嗜气芽孢杆菌及微生物菌剂和它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种嗜气芽孢杆菌(Bacillus?aerophilus)，其保藏编号为CGMCC?No.8840。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC?No.8840的嗜气芽孢杆菌。本发明还提供了如上所述的嗜气芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。通过上述技术方案，本发明可以更加有效地提高治理海洋石油污染的效率。
【专利说明】嗜气芽孢杆菌及微生物菌剂和它们的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及一种嗜气芽孢杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
【背景技术】
[0002]随着石油的海上开采和运输的发展，海洋石油污染的问题日趋严重。钻井平台倾覆、输油管道爆裂或油轮失事经常发生，如2010年7月大连输油管道爆炸造成的近海污染，以及2010年4月英国石油公司BP海上钻井平台倒塌造成的墨西哥湾污染等，据美国国家海洋和大气管理局估计，墨西哥湾底部油井每天漏油大约5000桶，截至2010年6月I日，泄入墨西哥湾的石油达1700万加仑到2700万加仑。都会导致大量石油泄漏到海洋环境中，如不采取科学有效的应对措施予以清除，都会造成难以估量的海洋生态灾难。
[0003]实践证明，海洋石油污染一旦发生，如能采取有效措施，损失就会小得多。迄今为止，海面油污的处理大致分为物理处理法、化学处理法和生物处理法三种。物理处理法主要采用的设备包括:拦油栅、浮油回收船、撇油器、吸油栏、消油剂喷洒装置、浮动油囊、轻便储油器、油拖网等；化学处理法是喷洒各种化学药剂，如分散剂、去垢剂、洗涤剂和其他表面活性剂等，采用这种方法能够把海面的浮油分散成极小的颗粒，使其在海水中乳化、分散、溶解或沉降到海底；生物处理法是根据某些微生物具有氧化和分解石油的能力，来清除海中的石油。
[0004]其中，生物处理法具有环境相容性好等优点，但是生物处理法的效率受到微生物的石油烃降解速率的限制，而目前能够降解石油烃的微生物的降解速率仍然较低。
【发明内容】
[0005]为了克服现有的微生物菌株降解石油烃的速率较低的缺陷，本发明提供了一种嗜气芽孢杆菌，该嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)的保藏编号为CGMCC N0.8840。
[0006]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌。
[0007]本发明还提供了如上所述的嗜气芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
[0008]本发明还提供了如上所述的嗜气芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
[0009]通过上述技术方案，本发明的微生物菌株能够以较高的速率降解石油烃，从而提高了治理海洋石油污染的效率。
[0010]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0011]生物材料保藏
[0012]本发明的嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)是本发明的发明人从山东烟台采集的深山湖底沉积泥样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC N0.8840，保藏日期为2014年2月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)。
【具体实施方式】
[0013]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0014]本发明提供了一种嗜气芽孢杆菌,该嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)的保藏编号为 CGMCC N0.8840。
[0015]本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌。
[0016]其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数可以为(2-300) X 108CFU。
[0017]根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养嗜气芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(Microbiology Culture Media Manual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有l_3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化钠和15-20g/L的琼脂。例如 发酵培养基可以含有:40-150g/L的淀粉、0.5_8g/L的氯化钠、
0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和l-10g/L的氯化亚铁。
[0018]其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125°C和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10_30分钟。
[0019]其中，为了进一步提高所述微生物菌剂降解石油烃的效果，优选地，所述微生物菌剂还含有营养盐；所述营养盐包括NaBr、H3B03、SrCl2、NaF、酒石酸钾钠和苹果酸钠。更优选地，每千克微生物菌剂中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3B03、10_40mg的SrCl2、l_5mg的NaF、0.5-5g的酒石酸钾钠和IO-1OOmg的苹果酸钠。
[0020]其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括:将嗜气芽孢杆菌接种于培养基中进行培养，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为(2-300) X 108CFU。培养的温度可以为28-32。。。
[0021]其中，为了进一步提高所述微生物菌剂降解石油烃的效果，优选地，所述微生物菌剂的制备方法还可以包括:将在发酵培养基中进行培养后得到的物料与营养盐混合；所述营养盐包括NaBr、H3B03、SrCl2、NaF、酒石酸钾钠和苹果酸钠。更优选地，营养盐的用量使得每千克所述微生物菌剂中含有50-100mg的NaBr、10-40mg的H3B03、10-40mg的SrCl2、l_5mg的NaF、0.5-5g的酒石酸钾钠和IO-1OOmg的苹果酸钠。
[0022]本发明还提供了如上所述的嗜气芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
[0023]其中，所述石油烃可以包括烷烃和/或芳烃；所述烷烃的碳原子数可以为11-35，所述芳烃的碳原子数可以为10-20。[0024]本发明还提供了如上所述的嗜气芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
[0025]以下通过实施例进一步详细说明本发明:
[0026]实施例1
[0027]本实施例用于说明本发明的嗜气芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0028]将保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0029]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的氯化亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的嗜气芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,所得到的培养液即为本实施例的微生物菌剂。
[0030]实施例2
[0031]本实施例用于说明本发明的嗜气芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0032]将保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0033]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的氯化亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的嗜气芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,在每kg上述得到的培养液中，加入80mg的NaBr、30mg的H3B03、20mg的SrCl2、3mg的NaF、2g的酒石酸钾钠和50mg的苹果酸钠，混合后得到的物料即为本实施例的微生物菌剂。
[0034]实施例3
[0035]本实施例用于说明本发明的嗜气芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0036]将保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0037]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有40g/L的淀粉、6g/L的氯化钠、lg/L的碳酸钙、8g/L的磷酸二氢钾和8g/L的氯化亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的嗜气芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,在每kg上述得到的培养液中，加入50mg的NaBrUOmg的H3B03、40mg的SrCl2、5mg的NaF、5g的酒石酸钾钠和IOOmg的苹果酸钠,混合后得到的物料即为本实施例的微生物菌剂。
[0038]实施例4
[0039]本 实施例用于说明本发明的嗜气芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
[0040]将保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到种子菌液。[0041]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有120g/L的淀粉、lg/L的氯化钠、4g/L的碳酸钙、3g/L的磷酸二氢钾和2g/L的氯化亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的嗜气芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,在每kg上述得到的培养液中，加入90mg的NaBr、35mg的H3B03、15mg的SrCl2、2mg的NaF、lg的酒石酸钾钠和15mg的苹果酸钠，混合后得到的物料即为本实施例的微生物菌剂。
[0042]对比例I
[0043]将购自ATCC的商品号为ATCC? 49342?的芽孢杆菌(Bacillus sp.)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0044]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的氯化亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,所得到的培养液即为本对比例的微生物菌剂。
[0045]对比例2
[0046]将购自购自ATCC的商品号为ATCC? 49342?的芽孢杆菌(Bacillus sp.)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、10g/L的NaCl和余量的水)中，培养至菌密度OD6tltl值为0.6-0.8，得到种子菌液。
[0047]将IOOmL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的淀粉、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的氯化亚铁)，在30°C下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的芽孢杆菌的活菌数为IO9CFU,在每kg上述得到的培养液中，加入80mg的NaBr、30mg的H3B03、20mg的SrCl2,3mg的NaF、2g的酒石酸钾钠和50mg的苹果酸钠，混合后得到的物料即为本对比例的微生物菌剂。
[0048]测试实施例1
[0049]本测试实施例中，在实验室环境测试实施例1-4和对比例1-2的微生物菌剂的降解石油烃的效果。
[0050]将海边泥沙(取自山东烟台莱州湾，已干燥并灭菌)、水、十六烷和菲按重量比(1000:500:20:20)混合均匀，得到模拟石油烃污染的待处理样品。
[0051]取实施例1-4和对比例1-2的微生物菌剂各20mL，分别与Ikg上述待处理样品混合，在25°C避光下培养30或60天后，得到处理后的样品。用二氯甲烷萃取处理后的样品，并用气相色谱法测定处理后的样品中的十六烷和菲的残留量，并计算十六烷和菲的降解率，结果如表1所示。
[0052 ]表1
[0053]
【权利要求】
1.一种嗜气芽孢杆菌，其特征在于:该嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)的保藏编号为 CGMCC N0.8840。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，其特征在于:所述菌体包括保藏编号为CGMCC N0.8840的嗜气芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于:每克所述微生物菌剂所含的总活菌数为(2-300) X 108CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:所述培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于:所述培养基含有40-150g/L的淀粉、0.5-8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2_10g/L的磷酸二氢钾和l_10g/L的氯化亚铁。
6.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂,其特征在于:所述微生物菌剂还含有营养盐；所述营养盐包括NaBr、H3B03、SrCl2, NaF、酒石酸钾钠和苹果酸钠。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，每千克微生物菌剂中含有50-100mg 的 NaBr、 10-40mg 的 H3B03、10_40mg 的 SrCl2、l_5mg 的 NaF、0.5_5g 的酒石酸钾钠和IO-1OOmg的苹果酸钠。
8.权利要求1所述的嗜气芽孢杆菌和权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在降解石油烃中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述石油烃包括烷烃和/或芳烃；所述烷烃的碳原子数为11-35，所述芳烃的碳原子数为10-20。
10.权利要求1所述的嗜气芽孢杆菌和权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在降解原油中的应用。
【文档编号】A62D3/02GK103952353SQ201410168127
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月24日 优先权日:2014年4月24日
【发明者】赵文勇, 阮志勇, 赵秉强, 王慧敏, 赵君才, 吕昭辉, 刘慧 , 宋昭, 王彦伟, 刘小飞 申请人:烟台海上传奇生物科技有限公司