用于自动化的外植体制备的系统及使用方法与流程

相关申请的交叉引用

本申请根据25usc§119(e)要求2015年6月29日提交的美国专利申请序列号62/186,059的权益，其全部公开内容以引用的方式并入本文中。

本公开整体涉及用于制备用在植物育种中的种子的装置，且更具体地讲涉及用于制备用于基因转化和转基因工程的外植体的装置。

背景技术：

大豆(glycinemax)为最重要的农作物之一，全世界有超过2亿公吨的年作物产量和超过400亿美元的估计价值。大豆占全球所有油籽生产的超过97％。因此，用于改良这种有价值的作物的质量和产量的可靠且有效的方法具有显著利益。

用于改良大豆的传统育种方法已受到限制，因为大多数大豆栽培品种仅源自几个亲代品系，从而导致用于育种的窄种源基础。christou等人，tibtech8:145-151(1990)。现代研究工作已集中于植物基因工程技术以改良大豆生产。转基因方法被设计为将所要的基因引入作物植物的遗传生殖系中以产生优良的植物品系。方法已成功地提高若干其他作物植物对疾病、昆虫和除草剂的抗性，同时改良营养价值。

已开发用于将基因转移至植物组织中的若干方法，包括基因枪(例如高速微粒轰击)、显微注射、电穿孔和直接dna摄取。近来已使用农杆菌介导的基因转化来将感兴趣的基因引入大豆中。然而，已证明大豆是用于转基因工程的挑战性系统。大豆外植体的有效转化和再生难以实现，且通常难以重复。

作为病原土壤细菌的根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)具有将其称为t-dna的dna转移至宿主植物细胞中且诱导宿主细胞产生对细菌营养有用的代谢产物的内在能力。使用重组技术，t-dna中的一些或全部可以被感兴趣的一个或多个基因替代，从而产生对使宿主植物转化有用的细菌载体。农杆菌介导的基因转移通常针对组织培养中的未分化细胞，但也可针对从植物的叶或茎取得的分化细胞。已开发用于大豆的农杆菌介导的转化的许多程序，这些程序可基于经受转化的外植体组织宽松地分类。

olhoft等人的美国专利第7,696,408号公开了用于使单子叶植物和双子叶植物两者转化的子叶节方法。“子叶节”(cotnode)方法涉及通过以下方式从5-7天大的大豆幼苗移除下胚轴：在子叶节正下方切割，分裂且分开具有子叶的剩余下胚轴区段，并从子叶移除上胚轴。使子叶外植体在腋芽和/或子叶节的区域中受创，且在黑暗中以根癌农杆菌培养五天。该方法需要种子的体外发芽，且创伤步骤引入显著的可变性。

martinelli等人的美国专利第6,384,301号公开了农杆菌介导的基因从大豆胚传递至活分生组织中，这些大豆胚从大豆种子切除，接着以选择剂和激素培养分生组织外植体以诱导嫩芽形成。类似于“子叶节”方法，优选地使分生组织外植体在接种之前受创。

paz等人的美国专利第7,473,822号公开了称为“半粒种子外植体”(half-seedexplant)方法的修改的子叶节方法。成熟大豆种子经浸润、表面灭菌且沿种脐分裂。在感染之前，完全移除胚轴和嫩芽，但无其他创伤发生。农杆菌介导的转化进行，选择潜在转化体，且在选择培养基上重新产生外植体。

转化效率在这些方法下仍然相对低，对于“子叶节”方法为约0.3％至2.8％，对于“分生组织外植体”方法为1.2％至4.7％，且对于“半粒种子外植体”方法介于3.2％与8.7％之间(整体4.9％)。在本领域中通常为约3％的转化效率。

改良的“分裂种子”(split-seed)转基因方案可使转基因大豆产品的未来生产和发展加速。用于转基因至大豆组织中的稳定整合的有效且高通量的方法将促进育种计划且具有提高作物生产率的潜力。

技术实现要素：

公开一种用于自动化外植体制备的方法和设备。根据一个方面，自动化的外植体制备方法可包括操作泵以用农杆菌溶液填充包括多个外植体的外植体器皿，操作第一机械臂以将经填充的外植体器皿移动至震荡器台的震荡器板上，操作震荡器台以使震荡器板在由震荡器板限定的平面内的方向上移动以便用农杆菌溶液感染所述多个外植体，和响应于确定外植体已被农杆菌溶液感染而操作第二机械臂将外植体从经填充的外植体器皿移动至培养基器皿上的预定位置处。

在一些实施方案中，该方法还可以包括响应于确定培养基器皿具有预定数量的定位于该培养基器皿上的外植体而操作第一机械臂将培养基器皿移动至传递台上。此外，在一些实施方案中，该方法还可以包括确定培养基器皿具有预定数量的定位于该培养基器皿上的外植体，其包括确定培养基器皿具有一定数量(n)的定位于该培养基器皿上的外植体且这些外植体在该培养基器皿上相隔360/n度均匀间隔开。

在一些实施方案中，操作第一机械臂移动培养基器皿可包括操作第一机械臂以使培养基器皿的盖子紧固在该培养基器皿上，和操作第一机械臂将经紧固的培养基器皿移动至传递台上。

在一些实施方案中，该方法还可以包括用相机捕获经填充的外植体器皿的底部的图像，基于该图像确定外植体在该经填充的外植体器皿中的定位，和操作第二机械臂夹持该定位处的外植体。另外，在一些实施方案中，操作第二机械臂移动外植体可包括响应于操作第二机械臂夹持该外植体而操作第二机械臂移动该外植体。

在一些实施方案中，确定外植体在经填充的外植体器皿中的定位可包括确定多个外植体在经填充的外植体器皿中的定位和从所述多个外植体选择外植体。

另外，在一些实施方案中，该方法还可以包括基于目前定位于培养基器皿中的每一者上的许多外植体而从多个培养基器皿选择培养基器皿。在一些实施方案中，选择培养基器皿可包括选择目前定位于培养基器皿上的外植体少于六个的培养基器皿，且操作第二机械臂将外植体从经填充的外植体器皿移动至所选培养基器皿上的预定位置处可包括基于目前定位于培养基器皿上的各个其他外植体的位置确定移动该外植体所朝向的所选培养基器皿上的预定位置。

在一些实施方案中，该方法还可以包括操作第一机械臂将多个培养基器皿的各个培养基器皿从器皿分配器移动至转移台上与所述多个培养基器皿的各个其他培养基器皿的位置不同的预定位置处。在一些实施方案中，该方法还可以包括响应于确定各个培养基器皿具有预定数量的定位于该培养基器皿上的外植体而操作第二泵以将农杆菌溶液从经填充的外植体器皿泵入溶液废弃物容器中。另外，在一些实施方案中，该方法可包括响应于确定农杆菌溶液已从经填充的外植体器皿移除而操作第一机械臂将该经填充的外植体器皿移动至器皿废弃物容器中。

在一些实施方案中，该方法可包括操作第一机械臂移动经填充的外植体器皿，其包括用压缩空气源操作第一机械臂的爪夹以抓取经填充的外植体器皿，且操作第二机械臂移动外植体可包括操作第二机械臂以用由第二机械臂的负压源施加于外植体上的吸力来紧固该外植体。在一些实施方案中，操作第二机械臂移动外植体可包括响应于确定已达到与外植体感染相关联的所需感染时间而操作第二机械臂从经填充的外植体器皿移动外植体。

在一些实施方案中，操作震荡器台以移动板可包括在由板限定的平面内以包括旋转或侧向移动中的至少一者的移动模式移动该板。此外，在一些实施方案中，该方法可包括对第二机械臂的夹具进行灭菌。在一些实施方案中，农杆菌溶液可包括根癌农杆菌。在其他实施方案中，农杆菌溶液可包括发根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)。另外，在一些实施方案中，外植体可包括大豆外植体。在其他实施方案中，外植体可包括菜籽下胚轴区段。

根据另一方面，外植体制备设备可包括：第一机械臂，其包括抓取外植体器皿以用于移动的爪夹；第二机械臂，其包括用吸力紧固外植体以用于移动的抽吸夹；泵，其被配置成传递农杆菌溶液；震荡器台，其包括震荡器板且被配置成移动震荡器板；和电子控制器。在一些实施方案中，电子控制器可被配置成：操作泵以用农杆菌溶液填充包括多个外植体的外植体器皿，操作第一机械臂以将经填充的外植体器皿移动至震荡器台的震荡器板上，操作震荡器台以使震荡器板在由震荡器板限定的平面内的方向上移动以便用农杆菌溶液感染所述多个外植体，和响应于确定外植体已被农杆菌溶液感染而操作第二机械臂将外植体从经填充的外植体器皿移动至培养基器皿上的预定位置处。

在一些实施方案中，外植体制备设备还可以包括第三机械臂，其包括抓取外植体器皿以用于移动的爪夹。在一些实施方案中，第一机械臂可包括压缩空气源，且电子控制器可被配置成操作压缩空气源以使爪夹在打开与闭合位置之间移动。在一些实施方案中，农杆菌溶液可包括根癌农杆菌。在其他实施方案中，农杆菌溶液可包括发根农杆菌。另外，在一些实施方案中，外植体可包括大豆外植体。在其他实施方案中，外植体可包括菜籽下胚轴区段。

根据又一方面，器皿分配系统可包括外壳；细长主体，其紧固至外壳且以纵向轴线为中心，其中该细长主体被配置成沿着纵向轴线紧固培养皿的叠堆；第一气动装置，其定位于外壳中且被配置成沿着纵向轴线在第一方向上移动培养皿叠堆的一组培养皿以使培养皿叠堆的第一培养皿与该组培养皿分开；和第二气动装置，其定位于外壳中且被配置成使所分开的第一培养皿沿着与纵向轴线正交的轴线移动。

在一些实施方案中，第一气动装置可包括被配置成紧固该组培养皿的底部培养皿的一对器皿夹持臂。另外，在一些实施方案中，第二气动装置可被配置成将所分开的第一培养皿移动至外壳外侧的某位置处。在一些实施方案中，器皿分配系统还可以包括第三气动装置，其定位于外壳中且被配置成：响应于确定所分开的第一培养皿已从由第二气动装置操作的板延伸器移除，而使该组培养皿在与第一方向相反的第二方向上移动。

附图说明

详细描述具体参考以下附图，在附图中：

图1和图2为用于制备外植体(例如用于基因转化的大豆种子外植体)的系统的透视图；

图3为图1的系统的俯视平面图；

图4为图1的系统的机械臂的爪夹组件的侧面正视图；

图5为图4的爪夹组件的爪夹的透视图；

图6为图1的系统的机械臂的抽吸夹组件的透视图；

图7为图1的系统的泵送系统的透视图；

图8为图7的泵送系统的经部分装配的流体传递系统的透视图；

图9为使用中的图8的经装配流体传递系统的侧面正视图；

图10为使用中的图7的泵送系统的流体抽取系统的侧面正视图；

图11为图1的系统的震荡器台的透视图；

图12至图19为处于各种操作状态的图1的系统的器皿分配系统的视图；

图20为图1的系统的传递台的透视图；

图21为图1的系统的灭菌装置的透视图；

图22为包括成像台的图1的系统的转移台的透视图；

图23为图1的系统的简化框图；

图24至图25为显示用于图1的系统的例示性操作程序的框图；

图26为显示用于将培养基器皿从图12至图19的器皿分配系统移动至图1的系统的转移台上的例示性程序的框图；

图27为显示用于将经感染的外植体从经填充的外植体器皿移动至培养基器皿中的例示性程序的框图；

图28为显示用于将培养基器皿移动至图20的传递台上的例示性程序的框图；且

图29至图30为用以识别将要由图1的系统拾起的外植体的图27的操作程序的图像捕获过程的图解。

具体实施方式

虽然本公开可容许各种修改和替代形式，但已通过实例在附图中详细地描述了具体的示例性实施方案，并且将在本文详细描述这些实施方案。然而，应理解，无意将本公开的概念限制于所公开的特定形式，相反地，意图将涵盖落入由随附权利要求所限定的本发明的精神和范畴内的所有修改、等效物和替代方案。

如本文所用，术语“抓取”和“夹持”是指用工具固持或抓住外植体，例如大豆种子外植体或菜籽下胚轴区段。允许外植体被稳固地夹紧的任何后续机构或动作被视为在术语“抓取”的范畴内。

如本文所用，术语“基因修饰”或“转基因”涉及包括预选dna序列的植物细胞、植物组织、植物部分、植物种质或植物，该预选dna序列通过转化引入至植物细胞、植物组织、植物部分、植物种质或植物的基因组中。

如本文所用，术语“转基因”、“异源性”、“引入”或“外来”dna或基因涉及重组dna序列或基因，该重组dna序列或基因并未天然地存在于为重组dna或基因的受体的植物的基因组中，或该重组dna序列或基因在受体植物中存在于相比未转化植物的基因组中的不同定位或联合处。

如本文所用，术语“外植体”涉及从供体植物(例如，从供体种子)移除或隔离、体外培养且能够在适合的培养基中生长的一块植物组织，例如可转化的植物组织(诸如大豆外植体组织或菜籽下胚轴)。

如本文所用，术语“植物”涉及整棵植物、植物组织、植物部分，包括花粉、种子或胚、植物种质、植物细胞，或植物的群组。可在本发明的方法中使用的植物的分类不限于大豆，而是通常可以包括可经受转化技术的任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物两者。

如本文所用，术语“转化”涉及核酸或片段至宿主生物体中的转移和整合，从而导致基因稳定的遗传。含有转化核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。已知的转化方法包括根癌农杆菌或发根农杆菌介导的转化、磷酸钙转化、聚凝胺转化、原生质融合、电穿孔、超声波法(例如，声孔效应)、脂质体转化、显微注射、裸dna、质粒载体、病毒载体、基因枪(微粒轰击)、碳化硅whiskers^tm介导的转化、气溶胶射束(aerosolbeaming)或peg转化以及其他可能的方法。

如本文所用，“可转化的植物组织”是指适合于通过农杆菌(其在植物中宿主范围广泛)转化的任何植物部分。nestere.,frontplantsci.5:730(2015)。可转化的植物组织包括来自双子叶植物或单子叶植物物种的细胞，诸如大豆(glycinemax)；油菜籽(也称为菜籽)(欧洲油菜(brassicanapus))；玉蜀黍(也称为玉米(zeamays))；棉花(棉属(gossypiumspp.))；红花(carthamustinctorius)；向日葵(helianthusannuus)；烟草(nicotianatabacum)；拟南芥(arabidopsisthaliana)；蓖麻(ricinuscommunis)；椰子(cocusnucifera)；芫荽(coriandrumsativum)；花生(arachishypogaea)；油棕榈(elaeisguineeis)；橄榄(oleaeurpaea)；稻(oryzasativa)；南瓜(cucurbitamaxima)；大麦(hordeumvulgare)；甘蔗(saccharumofficinarum)；稻(oryzasativa)；小麦(小麦属(triticumspp.)，包括硬粒小麦(triticumdurum)和普通小麦(triticumaestivum))；浮萍(浮萍属(lemnaceaesp.))；甜菜(betavulgaris)；苜蓿(medicagosativa)；高梁(sorghum)；和草皮草(turfgrass)。因此，可选择任何适合的植物物种或植物细胞作为可转化的植物组织的来源。在一些实施方案中，可转化的植物组织包括花粉、胚、花、果实、嫩枝、叶子、根、茎和外植体。

可用于再生植物的可转化的植物组织包括来自例如以下的组织：胚、不成熟胚、下胚轴细胞(例如菜籽下胚轴区段)、分生组织细胞、愈合组织、花粉、叶子、花药、根、根尖、穗丝(silk)、花和果仁。可转化的植物组织也包括原生质体和原生质球状体，其是指细胞壁完全和部分地被移除的植物细胞。

参考图1至图3，显示用于自动化制备外植体(例如大豆种子外植体或菜籽下胚轴区段)的系统10，这些外植体用于通过任何已知的方法进行基因转化。系统10例示性地被配置成作为转基因方案和转基因大豆产品开发的一部分来制备大豆种子外植体(下文称为种子外植体12)。示例性转基因方案描述于标题为“improvedsoybeantransformationforefficientandhigh-throughputtransgeniceventproduction”的美国专利申请序列号14/133,370和标题为“improvedsoybeantransformationforefficientandhigh-throughputtransgeniceventproduction”的美国专利申请序列号14/134,883中，这些美国专利申请以引用方式明确地并入本文。此外，在一些实施方案中，本文所描述的技术可与以下文献中所描述的技术结合使用：名称为“systemforimagingandorientingseedsandmethodofuse”的美国临时专利申请第61/989,266号、名称为“systemforseedpreparationandmethodofuse”的美国临时专利申请第61/989,275号和/或名称为“systemforcuttingandpreparingseedsandmethodofuse”的美国临时专利申请第61/989,276号，这些临时专利申请明确地以引用的方式并入本文中。

更具体地讲，如下文所描述，系统10被配置成将农杆菌溶液(含有根癌农杆菌或发根农杆菌)传递至外植体(例如种子外植体或下胚轴区段)12的器皿中，搅动外植体12(例如通过震荡种子外植体12的器皿)，和将外植体12转移至培养基器皿(例如琼脂生长介质的器皿)。系统10降低用户的与重复程序所涉及到的任务相关联的损伤风险，减少人员对农杆菌溶液的暴露，且确保外植体12得到同等处理以保证质量。

应当了解，本文所描述的任何装置和方法可结合这些申请中所公开的转化方法一起使用。也应当了解，在其他实施方案中，本文所描述的任何装置和方法可被配置成与可经受转化技术的其他分类的植物一起使用，这些植物包括单子叶植物和双子叶植物两者。

系统10包括将外植体12和/或器皿16在布置于平台18上的各个工作台之间移动的一组机械臂14。在例示性实施方案中，各个机械臂14为被配置成独立于各个其他机械臂14而操作的epsonc3型六轴铰接臂。在其他实施方案中，机械臂14可具有相较于本文所描述的机械臂不同的自由度。例如，机械臂14可体现为具有至少两个独立轴的机械臂。

在例示性实施方案中，机械臂14中的一者(下文称为机械臂20)包括被配置成抓取和固持外植体12的抽吸夹22(参见图6)，且其他机械臂14中的每一者(下文称为机械臂24)均包括被配置成抓取和固持器皿16或器皿16的一部分(例如器皿16的底部或器皿16的盖子)的爪夹26。在一些实施方案中，系统10可在机械臂24之一停止运转的情况下操作。此外，应当了解，在其他实施方案中，系统10可仅包括单个机械臂24将器皿16在布置于平台18上的各个工作台之间移动。另外，在例示性实施方案中，各个机械臂14能够使对应夹具22、26围绕该夹具的轴线旋转至少180度。

如图1至图3中所示，布置于平台18上的工作台包括一对传递台28和一对转移台30。在例示性实施方案中，传递台28定位于平台18后部，朝向平台18上的相对末端处，这些相对末端为器皿16可由用户定位以用于通过系统10处理的位置和器皿16可经定位以由用户在系统10处理之后取回的位置。此外，将转移台30朝向平台18中间定位以使得转移台30中的每一者均可由机械臂20和至少一个机械臂24接近。如下文更详细描述的，转移台30用于将用根癌农杆菌溶液感染的外植体12转移至包括培养基(例如琼脂)的器皿16。

转移台30中的每一者也包括成像台32，其可操作以捕获器皿16内的外植体12的许多图像。系统10也包括一对震荡器台34，其可操作以搅动或震荡含有农杆菌溶液(含有根癌农杆菌或发根农杆菌)的器皿16内的外植体12。系统10也包括泵送系统36，其被配置成将农杆菌溶液传递至器皿16且在包括于那些器皿16中的外植体12由农杆菌溶液感染之后从器皿16抽取农杆菌溶液。另外，系统10包括一对器皿分配系统38，其被配置成固持和分配器皿16以供系统10使用。在例示性实施方案中，器皿分配系统38中的每一者均被配置成在给定时间固持多达五十个器皿。系统10也包括被配置成对机械臂20的抽吸夹22进行灭菌的灭菌装置40，和在由系统10使用之后容纳所丢弃器皿16的一对器皿废弃物容器42。

在使用中，可操作系统10以自动感染许多外植体12以用于转化。为此，系统10可将农杆菌溶液泵送至外植体12的器皿16中。系统10随后可操作机械臂24将外植体12的经农杆菌填充的器皿16置于震荡器台34上持续预定时长(例如三十分钟)以确保外植体12得到适当感染。在外植体12处于震荡器台34的同时，系统10可操作机械臂24将含有培养基(诸如琼脂)的器皿16分配在转移台30上的预定位置处。在震荡器台34处已过去预定时长之后，系统10可操作机械臂24将经感染的外植体12的经农杆菌填充的器皿16移动至成像台32上。可在成像台32处捕获经农杆菌填充的器皿16的一个或多个图像以确定器皿16上外植体12的定位。基于所捕获的图像，系统10可操作机械臂20从器皿16个别地抓取外植体12且将外植体12中的每一者移动至培养基器皿16内的预定定位处。在已用预定数量的经感染的外植体12填充培养基器皿16之后，系统10可操作机械臂24将经填充的培养基器皿16中的每一者移动至相应传递台28中，在其中系统10的用户可取回那些培养基器皿16。系统10可操作机械臂24将经农杆菌填充的器皿16移动至泵送系统36中以用于抽取农杆菌溶液且将空器皿16丢弃在器皿废弃物容器42中。下文关于图4至图30更详细地描述这些处理步骤和系统10的各种部件中的每一者。

现参考图4至图5，更详细显示机械臂24中的一者包括爪夹26的部分。在例示性实施方案中，机械臂24中的每一者均包括夹具组件44，其被配置成抓取和固持器皿16或器皿16的一部分(例如器皿16的底部或器皿16的盖子)。在例示性实施方案中，夹具组件44包括主体46，该主体附接至每一臂24的远侧区段48。爪夹26紧固至主体46的远侧区段50。

夹具组件44的例示性爪夹26包括三个指状物52，其被配置成从沿着夹具组件44限定的纵向轴线54径向向内和向外移动，以使得爪夹26或更具体地讲指状物52可前进到与和不与器皿16接触。在例示性实施方案中，爪夹26的指状物52均匀间隔开以使得指状物52中的每一者绕纵向轴线54与其他指状物52中的每一者间隔开大约120度。

如图所示，指状物52中的每一者均从夹具组件44的主体46的远侧区段50向远侧延伸。此外，指状物52中的每一者均包括在相应指状物52的远侧末端58中限定的孔隙56。此外，接触螺杆64在相对于纵向轴线54径向的方向上延伸穿过指状物52的远侧末端58且被配置成接触器皿16来抓取该器皿16。应当了解，本文中使用的器皿16中的每一者均可体现为培养皿或任何其他器皿，该器皿包括底部60和盖子62，该盖子搁置于底部60顶部且当盖子62紧固至底部60时与底部重叠。

如图4中所示，夹具组件44被配置成通过移动爪夹26的指状物52与器皿16接触来抓取和固持器皿16。当器皿16由爪夹26抓取时，盖子62(如果尚未移除)被配置成搁置在孔隙56中，且接触螺杆64被配置成接触底部60。此外，机械臂24可操作夹具组件44以通过将指状物52移动至刚好未接触器皿16的底部60的位置而移除器皿16的盖子62，随后在沿着纵向轴线54远离底部60的方向上移动夹具组件44。

在例示性实施方案中，机械臂24包括压缩空气源66(例如压缩空气泵)，其被配置成调控向夹具组件44和爪夹26供应的压缩空气的压力。在例示性实施方案中，当抓取器皿16时，压缩空气源66被配置成供应足以牢固地固持器皿16而不压碎器皿16(其可能易碎)的压力。在例示性实施方案中，夹具组件44的主体46体现为三指32mm内径夹持器(部件号为mhsl3-32d的d-y59az型定位夹持器)，其可从smcpneumatics商购获得。

现参考图6，系统10的机械臂20包括夹具组件80，该夹具组件被配置成抓取且固持外植体12。在例示性实施方案中，夹具组件80包括主体82，该主体附接至机械臂20的远侧区段84。夹具组件80也包括悬挂机构86，该悬挂机构将主体82连接至抽吸夹22。主体82具有紧固至远侧区段84的近侧圆盘88和从近侧圆盘88延伸至远侧圆盘92的多个支柱90。

悬挂机构86从紧固至圆盘92的近侧末端94延伸至远侧末端96。如图13中所示，夹具22紧固至悬挂机构86的远侧末端96。悬挂机构86被配置成允许夹具22如由箭头98、100所指示发生一些轴向移动，使得可使夹具22前进到与外植体12接触而不压碎外植体。在例示性实施方案中，悬挂机构86包括偏置元件，比如螺旋弹簧102，该偏置部件使夹具22在由箭头100所指示的方向上向外偏置。

组件80的夹具22被配置成抓取且固持外植体12。在例示性实施方案中，夹具22包括圆柱形主体104，该圆柱形主体紧固至悬挂机构86的远侧末端96。主体104由可从dupont公司商购获得的比如氟化橡胶的弹性体材料形成。应当了解，在其他实施方案中，可使用其他弹性体材料。主体104包括波纹管，该波纹管为主体104提供有限的挠性。主体104也具有某一高温度额定值，以允许对夹具22灭菌。在例示性实施方案中，温度额定值为446华氏度。应当了解，在其他实施方案中，可使用其他弹性体材料。

夹具组件80被配置成经由真空抓取且固持外植体12。为此，夹具22包括中空通道106，该中空通道沿轴线108纵向延伸穿过主体104。通道106连接至限定于夹具组件80的悬挂机构86和主体82中的通道110以及负压源112。负压源112例示性地体现为泵，且电气地耦合至控制器500。控制器500可操作源112以经由通道106、110抽吸真空且将外植体12紧固至夹具22。在例示性实施方案中，夹具22具有小于外植体12的平均长度的百分之五十的半径，该平均长度可取决于例如外植体12的特定物种而不同。

现参考图7至图10，泵送系统36包括多个泵150，其中的每一者被配置成将含有根癌农杆菌或发根农杆菌的农杆菌溶液传递至器皿16或从器皿16抽取农杆菌溶液(例如在器皿16中的外植体12感染之后)。如图所示，在例示性实施方案中，泵送系统36包括八个泵150，其中六个泵150用于传递农杆菌溶液(即流出泵)，且两个泵150用于虹吸/移除农杆菌溶液(即流入泵)。在一些实施方案中，泵150可经布线以仅在一个方向上旋转，其防止用于虹吸的泵150无意中逆向运行且将经过使用的农杆菌溶液洒至平台18上。在例示性实施方案中，泵送管154将泵150连接至储存农杆菌的溶液容器152，其中一些可用于储存未使用的农杆菌且其余部分可用于储存经过使用的农杆菌。具体地讲，在使用中，特定泵150从溶液容器152中的一者抽取未使用的农杆菌且将所抽取的溶液递送至器皿16。在使用之后，另一个泵150可从器皿16抽取经过使用的农杆菌溶液且将经过使用的溶液分配在溶液容器152的另一者中。在一些实施方案中，泵150中的每一者可体现为蠕动泵(例如可从welco,co.,ltd.商购获得的蠕动泵)。此外，泵送管154可体现为3/16英寸的bpt蠕动泵管，其可从thermofisherscientific,inc.商购获得。

例示性泵送系统36包括流体传递台160，在该流体传递台处，泵送系统36被配置成将流体泵送至容器(例如种子外植体12的器皿16)中；和流体抽取台162，在该流体抽取台处，泵送系统36被配置成从容器(例如经过使用的农杆菌溶液的器皿16)抽取流体。在例示性实施方案中，泵送系统36包括用于机械臂24中的每一者的单独的流体传递台160和用于臂24中的每一者的单独的流体抽取台162(例如，位于泵送系统36的相对末端处)。

如图8至图9中所示，流体传递台160包括管固持器164，其被配置成紧固泵送管154的末端166以在将流体泵送至器皿16中时控制流体从泵送系统36的流动方向。应当了解，泵送管154从其在管固持器164处的末端166延伸至相应泵150。在例示性实施方案中，管固持器164包括底部168和一般从底部168垂直延伸的管区段170。管固持器164的底部168包括其中所限定的多个孔隙172，这些孔隙限定穿过底部168的通道。如图所示，泵送系统36的流体传递台160包括在水平方向上从流体传递台160的底部176向外延伸的水平板174。流体传递台160也包括相应的多个支柱175，其从水平板174垂直朝上延伸且被配置成容纳在底部168的多个孔隙172中。在例示性实施方案中，流体传递台160包括一组三个孔隙172和相应的一组三个支柱175；然而，在其他实施方案中，流体传递台160可包括不同数量的支柱175和/或孔隙172。

管固持器164的管区段170包括其中限定的多个凹槽178，其从底部168垂直延伸且经设计以紧固泵送管154。也就是说，在例示性实施方案中，流体传递所用的泵送管154的每一件被配置成穿过由相应凹槽178限定的通道且牢固地维持在该通道内。此外，在例示性实施方案中，流体传递台160包括滴盘180(例如空器皿16)，其定位在管固持器164下方且被配置成容纳任何无意中从管固持器164处的泵送管154的末端166滴落的流体。如图9中所示，在使用中，机械臂24控制爪夹26紧固器皿16且将该器皿16移动至泵送管154的末端166下方的位置处。在器皿16得到适当定位之后，泵送系统36可操作相应泵150以将流体(例如农杆菌溶液)传递至器皿16中。

如图10中所示，流体抽取台162包括抽取管182，其从流体抽取台162的底部184延伸且被配置成从容器(例如器皿16)抽取流体。抽取管182包括第一笔直区段186，其在第一末端188处耦合至泵送管154，该泵送管延伸至用于弃置由流体抽取台162抽取的流体的溶液容器152中。抽取管182也包括第二笔直区段190，其通过弯曲区段194连接至第一笔直区段186的第二末端192。在例示性实施方案中，弯曲区段194体现为90度互连以使得第一笔直区段186和第二笔直区段190彼此大致垂直。在例示性实施方案中，抽取管182体现为在于管末端中限定的小孔隙处具有90度弯曲(以防止抽吸器皿16)的中空1/4英寸不锈钢管的6英寸区段。然而，在其他实施方案中，抽取管182可以其他方式加以构造。在使用中，机械臂24可控制爪夹26紧固器皿16且将该器皿16移动至抽取管182的远侧末端196定位在器皿16的仓198内的位置。应当了解，器皿16中的每一者包括容纳外植体12和/或农杆菌溶液的仓198。在一些实施方案中，器皿16可体现为培养皿。在操作中，移动器皿16以使得抽取管182插入仓198中，机械臂24可使器皿16朝向抽取管182倾斜以便迫使流体朝向抽取管182的末端196。泵送系统36可操作相应泵150以从器皿16抽取流体(例如农杆菌溶液)。

如上文所论述，例示性系统10包括一对震荡器台34，其可操作以搅动或震荡含有根癌农杆菌溶液的器皿16内的外植体12。具体地讲，在例示性实施方案中，震荡器台34中的一者可由机械臂24中的一者达到，且另一个震荡器台34可由另一个机械臂24达到(参见图3)。如图11中所示，例示性震荡器台34包括驱动载台200和耦合至驱动载台200的震荡器板202。在例示性实施方案中，驱动载台200被配置成使震荡器板202在由震荡器板202限定的平面内移动以便搅动定位在震荡器板202上的器皿16的内容物。具体地讲，在例示性实施方案中，震荡器台34震荡多达四个外植体12于农杆菌溶液中的器皿16持续30分钟。在其他实施方案中，外植体12可暴露于农杆菌溶液中和/或与农杆菌溶液混合持续不同的时间段。

应当了解，例示性驱动载台200包括电连接至下文所描述的控制器的电动机(未示出)，且可操作以按旋转、侧向和/或在由震荡器板202限定的平面内的其他类型的运动方式移动震荡器板202。在一些实施方案中，震荡器台34可包括可从zabertechnologies,inc.商购获得的t-lsm025b型驱动载台或可从thermofisherscientific,inc.商购获得的variomagteleshake单元。此外，取决于特定实施方案，震荡器板202可由铝、plexiglas、teflon和/或另一种适合的材料构造。

如上所述，例示性系统10包括一对器皿分配系统38，其被配置成固持和分配由系统10使用的器皿16。具体地讲，在例示性实施方案中，器皿分配系统38可分配填充有培养基(例如琼脂)的器皿16。现参考图12至图19，显示器皿分配系统38中的一者及其操作。如图12中所示，器皿分配系统38包括外壳300和细长主体302，该细长主体紧固至外壳300且从外壳朝上延伸。细长主体302包括紧固至外壳300的弯曲底板304和多个支柱306，这些支柱中的每一者在支柱306的近侧末端308处紧固至弯曲底板304且从弯曲底板304朝上延伸至远侧末端310。支柱306由弯曲板312在远侧末端310处紧固，且由另一个弯曲板314在位于支柱306的近侧末端308与远侧末端310之间的某点处紧固。因而，在例示性实施方案中，器皿分配系统38包括在三个点处紧固的三个支柱306以便防止支柱306移动或翘曲。在其他实施方案中，器皿分配系统38可包括不同数量的支柱306和/或支撑点。

在例示性实施方案中，细长主体302的支柱306和弯曲板304、312、314限定以纵向轴线318为中心的通道316，其从远侧末端310延伸进入外壳300中(参见图14至图19)。一组器皿16可被叠堆在通道316内以使得纵向轴线318大致穿过这些器皿16中的每一者的中心。

如图14至图19中所示，多个气动装置包括于器皿分配系统38的外壳300内且被配置成移动器皿分配系统38的各种部件以便从器皿16的叠堆取回器皿16且使器皿16远离外壳300延伸，以使得相应机械臂24可取回用于系统10中的器皿16。例如，如图13中所示，在操作中，气动装置340(参见图16)被配置成将固持器皿16的板延伸器320从外壳300内经由外壳300中所限定的通道322移动至外壳300外侧的位置。应当了解，器皿分配系统38的一个或多个部件可从图14至图19中省略以强调其他部件和/或出于明晰的目的。

现参考图14至图19，在器皿分配系统38的各个操作阶段，在无外壳300的情况下显示外壳300内侧的器皿分配系统38的部件。如图14中所示，在操作中，气动装置324被配置成操作一对夹具臂326以紧固和/或松开器皿16的叠堆的器皿16。在例示性实施方案中，夹具臂326彼此平行，且夹具臂326中的每一者具有区段328，该区段中所限定的负轮廓(未示出)对应于具有盖子62的器皿16的正轮廓。在例示性实施方案中，器皿16的盖子62被配置成搁置在器皿16中所限定负台面的凸耳(未示出)上。因而，夹具臂326可在不压碎器皿16的情况下对其进行紧固。

如图15中所示，在操作中，气动装置324闭合夹具臂326以紧固叠堆底部第二个器皿16，且气动装置330沿着纵向轴线318在由箭头332所指示的方向上抬起所夹持的器皿16和叠堆在所夹持的器皿16上的其他器皿16。于是，器皿分配系统38使底部器皿16与器皿16的叠堆分开。底部器皿16通过器皿提升器334固持在适当位置，该器皿提升器可通过气动装置336沿着纵向轴线318移动。如图16中所示，气动装置340可操作以在如由箭头342所指示的垂直于纵向轴线318的方向上移动板延伸器320和由器皿提升器334支撑的底部器皿16。板延伸器320被配置成使器皿16经由通道322移动至外壳300外侧的位置，以使得机械臂24可抓取器皿16。如下文所描述，机械臂24从板延伸器320(参见图17)抓取器皿16且将器皿16移动至相应转移台30。气动装置340通过在由箭头344所指示的方向上移动板延伸器来使板延伸器320缩回至其定位于器皿16的叠堆与器皿提升器334之间的位置。

如图18中所示，在操作中，在已从板延伸器320移除器皿16且已使板延伸器320缩回之后，气动装置336升高器皿提升器334。具体地讲，气动装置336将器皿提升器334沿着纵向轴线318在由箭头332指示的方向上移动，直至器皿提升器334与由夹具臂326固持的器皿16叠堆的底部器皿16接触(或接近与其接触)为止。以此方式，将器皿提升器334移动至使得其可支撑器皿16叠堆的重量的位置中。如图19中所示，气动装置330、324彼此结合操作以沿着纵向轴线318在由箭头346指示的方向上降低器皿16的叠堆。在降低器皿16的叠堆之后，气动装置330可打开夹具臂326以松开底部器皿16。应当了解，参考图14至图19所描述的程序可在每次器皿分配系统38将培养基的器皿16提供给相应机械臂24时进行重复。

如上所述，系统10包括一对传递台28。在例示性实施方案中，传递台28中的每一者被配置成服务于多个目的。具体地讲，系统10的用户/操作者可将外植体12的器皿16置于传递台28中的每一者的台面360上以由系统10使用。在系统10的操作已开始之后，控制器500操作相应机械臂24抓取外植体12的器皿16且将器皿16移动至泵送系统36以如下文所述用农杆菌溶液进行填充(参见图24至图28)。在外植体12已被农杆菌(即，处于相应震荡器台34处)感染且置于供生长的培养基器皿16上之后，机械臂24将培养基器皿16移动返回至相应传递台28以由用户/操作者接近。

如图20中所示，传递台28包括两个传感器362、364。在例示性实施方案中，传感器362、364体现为可从keyencecorp.商购获得的lv-nh32型可调节光斑传感器，其为反射型传感器，其中来自传感器内侧的激光的光束发射且在有某物处于该光束路径内的情况下反射回传感器，从而有效地感测器皿16的存在。传感器362被配置成感测定位在台面360上的第一器皿16或底部器皿16的存在，而传感器364被配置成感测叠堆在第一器皿16顶部的第二器皿16的存在，其指示器皿16的叠堆。因而，控制器500可利用传感器362、364的传感器数据来确定传递台28的状态(例如，无器皿16存在，存在一个器皿16，或存在多个器皿16)。此外，该状态可通过控制器500传输给用户和/或由系统10使用(例如，用以确认外植体12何时可供机械臂24拾取)。尽管例示性传递台28包括两个可调节光斑传感器，但应当了解，其他实施方案可使用不同数量和/或类型的传感器。例如，在一些实施方案中，传感器362、364可体现为光学传感器、感光器、压力传感器、图像传感器、运动传感器、惯性传感器、压电传感器和/或适于进行本文所描述的功能的任何其他类型的传感器。

现参考图21，系统10包括灭菌装置40，其被配置成对机械臂20的抽吸夹22进行灭菌。为此，控制器500操作机械臂20将抽吸夹22插入至填充有乙醇或另一种适合的灭菌溶液的容器370(参见图2至图3)中。在例示性实施方案中，溶液含有70％乙醇。可操作机械臂20将夹具22在乙醇内向上和向下和侧向移动持续一定时间段，随后如图21中所示，使夹具22前进至灭菌装置40的开口372中。在例示性实施方案中，灭菌装置40为干热玻璃珠灭菌器，比如inotechbiosciencesteri250。在例示性实施方案中，机械臂20可再次经操作以使夹具22在灭菌器40内上下移动几秒。机械臂20可随后从灭菌器40缩回夹具22以允许夹具22冷却。归因于由灭菌器40产生的热，夹具22的波纹管可能变得卡在一起以使得夹具22的性能可能被削弱。在那些情况下，机械臂20可执行分开波纹管的程序(例如通过抽吸无菌表面和拉伸波纹管)。

如上所述，转移台30用于将被农杆菌溶液感染的外植体12转移至包括培养基(例如琼脂)的器皿16中。现参考图22，显示转移台30中的一者的一部分。如上所述，转移台30包括被配置成捕获外植体12的器皿16的图像的成像台32，这些图像由控制器500进行分析以确定器皿16上外植体12的定位。应当了解，机械臂20可基于特定外植体12在器皿16上的确定定位来对其进行抓取。在例示性实施方案中，转移台30包括透明台面380，其上可置放多个器皿16。例如，透明的台面380可由plexiglas、丙烯酸、玻璃和/或另一种适合的透明材料构成。在其他实施方案中，台面380在台面380的一个或多个部分中(例如成像台32外侧)可为不透明或半透明的。

成像台32包括光源382，其定位在透明台面380下方且被配置成照亮透明台面380中对应于成像台32的部分，以便照亮置于成像台32上的器皿16内的外植体12。光源382例示性地体现为红发光二极管(led)。应当了解，在其他实施方案中，可使用其他颜色的led。在另外其他实施方案中，可使用其他光源。

系统10包括相机384，其从提升器安装在成像台32上方(参见图3)。相机384可操作以捕获成像台32处的器皿16的内容物的图像。在例示性实施方案中，相机384被配置成捕获黑白图像；然而，在其他实施方案中，相机384可被配置成捕获有色、灰度和/或其他类型的图像。应当了解，通过适当地设定相机384的光圈，可消除所捕获图像中所有或接近所有透明对象(例如器皿16)的痕迹。此外，使用黑白相机，从光源382发射的红光在所捕获的图像中呈现亮白色，且固体对象(例如种子外植体12)呈现黑色。相机384电气地耦合至电子控制器500(参见图23)。如下文更详细地描述，图像可被发送至控制器500以确定外植体12在器皿16中的相对定位和取向，使得系统10可将机械臂20导向至供取回的外植体12。

现参考图23，系统10包括电子控制器500。控制器500实质上为主计算机，该主计算机负责解译由与系统10相关联的传感器发送的电气信号且负责启动或激励与系统10相关联的电控部件。例如，电子控制器500被配置成控制传感器362、364，气动装置324、330、336、340，泵150，驱动载台210，相机384等等的操作。虽然电子控制器500在图23中显示为单个单元，但控制器500可包括用于各种组件的许多单独的控制器以及发送信号且从各种单独控制器接收信号的中央计算机。电子控制器500还确定应何时执行系统10的各种操作。如下文将更详细地描述，电子控制器500可操作以控制系统10的部件，使得系统10选择且处理大豆外植体12以在转基因方案中使用。

为此，电子控制器500包括通常与在机电系统的控制下利用的电子单元相关联的许多电子部件。例如，除通常包括于此类装置中的其他部件之外，电子控制器500可包括诸如微处理器502的处理器和诸如可编程只读存储器装置(“prom”)的存储器装置504，可编程只读存储器装置包括可擦除prom(eprom或eeprom)。除其他事物以外，提供存储器装置504以存储呈例如一个软件例程(或多个例程)形式的指令，该指令在由微处理器502执行时允许电子控制器500控制系统10的操作。

电子控制器500也包括模拟接口电路506。模拟接口电路506将来自各种部件的输出信号转换成适于呈现至微处理器502的输入的信号。具体地讲，模拟接口电路506通过使用模拟-数字(a/d)转换器(未示出)等将由传感器产生的模拟信号转换成数字信号以供微处理器502使用。应当了解，a/d转换器可体现为离散装置或许多装置，或可整合到微处理器502中。也应当了解，如果与系统10相关联的传感器中的任何一个或多个产生数字输出信号，则可绕过(bypass)模拟接口电路506。

类似地，模拟接口电路506将来自微处理器502的信号转换成合于呈现至与系统10相关联的电气控制部件(例如，机械臂14)的输出信号。具体地讲，模拟接口电路506通过使用数字-模拟(d/a)转换器等将由微处理器502产生的数字信号转换成模拟信号以供与系统10相关联的电子控制部件使用。应当了解，类似于上述a/d转换器，d/a转换器可体现为离散装置或许多装置，或可整合至微处理器502中。也应当了解，如果与系统10相关联的电子控制部件中的任何一个或多个对数字输入信号进行操作，则可绕过模拟接口电路506。

因此，电子控制器500可操作以控制系统10的操作。具体地讲，电子控制器500执行包括控制方案之类的例程，在该控制方案中，电子控制器500监视与系统10相关联的传感器的输出且控制向系统10的电子控制部件的输入。为此，电子控制器500连续地或间歇地进行许多计算，包括查找预先编程的表格中的值，以便执行算法以进行诸如以下的功能：对机械臂14供能，对泵150供能，改变光源382的光强度以改善图像对比度等等。在一些实施方案中，控制器500也可包括接收来自系统10用户的输入的用户输入装置508和/或向用户提供输出的用户输出装置510。用户输入装置508可体现为任何集成或周边装置，诸如键盘、鼠标、触摸屏和/或被配置成执行本文所描述的功能的其他输入装置。类似地，用户输出装置510可体现为任何集成或周边装置，诸如显示器、麦克风和/或被配置成执行本文所描述的功能的其他输出装置。

现参考图24至图25，显示用于自动化的外植体制备的例示性操作程序1000。将了解，在程序1000开始之前，控制器500可校准系统10，将消息提供给用户，检索用户输入，初始化安全机构(例如，光幕)，和执行其他设置功能。例如，如果尚未进行，则控制器500可使用任何适合的方案校准系统10以将机械臂20的坐标系统映射到相机384的坐标系统或以其他方式使其相关联，以使得图像中所捕获对象的定位可转换成该对象相对于臂20的定位。此外，控制器500可校准系统10以使机械臂20、24的坐标系统与系统10的各个预先限定的定位(例如，转移台30、震荡器台34、传递台28、泵送系统36、器皿分配系统38等上的具体点)相关联，以确保机械臂20、24在适当定位中取回和放下相关外植体12和/或器皿16。另外，在一些实施方案中，控制器500可在显示器或其他用户输出装置510上向用户提供设置说明(例如，将外植体12的器皿16置于传递台28上)和/或经由用户输入装置508取回来自用户的输入(例如，以暂停系统10)。

在方框1002中，系统10确定操作者是否已将外植体12的器皿16置于传递台28上。如上文所论述，在一些实施方案中，系统10基于由传感器362、364产生的传感器数据来进行此类确定。出于描述清晰的目的，本文相对于系统10或平台18的一个“侧面”(例如一个机械臂24)描述程序1000；然而，应当了解，程序1000可由系统10的两侧并行进行。如果已将外植体器皿16置于传递台28上，则程序1000前进至方框1004，其中控制器500操作机械臂24抓取外植体器皿16且将该外植体器皿16从传递台28移动至泵送系统36。具体地讲，如上所述，机械臂24将外植体器皿16移动至流体传递台160。

程序1000前进至方框1006，其中控制器500操作泵150中的一者以用根癌农杆菌溶液填充外植体器皿16。在一些实施方案中，应当了解，用户可能需要在特定实验中利用多种不同类型的溶液。在此类实施方案中，泵送系统36的泵150可被配置成抽取不同的溶液，且控制器500可控制泵送系统36以确保在给定的时间将适当的溶液传递至器皿16。在方框1008中，控制器500操作机械臂24将经填充的外植体器皿16移动至相应震荡器台34的预先限定的定位上。在例示性实施方案中，震荡器台34在震荡器板202上具有四个预先限定的定位，在这些定位处可置放器皿16以使得震荡器台34可处理(即搅动)四个外植体器皿16。如上所述，机械臂24可在初始化期间进行校准以存储与那些定位相关联的数据(即，“记住”定位)。

在方框1010中，震荡器台34被配置成搅动/震荡外植体12的器皿16以便用根癌农杆菌溶液感染外植体12。在一些实施方案中，控制器500可利用定时器追踪震荡器台34处理特定器皿16的处理时间。在震荡器台34处理外植体12的器皿16的同时，控制器500操作机械臂24将培养基(例如琼脂)器皿16从器皿分配系统38移动至转移台30处的预定位置处。在例示性实施方案中，控制器500指示机械臂24将五个培养基器皿16移动至如图3中所示的转移台30上的五个分开的预定/校准位置处。

在例示性实施方案中，如图26中所示，程序1100可用于将培养基器皿16移动至转移台30。程序1100始于方框1102，其中控制器500操作机械臂24从器皿分配系统38(即，从板延伸器320)抓取培养基器皿16且将该器皿16移动至成像台32。程序1100前进至方框1104，其中控制器500操作机械臂24抓取培养基器皿16的盖子62且从器皿16移除盖子62。在方框1106中，控制器500操作机械臂24将器皿16的盖子62移动至转移台30处的预定位置处(例如上文所描述的五个预定位置中的一者)。在方框1108中，控制器500操作机械臂24抓取成像台32处的打开的培养基器皿16(即，器皿16的底部60)且将其移动至转移台30上相应盖子62所处的位置处。换句话讲，如图22中所示，机械臂24将器皿16的底部60置于相应盖子62的顶部上。

程序1100前进至方框1110，其中控制器500确定是否移动另一个培养基器皿16。如上所述，在例示性实施方案中，控制器500被编程以将五个培养基器皿16从器皿分配系统38移动至转移台30上预先限定的位置处。因此，在例示性实施方案中，控制器500确定其是否已将五个培养基器皿16移动至转移台30上。如果如此，程序1110终止。否则，程序1110返回至方框1102，其中控制器500指示机械臂24抓取另一个培养基器皿16。尽管例示性实施方案描述使用五个培养基器皿16，但在其他实施方案中，系统10可利用与本文所描述的技术相符的任何适合数量的培养基器皿16。

返回至图24，在控制器500将适当数量的培养基器皿16移动至转移台30上之后。如图26中所示，程序1000前进至方框1014，其中控制器500确定外植体器皿16是否已由震荡器台34处理至足以用根癌农杆菌溶液充分感染外植体12。例如，在例示性实施方案中，控制器500利用定时器以确认特定外植体器皿16已由震荡器台34搅动持续了预定的阈值感染时间(例如30分钟)。然而，在其他实施方案中，应当了解，系统10可利用任何其他适合的条件和/或技术来确定外植体12是否已被感染。

如果已达到所需感染时间(或满足其他感染条件)，则程序1000前进至图25的方框1016，其中控制器500从震荡器台34选择外植体器皿16(例如，感染定时器到期的外植体器皿16)，且操作机械臂24抓取外植体器皿16并将其移动到成像台32。程序1000前进至方框1018，其中控制器500操作机械臂20将经感染的外植体12从成像台32处的外植体器皿16移动至培养基器皿16上的预定位置处。为此，可使用例示性操作程序1200，如图27中所示。

现参考图27，程序1200始于方框1202，其中控制器500操作相机384捕获成像台32处器皿16中经感染的外植体12的图像。一个这样的图像600显示于图30中。如图30中所示，外植体12可在器皿16内相对于彼此以任意定位和取向定位。在方框1204中，控制器500可处理所捕获图像600以识别器皿16上的经感染的外植体12的定位。在一些实施方案中，控制器500被配置成确定所有可识别的外植体12的定位，而在其他实施方案中，控制器被配置成仅识别单个外植体12。

应当了解，控制器500可利用任何适合的图像处理技术来确定外植体的定位。例如，在例示性实施方案中，控制器500将图像转化成二元图像(即黑色和白色)，且利用epsonc3型六轴铰接臂中所包括的软件包的几何对象识别功能。具体地讲，将由用户加载且存储在控制器500的存储器装置504中的外植体12的参考图像604(参见图29)与外植体12的所捕获图像600进行比较以识别匹配606。几何对象识别功能通过使用基于边缘的几何特征来使用识别与参考图像(即，对象模型)的匹配的算法。此外，几何对象识别功能包括各种参数，诸如用于与另一图像进行比较的参考图像，匹配606所需的接受度或宽容度，匹配606的最小或最大对象大小和/或其他合适的参数。

如果控制器500不能定位与其他外植体12分离的个别外植体12但定位外植体12的群610(例如重叠的外植体12)，则控制器500执行分离重叠的外植体12的群610的方案。例如，在例示性实施方案中，控制器500可使用适合的成像算法来识别群610的几何中心(例如，通过检测该群的质量中心)，且指示机械臂20将抽吸夹22插入器皿16的仓198中(例如插入农杆菌溶液中)且搅拌或搅动外植体12的群610以便使其分散。在其他实施方案中，控制器500可指示机械臂20抓取和放下群610中的外植体12中的一者以便使其分离。在另外其他实施方案中，控制器500可将抽吸夹22移动至仓198中群610的位置处，且逆向操作负压源112(如果在特定系统10的情况下可能的话)以将压缩空气排出至仓198中来分离外植体12。

应当了解，在其他实施方案中，系统10可利用任何其他适合的机制来分离外植体12的群610。此外，控制器500可利用任何适合的图像处理算法和技术来识别器皿16中的外植体12的定位。例如，控制器500可利用诸如加速稳健特征(speededuprobustfeature；surf)、尺度不变特征转换(scale-invariantfeaturetransform；sift)、多尺度定向修补(multi-scaleorientedpatch；mops)、canny、图像梯度运算符(imagegradientoperator)和sobel滤波器的特征检测算法、技术和滤波器，以识别图像600和外植体参考图像604的特征(例如，兴趣点诸如拐角、边缘、斑点等)。在一些实施方案中，控制器500可利用诸如随机样本一致性(ransac)算法的特征匹配算法以确定在图像600和外植体参考图像604中识别的任何特征是否彼此对应，且如果如此，则确定这些特征的对应定位。另外或替代地，控制器500可利用图像分割算法(例如，金字塔分割、分水岭算法等)来识别图像中的对象。将了解，取决于特定实施方案，控制器500可在所捕获图像的分析期间利用上述算法中的任何一者或多者。

在控制器500确定外植体16的定位之后，程序1200前进至方框1206。在方框1206中，控制器500识别和选择(例如任意或以演算方式)经感染的外植体12以移动至如上文所描述的转移台30上的培养基器皿16中。在方框1208中，控制器500选择移动所选外植体12所朝向的培养基器皿16。更具体地讲，在方框1210中，控制器500确定培养基器皿16上的置放所选外植体12的预定定位。

在例示性实施方案中，由系统10的用户/操作者提供的外植体12的原始器皿16(参见图24的方框1002)容纳大约三十个种子外植体，且控制器500被配置成在五个培养基器皿16中的每一者上的预定定位中置放六个外植体12。例如，控制器500可被配置成将外植体12以彼此距离相等的圆形(例如，相隔大约60度)置放在培养基器皿16上。因此，在例示性实施方案中，控制器500基于先前已置放外植体12的定位来选择培养基器皿16和要将外植体12置放在培养基器皿16上的定位。在例示性实施方案中，控制器500在存储器504中存储先前的定位(即，外植体12目前置放的定位)以便防止多个外植体12被置放在相同定位处。然而，在其他实施方案中，系统10可利用例如相机和图像处理技术来进行此类确定。

程序1200前进至方框1212，其中控制器500操作机械臂20从成像台32处的器皿16夹持所选的外植体12。应当了解，为了从器皿16抓取外植体12，将夹具组件80定位于外植体12的夹持定位/点(例如外植体12的中心)上方以使得夹具组件80的中空通道106与夹持定位大致共线。夹具组件80随后朝向外植体12向下前进，直至抽吸夹22处于与外植体12的外表面完全接触的状态为止。如上所述，悬挂机构86操作以防止外植体12被压碎，同时确保夹具22处于与外植体12的表面完全接触的状态，以提供有限的吸力损失。随后可启动负压源112以将外植体紧固至夹具22。

在方框1214中，控制器500操作机械臂20将所夹持的外植体12移动至所选培养基器皿16和器皿16上的确定位置处。在方框1216中，控制器500确定培养基器皿16中的每一者是否已满。如果如此，程序1200终止。否则，程序1200返回至方框1202，其中控制器500指示相机384捕获成像台32处的器皿16的另一个图像。在一些实施方案中，程序1200可利用由相机384捕获的原始图像600(由图27中的虚线箭头标示)。如上所述，在例示性实施方案中，如果在器皿16上具有六个外植体12，则将培养基器皿16视为“满的”。在其他实施方案中，控制器500可另外地或替代性地使用其他标准来进行此类确定。例如，在一些实施方案中，控制器500可确定在成像台32处的器皿16上是否残余有任何外植体12；如果无残余，则程序1200可终止。

在一些实施方案中，系统10可被配置成在各个培养基器皿16上使预定数量(n)的外植体12均匀间隔开，以使得外植体12在培养基器皿16上以大约360/n度彼此间隔开。此外，在一些实施方案中，置放在特定培养基器皿16上的外植体12的预定数量(n)可由系统10的操作者选择。例如，在其中操作者选择或系统10以其他方式确定将六个外植体12置于各个培养基器皿16上的实施方案中，那六个外植体12将在相应培养基器皿16上彼此间隔开大约60度(360/60＝60)。在系统10确定将四个外植体12置于各个培养基器皿16上的实施方案中，那四个外植体12将在相应培养基器皿16上彼此间隔开大约90度(360/4＝90)。在此类实施方案中，如果所有n个外植体12均被置于(例如均匀地)培养基器皿16上，则该培养基器皿16可被视为“满的”。

返回至图25，在已将经感染的外植体12移动至培养基器皿16中之后，程序1000前进至方框1020。在方框1020中，控制器500指示机械臂24抓取和移动成像台32处的器皿16，从该器皿将经感染的外植体12移动至泵送系统36或更具体地讲，移动至流体抽取台162。如上所述，机械臂24将器皿16移动至使得抽取管182的远侧末端196定位在器皿16的仓198内的位置中。在方框1022中，控制器500操作适当的泵150以将农杆菌溶液从器皿16抽取/泵送至相应溶液容器152(用于使用过的溶液)中。如上所述，控制器500可在抽取期间同时操作机械臂24朝向抽取管182倾斜器皿16以便确保从器皿16移除所有或大部分农杆菌。

程序1000前进至方框1024，其中控制器500操作机械臂24将空器皿16移动至适当的器皿废弃物容器42中。机械臂24松开其夹具以将器皿16放入废弃物容器42中。应当了解，通过在弃置器皿16之前从器皿16移除农杆菌溶液，农杆菌在弃置期间洒出或喷溅的风险被降低或减到最少。在方框1026中，控制器500操作机械臂20对抽吸夹22进行灭菌。为此，控制器500可使用与上文参考图21所描述的程序类似的程序。

在方框1028中，控制器500操作机械臂24将具有经感染的外植体12的“满的”培养基器皿16移动至传递台28上。如上所述，培养基器皿16可叠堆在传递台28上以由系统10的用户/操作者取回。此外，控制器500在完成时可经由用户输出装置510通知用户/操作者培养基器皿16可供拾取。

在例示性实施方案中，如图28中所示，程序1300可用于将满的培养基器皿16移动至传递台28。程序1300始于方框1302，其中控制器500操作机械臂24选择(任意或以演算方式)具有经感染的外植体12的满的培养基器皿16之一且将其移动至成像台32。如上所述，在例示性实施方案中，培养基器皿16最初置于转移台30上以使得各个器皿16的底部60置于其盖子62的顶部。因此，在例示性实施方案中，控制器500更具体地操作机械臂24抓取培养基器皿16的底部60且将其移动至成像台32。

在方框1304中，机械臂24将盖子62紧固至被移动到成像台32的培养基器皿底部60上。也就是说，控制器500操作机械臂24从转移台30抓取所选培养基器皿16的盖子62，且将盖子62移动到成像台32处培养基器皿16的底部60上。在方框1306中，控制器500操作机械臂24将具有经感染的外植体12的经紧固的培养基器皿16移动到传递台28。如上文所论述，如果另一个培养基器皿16已被置于传递台28上，则机械臂24叠堆器皿16。

程序1300前进至方框1308，其中控制器500确定是否移动另一个满的培养基器皿16。换句话讲，控制器500确定任何培养基器皿16是否保留在转移台30上。如果未保留，则程序1300终止。否则，程序1300返回至方框1302以重复程序1300且将另一个满的培养基器皿16移动至传递台28上。在例示性实施方案中，因为系统10将经感染的外植体12移动至转移台30上的五个培养皿16中，所以应当了解，系统10在将经感染的外植体12适当地定位于培养皿上之后，将这五个培养皿16叠堆在传递台28上。

农杆菌培养是用于将表达载体引入植物中的广泛利用的方法，该方法基于农杆菌的自然转化系统。horsch等人,science227:1229(1985)。根癌农杆菌和发根农杆菌是已知可用来基因转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的ti质粒和ri质粒分别携带负责遗传转化植物的基因。kado,c.i.,crit.rev.plant.sci.10:1(1991)。用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述也是可用的，例如gruber等人,同上,miki等人,同上,moloney等人,plantcellreports8:238(1989)和美国专利第4,940,838号和第5,464,763号。

如果将农杆菌用于转化，则应将要插入的dna克隆为特殊质粒，即，克隆为中间载体或克隆为二元载体。中间载体无法在农杆菌中自我复制。中间载体可通过辅助质粒(缀合)转移至农杆菌中。thejapantobaccosuperbinarysystemisanexampleofsuchasystem(komari等人的综述(2006)见于：methodsinmolecularbiology(k.wang编)no.343:agrobacteriumprotocols(第2版第1卷)humanapressinc.,totowa,nj,第15-41页；和komori等人(2007)plantphysiol.145:1155-1160)。二元载体可在大肠杆菌和农杆菌两者中自我复制。这些二元载体包含由右t-dna边界区和左t-dna边界区构造的选择性标记基因和接头或多聚接头。这些二元载体可直接转化成农杆菌(holsters,1978)。用作宿主细胞的农杆菌将包括携带vir区的质粒。ti或ri质粒也包括t-dna的转移所必需的vir区。vir区为t-dna至植物细胞中的转移所必需的。可含有额外的t-dna。

当使用二元tdna载体(bevan(1984)nuc.acidres.12:8711-8721)或共培养程序(horsch等人(1985)science227:1229-1231)使细胞由细菌感染时，农杆菌宿主的毒性功能将指导含有构建体和相邻标记物的t链向植物细胞dna中的插入。通常，农杆菌转化系统用来工程改造双子叶植物(bevan等人(1982)ann.rev.genet16:357-384；rogers等人(1986)methodsenzymol.118:627-641)。农杆菌转化系统也可用来转化dna并且将dna转移至单子叶植物和植物细胞。参见美国专利第5,591,616号；hernalsteen等人(1984)emboj3:3039-3041；hooykass-vanslogteren等人(1984)nature311:763-764；grimsley等人(1987)nature325:1677-179；boulton等人(1989)plantmol.biol.12:31-40和gould等人(1991)plantphysiol.95:426-434。

包括一部分胚轴的分裂大豆种子通常可用含有适合的基因构建体的农杆菌(如根癌农杆菌或发根农杆菌)培养物接种约0.5至3.0小时，更通常接种约0.5小时，然后在适合的培养基上共培养长达约5天。推定地含有转基因的拷贝的外植体起源于包括一部分胚轴的转化分裂大豆种子的培养。这些外植体可经识别且分离以用于进一步的组织繁殖。

许多替代性技术可也用于将dna插入宿主植物细胞中。这些技术包括但不限于使用由作为转化剂的根癌农杆菌或发根农杆菌传递的t-dna进行转化。农杆菌技术的实例描述于例如以下文献中：美国专利第5,177,010号、美国专利第5,104,310号、欧洲专利申请第0131624b1号、欧洲专利申请第120516号、欧洲专利申请第159418b1号、欧洲专利申请第176112号、美国专利第5,149,645号、美国专利第5,469,976号、美国专利第5,464,763号、美国专利第4,940,838号、美国专利第4,693,976号、欧洲专利申请第116718号、欧洲专利申请第290799号、欧洲专利申请第320500号、欧洲专利申请第604662号、欧洲专利申请第627752号、欧洲专利申请第0267159号、欧洲专利申请第0292435号、美国专利第5,231,019号、美国专利第5,463,174号、美国专利第4,762,785号、美国专利第5,004,863号和美国专利第5,159,135号。含t-dna的载体对于植物细胞转化的用途已得到深入研究且充分地描述于欧洲专利申请120516；an等人(1985,emboj.4:277-284)、fraley等人(1986,crit.rev.plantsci.4:1-46)以及lee和gelvin(2008,plantphysiol.146:325-332)中，并在本领域中已非常明确。

植物转化的另一种已知方法为微粒介导的转化，其中dna携带于微粒的表面上。在此方法中，表达载体用基因枪引入植物组织中，该基因枪使微粒加速至足以穿透植物细胞壁和细胞膜的速度。sanford等人,part.sci.technol.5:27(1987),sanford,j.c.,trendsbiotech.6:299(1988),sanford,j.c.,physiol.plant79:206(1990),klein等人,biotechnology10:268(1992)。

替代地，基因转移和转化方法包括但不限于经由氯化钙沉淀的原生质体转化、裸dna的聚乙二醇(peg)或电穿孔介导的摄取(参见paszkowski等人(1984)emboj3:2717-2722,potrykus等人(1985)molec.gen.genet.199:169-177；fromm等人(1985)proc.nat.acad.sci.usa82:5824-5828和shimamoto(1989)nature338:274-276)和植物组织的电穿孔(d'halluin等人(1992)plantcell4:1495-1505)。

虽然已在附图和前面的描述中详细地例示且描述了本公开，但此例示和描述在特性方面将被视为示例性的而非限制性的，应当理解，仅显示且描述了例示性实施方案，且希望在本公开的精神内的所有变化和修改都将受到保护。

存在源于本文所描述的方法、设备和系统的各种特征的本公开的多个优点。将注意到，本公开的方法、设备和系统的替代性实施方案可以并不包括所描述的所有特征而仍受益于此类特征的至少一些优点。本领域的普通技术人员可容易地设计其自己的方法、设备和系统的实行方案，这些实行方案包括本发明的特征中的一个或多个且落入由随附权利要求所限定的本公开的精神和范畴内。