也会激活感觉神经元上的trpv1和trpa1，诸如羟基十八碳二烯酸(hode)和羟基二十碳四烯酸(hete)、前列腺素、前列腺环素和血栓素(ruparel等人，releasedlipidsregulatetransientreceptorpotentialchannel(trp)-dependentoralcancerpain.molpain.2015；11:30)。如本文所用，术语“氧化应激”是基于志愿者的阈值标准，其表现出自由基产生和身体抵抗或解毒反应性中间体或修复所产生的损伤的能力之间的不平衡。如本文所用，术语“能量不平衡”或术语“线粒体功能障碍”是指能量稳态的不平衡。线粒体存在于人体的每个有核细胞中，并将碳水化合物和脂肪的能量转化为能够为大多数细胞功能提供动力的atp。柠檬酸循环和脂肪酸的β-氧化两者均在线粒体中进行。在其中齿龈发炎或损伤的齿龈炎中，amp水平是高的，这意味着atp产生受损。同样地，肉毒碱是一种有助于将脂肪酸带入线粒体的辅助因子。脱氧肉毒碱是肉毒碱的直接前体。如本文所用，术语“屏障功能”是指上皮对抗环境(诸如热、粉尘和微生物)的防御功能。如本文所用，术语“免疫测定法”是指基于抗体结合到特异性靶标的任何测定法，包括但不限于elisa(酶联免疫吸附测定法)和免疫印迹法。靶标可包括但不限于蛋白质、肽、脂肪酸、碳水化合物、代谢物和核酸。本发明的某些实施方案提供一种用于收集齿龈样品的方法。在牙齿周围或在齿龈和牙齿之间的连接区域周围采集齿龈组织。在一个或多个实施方案中，使用收集装置，诸如齿间牙龈刷或颊刷，以通过用平行于牙龈线定向的刷头来回擦拭多次来收集齿龈样品。收集装置的接触齿龈和牙齿之间的连接区域的部分可被拆下并置于容器中；例如，刷头可用一对无菌剪刀夹住并置于容器中，该容器可含有缓冲溶液或rnalater溶液。本发明包括以下研究结果：一些蛋白质生物标志物在齿龈炎处理中随时间降低，这表明这些蛋白质生物标志物与齿龈炎、炎症、敏感性、能量不平衡、线粒体功能障碍和氧化应激相关联。蛋白质生物标志物的示例包括icam-1、il-1α、il-β、tnf-β、il-12p12、il-13、il-4、il-5、crp、嗜酸性粒细胞趋化因子、gm-csf、ifn-y、il-10、il-15、il-16、il-6、il-7、il-8、mcp-1/ccl2、mdc、saa、tie-2、vcam-1、vegf、vegf-2、vegf-d、vegf-c和tarc/ccl17。本专利申请还鉴定了与齿龈炎相关联的齿龈中的代谢物。随着齿龈组织的健康状态改善或恶化，出现代谢物13-hode、9-hode、1-花生四烯酰甘油磷酸乙醇胺、1-油酰基甘油磷酸乙醇胺、瓜氨酸和鸟氨酸的变化。齿龈炎部位中的龈下细菌刺激人外周血单核细胞(pbmc)中鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸的产生。同样地，内毒素和lta也在一定程度上刺激了pbmc中它们的产生。已知这些细菌毒力因子会引起炎症、氧化应激和细胞损伤。各种脂质代谢物与不同的炎性疾病有关。虽然对前列腺素了解很多，但对其他脂质代谢物的关注却少得多。13-hode和9-hode是亚油酸的稳定氧化产物，其产生在氧化应激、炎症和上皮损伤增加的情况下增加。13-hode在rbc成熟过程中的线粒体降解步骤期间大量产生，而相关分子13-羟基-亚油酸与气道高反应性相关。13-hode被认为是线粒体功能障碍、上皮受损和炎性疾病之间的潜在联系(ulaganathanmabalirajan等人，linoleicacidmetabolitedrivessevereasthmabycausingairwayepithelialinjury.scientificreports3，文章号：1349(2013)doi:10.1038/srep01349)。本发明还描述了在齿龈中腺苷5'-单磷酸(amp)、2-甲基丁酰基肉毒碱(c5)、脱氧肉毒碱和丙酰肉毒碱的增加，其指示线粒体功能障碍。细菌内毒素(诸如lps)诱导有氧糖酵解的“瓦博格效应(warburgeffect)”(tannahill等人，succinateisaninflammatorysignalthatinducesil-1bthroughhif-1a,nature496,238-242,2013)。在某些实施方案中，本发明传达在一段时间(诸如六周)内的处理期间齿龈中2-甲基丁酰基肉毒碱(c5)、脱氧肉毒碱和丙酰基肉毒碱的减少。如图2所示，在处理期期间，出血和炎症的齿龈炎症状减弱。2-甲基丁酰基肉毒碱(c5)、脱氧肉毒碱和丙酰基肉毒碱的减少指示能量产生或线粒体功能障碍的改善。衍生自脱氧肉毒碱的肉毒碱将来自脂肪酸的长链酰基基团转运到线粒体基质中，因此它们可通过β-氧化分解成乙酰coa，以经由柠檬酸循环产生atp。脱氧肉毒碱的供应导致肉毒碱的增加。后者处理还在心脏、骨骼肌和肾脏中产生瞬时但显著减少的l-肉毒碱(sartorelli等人，carnitineanddeoxycarnitineconcentrationinrattissuesandurineaftertheiradministration.biochimbiophysacta.1989年11月6日；1006:15-8.)。齿龈炎中脱氧肉毒碱的增加可能降低l-肉毒碱水平，从而干扰β-氧化和线粒体功能。齿龈炎中脱氧肉毒碱的增加可能改变l-肉毒碱水平，从而干扰β-氧化和线粒体功能。在齿龈炎中，丙酰基肉毒碱增加。丙酰基肉毒碱是支链氨基酸(bcaa)的副产物。bcca是具有脂肪族侧链的氨基酸，其具有支链(结合到三个或更多个碳原子的中心碳原子)。在蛋白氨基酸中，有三种bcaa：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。bcca的降解涉及支链α-酮酸脱氢酶复合体。这种复合体的缺乏导致支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)及其有毒副产物在血液和尿液中的累积，使得该病症命名为枫糖尿病。丙酰基肉毒碱的累积指示bcaa的代谢受到干扰。齿龈炎最常见的症状之一是出血，其部分原因是损伤的脉管系统和上皮屏障。icam-1也称为cd54(分化簇54)是细胞表面糖蛋白，其通常在内皮细胞和免疫系统细胞上表达。该蛋白质是在白细胞和内皮细胞的膜中以低浓度连续存在的细胞间粘附分子。细胞因子刺激后，在血管内皮、巨噬细胞和淋巴细胞中的浓度大大增加。icam-1是lfa-1(整联蛋白)的配体，lfa-1是在白细胞上发现的受体。当激活时，白细胞经由icam-1/lfa-1结合到内皮细胞，并且然后转移到组织中。由于与免疫应答的这些关联，已经假设icam-1可在信号转导中起作用。icam-1连接产生促炎作用，诸如炎性白细胞募集。重要地，icam-1对形成血睾屏障的紧密连接具有拮抗作用。icam-1与蛛网膜下腔出血有关。在许多研究中，显示蛛网膜下腔出血患者的icam-1水平显著高于对照志愿者。vcam-1基因含有六或七个免疫球蛋白结构域，并且在被促炎细胞因子刺激后在大血管和小血管上表达。它另选地拼接成两种已知的编码人中的不同同种型的rna转录物。vcam-1是一种细胞表面唾液酸糖蛋白，其介导淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞与血管内皮的粘附。形成血脑屏障的人脑微血管内皮细胞在炎性条件下释放可溶性血管细胞粘附分子-1(svcam-1)。同样地，人脑内皮也表达整联蛋白α-4/β-1，其结合到svcam-1。整联蛋白α-4/β-1与svcam-1的结合通过触发细胞内信号转导事件直接损害血脑屏障功能。由于内皮细胞之间的紧密连接损伤，施加重组svacm-1到培养的原代脑内皮细胞增加了对可溶性示踪剂葡聚糖的渗透性(haarmann等人，solublevcam-1impairshumanbrainendothelialbarrierintegrityviaintegrinα-4-transducedoutside-insignaling,actaneuropathologica.2015年5月，第129卷，第639至652页)。icam-1和vcam-1在患有齿龈炎的齿龈中是高的。结合的精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸的变化指示齿龈组织中齿龈炎期间屏障功能的损伤。丝聚蛋白原是表皮和齿龈中表皮颗粒细胞中透明角质颗粒的主要组分。在上皮终末分化期间，丝聚蛋白原多蛋白被去磷酸化并被丝氨酸蛋白酶快速剪切成单体丝聚蛋白。丝聚蛋白结合到角蛋白细胞支架，从而有助于鳞屑生物发生。在这些鳞屑内，丝聚蛋白通过肽基精氨酸脱亚胺酶进行瓜氨酸化，其中精氨酸残基被转化为瓜氨酸残基。精氨酸带正电荷，而瓜氨酸为负电荷。带正电荷的精氨酸与邻近的带负电荷的氨基酸残基形成盐键以稳定丝聚蛋白。将带正电荷的精氨酸修饰成中性氨基酸残基(诸如瓜氨酸或鸟氨酸)将减少蛋白质内的盐键，从而导致蛋白质去稳定和解折叠，并最终降解成吸湿性氨基酸。这些氨基酸构成天然保湿因子的一种要素。结果，瓜氨酸化是表皮分化和屏障形成中的必需过程。强大的屏障功能保护身体免受外来环境物质的侵入。(sandilands等人，filaggrininthefrontline:roleinskinbarrierfunctionanddisease.jcellsci.2009年5月1日；122(pt9):1285-94.doi:10.1242/jcs.033969)。在某些实施方案中，本发明涉及一种或多种用于测定柠檬酸循环、β-氧化和氧化磷酸化的基因表达的方法。柠檬酸循环，也称为三羧酸循环，是细胞内部的一系列化学反应以通过将来自碳水化合物、脂肪和蛋白质的乙酰-coa氧化成二氧化碳和以atp形式的化学能来产生能量。此外，该循环提供了还原剂nadh，其用于许多其他生化反应中。β-氧化是分解代谢过程，通过该分解代谢过程，脂肪酸分子在线粒体中分解以生成进入柠檬酸循环的乙酰-coa，以及nadh和fadh2，它们是电子传递链中使用的辅酶。氧化磷酸化(或简称oxphos)是代谢途径，其中细胞中的线粒体使用其结构，酶和由碳水化合物、脂肪酸和氨基酸氧化释放的能量来形成atp。在某些方面，本发明描述了齿龈炎中大分子(诸如蛋白质)降解的增加。在基线阶段的齿龈炎中存在更多的二肽，诸如苏氨酰苯丙氨酸、苏氨酰亮氨酸、赖氨酰亮氨酸、赖氨酰苯丙氨酸、亮氨酰亮氨酸、精氨酰苯丙氨酸和精氨酰亮氨酸。蛋白质的这种降解指示炎症中蛋白酶的产生增加。实施例术语“游离”是指如实施例中所述直接在上清液中测量的物质。术语“总”是指如实施例中所述在上清液和球团两者中测量的物质。术语“结合”是指如实施例中所述掺入到蛋白质中的物质。例如，结合的瓜氨酸是指瓜氨酸分子掺入到蛋白质中。结合的瓜氨酸在数值上等于总瓜氨酸减去游离瓜氨酸。实施例1—从上述个体牙齿收集宿主齿龈组织以评估齿龈炎相关分子标志物的变化的方法通常通过临床量度诸如牙龈发红、牙龈出血或袋深度来实现对人的齿龈炎的程度的评估。虽然这些量度基于专业开发的量表，但实际值可能因审查员的不同而变化。期望望没有人为误差的客观读数。该样品收集方法能够非侵入性地和部位特异性地采集样品进行客观测量。非侵入性齿龈样品收集：刷样品取自4名志愿者(均为女性，年龄为43至48岁)的上口、前牙龈和颊表面。使用interdentalgumbrushes(sunstaramericainc,chicago,il)或masteramptmbuccalbrush(目录号mb100sp；epicentretechnologiescorp.,madison,wi)刷对6个边缘齿龈(如图1所示)和6个颊部区域进行取样，每个样品部位一个刷。在每个样品部位处，将刷以平行于牙龈线水平定向的刷头前后擦拭10次。用无菌剪刀将每个刷头夹住并置于含有800μldpbs(杜氏磷酸盐缓冲盐水；lifetechnologies,grandisland,ny)的15ml锥形管中，该dpbs含有蛋白酶抑制剂，包括aebsf(4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐)2mm、抑肽酶0.3μm、苯丁抑制素130μm、edta(乙二胺四乙酸)1mm、e-641μm和亮抑酶肽1μm。从齿龈样品提取代谢物和蛋白质：将来自给定志愿者的所有齿龈拭子汇集到相同的收集管中。同样地，将来自给定志愿者的所有颊拭子汇集到单独的单个收集管中。将所有收集管在多管涡旋器上在4℃下剧烈摇动15min，以从收获的齿龈和颊样品提取包括代谢物和蛋白质的物质。使用无菌镊子将刷头轻轻擦拭到管的侧面以收集尽可能多的裂解物并随后丢弃。然后将提取的物质在冷冻的4℃台式离心机sigma4k15(sigmalaborzentrifugengmbhp.o.box1713-37507osterode/germany)中以5000rpm(每分钟转数)离心，以分离可溶性和不可溶性级分。将分离的样品储存在-80℃的冰箱中。在分析样品的总蛋白质后，样品似乎具有足够的蛋白质以用于进一步分析，诸如蛋白质组学或代谢组学。齿间牙龈刷似乎收集足够的齿龈组织以用于进一步可量化的分子分析。实施例2—在齿龈炎处理的六周内，齿龈炎富含的细菌丰度降低对69名志愿者进行随机，平行组临床研究(阴性对照组35名，并且测试方案组34名)。志愿者平均年龄为39岁，在20岁至69岁的范围内，并且46％的志愿者是女性。处理组平衡良好，因为以下的差异统计学上不显著(p≥0.395)：人口统计学特征(年龄、种族、性别)或齿龈出血指数(gbi)的开始测量值；平均值＝29.957，其中至少有20个出血部位和改良齿龈指数(mgi)；平均值＝2.086。所有69名志愿者参加了每次访问并完成了研究。在6周的时间内对以下处理组进行比较：测试方案：pro-healthclinicalplaquecontrol(0.454％氟化亚锡)洁齿剂、具有精密清洁刷头的professionalcare1000、和pro-healthrefreshingcleanmint(0.07％cpc)漱口水。对照方案(阴性对照)：cavityprotection(0.243％氟化钠)洁齿剂和indicatorsoftmanualtoothbrush。如图2所示，测试方案组在第1、3和6周相对于阴性对照组显示出显著(p<0.0001)更低的平均出血(gbi)和炎症(mgi)。在该临床研究中，还在测试方案中从相同的志愿者收集牙菌斑。从牙齿/牙龈界面处用无菌刮匙从每个志愿者取出龈上样品，小心避免与口腔软组织接触。从所有可用的天然牙齿(仅上部牙弓)取样菌斑，直至看不到菌斑。取样后，通过摇动储存在冰上的预先标记的(志愿者id、样品首字母、访问和日期)含有1mlpbs/甘油缓冲液(20％甘油)和约30个无菌1mm玻璃珠的1.5mleppendorf管，从刮匙中释放菌斑直至收集所有样品。然后将样品转移到-70℃冰箱以用于储存直至进一步处理。使用基因组dna试剂盒(qiagen,valencia,ca)按照制造商的说明从龈上菌斑样品分离基因组dna。在定bgiamericascorporation(cambridge,ma)中进行元测序。所有数据均在mason,ohio的procter&gamblecompany的globalbiotech上分析。在6周处理中，龈上菌斑中细菌和宿主dna的量发生变化，如图3所示。在第1周和第3周，某些细菌诸如卟啉单胞菌口服分类群279(porphyromonassporaltaxon279)和苍白普雷沃菌减少(图4)。在处理的四个时间段内绘制每种菌种的量。某些细菌(诸如口腔消化链球菌(peptostreptococcusstomatis)和中间普雷沃菌)的量从基线到第3周减少。中间普雷沃菌的量在相对百分比丰度方面在第6周与基线没有统计学差异，但中间普雷沃菌的绝对丰度在第6周远低于在基线处的绝对丰度，因为细菌dna的总量在第6周急剧下降(图3和图4)。实施例3—在6周处理期间，细胞因子、趋化因子和其他生物活性蛋白质的产生随着齿龈炎症状缓解而减少使用实施例1中描述的程序，从与实施例2相同的志愿者收集齿龈刷样品。在取样之前，志愿者用水冲洗它们的口30秒。然后牙科卫生员使用颊拭子刷(epicentrebiotechnologies,madison,wi，目录号mb100sp)对牙龈线正上方的区域进行取样。将拭子立即置于1.5mleppendorf管中的1ml提取缓冲液[pbs，0.25mnacl，1xhalttm蛋白酶抑制剂单次使用混合物(lifetechnologies,grandisland,ny)]中，涡旋30秒，并立即在干冰上冷冻并储存在-80c冰箱中直至分析。将样品从冰箱中取出，解冻并通过将样品置于管式振荡器上在4℃下提取30分钟。将管在eppendorf离心机5417r(eppendorf,ontario,canada)中以15000rpm离心10min以沉淀任何碎片。使用bio-rad蛋白质测定法(biorad,hercules,ca)分析提取物(800μl)的蛋白质浓度。使用v-plex人生物标志物40-plex试剂盒(mesoscalediagnosticsrockville,maryland)测量齿龈样品中的四十种蛋白质。按照制造商的说明书进行测定。v-plex人生物标志物40-plex试剂盒分为四个面板或四个96孔板。在齿龈样品中测量的蛋白质中，大多数蛋白质在6周处理期间具有显著的丰度变化(表1)。那些包括fn-γ、il-1β、il-2、il-4、il-6、il-8、il-10、il-12p70、il-13、tnf-α、gm-csf、il-5、il-16、il-7、il-12/il-23p40、il-1α、vegf-a、il-17a、il-15、tnf-β、il-8(ha)、mcp-1、mcp-4、嗜酸性粒细胞趋化因子、ip-10、mdc、嗜酸性粒细胞趋化因子-3、tarc、mip-1α、mip-1β、vegf-c、vegf-d、tie-2、flt-1/vegfr1、plgf、fgf(碱性)、saa、crp、vcam-1和icam-1。icam-1和vcam-1在具有齿龈炎的齿龈中是高的，如表1所示。表1：齿龈刷样品中蛋白质丰度的变化。实施例4—在齿龈样品中鉴定出一百七十种代谢物将与实施例3中所述相同的齿龈刷样品用于代谢组学分析。从处理或对照方案(测试方案：pro-healthclinicalplaquecontrol(0.454％氟化亚锡)洁齿剂、具有精密清洁刷头的professionalcare1000、和pro-healthrefreshingcleanmint(0.07％cpc)漱口水；对照方案(阴性对照)：cavityprotection(0.243％氟化钠)洁齿剂和indicatorsoftmanualtoothbrush)中随机选择十四名志愿者，以确定在处理的前3周期间齿龈样品中是否有任何代谢物浓度发生变化。将基线和第3周样品两者均以干冰形式送至metabolon,inc.(durham,nc)以用于代谢组学测量。鉴定和量化了170种代谢物。如表2所示，在处理的前3周期间一些代谢物浓度发生变化。在处理方案组中处理3周后，齿龈样品中的瓜氨酸浓度降低。同样地，在处理3周后，处理方案组中鸟氨酸也减少。瓜氨酸和鸟氨酸的减少可能与齿龈炎缓解相关联，因为据报道瓜氨酸与内毒素处理相关联(tannahillgm1、curtisam、adamikj、palsson-mcdermottem、mcgettrickaf、goelg、frezzac、bernardnj、kellyb、foleynh、zhengl、gardeta、tongz、janyss、corrsc、haneklausm、caffreybe、piercek、walmsleys、beasleyfc、cumminse、nizetv、whytem、taylorct、linh、masterssl、gottliebe、kellyvp、clishc、auronpe、xavierrj、o'neillla.succinateisaninflammatorysignalthatinducesil-1βthroughhif-1α.nature.2013年4月11日；496(7444):238-42.doi:10.1038/nature11986.epub2013年3月24日。)。如表2所示，脱氧肉毒碱在齿龈炎(基线)中较高，指示脂肪酸的异常β-氧化。琥珀酸是柠檬酸循环中的中间体。琥珀酸(为柠檬酸循环中的中间体)水平在齿龈炎中增加，如表2所示。表2：在齿龈炎处理期间基线和第3周之间的齿龈刷样品中代谢物的比较实施例5—在6周内，瓜氨酸在方案处理中减少。使用梯度亲水相互作用液相色谱和串联质谱(hilic/ms/ms)，对来自如实施例2中所述的相同齿龈刷样品的提取物的瓜氨酸和鸟氨酸进行定量。如实施例1中所述，将齿龈刷样品置于提取缓冲液中。将上清液进行hilic/ms/ms和bca分析。对于游离瓜氨酸和鸟氨酸分析，直接(50μl齿龈刷提取物和50μl样品溶液样品溶液(含0.754％甲酸的50/50乙腈/超纯水)或用样品溶液稀释5倍，分析齿龈刷样品的提取物。对于总瓜氨酸和鸟氨酸分析，首先使用6nhcl(50μl提取物和450μl6nhcl)水解齿龈刷样品的提取物，不摇动，并置于热板上在110℃下保持16小时。然后将水解的样品在室温下真空干燥(lifetechnology,grandisland,ny的savantspeedvac)，并且然后在1ml稀释溶液(含0.754％甲酸的50/50乙腈/超纯水)中重构以用于分析。使用梯度亲水相互作用液相色谱和串联质谱(hilic/ms/ms)分析标准物和样品。分析物和对应的istd(稳定同位素标记的内部标准)使用表3中所示的选定反应监测方案，通过电喷雾电离(esi)以正模式进行监测。通过给信号绘图构建标准曲线，本文将其定义为每个标准物与对应于标准物的每个分析物质量的峰面积比率(峰面积分析物/峰面积istd)。然后使用生成的回归方程反算出校准标准物和齿龈刷提取物样品中每种分析物的质量。计算蛋白质结合的瓜氨酸或鸟氨酸的浓度，分别从总瓜氨酸或鸟氨酸的浓度中减去游离瓜氨酸或鸟氨酸的浓度得到。如表3所示，结果报告为瓜氨酸或鸟氨酸的浓度，或者通过将瓜氨酸或鸟氨酸的量除以存在于提取物中的总蛋白质的量来标准化结果。表3：分析物及其对应的稳定同位素标记的内标的多反应监测(mrm)转变分析物mrm内标mrm瓜氨酸176→159d7-瓜氨酸181→164鸟氨酸133→70d6-鸟氨酸139→76如实施例2中所述，分析了方案处理中的所有样品。如图5所示，瓜氨酸水平在处理的第一周迅速降低，并且然后在处理的第3周和第6周继续逐渐下降。这些结果与临床观察结果一致，其中齿龈出血部位(gbi)和齿龈炎症(mgi)在6周处理期内减少。实施例6—含有鸟氨酸的蛋白质水平在6周处理期间降低。使用实施例1中描述的程序，从与实施例2相同的志愿者收集相同齿龈刷样品。在取样之前，志愿者用水冲洗他们的口30秒。然后牙科卫生员使用颊拭子刷(epicentrebiotechnologies,madison,wi，目录号mb100sp)对牙龈线正上方的区域进行取样。将拭子立即置于1.5mleppendorf管中的1ml提取缓冲液[pbs，0.25mnacl，1xhalttm蛋白酶抑制剂单次使用混合物(lifetechnologies,grandisland,ny)]中，涡旋30秒，并立即在干冰上冷冻并储存在-80c冰箱中直至分析。将样品从冰箱中取出，解冻并通过将样品置于管式振荡器上在4℃下提取30分钟。将管在eppendorf离心机5417r(eppendorf,ontario,canada)中以15000rpm离心10min以沉淀任何碎片。使用bio-rad蛋白质测定法(biorad,hercules,ca)分析提取物(800μl)的蛋白质浓度。患有齿龈炎的受试者遵循测试方案6周(pro-healthclinicalplaquecontrol(0.454％氟化亚锡)洁齿剂、具有精密清洁刷头的professionalcare1000、和pro-healthrefreshingcleanmint(0.07％cpc)漱口水)。基线(bl)代表患病状态。在第1周至第6周的处理中，齿龈炎的症状，诸如出血和炎症得到缓解。蛋白质结合的鸟氨酸(总鸟氨酸和游离鸟氨酸之间的差值)在齿龈炎中较高，如图6所示。随着齿龈炎的严重度降低，蛋白质结合的鸟氨酸逐渐减少。实施例7—在6周处理期间，齿龈样品中鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环中酶的表达发生变化。如实施例1和3中所述，从与实施例2中相同的志愿者收集单独的齿龈样品，并用于检查6周处理期间基因的表达。收获样品后，将刷子完全浸入rnalater溶液(1ml，在1.5mleppendorf管中)，以防止rna在运输和储存期间降解(qiagen,valencia,ca)。将小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并在干冰上转移至实验室以用于生物标志物分析。如先前在出版物中所述进行rna分离和微阵列分析(offenbachers、barrossp、paquettedw、winstonjl、biesbrockar、thomasonrg、gibbrd、fulmeraw、tiesmanjp、juhlinkd、wangsl、reichlingtd、chenks、hob.jperiodontol.2009年12月；80(12):1963-82.doi:10.1902/jop.2009.080645.gingivaltranscriptomepatternsduringinductionandresolutionofexperimentalgingivitisinhumans)。鸟氨酸-瓜氨酸-精氨酸循环由四种酶组成(图7)。该循环的主要特征是三种氨基酸可以相互转化。第一种酶是鸟氨酸氨甲酰基转移酶，其将氨甲酰基团从氨甲酰磷酸转移至鸟氨酸以产生瓜氨酸。该反应发生在线粒体的基质中。在处理中降低了鸟氨酸氨甲酰基转移酶的表达(图8)。第二种酶是精氨琥珀酸合酶。该酶使用atp通过形成瓜氨基-amp中间体来激活瓜氨酸，该中间体被天冬氨酸残基的氨基基团攻击以产生精氨琥珀酸。该反应和随后的两个反应(精氨琥珀酸至精氨酸和精氨酸至鸟氨酸)发生在细胞溶胶中。同样，精氨琥珀酸合成酶的表达在处理期间降低。第三种酶是精氨琥珀酸裂解酶，其催化精氨琥珀酸裂解成富马酸和精氨酸。最后一种酶是精氨酸酶。精氨酸酶裂解精氨酸以产生尿素和鸟氨酸。与鸟氨酸氨甲酰基转移酶和精氨琥珀酸合成酶基因的表达降低相反，精氨酸酶i(肝)和ii增加(图8)。精氨酸也是一氧化氮合酶的底物，该合酶氧化精氨酸以产生瓜氨酸和一氧化氮。一氧化氮合酶3基因的表达也增加(图8)。实施例8—实验性齿龈炎中齿龈样品中瓜氨酸增加。实验性齿龈炎：进行另一项临床研究以确定健康人志愿者中瓜氨酸是否在实验诱导的齿龈炎中增加。这是一项病例对照研究，招募了60名志愿者。研究人群包括如下两组：第1组或高出血者组，三十(30)名具有至少20个出血部位的志愿者，其中出血是基线时gbi部位评分为1或2。第2组或低出血者组，三十(30)名具有2个或更少出血部位的志愿者，其中出血是gbi部位评分为1或2。该研究由两个阶段组成：健康/严格的卫生阶段，具有牙齿清洁程序，以彻底清洁牙齿，抛光和严格的口腔卫生；和在没有口腔卫生的情况下诱导性齿龈炎阶段。在筛选访问时，志愿者进行了口腔软组织评估并进行了齿龈炎评估(改良的齿龈指数(mgi)和齿龈出血指数(gbi)。在第2次访问时(筛选访问后)，参与者接受了口腔软组织检查，随后进行了齿龈炎评估，并且收集齿龈样品，如下所述，用于宿主生物标志物分析。随后，所有志愿者进入健康/严格的卫生阶段，持续两周。在两周的严格卫生后，所有志愿者进入诱导性齿龈炎阶段，持续三周。重新评估口腔软组织检查和齿龈炎，并在基线、wk0和wk2时收集所有齿龈样品。齿龈样品收集—使用如实施例1中所述的程序从上牙弓的每一侧收集齿龈刷样品。仅从颊部位靠近牙龈线收集齿龈刷样品(优选地来自四个相邻牙齿，优选地来自前臼齿和磨牙区域)。志愿者用15mllisterine冲洗液冲洗30秒，以清洁取样区域的表面。在listerine冲洗后，志愿者用20ml水冲洗30秒。然后，用棉卷分离选择的部位，并用空气注射器轻轻干燥，并用收集刷/拭子从靠近所选牙齿的牙龈线的齿龈区域取两个牙龈拭子。将样品置于预先标记的(志愿者id、样品id、访问和日期)小瓶中，该小瓶含有1ml提取缓冲液[pbs，0.25mnacl，1xhalttm蛋白酶抑制剂单次使用混合物(lifetechnologies,grandisland,ny)]在1.5mleppendorf管中。将小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并在干冰上转移至实验室以用于生物标志物分析。使用如实施例5中所述的程序分析来自三次访问的样品，并显示在图9中。这三次访问是基线、第0周(刚好健康/严格卫生阶段之后和诱导性齿龈炎阶段之前)和第2周(诱导性齿龈炎阶段结束时)。在基线和第0周时，高和低出血者组两者的游离瓜氨酸水平均是低的，但在第2周时两组中诱导性齿龈炎中游离瓜氨酸水平均迅速上升。实施例9—含有瓜氨酸的蛋白质水平在实验诱导性齿龈炎中降低。使用与实施例5中所述相同的程序。样品与实施例8中所述的相同。在高和低出血者组两者中，在齿龈组织中蛋白质结合的瓜氨酸在基线时比在第0周时低，如图10所示。在第2周时，在两组中在实验性齿龈炎中其均是低的。实施例10—实验性齿龈炎中齿龈样品中含有鸟氨酸的蛋白质水平增加。使用实施例5中描述的程序分析来自如实施例8中所述的实验性齿龈炎的相同齿龈刷样品。两组中结合的鸟氨酸在第0周时最低(图11)。它在基线时的水平高于第0周时的水平。在第2周时，当两组均诱发了齿龈炎时，结合的鸟氨酸达到峰值。同样值得注意的是，在两组中诱导性齿龈炎中总鸟氨酸(游离和蛋白质结合的鸟氨酸)增加(图12)。实施例11—实验诱导性齿龈炎中齿龈样品中含有精氨酸的蛋白质水平降低。使用如实施例5中所述的程序分析来自如实施例8中所述的实验性齿龈炎的相同齿龈刷样品。。在两组中，蛋白质结合的精氨酸在诱导性齿龈炎中是最低的(图13)。两组中wk0时的其水平均高于基线时的其水平。齿龈刷样品中的总精氨酸显示出与蛋白结合的精氨酸相同的模式(图14)。实施例12—人牙菌斑，脂多糖(lps)和脂磷壁酸(lta)刺激瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸的产生。使用histopaque1077(sigmaaldrichco.,st.louis,mo)和leucosep管(greinerbio-one,monroe,n.carolina)，从gulfcoastregionalbloodcenter,houston,tx,usa获得的血液中分离人原代血单核细胞。将细胞在37℃和5％co2气氛下在含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素抗生素的90孔板(thermofisherscientific,inc.,grandisland,ny)的每个孔中的200μlroswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640培养基中培养。枯草芽孢杆菌(b.subtilis)lta、金黄色葡萄球菌(s.aureus)lta、牙龈卟啉单胞菌lps和大肠杆菌lps购自invivogen(sandiego，ca)。在受控的临床检查者盲法研究中收获人牙菌斑。使用了四十(40)名志愿者用于取样，其中二十(20)名符合健康资格—每个人具有多达3个出血部位，并且其中所有袋深度小于或等于2mm；以及二十(20)名志愿者被认定为不健康—大于20个出血部位，其中至少3个袋深度大于或等于3mm但不超过4mm出血，并且至少3个袋深度小于或等于2mm，无出血。志愿者有多达6个部位被确定为“取样部位”。“取样部位”在基线、第2周和第4周收集龈上和龈下菌斑。龈下菌斑样品取自预先确定的部位的齿龈沟。在样品收集之前，该部位用刮匙除去了龈上菌斑。将该部位干燥并用另一种牙科刮匙(例如，gracey13/14、15/16、11/12、7/8、1/2)收集龈下菌斑样品。将来自每个部位的样品置于预先标记的2.0ml无菌管中，该无菌管含有300μldpbs缓冲液和约30个直径为1mm的玻璃珠。将样品在4℃下储存并在4℃下运输过夜。将龈下样品储存在-80℃冰箱中直至分析。将样品解冻并在tissuelyserii(qiagen,valencia,ca,usa)中以30次摇动/秒分散3min。使用piercemicrobca蛋白质试剂盒(thermofisherscientific,grandisland,ny,usa)按照制造商的说明测量分散的龈下样品的蛋白质浓度。将细胞以每孔100,000个细胞接种到96孔上(每孔中具有200μlrpmi1640培养基)(thermofisherscientific,inc.,grandisland,ny,usa)中，该孔含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素抗生素，并用临床样品和细菌组分处理。然后将细胞在37℃和5％co2气氛下温育24小时。在实验结束时，用培养基将细胞收获到15ml聚丙烯锥形管中。通过在4℃下以1000rpm离心10min将细胞与培养基分离，并立即冷冻并储存在-80℃下直至分析。使用如实施例5中所述的程序分析样品。将人龈下菌斑从出血部位的60个龈下菌斑汇集。汇集的样品刺激原代人外周血单核细胞中瓜氨酸、精氨酸和鸟氨酸的产生(表4)。同样地，它们也增加了相同细胞中的苹果酸、富马酸和琥珀酸。lps和lta还增加了人原代外周血细胞中瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸和琥珀酸的产生。表4：人龈下菌斑，lps和lta增加人原代外周血单核细胞中瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸和琥珀酸的产生。实施例13—其产物在齿龈中增强屏障功能的基因的表达。如实施例1和3中所述，从与实施例2中相同的志愿者收集单独的齿龈样品，并用于检查六周处理期间基因的表达。收获样品后，将刷子完全浸入rnalater溶液中以防止rna在运输和储存期间降解(qiagen,valencia,ca)。将小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并在干冰上转移至实验室以用于生物标志物分析。如先前在出版物中所述进行rna分离和微阵列分析(offenbachers、barrossp、paquettedw、winstonjl、biesbrockar、thomasonrg、gibbrd、fulmeraw、tiesmanjp、juhlinkd、wangsl、reichlingtd、chenks、hob.jperiodontol.2009年12月；80(12):1963-82.doi:10.1902/jop.2009.080645.gingivaltranscriptomepatternsduringinductionandresolutionofexperimentalgingivitisinhumans)。紧密连接蛋白是紧密连接的最重要组分的蛋白质家族，其中它们建立了细胞旁屏障，其控制上皮细胞之间的细胞间隙中的分子流动。它们具有四个跨膜结构域，其中n-末端和c-末端位于细胞质中。与角蛋白类似，在分化期间在角蛋白的不同层中表达不同的紧密连接蛋白。紧密连接蛋白是屏障功能的重要组分。如表5所示，cldn1和12在处理期间减少，而cldn17和23增加。这些变化可作为齿龈炎的生物标志物进行探索。表5：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中的紧密连接蛋白基因的表达。肽酰基精氨酸脱亚氨酶催化一种称为精氨酸脱亚氨化或瓜氨酸化的翻译后修饰形式。这些家族成员具有不同的底物特异性和组织特异性表达模式。i型肽基精氨酸脱亚胺酶，也称为padi1，参与表皮分化的晚期阶段，其中消除了丝聚蛋白和角蛋白k1，其保持角质层的水合作用，并因此保持皮肤屏障功能。padi2被广泛表达。针对padi2的其已知的底物包括中枢神经系统中的髓鞘碱性蛋白以及骨骼肌和巨噬细胞中的波形蛋白。padi3参与头发和皮肤分化两者。如表6所示，在处理期期间padi1增加而padi2减少。这些变化可用作齿龈炎严重度的生物标志物。表6：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中的肽基精氨酸脱亚胺酶基因的表达。角蛋白是纤维结构蛋白家族，是构成人体皮肤、口腔粘膜和齿龈的外层的关键结构材料。角蛋白提供必要的强度和屏障功能。角蛋白单体组装成束以形成中间长丝。当角质细胞从基底层向外移动到棘层、颗粒层和角质层时，角蛋白组成发生变化。如表7所示，角蛋白基因的表达在处理期期间发生显著变化。这些变化可用作齿龈炎严重度的生物标志物。表7：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中的角蛋白基因的表达。为了提供对外部环境和微生物的保护，齿龈角质细胞经历分化。随着角质细胞从基底层向外迁移至角质层，分化基因(诸如内披蛋白、兜甲蛋白、丝聚蛋白、envoplakin和旁血小板溶蛋白基因)的表达升高。如表8所示，那些分化基因的表达在处理期间升高。角质细胞分化基因的表达增加可用作齿龈炎严重度的生物标志物。表8：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中的角质细胞分化的基因的表达。实施例14—齿龈中脂氧合酶和前列腺素-内过氧化物合成2的表达使用与如实施例13中所述相同的齿龈样品来检查六周处理期间基因的表达。收获样品后，将刷子完全浸入rnalater溶液中以防止rna在运输和储存期间降解(qiagen,valencia,ca)。将小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并在干冰上转移至实验室以用于生物标志物分析。如先前在出版物中所述进行rna分离和微阵列分析(offenbachers、barrossp、paquettedw、winstonjl、biesbrockar、thomasonrg、gibbrd、fulmeraw、tiesmanjp、juhlinkd、wangsl、reichlingtd、chenks、hob.jperiodontol.2009年12月；80(12):1963-82.doi:10.1902/jop.2009.080645.gingivaltranscriptomepatternsduringinductionandresolutionofexperimentalgingivitisinhumans)。15-脂氧合酶和5-脂氧合酶是高度调节的脂质过氧化酶，其表达和它们的代谢物与几种重要的炎性病症相关。如表9所示，处理期间alox15b、alox5、alox5ap和ptgs2减少。它们的变化可用作齿龈炎严重度的生物标志物。表9：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中用于代谢多不饱和脂肪酸的基因的表达。实施例15—齿龈中谷胱甘肽过氧化物酶的表达使用如实施例13中所述相同的齿龈样品来检查六周处理期间基因的表达。收获样品后，将刷子完全浸入rnalater溶液中以防止rna在运输和储存期间降解(qiagen,valencia,ca)。将小瓶涡旋/混合30秒，立即在干冰上冷冻，储存并在干冰上转移至实验室以用于生物标志物分析。如先前在出版物中所述进行rna分离和微阵列分析(offenbachers、barrossp、paquettedw、winstonjl、biesbrockar、thomasonrg、gibbrd、fulmeraw、tiesmanjp、juhlinkd、wangsl、reichlingtd、chenks、hob.jperiodontol.2009年12月；80(12):1963-82.doi:10.1902/jop.2009.080645.gingivaltranscriptomepatternsduringinductionandresolutionofexperimentalgingivitisinhumans)。谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)在处理期间增加。它是一种具有过氧化物酶活性的酶。其主要的生物学作用是保护生物体免受氧化损伤。谷胱甘肽过氧化物酶的生化功能是将脂质氢过氧化物还原为其对应的醇并将游离过氧化氢还原为水。如表10所示，gpx1和gpx3两者在处理期间均增加。它们的变化代表了齿龈炎严重度的降低。表10：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中谷胱甘肽过氧化物酶基因的表达。实施例16—用于柠檬酸循环、β-氧化和氧化磷酸化的基因的表达如实施例13中所述收集和分析相同的齿龈样品。β-氧化是分解代谢过程，其中具有不同长度的链脂肪酸分子在真核生物的线粒体中的细胞溶胶中裂解以产生乙酰-coa。后者进入柠檬酸循环并随后导致atp的产生。许多酶参与此过程。如表11所示，这些基因的表达在处理期间增加。其表达的增加指示齿龈组织中atp产生的改善。表11：在基线、第1、3和6周时处理齿龈炎期间齿龈刷样品中用于柠檬酸循环、β-氧化和氧化磷酸化的基因的表达。本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确数值。相反，除非另外指明，否则每个此类量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。除非明确排除或以其它方式限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。对任何文献的引用不是对其作为与本发明的任何所公开或本文受权利要求书保护的现有技术的认可，或不是对其自身或与任何一个或多个参考文献的组合提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文献中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。虽然已举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的实质和范围的情况下可作出各种其它变化和修改。因此，本文旨在于所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12