专利名称：一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，涉及一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降 解多环芳烃中的应用。
背景技术：
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称 PAHs)是含有两个或两个 以上苯环的芳香族碳氢化合物。常温下，纯的多环芳烃呈固态，其总体特征是高熔点、高沸 点、低水溶性，多环芳烃的水溶性随着苯环数量的增加而降低，其生物可利用性和可降解性 也随之降低，在环境中停留的时间长。多环芳烃来自自然界和人类活动。多环芳烃是本来就存在于自然界中的一类有机 物，可以通过某些藻类、植物及降解菌在好氧生长过程中合成，还可能是微生物在厌氧情况 下降解大量有机物时产生多环芳烃，比如未开采的煤和石油中都含有大量多环芳烃，另一 方面，有机物的不完全燃烧是产生多环芳烃污染的一个重要因素。自然环境中的多环芳烃 对环境并未构成太大的威胁，而来自人类活动的多环芳烃的含量已经足以影响整个生态系 统的安全。随着人类活动的加剧，有毒有害物质对环境的污染日趋加重，其中多环芳烃就是 一类典型的有害物质，因其具有致畸性、致癌性及致突变性而受到人们的广泛关注。多环芳 烃在大气、水、土壤和植物中均有分布，虽然大气中的多环芳烃浓度不是很高，但其可以通 过呼吸作用损坏动物的肺；水体中的多环芳烃通过大气中多环芳烃沉降，以及含多环芳烃 污水的直接排放等方式进入水体当中，水体沉积物中的多环芳烃的含量是很高的；土壤中 的多环芳烃主要来源于大气的颗粒沉降和降水降雪，还有一些来自油田和废弃的炼油厂的 直接倾倒和排污；植物中的多环芳烃大部分来源于大气沉降，一些植物能吸收这类物质。多 环芳烃广泛地分布在我们的生活环境中，对人体和环境都有很大的危害，因此，对多环芳烃 污染的生物修复进行研究是非常具有实际意义的。尽管多环芳烃能够经过吸附、挥发、光解、化学降解等方法去除，但生物降解是最 重要的降解途径。目前，学者们已经分离出许多可以降解多环芳烃的微生物，其中细菌占主 要地位。但是，以往降解芳烃的微生物大多都是针对低分子量的多环芳烃，对高分子量多环 芳烃的降解效果不明显。因此，寻找降解高分子量(高环)多环芳烃降解菌是目前的热点 问题。
发明内容
本发明的目的是提供一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用。本发明提供的矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)，命名为LD^，分离 自海南省海口市福山油田美台1号井出油口原油污染表层(<2cm)沙质土，已于2010年 12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为 北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No. 4400。矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae) LD29CGMCC No. 4400 简称矢野口鞘氨醇杆菌 U^9。矢野口鞘氨醇杆菌可用于降解有机芳香化合物。所述有机芳香化合物可为 多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)。所述多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)具体 可为菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘中的至少一种。本发明还保护一种降解有机芳香化合物的制剂(菌剂)，它的活性成分为矢野口 鞘氨醇杆菌U^9。所述有机芳香化合物可为多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)。所述 多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)具体可为菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘中的至少一 种。矢野口鞘氨醇杆菌可用于环境污染修复。所述环境污染可为有机芳香化合 物污染。所述有机芳香化合物可为多环芳烃化合物(多环芳烃类化合物)。所述多环芳烃 化合物(多环芳烃类化合物)具体可为菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘中的至少一种。所述 环境为土壤或水体。矢野口鞘氨醇杆菌LD^可在好氧条件下分别以菲、蒽、荧蒽和芘作为唯一碳源和 能源生长繁殖，同时将其降解。另外，矢野口鞘氨醇杆菌LM9对混合多环芳烃也有降解效 果，尤其对混合多环芳烃中五环的苯并[a]芘也产生了降解效果。本发明可用于多环芳烃 污染土壤的修复和多环芳烃污染水体的修复，减少环境中多环芳烃含量，具有快速、方便、 环保的优点，为多环芳烃污染的生物修复提供了新的微生物资源，对于环境治理具有重大 价值，具有可观的经济效益与良好的社会效益。
图1为矢野口鞘氨醇杆菌LD^对混合PAHs降解效果曲线图。图2为不同葡萄糖浓度对矢野口鞘氨醇杆菌LD^降解荧蒽的影响柱状图；CK为 不加葡萄糖母液的处理。图3为不同氮素浓度对矢野口鞘氨醇杆菌LD^降解荧蒽的影响柱状图；CK为不 加蛋白胨母液的处理。图4为菲标准品的标准曲线。图5为蒽标准品的标准曲线。图6为荧蒽标准品的标准曲线。图7为芘标准品的标准曲线。图8为苯并[a]芘标准品的标准曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。菲、蒽、荧蒽、芘和苯并[a]芘的检测方法实验结束后，向每个试管中加IOmL乙酸乙酯，涡旋30s。静置待水层与有机层分 离，用移液管从上层有机层取ImL乙酸乙酯到干净的棕色玻璃瓶。55°C下用氮气流轻轻吹 乙酸乙酯至完全挥发，再加入2mL乙腈溶解结晶的PAHs。用0. 22 μ m孔径的有机相滤膜过滤乙腈溶液到另一干净的棕色玻璃瓶中，盖上盖。用安捷伦LC1200高效液相色谱仪测定多 环芳烃浓度，采用Venusil MP-C18柱(粒径5 μ m，直径4mm，长度250mm，天津博纳艾杰尔科 技)，流动相为乙腈和水；前5min内采用60 %乙腈洗脱，在接下来的25min，进行梯度洗脱 (60 %乙腈一100 %乙腈)，100 %乙腈洗脱保持5min,共计35min。菲标准品的标准曲线见图4，目标峰为自洗脱开始24. 157士0. 059min。蒽标准品的标准曲线见图5，目标峰为自洗脱开始24. 579士0. 076min。荧蒽标准品的标准曲见图6，目标峰为自洗脱开始25. 801 士0. 055min。芘标准品的标准曲线见图7，目标峰为自洗脱开始26. 311 士0. 056min。苯并[a]芘标准品的标准曲线见图8，目标峰为自洗脱开始29. 700士0. 060min。实施例1、矢野口鞘氨醇杆菌LD^的分离与鉴定一、样品的采集2008年10月现场采集海南省海口市福山油田美台1号井出油口原油污染表层 (< 2cm)沙质土。二、矢野口鞘氨醇杆菌LD^的分离和筛选采用水-硅油双相体系驯化多环芳烃降解菌，蒽的起始浓度为100mg/L。水相无 机盐培养基(pH 7. 5) =MgSO4 · 7H20 0. 2g, KH2PO4L 0g, K2HPO4L 0g, FeSO4O. 05g, CaCl2O. 02g, NH4NO3L Og, NaCl 0. 5g，去离子水 1000mL。经过若干代反复驯化，在NR固体培养基中划线培养，得到多株纯菌，纯菌经过接 种至液体培养基中验证其降解能力，最后得到一株能够降解蒽、菲、芘、荧蒽的高效降解菌， 将其命名为LD^。NR固体培养基(pH7. 4 7. 6):牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂 15g 20g，去离子水IOOOmL0三、矢野口鞘氨醇杆菌LD^的鉴定1、形态学鉴定菌落呈规则圆形，黄色，表面湿润、光滑、突起，边缘整齐，不透明，质地粘稠。2、生理生化鉴定鉴定结果见表1。表1菌株LD^的生理生化特征
试验项目结果试验项目结果试验项目结果试验项目结果细胞形态杆状革兰氏染色阴性氧化酶+接触酶+对照D-蜜二糖+P-苯乙醇酸L-组氨酸a-环糊精+甲基葡糖苷+衣康酸羟基脯氨酸+糊精+D-阿洛酮糖+a-氧代丁酸L-亮氨酸+糖原D-棉子糖+a-氧代戊二酸L-鸟氨酸Tween40+L-鼠李糖+a-氧代戊酸L-苯丙氨酸
权利要求
1.矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobiumyanoikuyae)LD29，其保藏编号为 CGMCCNo. 4400。
2.矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobiumyanoikuyae)LD29CGMCC No. 4400在降解有机芳香 化合物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述有机芳香化合物为多环芳烃化合物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述多环芳烃化合物为菲、蒽、荧蒽、芘和苯 并[a]芘中的至少一种。
5.一种降解有机芳香化合物的制剂，它的活性成分为矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)LD29CGMCC No. 4400。
6.如权利要求5所述的制剂，其特征在于所述有机芳香化合物为多环芳烃化合物。
7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于所述多环芳烃化合物为菲、蒽、荧蒽、芘和苯 并[a]芘中的至少一种。
8.矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobiumyanoikuyae)LD29CGMCC No. 4400在环境污染修复 中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述污染为有机芳香化合物污染；所述有机 芳香化合物优选为多环芳烃化合物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述多环芳烃化合物为菲、蒽、荧蒽、芘和 苯并[a]芘中的至少一种；所述环境为土壤或水体。
全文摘要
本发明公开了一株矢野口鞘氨醇杆菌及其在降解多环芳烃中的应用。本发明提供的矢野口鞘氨醇杆菌(Sphingobium yanoikuyae)，命名为LD29，菌种保藏号为CGMCCNo.4400。矢野口鞘氨醇杆菌LD29可在好氧条件下分别以菲、蒽、荧蒽和芘作为唯一碳源和能源生长繁殖，同时将其降解。另外，矢野口鞘氨醇杆菌LD29对混合多环芳烃也有降解效果，尤其对混合多环芳烃中五环的苯并[a]芘也产生了降解效果。本发明可用于多环芳烃污染土壤的修复和多环芳烃污染水体的修复，减少环境中多环芳烃含量，具有快速、方便、环保的优点，为多环芳烃污染的生物修复提供了新的微生物资源，对于环境治理具有重大价值，具有可观的经济效益与良好的社会效益。
文档编号A62D3/02GK102120976SQ201010598120
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者付博, 刘芳, 李季, 梁金松 申请人:中国农业大学