专利名称：利用柠檬酸废水生产有机磷农药降解菌剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂和废水资源化技术领域。
背景技术：
柠檬酸作为一种重要的化工原料和食品添加剂被广泛应用于食品、医药、化工等行业。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约80万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过60%。柠檬酸的生产是以薯干或玉米为原料，依次经原料处理、发酵、提取、精制等工序制得产品。柠檬酸废水主要来自发酵和提取工序产生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗滤布水。废水中主要含有淀粉、蛋白质、碳水化合物、各种有机酸、氨氮和脂肪等，COD浓度为20000 30000mg/L，属于高浓度有机废水。据统计，每生产I吨柠檬酸，产生高浓度废水7. 5 15吨。直接排放会对环境将造成严重 污染，处理达标排放费用高昂。柠檬酸废水的资源化利用技术开发非常紧迫。有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，至今仍是农药中用量最多的类别，在农业生产中起到了举足轻重的作用，我国有机磷农药的生产和使用量占农药总生产和使用量的一半以上。但是，有机磷农药具有较强的毒性，长期、大量使用后，其在农作物上的残留会引起食品安全问题，也影响了我国农产品出口，而且散落的农药也会使水和土壤受到污染。利用微生物降解有机磷农药残留的生物修复方法具有低成本、无毒、无二次污染等优点，是最具应用前景的削减农药污染的方法之一。中国发明专利(申请号200610090054. 7)公开了一株降解有机磷农药的施氏假单胞菌，是从农药厂排污口土壤样品中分离的；中国发明专利(申请号200410081019.X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌，是从长期农药污染的土壤中分离获得。本专利是从油菜叶际分离出的一株高效降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌，能够在植物叶际环境下保持良好的降解性能。以柠檬酸废水为培养基的主要原料生产农药降解菌剂的方法未见文献报道。此方法不仅可以减少高浓度有机废水的排放，而且降低菌剂的生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够资源化利用柠檬酸废水生产有机磷农药残留降解菌剂的方法。本发明所使用的菌株是由发明人分离筛选出来的一株高效降解有机磷农药残留的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株，该菌株于2009年11月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC No. 3374，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。本发明所述的枯草芽孢杆菌有机磷农药降解菌剂的生产方法如下I、柠檬酸废水预处理用氢氧化钠水溶液调节废水的pH到6. 7 7. 8，于115 126°C灭菌10 35分钟。
2、液体种子制备向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于28 45°C，120 200转/分振荡培养24 48小时，得到液体种子。3、液态发酵向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为2% 20%的液体种子，于25 40°C，通无菌空气培养12-48小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到5 X IO8CFU/毫升以上。4、固体菌剂制备以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液生物碳为
I 1.5 5的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30 %以下，包装，存放在阴凉干燥处。5、液体菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至有效活菌数5X 109CFU/mL以上，加入质量分数为0. 5%的甘氨酸和质量分数为I. 5%甘油，灌装保藏；
使用时用水稀释50-500倍。
具体实施例方式由本发明技术方案生产的枯草芽孢杆菌微生物菌剂能够快速降解植物叶面和土壤中的有机磷农药残留，并且促进植物生长，提高农产品质量，改善农田环境质量；而且生产成本低，有效地利用了废水，减少污染物排放。
具体实施方式
如下实施例I :柠檬酸废水生产枯草芽孢杆菌微生物菌剂柠檬酸废水预处理用氢氧化钠水溶液调节废水pH到7. 0，于121°C灭菌15分钟。液体种子制备向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于45°C, 150转/分振荡培养36小时,得到液体种子。液态发酵向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种5% (体积比)的液体种子，于32°C，通无菌空气培养16小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到
3.5 X IO9CFU/ 毫升。固体菌剂制备以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液生物碳为I : 3的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30%以下，包装，存放在阴凉干燥处，12个月内使用。液体菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至有效活菌数5 X 109CFU/mL以上，加入质量分数为0. 5%的甘氨酸和质量分数为I. 5%甘油，灌装，室温保藏，6个月内使用。实施例2 :有机磷农药降解菌剂对油菜叶面敌敌畏农药残留的降解效果选取两个完全相同的油菜地块，各30m2，均匀喷洒1000倍稀释的80%敌敌畏乳油农药。6h后，均匀喷施用清水稀释600倍的农药降解液体菌剂，以喷施清水作对照。24h后，五点取样法检测油菜叶面敌敌畏残留，发现处理组较对照组敌敌畏残留量减少80%左右。实施例3 :有机磷农药降解菌剂对土壤中乐果残留的降解效果选取两个完全相同的未种植作物的农田地块，各30m2，均匀喷洒1000倍稀释的50%乐果乳油农药；6h后，均匀撒入固体农药降解菌剂I公斤，翻耕均匀；36d后，五点取样法检测油菜叶面乐果的残留，发现处理组较对照组乐果残留量减少50%左右。实施例4 :枯草芽孢杆菌微生物菌剂促进油菜生长采用蔬菜大棚小区实验，设置8个条件完全相同的实验小区，每个小区30m2，2个小区为I组平行试验，共分成4组，种植油菜，在油菜幼苗期，第I组2个小区不施肥作对照；第2组2个小区按照50公斤/亩的用量在 油菜完全发芽后和3周后各追施枯草芽孢杆菌微生物菌剂一次；第3组2个小区按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次；第4组2个按照15公斤/亩的施肥量在油菜完全发芽后和3周后各施用尿素一次，并在每次施用尿素后I天按照50公斤/亩的施肥量追施微生物菌剂一次，各小区相同的灌溉和管理方式。油菜生长5周后调查产量和品质。单独施用微生物菌剂和单独施用尿素的油菜产量基本一致，都比不施肥的对照小区增产60%左右；两种菌剂和尿素都施用的小区比对照小区增产90%左右；油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量以不施肥和单独施用微生物菌剂的最低，在国家标准限量值的1/3以下，施用尿素后又施用微生物菌剂的也在国家标准限量的1/2以下，而单独施用尿素的油菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量都超标严重。表明该微生物菌剂具有良好的增产效果，而且可以明显提高油菜的品质。本发明所提供的降解有机磷农药的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年11月2日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。保藏编号为CGMCC No. 3374。
权利要求
1.一种利用柠檬酸废水生产有机磷农药降解菌剂的方法，其特征在于有机磷农药降解菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号=CGMCC No. 3374。
2.利用权利要求I所述有机磷农药降解菌剂的生产方法，其特征在于发酵培养基以柠檬酸废水为主要原料，菌剂生产方法及步骤包括 (1)柠檬酸废水预处理用氢氧化钠水溶液调节废水的PH到6.7 7. 8，于115 126°C灭菌10 35分钟。
(2)液体种子制备向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，于28 45°C，120 200转/分振荡培养24 48小时，得到液体种子。
(3)液态发酵向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为2% 20%的液体种子，于25 40°C，通无菌空气培养12-48小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到5 X IO8CFU/毫升以上。
(4)固体菌剂制备以过30目筛的生物碳为载体，按照发酵液生物碳为I: 1.5 5的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30 %以下，包装，存放在阴凉干燥处。
(5)液体菌剂制备培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至有效活菌数5X 109CFU/mL以上，加入质量分数为0. 5%的甘氨酸和质量分数为I. 5%甘油，灌装保藏；使用时用水稀释50-500倍。
全文摘要
本发明涉及一种利用柠檬酸废水生产有机磷农药降解菌剂的方法，属于微生物菌剂和废水资源化技术领域。该方法主要是以柠檬酸生产过程中产生的高浓度有机废水为主要培养基原料，采用液态发酵的方法生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.3374菌剂。生产工艺包括(1)柠檬酸废水pH调节和灭菌；(2)接种斜面保藏的枯草芽孢杆菌，振荡培养获得液体种子；(3)向装有柠檬酸废水培养基的发酵罐中接种液体种子，通无菌空气培养得到液态发酵产物；(4)发酵产物用生物碳作载体可制备固体菌剂；(5)发酵液经浓缩后添加保护剂获得液体菌剂。该工艺生产的有机磷农药降解菌剂，具有生产成本低、环境友好的特点，产品能高效降解植物表面和土壤中的有机磷农药残留，而且还可以改善土壤环境质量、提高作物产量和品质。同时为柠檬酸生产过程中产生的大量高浓度废水找到有效的资源化利用方法，减少污染物排放。
文档编号A62D101/26GK102965293SQ20111025660
公开日2013年3月13日 申请日期2011年9月1日 优先权日2011年9月1日
发明者白志辉, 李滨, 赵志瑞, 唐景春, 马安周, 王晓辉 申请人:中国科学院生态环境研究中心