专利名称：假黄单胞菌及其在降解烟碱类杀虫剂吡虫啉中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indicaCGMCC6648及其应用于烟碱类杀虫剂吡虫啉的降解及其羟基化。
背景技术：
卩比虫啉(Imidacloprid,IMI)是一种高效安全、高选择性的含氮杂环类杀虫剂,其作用于昆虫烟碱乙酰胆碱受体，具有触杀、胃毒和内吸活性。MI已广泛用于刺吸式口器害虫如蚜虫和叶蝉及鞘翅目害虫防治，用于建筑防治白蚁和防治猫和狗等宠物身上的跳蚤等。目前，頂I已在全球120个国家登记，在140多种作物上使用。自20世纪90年代以来，頂I已成为我国主要农药品种，主要用于防治水稻褐飞虱、蚜虫等害虫。越来越多的报道显示，MI在土壤中有残留，其降解半衰期超过100d。同时，随着害虫对MI抗性的增加，MI的使用 剂量呈现不断增加的趋势，因而MI的环境的风险性也在不断增加。MI通过以下3条途径在环境中降解:(I)氧化咪唑环烷环，生成5-羟基吡虫啉(5-hydroxyl Ml)，然后脱水转变成烯式吡虫啉(olefin IMI) ； (2)还原硝基基团为亚硝基卩比虫啉(nitrosimine IMI),水解nitrosimine基团变成胍基卩比虫啉(guanidine頂I)，然后进一步氧化生成羰基吡虫啉(urea IMI) ； (3)氧化断裂吡虫啉亚甲基桥途径，生成6-氯烟酸。由于olefin IMI对桃蚜与棉蚜的杀虫效果是IMI的16倍，因而IMI羟基化途径受到研究者的广泛关注，頂I经由5-hydroxy IMI和olefin IMI途径代谢，甚至可提高頂I的对蚕豆蚜的生物活性(Liu et al.2011)。微生物降解法是有机污染物降解的最有效的方法之一。申请人筛选到一株可降解IMI的假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica,该菌株已由申请人提交并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC6648。Pseudoxanthomonas indicaCGMCC6648菌株降解MI的主要途径为羟基化MI生成5-hydroxy IM10在静息细胞转化液中添加糖或有机酸可加速頂I的降解和促进MI的羟基化。申请人也曾申请嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788轻基化IMI的发明专利(专利号:ZL200310106283.X)。与 Stenotrophomonas maltophilia CGMCC1.1788 相比，Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648具有更高的IMI的降解和轻基化能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种可降解烟碱类杀虫剂MI的细菌菌株及其在MI生物降解和羟基化中的应用，本发明示意图如图1所示。本发明所提供的菌株为一种假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC6648。本发明所提供的假黄单胞菌CGMCC6648具降解烟碱类杀虫剂IMI的能力；其降解IMI过程中，产生主要代谢产物5-hydroxy IMI ;产物的液相色评质谱联用分析如图2所示。本发明所提供的假黄单胞菌CGMCC6648降解IMI的方法为:将假黄单胞菌CGMCC6648在营养培养液中振荡培养24h，离心收集和洗涤菌体；将菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，并加入10mmol/L的糖或有机酸盐以及500mg/L卩比虫啉,上述悬浮液分装于体积为50ml的离心管中，每根离心管中分装1-1Oml悬浮液；上述悬浮液于220rpm的摇床中30°C振荡培养。培养48h，假黄单胞菌CGMCC6648可降解1_43%的MI，并生成0.015-0.67mmol/L 的 5-hydroxy IMI。在假黄单胞菌CGMCC6648静息细胞的悬浮液中添加糖或有机酸盐，能有效地促进假黄单胞菌CGMCC6648降解MI及其羟基化活性(图4、图6)。
图1假黄单胞菌CGMCC6648代谢MI的羟基化途径。图2假黄单胞菌CGMCC6648代谢MI的产物质谱图。图3假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中未添加糖和有机酸的条件下代谢頂I的HPLC图。图4假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢頂I的HPLC图。图5嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC1.1788在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加IOOmmoI/L葡萄糖的条件下代谢MI的HPLC图。图6假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L乳糖的条件下代谢頂I的HPLC图。图7假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L丙酮酸钠的条件下代谢頂I的HP LC图。图8假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L琥珀酸钠的条件下代谢頂I的HPLC图。图9假黄单胞菌CGMCC6648在2ml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L苹果酸钠的条件下代谢頂I的HPLC图。图10假黄单胞菌CGMCC6648在Iml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢頂I的HPLC图。图11假黄单胞菌CGMCC6648在IOml反应体积、磷酸盐缓冲液中添加100mmol/L葡萄糖的条件下代谢頂I的HPLC图。
具体实施例方式实例一:可生物降解IMI的菌株分离筛选、鉴定和生物学特性1、菌株分离从江苏省南京市仙林地区采集土壤，取2g 土壤加入含5颗玻璃珠的18mL无菌水中，振荡lOmin，静置5min后，取Iml悬液加入19ml含200mg/UMI的矿物盐培养基中。矿物盐培养基的组成为:1.36g/LKH2P04, 2.13gL Na2HPO4,0.5gL MgSO4.7H20 和 10ml/L 金属离子液，pH7.5。金属离子液组成为:0.40gL CaCl2.2H20, 0.30g/L H3BO3, 0.04gLCuSO4.5H20, 0.lOg/L KI, 0.20g/L FeSO4.7H20，0.40g/LMnS04.7H20，0.20g/LNaMo04.2H20和10.0mL/L浓盐酸。样品于30°C、转速为220rpm的摇床中培养一个月。取100 μ I样品稀释到10_3和10_4后，涂布LB平板。LB培养基组成为(g/L):蛋白胨10、酵母膏5、NaCllO,PH7.2。从LB平板挑取形态不同的单菌落划线至LB平板上，30°C培养3_6天后，再次进行菌种平板划线纯化。总共获得9株形态各异的细菌。2、菌株降解MI能力的测定接种上述纯化菌种至含20mL LB液体培养基的IOOmL三角瓶中，30°C培养24h后离心收集细胞。细胞悬浮于含200mg/L IMI的0.2mol/L的磷酸盐缓冲液中(pH7.5)，安捷伦1200型HPLC仪分析检测MI含量变化。HPLC条件为:流动相为25%乙腈和75%的去离子水，流速为lml/min ;HPLC柱为安捷伦HC-C18反相柱(4.6 X 250mm，5 μ m)，柱温为30°C ；检测波长为269nm。在上述条件下，命名为Z_9的菌株具有可将MI转化为一种极性更大的产物，该产物的HPLC保留时间与5-羟基吡虫啉(5-hydroxy IMI)相同，液相色谱质谱联用分析仪检测该产物的分子量为271 (m+H272)，与5-hydroxy IMI分子量一致(图2)。上述结果表明Z-9菌株可羟基化MI生成5-hydroxy IM103、Z-9菌株的鉴定及生物学特性在LB固体培养基上，Z-9菌落呈米黄色、半透明、光滑、有粘液、凸起、边缘规整。革兰氏阴性。显微镜观察，Z-9菌体呈椭圆状，大小为0.5-0.7X1.3-1.5 μ m。无鞭毛，无芽孢。采用16S rRNA基因序列分析进行 Z-9菌株的分类学鉴定。从含LB固体培养基上用无菌牙签挑取Z-9单菌落接种于装有20mLLB液体培养基的IOOmL三角瓶中，于30 °C、220rpm的摇床中培养16h。发酵液于13000rpm离心5min后收集菌体，采用TaKaRa公司的MiniBEST细菌基因组提取试剂盒提取Z_9菌株的基因组DNA。采用16S rRNA基因扩增通用引物Kl和K2扩增Z-9菌株的16S rRNA基因。Kl 引物序列为:5 ' -AACTGAAGAGTTTGATCC-3 ' (SEQ ID No:1)，K2 引物序列为:5' -TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID No:2)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR扩增条件为:94°C预变性5min后，94°C变性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C延伸lOmin。所得序列由生工生物工程(上海)有限公司测序后，得到的部分16S rRNA基因序列(SEQ ID No:3)在美国国家生物技术信息中心的Genbank数据库中进行blast搜索。比对结果表明Z-9菌株与假黄单胞菌属Pseudoxanthomonas indica亲缘关系最近，相似性达到100%。Z-9菌株于2012年10月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名为假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica,保藏编号为CGMCC6648。实施例二:将-80。C保藏的 Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648 划线于 LB 固体培养基上，于30° C培养箱中培养。挑取单菌落，接种于含25mL LB液体培养基的IOOmL锥形瓶中，30°C，220rpm下振荡培养24h。以1%的接种量接入含IOOmL LB液体培养基的500mL锥形瓶中，30°C，220rpm下振荡培养12h，当OD6tltl值达到5时，取IOml菌液于4°C，8000rpm离心5min，收集菌体。菌体用磷酸盐缓冲液(0.2mol/LNa2HP04/KH2P04,pH7.5)洗涤两次后，悬浮于用IOmL含500mgL的MI磷酸盐缓冲液。取2ml上述转化反应液，分装在三个50ml的离心管里，每管各装2ml，于30°C，220rpm摇床振荡培养48h。HPLC分析(图3) IMI的降解量和5-hydroxy IMI的生成量，结果显示IMI减少了 0.09mmol/L,同时生成0.02mmol/L的5-hydroxy IMI, IMI 的降解率为 5.4%。实施例三:与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了 100mmol/L的葡萄糖，HPLC分析(图 4)结果显不，IMI 减少了 0.BBmmoI /I,,同时生成 0.SQmmoI /I,的 5-hydroxy IMI, IMI 的降解率为43.6%。上述结果表明葡萄糖可极大地促进MI的降解和5-hydroxy IMI的生成。在相同的培养和转化条件下，以嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia CGMCC1.1788替代假黄单胞菌属CGMCC6648，HPLC分析(图5)结果显示MI减少了 0.48mmol/L,同时生成了 0.40mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI 的降解率为 28.2%。上述结果表明，Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648具有比嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC1.1788高得多的IMI降解和羟基化能力。实施例四:与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了 100mmol/L的乳糖，HPLC分析(图6)结果显示，结果显示IMI减少了 0.77mmol/L,同时生成0.67mmol/L的5-hydroxy IMI,IMI的降解率为43.1%。上述结果表明乳糖可极大地促进MI的降解和5-hydroxy IMI的生成。实施例五:与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了 100mmol/L的丙酮酸钠，HPLC分析(图 7),结果显不 IMI 减少了 0.62mmol/L,同时生成 0.61mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI 的降解率为35.8%。上述结果表明丙酮酸盐也能加速MI的降解和5-hydroxy IMI的生成。实施例六:与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了 100mmol/L的琥珀酸钠，HPLC分析(图 8),结果显不 IMI 减少了 0.174mmol/L,同时生成 0.048mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI的降解率为10.39%。实施例七:与实例二基本相同，只是磷酸盐缓冲液中添加了 100mmol/L的苹果酸钠，HPLC分析(图 9),结果显不 IMI 减少了 0.39mmol/L,同时生成 0.16mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI的降解率为23.0%。实施例八: 与实例三基本相同，只是转化液的体积由2ml缩小为1ml。HPLC分析(图10)，结果显不IMI减少了 0.71 mmol /I,,同时生成0.67mmol/L的5-hydroxy IMI, IMI的降解率为
43.5%。实施例九:与实例三基本相同，只是转化液的体积由2ml增加为10ml。HPLC分析(图11)结果显不，结果显不 IMI 减少了 0.016mmol/L,同时生成 0.015mmol/L 的 5-hydroxy IMI, IMI的降解率仅为1.0%。上述结果表明通气量影响5-hydroxy IMI的生成和MI的降解。
权利要求
1.一种假黄单胞菌其保藏号为:CGMCC 6648。
2.黄单胞菌CGMCC6648在降解烟碱类杀虫剂吡虫啉中的应用。
3.一种由权利要求1所述菌株降解吡虫啉的方法，是将假黄单胞菌CGMCC 6648在营养培养液中振荡培养24h，离心收集和洗涤菌体；将菌体悬浮于磷酸盐缓冲液中，并加入10mmol/L的糖或有机酸盐以及500mg/L卩比虫啉,上述悬浮液分装于体积为50ml的离心管中，每根离心管中分装1-1Oml悬浮液；上述悬浮液于220rpm的摇床中30°C振荡培养,假黄单胞菌CGMCC 6648可降解吡虫啉 ，并生成产物5-羟基吡虫啉。
全文摘要
本发明公开了一种降解烟碱类杀虫剂吡虫啉的假黄单胞菌Pseudoxanthomonas indica CGMCC6648；其降解吡虫啉的主要途径为羟基化吡虫啉生成5-羟基吡虫啉。在静息细胞转化液中添加糖和有机酸，可极大地提高假黄单胞菌CGMCC6648的吡虫啉羟基化能力。
文档编号A62D101/28GK103087955SQ20131002247
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者戴亦军, 翟闪, 马源, 刘中华, 葛峰, 袁生 申请人:南京师范大学