专利名称：拟除虫菊酯类农药降解菌及其分离纯化方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种降解海水环境中拟除虫菊酯类农药降解菌及其分离纯化方法和应用。
背景技术：
拟除虫菊酯类农药是一类高效、广谱农药，具有低毒、排泄迅速、能被生物降解等特点，因此，经常用于渔业生产上杀灭寄生虫和敌害生物。然而，由于养殖用户缺乏科学理论的知识，在清塘时大量使用拟除虫菊酯类农药，同时，拟除虫菊酯类农药在农田使用后，随地表径流进入近海养殖海域；最终导致近海海域水环境和沉积物中环境质量恶化，造成农药残留污染。由于此类农药对鱼、贝和甲壳类等水生生物毒性较大，因此，近年来，频繁发生污染、养殖生物死亡事件，特别是最近研究表明，由于此类农药的降解速度较慢且属亲脂 性农药，易被水生生物富集，并且有些品种有致癌、致畸、致突变和神经毒性等生理作用，从而对水体生态系统和水产品质量产生严重影响，最终导致市售水产品中该类农药出现超标现象，其残留给人类健康带来了巨大的威胁。因此，拟除虫菊酯类农药引起的海水养殖环境污染问题受到人们的普遍关注，如何有效的去除拟除虫菊酯类农药的残留污染和进行监控对保护近海生态环境、发展绿色养殖和保障食品安全具有重要意义。现有的以生物修复为理论基础的农药残留降解技术为解决这一难题提供了新的思路，微生物降解作为环境中农药降解的主要方式，具有以下优点①农药本身在自然界中的降解速度较慢，而利用微生物可加速农药的降解过程；②利用微生物对农药的降解通常只是一个自然过程的强化，不会导致二次污染和污染物的转移，可使环境中的污染物减少到最小程度。然而，目前微生物降解农药的研究主要集中在土壤、水果和淡水沉积物等环境，而对于近海环境中拟除虫菊酯类农药残留的降解菌的筛选等研究较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够同时降解海水养殖环境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯的拟除虫菊酯类农药降解菌及其分离纯化方法和应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种拟除虫菊酯类农药降解菌，该菌株为HS-24菌株，分类命名为噬甲基菌(Methylophaga sp.)，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6046，该菌株的16S rRNA 的 Genbank 登陆号为 JX087925。菌株的生物学特征为革兰氏染色阴性，为杆菌，精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，β -半乳糖甙酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶试验、尿素酶试验、吲哚试验、H2S反应均为阴性，不可以利用蔗糖。该菌株海水中生长，最适生长温度25_30°C，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。
一种拟除虫菊酯类农药降解菌的分离纯化方法，具体包括如下步骤
(1)培养基配制
将氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯分别相应加入I. 5倍重量的乳化剂，制备成相应的浓乳液，然后将各个浓乳液分别加入到营养培养基中，使氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯终浓度分别为100mg/L，得到富集培养液；
(2)降解菌分离纯化
取500 mL海水样品无菌状态下过滤富集后，加入到含富集培养液的三角瓶中，在温度28°C、转速180 rpm的条件下，培养7d，按10%接种量转移到新配制的富集培养液中，再在温度28°C、转速180 rpm的条件下，培养7d，取培养基发酵液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯化后的各菌落分别接至新配制的富集培养液中，在温度28°C、转速180 rpm的条件下，振荡培养7d，通过气相色谱-电子捕获器检测各富集培养液中拟除虫菊·酯类农药残留量，筛选对氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯5种拟除虫菊酯类农药具有高效降解能力的菌株，即为降解海水环境中拟除虫菊酯类农药的降解菌HS-24。所述的营养培养基的配制方法如下蛋白胨5. O g，磷酸高铁O. 01 g，酵母膏I. Og，过滤海水1000 mL, pH 7. 0-7. 8,于121°C高压蒸汽灭菌20 min后制得。所述的乳化剂为吐温-20。一种拟除虫菊酯类农药降解菌的应用，该菌株可用于海水及沉积物环境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯农药的生物降解。该菌株在ρΗ7· 0-7. 8、温度25_30°C、拟除虫菊酯类农药浓度100 mg/L条件下对氯氰菊酯(CYP)、溴氰菊酯(DEL)、氰戊菊酯(FEN)、氟氯氰菊酯(CYF)、联苯菊酯(BIF)五种拟除虫菊酯类农药的降解能力均达到75%以上。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明的高效拟除虫菊酯类农药降解菌可安全、高效、快速的降解海水环境中残留的氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯5种拟除虫菊酯类农药，在近海环境保护、养殖环境农药残留污染治理和保障食品安全方面具有很好的应用前景。上述降解海水环境中拟除虫菊酯类农药的降解菌，该菌株分类命名为噬甲基菌(Methylophaga sp.)菌株为 HS-24 株，保藏编号为 CGMCC No. 6046，于 2012 年 4 月 24 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
图I为本发明拟除虫菊酯类农药降解菌的扫描电镜 图2为本发明氯氰菊酯(CYP)、溴氰菊酯(DEL)、氰戊菊酯(FEN)、氟氯氰菊酯(CYF)、联苯菊酯(BIF)的标准样品色谱图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
拟除虫菊酯类农药降解菌株的筛选
I、培养基和试剂
营养培养基蛋白胨5. O g，磷酸高铁O. 01 g，酵母膏I. O g，过滤海水1000 mL, pH7.6-7.8，高压蒸汽灭菌(1211，20 min)后制得；
富集培养液将氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯分别相应加入
I.5倍重量的乳化剂吐温-20，制备成相应的浓乳液，然后将各个浓乳液分别加入到营养培养基中，使氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯终浓度分别为IOOmg/L，得到富集培养液。2、菌株分离纯化
海水样品采自宁波近岸海域，取500 mL海水无菌状态下过滤，富集后，加入到含有浓度为100 mg/L的氯氰菊酯、100 mg/L的溴氰菊酯、100 mg/L的氰戍菊酯、100 mg/L的氟氯氰菊酯、100 mg/L的联苯菊酯的富集培养液的250ml三角瓶中，在温度28°C、转速180 rpm的条件下，培养7 d，按10%体积接种量转移到新鲜的含氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯各100 mg/L的富集培养液中，同条件培养I周，取培养基发酵液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯化后的各菌落分别接至富集培养液中振荡培养(25°C，180 rpm)7d，通过气相色谱-电子捕获器(GC-E⑶)检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，最后筛选获得一株对上述5种拟除虫菊酯类农药具有高效降解能力的菌株，命名为HS-24。
该菌株分类命名为噬甲基菌(Methylophaga sp.)，菌株为HS-24株，保藏编号为CGMCCNo. 6046，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，该菌株的16S rRNA的 Genbank 登陆号为 JX087925。菌株的生物学特征为革兰氏染色阴性，为杆菌，精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，β -半乳糖甙酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶试验、尿素酶试验、吲哚试验、H2S反应均为阴性，不可以利用蔗糖。 该菌株海水中生长，最适生长温度25-30 V，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。具体实施例二
拟除虫菊酯类农药降解菌株的鉴定
将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的扫描电镜照片如图I所示。该菌株的主要生物学特征为革兰氏染色阴性，为杆菌，精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，β -半乳糖甙酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶试验、尿素酶试验、吲哚试验、H2S反应均为阴性，不可以利用蔗糖。该菌株海水中生长，25-30°C，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。该菌株经16SrRNA序列分析鉴定为与曬甲基菌(Methylophaga sp.)的相似性最高,达到98%。具体实施例三
拟除虫菊酯类农药降解菌对海水中拟除虫菊酯类农药的降解效果及应用
将分离、纯化后的菌株以菌量OD415nm=O. 2接种到100 mL含氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戍菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯各100 mg/L的富集培养基((配制方法如实施例一所示))的250mL三角瓶中，以不接菌的富集培养基作对照，在28 0C >180 rpm的恒温摇床上震荡培养7do培养结束后，吸取I mL培养液，加O. 4 g NaCL，涡旋混匀，依次采用4 mL的正己烷与丙酮(体积比1:1)的混合溶液和2 mL的正己烷与丙酮的混合溶液萃取，合并两次萃取所得上清液，取3 mL上清液，加入0.4 g无水硫酸钠，氮气吹干后用I mL异辛烷与丙酮的混合液(体积比1:1)溶解，用气相色谱检测，每个实验重复三次，通过考察降解率来判断该菌的降解能力。降解率计算公式降解率(％)=(对照样品残留量-处理样品残留量)X 100/对照样品残留量
氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯的标准样品色谱图如图2所示，本发明菌株对浓度为100 mg/L的氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯混合拟除虫菊酯类农药的降解率分别为87. 7%,84. 6%,77. 3%,75. 5%和80. 3%，表明建立的菌液中拟除虫菊酯类农药的检测方法具有较好的应用效果。 实验结果表明该菌对海水中拟除虫菊酯类农药残留具有较好的降解能力，因此，该菌对环境中拟除虫菊酯类农药的降解，尤其是海水养殖环境污染的修复具有广泛的应用前景。上述实施例是对本发明的进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于上述实施例，以权利要求书为准。
权利要求
1.一种拟除虫菊酯类农药降解菌，其特征在于该菌株为HS-24菌株，分类命名为噬甲基菌(Methylophaga sp.)，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6046，该菌株的16S rRNA的Genbank登陆号为JX087925。
2.根据权利要求I所述的拟除虫菊酯类农药降解菌，其特征在于该菌株的生物学特征为革兰氏染色阴性，为杆菌，精氨酸双水解试验、赖氨酸脱羧酶试验、V-P反应、明胶液化试验阳性，β -半乳糖甙酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶试验、尿素酶试验、吲哚试验、H2S反应均为阴性，不可以利用蔗糖。
3.根据权利要求I所述的拟除虫菊酯类农药降解菌，其特征在于该菌株海水中生长，最适生长温度25-30 V，最适生长pH为7. 0-7. 8，在固体培养基上，菌落圆形、较薄，呈白色，半透明。
4.一种根据权利要求I所述的拟除虫菊酯类农药降解菌的分离纯化方法，其特征在于具体包括如下步骤 (1)培养基配制 将氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯分别相应加入I. 5倍重量的乳化剂，制备成相应的浓乳液，然后将各个浓乳液分别加入到营养培养基中，使氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯终浓度分别为100mg/L，得到富集培养液； (2)降解菌分离纯化 取500 mL海水样品无菌状态下过滤富集后，加入到含富集培养液的三角瓶中，在温度28 °C、转速180 rpm的条件下，培养7d，按10%体积接种量转移到新配制的富集培养液中，再在温度28 °C、转速180 rpm的条件下，培养7 d，取培养基发酵液进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯化后的各菌落分别接至新配制的富集培养液中，在温度28°C、转速180 rpm的条件下，振荡培养7 d，通过气相色谱-电子捕获器检测各富集培养液中拟除虫菊酯类农药残留量，筛选对氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯5种拟除虫菊酯类农药具有高效降解能力的菌株，即为降解海水环境中拟除虫菊酯类农药的降解菌HS-24菌株。
5.根据权利要求4所述的拟除虫菊酯类农药降解菌的分离纯化方法，其特征在于所述的营养培养基的配制方法如下蛋白胨5. O g,磷酸高铁O. 01 g，酵母膏I. O g,过滤海水1000 mL, pH 7. 0-7. 8，于121 °C高压蒸汽灭菌20 min后制得。
6.根据权利要求4所述的拟除虫菊酯类农药降解菌的分离纯化方法，其特征在于所述的乳化剂为吐温-20。
7.一种根据权利要求I所述的拟除虫菊酯类农药降解菌的应用，其特征在于该菌株可用于海水及沉积物环境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯农药的生物降解。
8.根据权利要求7所述的拟除虫菊酯类农药的降解菌的应用，其特征在于该菌株在pH 7. 0-7. 8、温度25-30 °C、拟除虫菊酯类农药浓度100 mg/L条件下对氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯五种拟除虫菊酯类农药的降解能力均达到75%以上。
全文摘要
本发明公开了一种拟除虫菊酯类农药降解菌，该菌株为HS-24株，分类命名为噬甲基菌(Methylophagasp.)，于2012年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6046，该菌株的16SrRNA的Genbank登陆号为JX087925，该发明同时公开了拟除虫菊酯类农药降解菌的分离纯化方法及应用，优点是可安全、高效、快速的降解海水环境中氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯5种拟除虫菊酯类农药，在近海环境保护、养殖环境农药残留污染治理和保障食品安全方面具有很好的应用前景。
文档编号A62D3/02GK102899270SQ201210345259
公开日2013年1月30日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者史西志, 刘菁华, 孙爱丽, 李德祥, 周磊, 陈炯 申请人:宁波大学