专利名称：一种对苯二甲酸二乙酯的降解方法
技术领域：
本发明涉及微生物全细胞催化降解技术，具体为一种对苯二甲酸二乙酯的降解方法。
背景技术：
含苯环类物质在化学工业中具有广泛的应用，因此形成的工业废弃物数量较多， 且苯环类物质对环境有一定毒害作用，对生物甚至有致癌致畸作用，因此，苯环类物质的降 解是研究的热门课题。生物降解是污染物质降解常用的方法，苯环具有一定的生物降解性， 因此，微生物降解含苯环物质也有较多研究。含苯环物质的降解中，研究较多的是含苯环羧酸类物质的降解。这类物质具有一 定的水溶性，微生物长期接触过程中受到诱导作用，能够产生诱导酶，将其逐步降解，最终 转变为二氧化碳和水。但是对于非水溶性的含苯环酯类物质，由于其水溶性很差，往往需要 多种微生物、多种生物酶复合作用方能将其彻底降解为二氧化碳和水，因而难于被单一微 生物催化降解。在申请人检索的范围内，有关采用单一菌种睾丸酮丛毛单胞菌针对对苯二 甲酸二乙酯(DTP)进行彻底降解的文献尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明拟解决的技术问题是，提供一种对苯二甲酸二乙酯 的降解方法，该降解方法采用单一菌种对DTP进行降解，工艺简便，且具有较高的降解效 率，适用于工业化规模使用。本发明解决所述技术问题的技术方案是，设计一种对苯二甲酸二乙酯的降解方 法，该降解方法采用单一睾丸酮丛毛单胞菌针对对苯二甲酸二乙酯进行降解，主要包括以 下步骤(1).菌种的培养将睾丸酮丛毛单胞菌菌种在30-37°C、斜面固体培养基中培养 12-18h，存于4°C冰箱中备用；所述固体培养基的成分是磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/ L，氯化铵lg/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0. 25g/L，琼脂粉18g/L和底物3g/L ；所述底物为对苯 二甲酸二乙酯；(2).底物溶液的配制按照液体培养基的成分，配制浓度为l_5g/L的底物溶液 5-9份，每份50ml，分别装在150ml锥形瓶中，121°C下包扎灭菌25min后，冷却后备用；所述 液体培养基的成分是磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/L，氯化铵lg/L，氯化钠5g/L，硫酸 镁0. 25g/L和底物用量为l_5g/L ；(3).底物的降解将(1)中的睾丸酮丛毛单胞菌菌种转接到(2)中的底物溶液 中，制得降解液，并于30-37°C、振荡培养器转速为200r/min的条件下，振荡培养、催化降解 底物对苯二甲酸二乙酯；(4).底物降解率的检测从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液， 95°C水浴灭活5min，冷却后加入IOml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的底物，静置脱泡后，取正己烷层中的液体用正己烷稀释50-250倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的 扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断底物含量变化；(5).底物降解产物的检测从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解 液，95°C水浴灭活5min，冷却后加入IOml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的底物，静置脱泡 后，取水层中的液体用蒸馏水稀释50-250倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的 扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断降解中间产物对苯二甲酸含量的变化；当(4)中的正己烷层与(5)中的水层均无吸收峰时，认为底物降解完全，且中间产 物对苯二甲酸降解完全，底物降解彻底。与现有技术相比，本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法采用单一睾丸酮丛毛单胞 菌菌种降解对苯二甲酸二乙酯，针对性强，降解速度快，降解效果好，且工艺简单，操作方 便，适于工业化实际应用。
图1是本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法一个实施例(单胞菌对lg/L DTP降 解过程)绘制的曲线图；图2是本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法一个实施例(单胞菌对lg/L DTP降 解过程中产物变化情况)绘制的曲线图；图3是本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法另一个实施例(单胞菌对3g/LDTP降 解过程)绘制的曲线图；图4是本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法另一个实施例(单胞菌对3g/LDTP降 解过程中产物变化情况)绘制的曲线图；图5是本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法第三个实施例(单胞菌对5g/LDTP降 解过程)绘制的曲线图；图6是本发明对苯二甲酸二乙酯的降解方法第三个实施例(单胞菌对5g/LDTP降 解过程中产物变化情况)绘制的曲线图。本发明降解方法所采用的单一菌种为睾丸酮丛毛单胞菌 (Comamonastestosteroni)，从下水道废水中分离获得，并经过富集培养和以DTP为唯一碳 源的驯化，能够在30-37°C以DTP为唯一碳源生长，并将其催化降解为二氧化碳和水等无毒 害物质。该菌种已于2010年7月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 4025。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明降解方法做进一步说明本发明设计的对苯二甲酸二乙酯(DTP)的降解方法(简称降解方法)采用单一睾 丸酮丛毛单胞菌对进行降解，采用菌悬液为催化介质，以DTP为底物，通过催化降解过程中 正己烷层和水层中物质吸光度的变化，判断DTP的降解率和产物的生成情况。研究表明，本 发明所采用的睾丸酮丛毛单胞菌对可溶性苯、萘类物质具有一定的降解作用，可打开苯环 或萘环，对于对苯二甲酸二乙酯具有较好的降解作用。本发明降解方法采用单一睾丸酮丛毛单胞菌对DTP进行降解，主要包括以下步骤1.菌种的培养将睾丸酮丛毛单胞菌菌种在30-37°C、斜面固体培养基中培养 12-18h，存于4°C冰箱中备用；所述固体培养基的成分是磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/ L，氯化铵lg/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0. 25g/L，琼脂粉18g/L和底物DTP 3g/L ；2.底物溶液的配制按照液体培养基的成分，配制浓度为l_5g/L的底物溶液5-9 份，每份50ml，分别装在150ml锥形瓶中，121°C下包扎灭菌25min后，冷却后备用；所述液 体培养基的成分是磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/L，氯化铵lg/L，氯化钠5g/L，硫酸镁 0. 25g/L和DTP用量为l-5g/L ；所述底物为苯二甲酸二乙酯；3.底物的降解将步骤1中的睾丸酮丛毛单胞菌菌种转接到步骤2中的底物溶液 中，制得降解液，并于30-37°C、振荡培养器转速为200r/min的条件下，振荡培养、催化降解 底物DTP ；4.底物降解率的检测从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液， 95°C水浴灭活5min，冷却后加入IOml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的底物，静置脱泡后， 取正己烷层中的液体用正己烷稀释50-250倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的 扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断底物DTP含量的变化；5.底物降解产物的检测从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液， 95°C水浴灭活5min，冷却后加入IOml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的底物，静置脱泡后， 取水层中的液体用蒸馏水稀释50-250倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的扫 描，根据240nm处吸收峰的高低，判断降解中间产物对苯二甲酸(TA)含量的变化；当步骤4中的正己烷层与步骤5中的水层均无吸收峰时，认为底物降解完全，且中 间产物对苯二甲酸降解完全，底物降解彻底。本发明降解方法中所用培养基均含有底物DTP，为选择性培养基，具体成分如下固体培养基磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/L，氯化铵lg/L，氯化钠5g/L，硫酸 镁 0. 25g/L，DTP 3g/L，琼脂粉 18g/L。液体培养基磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/L，氯化铵lg/L，氯化钠5g/L，硫酸 镁0. 25g/L，DTP用量为l-5g/L ；在液体培养基适当的DTP浓度范围内，浓度越高，降解效果 越明显(参见实施例1-3)。但液体培养基中DTP浓度过高则会抑制菌体生长，反而影响降 解的效果；而浓度过低，则不能满足菌体生长能量的需要。本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明降解方法的具体实施例具体实施例仅是为了进一步详细说明本 发明，不够成对本发明申请权利要求的限制。实施例1以lg/L DTP为唯一碳源，以睾丸酮丛毛单胞菌为菌种对DTP进行降解。将分离获得的睾丸酮丛毛单胞菌菌种在30°C，斜面固体培养基(成分如前所说， 下同)中培养12h，存于冰箱备用；按照液体培养基的成分(成分如前所说，下同)，配制DTP 浓度为lg/L的底物溶液5份，每份50ml。分别装在5只150ml锥形瓶中，包扎灭菌(121°C， 25min)，冷却后备用；将斜面培养基中的菌种转接到待降解的底物溶液中，制得降解液，于 30°C,200r/min条件下振荡培养，使之催化降解底物DTP ；从未反应的零时开始计时，每隔 12h，取出一瓶降解液，95°C水浴灭活5min，冷却后加入IOml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的DTP，静置脱泡后，取正己烷层中的液体用正己烷稀释50倍，采用紫外分光光度计进行 400-190nm波长的扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断DTP含量变化；取水层中的液体 用蒸馏水稀释50倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的扫描，根据240nm处吸收 峰的高低，判断TA含量的变化。正己烷层中萃取的未降解DTP吸光度变化如图1所示。由图1的1240nm处吸光 度可见，lg/L的DTP经12h降解，DTP降解率可达75% ；经24h降解，DTP降解率可达95% 以上，几乎完全降解。水层中DTP降解产生的TA含量变化如图2所示。由图2可见，lg/L DTP降解12 小时，其中许多DTP转化为水溶性的中间产物TA，随着时间的延长，中间产物TA被进一步降 解。经48h，TA几乎完全降解。lg/L DTP经48h的降解，正己烷层(参见图1)及水层中(参见图2)，均无含苯环 的有毒害物质残余，表明所用菌株对DTP的降解彻底。实施例2以3g/L DTP为唯一碳源，以睾丸酮丛毛单胞菌为菌种对DTP进行降解。将分离获得的菌种在34°C，斜面固体培养基中培养15h，存于冰箱备用；按照液体 培养基的成分，配制DTP浓度为3g/L的底物溶液7份，每份50ml。分别装在7只150ml锥 形瓶中，包扎灭菌(12rC，25min)，冷却后备用；将斜面培养基中的菌种转接到待降解的底 物溶液中，制得降解液，于34°C，200r/min条件下振荡培养，使之催化降解底物DTP ；从未反 应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液，95°C水浴灭活5min，冷却后加入IOml正己 烷，充分振荡，萃取未溶解的DTP，静置脱泡后，取正己烷层中的液体用正己烷稀释150倍， 采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断DTP含 量变化；取水层中的液体用蒸馏水稀释150倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的 扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断TA含量的变化。正己烷层中萃取的未降解DTP吸光度变化如图3所示。由图3的240nm处吸光度 可见，3g/L DTP经12h，24h和36h，DTP降解率分别可达25%，55%和80%，经48h降解，DTP 降解率可达98 %以上，几乎完全降解。水层中DTP降解产生的TA含量变化如图4所示。由图4中可见，3g/L DTP降解 12小时，其中许多DTP转化为水溶性的中间产物TA，随着时间的延长，中间产物TA被进一 步降解。经60h左右，TA几乎完全降解。3g/L DTP经60h的降解，正己烷层(参见图3)及水层中(参见图4)，均无含苯环 的有毒害物质残余，表明所用菌株对DTP的降解彻底。实施例3以5g/L DTP为唯一碳源，以睾丸酮丛毛单胞菌为菌种对DTP进行降解。将分离获得的睾丸酮丛毛单胞菌菌种在37°C，斜面固体培养基中培养18h，存于 冰箱备用；按照液体培养基的成分，配制DTP浓度为5g/L的底物溶液9份，每份50ml。分 别装在9只150ml锥形瓶中，包扎灭菌(12rC，25min)，冷却后备用；将斜面培养基中的菌 种转接到待降解的底物溶液中，制得降解液，于37°C，200r/min条件下振荡培养，使之催化 降解底物DTP ；从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液，95°C水浴灭活5min， 冷却后加入IOml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的DTP，静置脱泡后，取正己烷层中的液体用正己烷稀释250倍，采用紫外分光光度计进行400-190nm波长的扫描，根据240nm处吸收 峰的高低，判断DTP含量变化；取水层中的液体用蒸馏水稀释250倍，采用紫外分光光度计 进行400-190nm波长的扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断TA含量的变化。正己烷层中萃取的未降解DTP吸光度变化如图5所示，由图中240nm处吸光度 可见，5g/L DTP 经 12h，24h，36h，48h，60h*72h 的降解，DTP 降解率分别可达 15%, 30%, 45 %，60 %，75 %和90 %，经84h的降解，DTP降解率可达99 %以上，几乎完全降解。水层中DTP降解产生的TA含量变化如图6所示。由图6中可见，5g/L DTP降解 12小时，其中许多DTP转化为水溶性的中间产物TA，随着时间的延长，中间产物TA被进一 步降解。经96h左右，TA几乎完全降解。5g/L的DTP经96h的降解，正己烷层(参见图5)及水层中(参见图6)，均无含苯 环的有毒害物质残余，表明所用菌株对DTP的降解彻底。
权利要求
一种对苯二甲酸二乙酯的降解方法，该降解方法采用单一睾丸酮丛毛单胞菌对对苯二甲酸二乙酯进行降解，主要包括以下步骤(1).菌种的培养将睾丸酮丛毛单胞菌菌种在30 37℃、斜面固体培养基中培养12 18h，存于4℃冰箱中备用；所述固体培养基的成分是磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/L，氯化铵1g/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0.25g/L，琼脂粉18g/L和底物3g/L；(2).底物溶液的配制按照液体培养基的成分，配制浓度为1 5g/L的底物溶液5 9份，每份50ml，分别装在150ml锥形瓶中，121℃下包扎灭菌25min后，冷却后备用；所述液体培养基的成分是磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠7g/L，氯化铵1g/L，氯化钠5g/L，硫酸镁0.25g/L和底物用量为1 5g/L；所述底物为苯二甲酸二乙酯；(3).底物的降解将(1)中的睾丸酮丛毛单胞菌菌种转接到(2)中的底物溶液中，制得降解液，并于37℃、振荡培养器转速为200r/min的条件下，振荡培养、催化降解底物对苯二甲酸二乙酯；(4).底物降解率的检测从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液，95℃水浴灭活5min，冷却后加入10ml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的底物，静置脱泡后，取正己烷层中的液体用正己烷稀释50 250倍，采用紫外分光光度计进行400 190nm波长的扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断底物含量变化；(5).底物降解产物的检测从未反应的零时开始计时，每隔12h，取出一瓶降解液，95℃水浴灭活5min，冷却后加入10ml正己烷，充分振荡，萃取未溶解的底物，静置脱泡后，取水层中的液体用蒸馏水稀释50 250倍，采用紫外分光光度计进行400 190nm波长的扫描，根据240nm处吸收峰的高低，判断降解中间产物对苯二甲酸含量的变化；当(4)中的正己烷层与(5)中的水层均无吸收峰时，认为底物降解完全，且中间产物对苯二甲酸降解完全，底物降解彻底。
全文摘要
本发明公开一种对苯二甲酸二乙酯的降解方法，主要包括1.菌种培养将睾丸酮丛毛单胞菌菌种在30-37℃、斜面固体培养基中培养12-18h；2.底物溶液配制配制浓度为1-5g/L的底物溶液5-9份，每份50ml，分别装在150ml锥形瓶中，121℃下包扎灭菌25min；3.底物降解将1中的菌种转接到2中的底物溶液中，制得降解液，并于30-37℃、转速为200r/min下，振荡培养、催化降解底物；4.底物降解率检测采用400-190nm波长扫描，据240nm处吸收峰，判断底物含量变化；5.底物降解产物的检测采用400-190nm波长扫描，据240nm处吸收峰，判断降解中间产物含量变化。
文档编号A62D101/28GK101947380SQ20101026759
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者巩继贤, 张健飞, 张卫玲, 李政, 李秋瑾 申请人:天津工业大学