Bc@金属氧化物复合纳米纤维的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种BC@金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：(a)制备BC纳米纤维；(b)在BC纳米纤维的表面包覆金属氧化物颗粒层，并自然堆积形成介孔结构，得到包覆有金属氧化物颗粒的BC@金属氧化物复合纳米纤维；(c)用碱催化步骤(b)中得到的BC@金属氧化物复合纳米纤维，得到可用于富集磷酸化蛋白或多肽的BC@金属氧化物复合纳米纤维。本发明还提供了BC@金属氧化物复合纳米纤维富集磷酸化蛋白或多肽的方法。本发明制备的复合纳米纤维能够灵敏、快速地富集磷酸化蛋白或多肽，实用性强，分离效果好，环境友好，具有良好的应用前景。
【专利说明】
80@金属氧化物复合纳米纤维的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及磷酸化蛋白及多肽的特异性富集技术领域，特别涉及一种以细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)为基底的BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质磷酸化作为一种重要的蛋白质翻译后修饰，在调节细胞活动中扮演着不可取代的角色，比如:信号传导、细胞骨架调节、基因表达、细胞周期、细胞凋亡等。蛋白质磷酸化的不平衡引起的细胞过程的失调是众多疾病的根源所在。因此，为了达到早期诊断疾病的目的，很多研究者把焦点放在了研究细胞内磷酸化蛋白含量的变化。然而，磷酸化蛋白在细胞内的存在形式是动态变化的，而且含量极低，加之大量的非磷酸化蛋白的影响，使直接研究分析磷酸化蛋白的任务极其艰巨。因此，检测分析前磷酸化蛋白的富集变得尤为重要和迫切。最近，有很多相关文献报道了各种各样的富集材料和相应的富集效果。其中，很多都是金属氧化物，例如，T12，ZrO2，Fe2O3和Al2O3，其中，四族元素的金属氧化物T12，ZrO2最常用而且效果最佳。同时，还有很多方法可用来提高材料的灵敏性，通过制成介孔结构来增加比表面积从而提高灵敏性是其中之一。大的比表面积和适当的孔径可以为蛋白质和多肽在富集过程中提供充分的活性位点和进出空间。
[0003]另外，包括基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)和纳升液相色谱电离串联质谱(Nan0-LC-ES1-MS)在内的质谱技术已成为分析磷酸化蛋白与多肽的不可或缺的工具。
[0004]现如今，由醋酸菌，如:木醋杆菌，生物合成的细菌纤维素(BC)引起了研究者的极大兴趣。不仅仅因为这种细菌纤维是环境友好型材料，具有可降解性能，还因为其具有前途广阔的属性，包括:良好的生物相容性，较高的机械和化学稳定性，良好的持水性和亲水性，大的表面积和多孔性，合成过程可控等特性，这使得细菌纤维素或其改性后的纤维素形成的纤维拥有多种用途。BC纤维通常被用于生物医药，食品及先进的声膜片等，而对于改性的BC纤维，BC纤维经常作为极好的基底来负载有特性的部分，从而拓展BC纤维的性能，最好的例子就是拥有很高的光催化能力的BCOT12。
[0005]最近，不同结构的T12复合材料被广泛的用于磷酸化蛋白或磷酸化多肽的富集过程中。而且，很多研究者尽其所能去增加材料的比表面积来提升材料的富集能力和灵敏度，并且还收获了一定的成效。另外，纳米级的T12颗粒拥有比微米级甚至更大的颗粒更大的比表面积，这一特点很吸引人，但是过于细小的粒径让他们的分离成为问题，因此，只有固定或包裹在其他成分外形成壳层，这样才可以使其大的比表面积在生物分离中拥有意义。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，该方法能够制备出重复性较好，均一稳定性较高和生物相容性较好的复合纳米纤维。该方法所制备的复合纳米纤维检测磷酸化蛋白或多肽的灵敏度高，选择富集性和重复性均较好。
[0007]本发明采用了以下技术方案:
[0008]在一方面，本发明提供了一种BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，包括以下步骤:
[0009](a)制备BC纳米纤维，该BC纳米纤维具有稳定的化学机械性能；
[0010](b)在BC纳米纤维的表面包覆金属氧化物颗粒层，并自然堆积形成介孔结构，得到包覆有金属氧化物颗粒的BCO金属氧化物复合纳米纤维；
[0011](C)用碱催化步骤(b)中得到的BCO金属氧化物复合纳米纤维，得到可用于富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金属氧化物复合纳米纤维，该复合纳米纤维具有有序的介孔结构。用碱催化可改进复合纳米纤维的介孔结构，进而形成对磷酸化蛋白或多肽富集有用的改良型BCO金属氧化物复合纳米纤维。
[0012]进一步地，在步骤(C)之后还包括步骤(d):
[0013]将BCO金属氧化物复合纳米纤维填充于移液枪枪头中，形成呈移液枪枪头形状的BCO金属氧化物复合纳米纤维。即，将改良后的复合纳米纤维制成Tip。
[0014]优选地，将改良后的复合纳米纤维填充于200yL的移液枪枪头中，形成特异性富集用Tip。
[0015]优选地，金属氧化物选自二氧化钛、二氧化错、三氧化二铝、三氧化二铁、二氧化锡中的一种或几种。
[0016]优选地，在步骤(a)中，采用细菌纤维素产生菌经生物合成法制备BC纳米纤维。
[0017]具体地，木醋杆菌在发酵条件下制备BC纳米纤维。
[0018]在一具体实施例中，更优选地，在步骤(a)中，BC纳米纤维为由细菌纤维素产生菌木醋杆菌(Acetobacter xylinum)NUST5.2在发酵条件下生物合成的细菌纳米纤维。细菌纤维素具有生物相容性好、物理化学性质稳定、比表面积大、机械强度好及有利于操作等优点。另外，细菌纤维素表面富含羟基，这为表面溶胶-凝胶过程提供了合适的目标基团。
[0019]优选地，在步骤(a)中，BC纳米纤维的直径为15_80nm。
[0020]优选地，在步骤(b)中，通过原位生长法在BC纳米纤维表面包覆金属氧化物颗粒层。
[0021]更优选地，在步骤(b)中，金属氧化物颗粒的粒径为5_15nm。
[0022]进一步地，在步骤(b)中，介孔结构的介孔孔径为6-10nm。
[0023]优选地，在步骤(c)中，碱选自氨水、N，N_二甲基甲酰胺和四甲基氢氧化铵中的一种或几种。
[0024]在另一方面，本发明还提供了一种BCO金属氧化物复合纳米纤维富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的方法，包括以下步骤:
[0025](e)用不同pH值的缓冲液洗涤BCO金属氧化物复合纳米纤维，使其处于富集最佳状态；
[0026](f)将磷酸化蛋白或磷酸化多肽加入BCO金属氧化物复合纳米纤维中进行富集；
[0027](g)用不同pH值的缓冲液洗涤步骤(f)中得到的富集有磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金属氧化物复合纳米纤维，以除去非特异性吸附的蛋白或多肽;及
[0028](h)用碱洗脱富集在BCO金属氧化物复合纳米纤维上的特异性磷酸化蛋白或多肽。
[0029]进一步的，在步骤(e)中，缓冲液包括缓冲液A和缓冲液B，其中缓冲液A为体积分数计含有0.4 %三氟乙酸(TFA)和80 %乙腈(ACN)的水溶液，缓冲液B为以体积分数计，25 %的乳酸和75 %的缓冲液A的混合液。
[0030]优选地，在步骤(e)中，缓冲液A洗涤两次后，缓冲液B再洗涤两次。
[0031]进一步地，在步骤(f)中，磷酸化蛋白或多肽与缓冲液B以1:2的体积比混合得到混合液，将该混合液加入移液枪枪头(Tip)中进行富集。
[0032]优选地，在步骤(f)中，借助于离心机使得混合液在复合纳米纤维材料中进行富集。
[0033]进一步地，在步骤(g)中，分别用缓冲液B和缓冲液A依次洗涤富集有磷酸化蛋白或多肽的BCO金属氧化物复合纳米纤维。
[0034]优选地，在步骤(g)中，缓冲液B洗涤两次后，缓冲液A洗涤两次。
[0035]本发明的BCO金属氧化物复合纳米纤维所富集的磷酸化蛋白或多肽可用碱洗脱下来，并进行基质辅助激光解析串联飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)检测。
[0036]本发明的质谱辅助型BCO金属氧化物复合纳米纤维包括细菌纤维(BC)和金属氧化物(二氧化钛、二氧化锆等)纳米颗粒层，并在此基础上改进复合纳米纤维比表面积及介孔孔径。细菌纤维表面富含羟基，金属氧化物纳米颗粒经水热法原位生长于细菌纤维(BC)表面。在本发明中，利用碱催化改性表面金属氧化物晶体性质，特异性富集磷酸化蛋白及多肽，本发明基于金属氧化物(二氧化钛)可与磷酸化蛋白或磷酸化多肽的磷酸根形成双配位键的原理。
[0037]借由上述方案，与现有技术相比，本发明至少具有以下优点:
[0038]本发明通过生物合成方法制备出细菌纤维素，随后通过原位生长法制备出规整的、具有粒径均匀的金属氧化物(二氧化钛等)纳米颗粒，并通过适量碱(氨水等)催化，促进生长的金属氧化物(二氧化钛)等纳米颗粒重新组装和晶体进一步生长、晶化，从而结晶度增强，从而使无规则的二氧化钛颗粒减少，使复合纳米纤维表面介孔结构优化至富集磷酸化蛋白及多肽的最优孔径，从而提高富集的灵敏性及缩短富集过程的时间。本发明提供的质谱辅助型BCO金属氧化物复合纳米纤维具有实用性强、利于分离、比表面积和孔径较好的特点，从而提供了一种新型灵敏的辅助质谱分析的材料。
[0039]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[°04°]图1为本发明实施例1的BC@mTi02复合纳米纤维的制备及其富集磷酸化蛋白的示意图；
[0041]图2为本发明实施例1的细菌纤维素(BC)的透射电子显微镜形貌图；
[0042]图3为本发明实施例1的包覆有二氧化钛纳米颗粒的BCOmT12复合纳米纤维的透射电子显微镜形貌图；
[0043]图4为本发明实施例1的细菌纤维素(BC)的扫描电子显微镜形貌图；
[0044]图5为本发明实施例1的包覆有二氧化钛纳米颗粒的BCOmT12复合纳米纤维的扫描电子显微镜形貌图；
[0045]图6为本发明实施例1中β-酪蛋白酶解液与BSA酶解液的混合溶液(摩尔比1:10)经BCOmT12复合纳米纤维富集前的质谱图；
[0046]图7为本发明实施例1中β-酪蛋白酶解液与BSA酶解液的混合溶液(摩尔比1:10)经BCOmT12复合纳米纤维富集后的质谱图；
[0047]图8为本发明实施例2中β-酪蛋白酶解液与磷酸化多肽样品的混合溶液(摩尔比1:10)经BCOmZrO2富集前的质谱图。
[0048]图9为本发明实施例2中β-酪蛋白酶解液与磷酸化多肽样品的混合溶液(摩尔比1:10)经BCOmZrO2富集后的质谱图。
【具体实施方式】
[0049]下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。应理解的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0050]实施例1
[0051 ] BC@mTi02(介孔二氧化钛包裹的细菌纤维素)复合纳米纤维的制备及其在生物质谱中的应用。
[0052]实施例1提供一种BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其中金属氧化物为二氧化钛，如图1所示，该方法依次包括以下步骤:
[0053](a)通过细菌纤维素产生菌的生物合成法制备BC纳米纤维
[0054]BC纳米纤维由细菌纤维素产生菌木醋杆菌(Acetobacter xylinum)NUST5.2在29°C的条件下培养发酵7天产生。整个培养过程用的是动态培养方法，这种方法可以有效地提高生产率。其间，21g蔗糖，1g酵母提取物，20g D-葡萄糖，4g硫酸铵(NH4)2S04，2g磷酸二氢钾(KH2PO4)和0.4g硫酸镁(MgSO4)溶于I升的水中，用2.5M氢氧化钠(NaOH)调PH至6.1左右配制成培养基，提供细菌生长所需营养。获得的BC纳米纤维浸入去离子水中洗涤净化，然后用千分之三的氢氧化钠(NaOH)和千分之三的过氧化氢(H2O2)水浴加热6小时，除去细菌残余。最后用去离子水漂洗几次，除去纤维上的碱试剂，使其接近中性，并于4°C冰箱保存。用之前使用冻干机将纤维冻干使用，所制备的纤维的直径约为15_40nm。
[0055](b)通过水热法形成均匀的T12层。
[0056]水热法是指在密封的压力容器中，水为溶剂，在高温高压的条件下进行的化学反应。水热法是利用高温高压的水溶液使那些在大气条件下不溶或难溶的物质溶解，或反应生成该物质的溶解产物，通过控制高压釜内溶液的温差使产生对流，以形成过饱和状态而析出生长晶体的方法。
[0057]具体制备方法为:将干燥的BC纳米纤维分散于乙醇和水(1:1，v:V)的混合溶液中，接着，用不同浓度的乙醇对其进行梯度脱水，直至浓度达到99%。然后，离心去除上清溶剂，并加入200毫升Ti(OBu)4的乙醇溶液，作为钛源。同时，加入2毫升乙酰丙酮防止水解。3小时机械搅拌后，将反应液转入聚四氟乙烯不锈钢高温反应釜中(最大体积为200毫升)，加热至180°C，在密闭条件下保温8小时。待反应完毕，温度降至室温后，用去离子水和乙醇分别洗涤3次。最后，在真空干燥箱中，60°C干燥过夜。其中，所得到的BCO金属氧化物复合纳米纤维表面的T12的粒径为5nm。
[0058](C)BCOmT12复合纳米纤维的改性。
[0059]将50mg上述获得的纳米纤维再次分散于60mL乙醇和水的混合溶液中(乙醇:水，2:1，v: V)，并加入适量氨水(3mL)，混匀后转入聚四氟乙烯不锈钢高温反应釜中(容量为10mL)，加热至160°C，保温20小时。反应完毕后，待温度至室温，所得的纳米纤维用水和乙醇分别洗涤几次，离心收集纤维，利用冻干机干燥备用。所得到的BCO金属氧化物复合纳米纤维的介孔结构的孔径为6nm。
[0060](d)BC@mTi02复合纳米纤维Tip(移液枪枪头形状)的制备。
[0061 ] 200yL移液枪枪头选作容器来支撑BCOmT12复合纳米纤维，形成移液枪枪头形状的BC@mTi02复合纳米纤维Tip。
[0062]具体步骤如下:首先，将适量脱脂棉放于Tip底端来延长液体通过时间，从而使样品与BCOmT i02复合纳米纤维充分接触。接着，将Img的BCOmT i02复合纳米纤维填充在脱脂棉上形成完整的BCOmT12复合纳米纤维Tip。放置于室温待后续富集使用。为了方便离心，用微量离心管制成适配器辅助离心(参考图1)。
[0063]BCimT i02复合纳米纤维对磷酸化蛋白的富集。
[0064]标准蛋白溶液的制备
[0065]β-酪蛋白和牛血清蛋白分别溶于25mM碳酸氢铵水溶液中，形成终浓度为2mg/mL的蛋白标准液，并用IM Tris溶液调pH至8.0。然后100°C变性10分钟。待温度降至室温后，加入胰蛋白酶以1:2.5(酶:底物)的比例进行酶解，37°C过夜，同时加入5%的乙腈提高胰蛋白酶的活性。酶解后的标准蛋白溶液储存于-20 V冰箱中，备用。
[0066]BQgmT12富集磷酸化蛋白具体包括以下步骤:
[0067](e)上样
[0068]在富集前，上述制成的复合纳米纤维Tip用两种不同pH的缓冲液处理达到最优富集状态，这两种缓冲液分别是:缓冲液A为以体积分数计含有0.4%三氟乙酸(TFA)和80%乙腈(ACN)的水溶液，缓冲液B为以体积分数计，25%的乳酸和75%的缓冲液A的混合液。其中，缓冲液B也作为接下来的上样缓冲液。前处理过程及接下来洗涤过程均借助离心机在5000rpm转速下离心2分钟，其中每种缓冲液洗涤2次。
[0069](f)前处理完毕后，将缓冲液B与蛋白溶液以2:1的体积比混匀，加入移液枪枪头(T i P)中进行富集。该过程借助离心机使混合液经过富集材料，并以3 500rpm的转速离心8分钟，将离心得到的样品重新移到Tip中，重复3次。
[0070](g)接着，分别用缓冲液B和缓冲液A先后洗涤复合纳米纤维Tip，目的是除去粘在纤维表面的非磷酸化多肽及试剂，每种缓冲液洗涤2次。
[0071](h)洗涤完毕后，用50yL 5%的氨水洗脱特异性吸附的磷酸化蛋白，离心速度、时间及次数与富集过程一致。最后将洗脱液冻干，并放于-20°C保存备用。
[0072]基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析(MALD1-T0F-MS)
[0073]MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，激光照射时基质从激光中吸收能量，传递给样品分子使其瞬间汽化，并将质子转移到样品分子使其离子化，然后进入飞行时间质量分析器，再根据它们各自的质荷比(m/z)进行检测。
[0074]具体过程为:将冻干的样品用3yL缓冲液C(乙腈/三氟乙酸/水，50%/0.1%/49.9%, v/v/v)复溶，然后与等体积的饱和CHCA基质混匀。CHCA基质是由α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于ΤΑ30溶液中形成的饱和溶液，其中，ΤΑ30是含有体积分数为30 %乙腈和0.1 %三氟乙酸的水溶液。然后，用微量移液枪将混合液体滴于靶板上，待自然风干后再滴一层CHCA基质，干燥并结晶后进行MALD1-TOF质谱分析。
[0075]其中，本实施例1的辅助质谱型BCOmT12复合纳米纤维，包括细菌纤维(BC)和包覆在其表层的二氧化钛纳米颗粒，该复合纳纤维由移液枪枪头支撑，辅助质谱型BCOmT12复合纳米纤维Tip由上述步骤a-d制成。辅助质谱特异性富集磷酸化蛋白或多肽的过程包括前处理、上样富集及洗脱分析过程，辅助质谱特异性富集磷酸化蛋白或多肽过程由上述步骤e-h完成。
[0076]本发明实施例1中的BCOmT12复合纳米纤维，对不同浓度的β_酪蛋白酶解液(10—5Μ、10—6Μ、10—7M)做质谱检测结果，灵敏度达到1.7pmol。
[0077]图1展示了实施例1的BCOmT12复合纳米纤维的制备及富集磷酸化蛋白的示意图。图2、图3分别为实施例1中细菌纤维素(BC)和BCOmT12复合纳米纤维的透射电子显微镜的形貌图。图4、图5分别为实施例1中细菌纤维素(BC)和BCOmT12复合纳米纤维的扫描电子显微镜的形貌图。图6、图7分别为β-酪蛋白酶解液与BSA酶解液的摩尔比为1:1O的混合溶液经BCOmT12复合纳米纤维富集前、富集后的质谱图。
[0078]实施例2
[0079]BCOZrO2复合纳米纤维的制备及其生物质谱中的应用。
[0080]实施例2提供一种BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其中金属氧化物为二氧化锆，该方法依次包括以下步骤:
[0081 ] (a)实施例2中BC纳米纤维的制备方法与实施例1相同，参照实施例1制备的BC纤维的直径为50-80nmo
[0082](b)通过水热法形成均匀的ZrO2层，其中用正丁醇锆做为锆源。
[0083]具体制备方法为:将干燥的BC纳米纤维分散于乙醇和水(1:1，v:V)的混合溶液中，接着，用不同浓度的乙醇对其进行梯度脱水，直至浓度达到99%。然后，离心去除上清溶剂，并加入250毫升正丁醇锆的乙醇溶液，作为锆源。同时，加入2.5毫升乙酰丙酮防止水解。3小时机械搅拌后，将反应液转入聚四氟乙烯不锈钢高温反应釜中(最大体积为200毫升)，加热至180°C，在密闭条件下保温8小时。待反应完毕，温度降至室温后，用去离子水和乙醇分别洗涤3次。最后，在真空干燥箱中，60°C干燥过夜。其中，所得到的BCO金属氧化物复合纳米纤维表面Zr02的粒径为15nm。
[0084](C)BCOmZrO2复合纳米纤维的改性。
[0085]将50mg上述获得的纳米纤维再次分散于60mL乙醇和水的混合溶液中(乙醇:水，2:1，v: V)，并加入适量四甲基氢氧化铵(3.5mL)，混匀后转入聚四氟乙烯不锈钢高温反应釜中(容量为10mL)，加热至160°C，保温20小时。反应完毕后，待温度至室温，所得的纳米纤维用水和乙醇分别洗涤几次，离心收集纤维，利用冻干机干燥备用。改性后所得BCOmZrO2复合纳米纤维的介孔结构孔径为I Onm。
[0086](d) BCOmZrO2复合纳米纤维Tip (移液枪枪头形状)的制备。
[0087]200yL移液枪枪头选作容器来支撑BCOmZrO2复合纳米纤维，形成移液枪枪头形状的BC@mZr02复合纳米纤维Tip。
[0088]具体步骤如下:首先，将适量脱脂棉放于Tip底端来延长液体通过时间，从而使样品与BC@mZr02复合纳米纤维充分接触。接着，将Img的BC@mZr02复合纳米纤维填充在脱脂棉上形成完整的BCOmZrO2复合纳米纤维Tip。放置于室温待后续富集使用。为了方便离心，用微量离心管制成适配器辅助离心。
[0089]BC@mZr02复合纳米纤维对磷酸化蛋白的富集。
[0090]磷酸化多肽样品的制备
[0091 ]从A549细胞提取磷酸化多肽样品，提取步骤包括:
[0092 ] (I)利用胰蛋白酶将细胞处理后，用4 °C的PBS洗涤3次。
[0093](2)将细胞分散于提前配制好的裂解液(参照商品说明书配制)中，冰浴20min。
[0094](3)利用细胞破碎仪彻底破碎细胞，冰浴下进行。
[0095](4)在4°C14800rmp离心 lOmin，取上清。
[0096](5)将上清用50mM碳酸氢铵溶液稀释，与胰酶孵育37 °C 12h。
[0097 ] BC@mZr02富集磷酸化蛋白具体包括以下步骤:
[0098](e)上样
[0099]在富集前，上述制成的复合纳米纤维Tip用两种不同pH的缓冲液处理达到最优富集状态，这两种缓冲液分别是:缓冲液A为以体积分数计含有0.4%三氟乙酸(TFA)和80%乙腈(ACN)的水溶液，缓冲液B为以体积分数计，25%的乳酸和75%的缓冲液A的混合液。其中，缓冲液B也作为接下来的上样缓冲液。前处理过程及接下来洗涤过程均借助离心机在5000rpm转速下离心2分钟，其中每种缓冲液洗涤2次。
[0100](f)前处理完毕后，将缓冲液B与蛋白溶液以2:1的体积比混匀，加入移液枪枪头(T i P)中进行富集。该过程借助离心机使混合液经过富集材料，并以3 500rpm的转速离心8分钟，将离心得到的样品重新移到Tip中，重复3次。
[0101](g)接着，分别用缓冲液B和缓冲液A先后洗涤复合纳米纤维Tip，目的是除去粘在纤维表面的非磷酸化多肽及试剂，每种缓冲液洗涤2次。
[0102](h)洗涤完毕后，用50yL的5%氨水洗脱特异性吸附的磷酸化蛋白，离心速度、时间及次数与富集过程一致。最后将洗脱液冻干，并放于-20°C保存备用。
[0103]基质辅助激光解析串联飞行时间质谱分析(MALD1-TOF-MS)
[0104]MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，激光照射时基质从激光中吸收能量，传递给样品分子使其瞬间汽化，并将质子转移到样品分子使其离子化，然后进入飞行时间质量分析器，再根据它们各自的质荷比(m/z)进行检测。
[0105]具体过程为:将冻干的样品用3yL缓冲液C(乙腈/三氟乙酸/水，50%/0.1%/49.9%, v/v/v)复溶，然后与等体积的饱和CHCA基质混匀。CHCA基质是由α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于ΤΑ30溶液中形成的饱和溶液，其中，ΤΑ30是含有体积分数为30 %乙腈和0.1 %三氟乙酸的水溶液。然后，用微量移液枪将混合液体滴于靶板上，待自然风干后再滴一层CHCA基质，干燥并结晶后进行MALD1-TOF质谱分析。
[0106]其中，本实施例2的辅助质谱型BCOmZrO2复合纳米纤维，包括细菌纤维(BC)和包覆在其表层的二氧化锆纳米颗粒，该复合纳纤维由移液枪枪头支撑，辅助质谱型BCOmZrO2复合纳米纤维Tip由上述步骤a-d制成。辅助质谱特异性富集磷酸化蛋白或多肽的过程包括前处理、上样富集及洗脱分析过程，辅助质谱特异性富集磷酸化蛋白或多肽过程由上述步骤e-h完成。
[0107]本发明实施例2中的BCOZrO2复合纳米纤维对β_酪蛋白酶解液(来自实施例1中所制备的)与磷酸化多肽样品(1: 1、1:10、1:100)的不同摩尔比的混合溶液做质谱检测，特异性达到1:100。
[0108]实施例2的BCOmZrO2复合纳米纤维的制备及富集磷酸化蛋白的过程及示意图与实施例I相似。
[0109]图8、图9分别为β-酪蛋白酶解液与磷酸化多肽样品的摩尔比为1:10的混合溶液经BCOmZrO2复合纳米纤维富集前和富集后的质谱图。
[0110]从以上实施例可以看出:在磷酸化蛋白或多肽的富集及检测方面，本发明的BCO金属氧化物复合纳米纤维不仅具有较高的特异性和灵敏性，质谱检测图谱也具有较高的信噪比，本发明为生物检测领域提供了可行的新方法。在材料方面，本发明的BCO金属氧化物复合纳米纤维不仅具有大的比表面积、有序的介孔结构，还具有操作简单、环境友好等优点。
[0111]以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (a)制备BC纳米纤维; (b)在BC纳米纤维的表面包覆金属氧化物颗粒层，并自然堆积形成介孔结构，得到包覆有金属氧化物颗粒的BCO金属氧化物复合纳米纤维； (c)用碱催化步骤(b)中得到的BCO金属氧化物复合纳米纤维，得到可用于富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金属氧化物复合纳米纤维。2.根据权利要求1所述的BC O金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于，在步骤(c)之后还包括步骤(d):将BCO金属氧化物复合纳米纤维填充于移液枪枪头中，形成呈移液枪枪头形状的BCO金属氧化物复合纳米纤维。3.根据权利要求1所述的BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述金属氧化物选自二氧化钛、二氧化锆、三氧化二铝、三氧化二铁、二氧化锡中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的BC O金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:在步骤(a)中，采用细菌纤维素产生菌经生物合成法制备BC纳米纤维。5.根据权利要求4所述的BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:在步骤(a)中，木醋杆菌在发酵条件下制备BC纳米纤维。6.根据权利要求1所述的BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:在步骤(b)中，通过原位生长法在BC纳米纤维表面包覆金属氧化物颗粒层。7.根据权利要求1或6所述的BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:在步骤(b)中，金属氧化物颗粒的粒径为5-15nm。8.根据权利要求1所述的BC O金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:在步骤(b)中，介孔结构的介孔孔径为6-10nmo9.根据权利要求1所述的BCO金属氧化物复合纳米纤维的制备方法，其特征在于:在步骤(c)中，碱选自氨水、N，N-二甲基甲酰胺和四甲基氢氧化铵中的一种或几种。10.—种权利要求1所述的BCO金属氧化物复合纳米纤维富集磷酸化蛋白或磷酸化多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤: (e)用缓冲液洗涤BCO金属氧化物复合纳米纤维，使其处于富集最佳状态； (f)将磷酸化蛋白或磷酸化多肽加入BCO金属氧化物复合纳米纤维中进行富集； (g)用缓冲液洗涤步骤(f)中得到的富集有磷酸化蛋白或磷酸化多肽的BCO金属氧化物复合纳米纤维，以除去非特异性吸附的蛋白或多肽； (h)用碱洗脱富集在BCO金属氧化物复合纳米纤维上的特异性磷酸化蛋白或多肽。
【文档编号】G01N27/62GK105862391SQ201610185965
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年3月29日
【发明人】刘坚, 高瑞芳, 陈啸, 孙东平
【申请人】苏州大学