用于降解菊酯类农药的真菌菌株及其菌剂和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于降解菊酯类农药的真菌菌株及其菌剂和应用，该菌株为腐皮镰孢菌(Fusarium?solani)JZB41C002，已于2014年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏号为CGMCC?No.9202。本发明还公开了一种包含上述菌株的菌剂以及其在降解残留菊酯方面的应用。该腐皮镰孢菌JZB41C002对土壤、水果、蔬菜或水体中残留的菊酯降解效果好，对于基础无机盐培养液中浓度为50mg/L的高效氯氰菊酯，采用本发明菌株处理5天后降解率达到74.6％。
【专利说明】用于降解菊酯类农药的真菌菌株及其菌剂和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种降解农药用的真菌，具体涉及一种用于降解菊酯类农药的真菌菌株及其菌剂和应用。
【背景技术】
[0002]据报道我国农药土壤污染高达1.4亿亩，蔬菜、水果中农药残留超标问题成为制约我国农产品出口的贸易壁垒，急慢性中毒事件也时有发生。有机磷、菊酯、氨基甲酸酯、杂环类等农药的广泛、大剂量使用不仅严重影响农产品的食品安全和质量，也引起了土壤、地表水和地下水的污染。
[0003]菊酯类农药已成为我国出口的蔬菜、水果中主要农药残留之一，引起急慢性中毒事件也越来越多，对人类、水生生物和自然环境造成很大危险。据资料报道，2003年世界拟除虫菊酯杀虫剂的销售额为13.0亿美元，位列杀虫剂第二位。菊酯类农药有蓄积毒性，长期接触会引起慢性疾病，如能刺激乳腺癌细胞增殖和P52基因的表达，具有拟雌激素活性，而且对鱼类，蛘类等水生生物也有很高的毒性。
[0004]例如高效氯氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂，广泛应用于农作物及家庭卫生害虫防除。高效氯氰菊酯具有对光、热稳定的特点，在环境中半衰期较长，很难在自然条件下快速降解，加之长期频繁使用，有关其农药残留超标问题日趋严重，当前农产品质量与安全问题，越来越引起社会的广泛关注。
[0005]而以微生物为主体的生物修复技术可用于降解多种有机污染物，具有安全、高效、无二次污染、费用低等优点，是国际上残留农药处理技术研究的前沿和热点。有关菊酯类农药微生物降解的报道还不多。如研究表明假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、肠杆菌属(Ehterobacte sp.)、产喊杆菌属(Alcaligenes sp.)和芽抱杆菌属(Bacillus sp.)等对拟除虫菊酯类农药具有较好的降解作用。王兆守等从茶叶中分离到一株标号为clf6经鉴定为假单胞菌属的菌株可有效地降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯，降解率分别为55.64% >44.56%和52.19% ?;许育新等分离得到的红球菌Rhodoco-ccus sp.CDT3和辛伟等分离到的蜡状芽孢杆菌BaciIluscereus TR2均可以降解氯氰菊酯。因此，开展拟除虫菊酯类农药微生物修复技术研究，筛选不同类型的菊酯类农药特别是高效氯氰菊酯的高效降解微生物菌株，可为减低土壤或作物中菊酯类农药残留提供有效手段，为保障农产品安全和农田环境安全提供技术支持。
[0006]但是，对菊酯类农药特别是高效氯氰菊酯具有高效降解性能的微生物菌株数量还比较有限，降解效率均不是很高，而且利用微生物实现对农药进行降解，机理十分复杂，具有很强的针对性，因此急需一种对菊酯类农药特别是高效氯氰菊酯具有高效降解性能的菌株。
【发明内容】
[0007]针对现有技术的缺陷，本发明的第一目的在于提供一种用于降解菊酯类农药的真菌菌株。
[0008]本发明的第二目的在于提供一种含有上述真菌菌株的菌剂。
[0009]本发明的第三目的在于提供上述真菌菌株或菌剂的应用。
[0010]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0011]—种用于降解菊酯类农药的真菌菌株，其为腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)JZB41C002，该菌株已于2014年5月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏号为CGMCC N0.9202，其保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0012]上述真菌菌株来源于北京市通州区种植蔬菜的农田土壤中，经过富集、分离和纯化得到，其对菊酯类农药特别是高效氯氰菊酯具有很强的降解作用。
[0013]上述真菌菌株的菌落特征如下:在PDA培养基上菌落呈现白色，松散絮状，28°C培养5d后菌落直径达5.35cm,背部微显淡黄色,呈圆形。
[0014]上述真菌菌株的孢 子特征如下:产生大小两种类型分生孢子，大型分生孢子梭形至月牙形，无色透明，两端较钝，具2~4个隔膜,多为3个,大小为21.6~36.5 μ mX 3~4 μ m。小型分生孢子纺锤形至卵圆形,具O~I个隔膜,大小为4.3~23 μ mX 2.0~4.5 μ m。产孢细胞属于简单瓶梗。
[0015]上述真菌菌株JZB41C002的ITS序列具有序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。将其用DNAMAN version5.2.2和BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比对，发现该菌JZB41C002与腐皮镰孢菌(Fusarium solani)的同源性最高,达到99%。
[0016]本发明参照《真菌鉴定手册》(魏景超)镰孢菌属特征，并结合上述形态特征和ITS序列相似性，将菌株JZB41C002鉴定为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。
[0017]本发明腐皮镰孢菌JZB41C002在好氧条件下可以利用菊酯类农药作为唯一碳源，该菌可在PDA培养基上生长，也可在含有菊酯类农药浓度为I~100mg/L的基础无机盐培养基中培养，生长温度为28~30°C，pH为6~7，最适生长温度为30°C，最适pH为7.0。
[0018]一种含有上述真菌菌株的菌剂，所述菌剂的制备方法如下:将腐皮镰孢菌JZB41C002接种于LB液体培养基中，在28~30°C条件下振荡培养至对数周期，培养时间为36-48h，所得培养液即为所述菌剂。
[0019]上述真菌菌株在降解残留菊酯方面的应用。
[0020]上述菌剂在降解残留菊酯方面的应用。
[0021]在上述菌剂的应用中，作为一种优选实施方式，所述菌剂在降解残留菊酯方面的应用具体方法为:将菌剂均匀喷洒于被处理物表面，其中菌剂使用浓度为
0.5-5.0X 107CFU/g，所述菌剂在28~30°C条件下于所述被处理物表面停留1_12天，更优选停留4-6天。
[0022]所述菊酯可以是高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯和三氟氯氰菊酯中的一种或多种，优选为高效氯氰菊酯。
[0023]本发明的有益效果:该腐皮镰孢菌JZB41C002对土壤、水果、蔬菜或水体中残留的菊酯降解效果好，对于基础无机盐培养基中浓度为50mg/L的高效氯氰菊酯，采用本发明菌株处理5天后降解率达到74.6% ;对于基础无机盐培养基中浓度为50mg/L的氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯或三氟氯氰菊酯，采用本发明菌株处理5天后降解率分别为72.8%、61.7%,65.4%,73.6%。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明真菌菌株在基础无机盐培养基中的生长与对其中的高效氯氰菊酯的降解效果图； [0025]图2为本发明真菌菌株在高效氯氰菊酯不同初始浓度下的降解效果图；
[0026]图3为本发明真菌菌株在不同初始pH下对高效氯氰菊酯的降解效果图；
[0027]图4为本发明真菌菌株在不同温度下对高效氯氰菊酯的降解效果图。
【具体实施方式】
[0028]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将采用实施例的方式对本发明进行详细说明。
[0029]本发明中使用的各种培养基均采用常规方法配制，实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法，均参照SambrookJ等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)。
[0030]本发明中使用的各种培养基的配制方法如下:
[0031]富集培养基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g,蒸懼水补至1000mL,调pH至7.0,高压灭菌20min。
[0032]普通培养基:蛋白胨5g、牛肉膏3g、氯化钠5g,琼脂15g、蒸懼水补至1000mL,调pH至7.0,高压灭菌20min,然后倒平板。
[0033]基础无机盐培养基:1gNH4NO3,0.5g MgS047H20，0.5g (NH4) 2S04，0.5g KH2PO4,0.5gNaCl, 1.5g K2HPO4,蒸懼水补至1L,调pH至7.0,高压灭菌20min。
[0034]分离培养基:lgΝΗ4Ν03、0.5g MgSO4.7Η20、0.5g(NH4)2S04、0.5gKH2P04、0.5g NaCl、1.5g K2HPO4> 15g琼脂、蒸懼水补至1L,调pH至?.0,高压灭菌20min,然后倒平板。
[0035]PDA培养基:200g马铃薯(去皮)，20g葡萄糖，20g琼脂，蒸馏水补至1L，pH =7.2 (具体配制方法为:称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10_20g葡萄糖和17-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml, 15磅蒸气、121°C、灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用)。
[0036]LB液体培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，蒸馏水补至1L，调pH至
7.0,高压灭菌20min。
[0037]LB固体培养基:胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaC110g，15g琼脂、蒸馏水补至1L，调pH至7.0,高压灭菌20min,然后倒平板。
[0038]实施例1:腐皮镰孢菌(Fusarium solani) JZB41C002的分离与纯化
[0039]取来源于北京通州区且施用过高效氯氰菊酯的菜田土壤样品3份，分别拌均，各取IOg,在无菌操作条件下，分别加到含高效氯氰菊酯浓度为50mg/L的IOOmL富集培养基的三角瓶中，在30°C下120r/min摇床上培养7d ;之后按10%的接种量(本实施例中“10%的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)将其转接到含高效氯氰菊酯浓度为100mg/L的下一批富集培养基中，继续培养7d ;再按10%的接种量转接到含高效氯氰菊酯浓度为200mg/L的富集培养基中，培养7d ;接着按10%的接种量转接到含高效氯氰菊酯浓度为200mg/L的基础无机盐培养基中，继续培养7d ;再按10%的接种量转接到含高效氯氰菊酯浓度为200mg/L的基础无机盐培养基中，继续培养7d ;然后各取0.1mL基础无机盐培养基发酵液分别转接到对应的普通培养基平板上，涂布平板，置于30°C恒温培养箱中培养2d-3d，选取不同形态特征的单菌落接种于含高效氯氰菊酯浓度为200mg/L的分离培养基上，采用平板划线法分别进行3次分离纯化。纯化后选取平板上长势较好的单菌落菌株编号，其中一株定名为JZB41C002，保存于具有PDA培养基的斜面试管中。
[0040]实施例2:腐皮镰孢菌(Fusarium solani) JZB41C002的ITS序列鉴定
[0041]PCR模板的获取包括两种方法，一种是提取基因组DNA以将其作为PCR模板，另一种是采用Takara公司的一种特殊酶，直接进行真菌的菌落PCR。下面对两种方法均做一介绍。
[0042]真菌鉴定中通用引物，即ITSl:5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCG G_3’ (SEQ IDN0.2)，ITS4:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ (SEQ ID N0.3)。
[0043]A)直接菌落PCR:[0044]a)模板的制备:将本发明纯化后的真菌JZB41C002接种到PDA培养基上，在25-28°C恒温培养箱中培养2-3d，挑取极微量菌丝即可作为PCR扩增的模板。本实施例采用此方法获得PCR模板。
[0045]b) PCR 反应体系:Mighty Amp DNA Polymerase (购自 Takara 公司)0.5μ L,ITSl(10 μ mol/L)0.5 μ L, ITS4(10 μ mol/L)0.5 μ L,2 X Reaction Buffer 10 μ L(购自Takara公司)，模板I μ L，ddH20补充至20 μ L。PCR扩增程序:预变性98 °C 2min;变性98°C 10s，退火56°C 15s，延伸68°C lmin，共35个循环。本实施例采用此PCR条件。
[0046]c)琼脂糖凝胶电泳:I % (0.5 X TBE)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并成像。
[0047]d)扩增产物测序及分析:回收的扩增产物由中美泰和生物技术(北京)有限公司进行T克隆后测序。
[0048]B)以JZB41C002基因组总DNA为模板的PCR:
[0049]a) JZB41C002基因组总DNA提取:将本发明纯化后的真菌JZB41C002接种到PDA培养基上在28 V培养48h后，分离出JZB41C002菌菌丝，将其液氮研磨后，称取0.5g研磨后的菌丝，按天根真菌DNA out试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)的操作说明对基因组总DNA进行提取。
[0050]b) PCR 反应体系:Taq DNA Polymerase0.5 μ L, ITSl (10 μ mol/L) 0.5 μ L,ITS4(10ymol/L)0.5μ L，超纯 dNTP Mixture2 μ L, Taq Reaction Buffer2.5 μ L，模板基因组DNAl μ L，ddH20补充至25 μ L。PCR扩增程序:预变性95°C 4min ;变性95°C 30s，退火48°C 30s，延伸72°C lmin，共30个循环；最后延伸72°C IOmin0
[0051 ] c)琼脂糖凝胶电泳:I % (0.5 X TBE)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物并成像。
[0052]d)扩增产物测序及分析:回收的扩增产物由中美泰和生物技术(北京)有限公司进行T克隆后测序。
[0053]经测序后本发明降解菌JZB41C002的ITS序列如序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，用DNAMAN version5.2.2和BLAST软件将其与GenBank中的序列进行同源性比对，发现该菌与腐皮镰孢菌(Fusarium solani)的同源性最高,达到99%。
[0054]实施例3:菌株JZB41C002对高效氯氰菊酯的降解效果测定[0055]I)将纯化后的菌株JZB41C002在LB液体培养基中培养至对数周期(对数周期采用测定0D600值来确定，0D600值达到0.8即为对数周期)，然后以10%接种量(本实施例中“ 10 %的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)将其接入含高效氯氰菊酯浓度为50mg/L的基础无机盐培养液中，在30°C，120r/min的恒温摇床上振荡培养5天，同时设不接菌的培养液作对照，每个样品处理3个重复。培养结束后，吸取上清液2mL，加入IOmL乙腈，2g NaCl,润旋lmin,静置30min,分层，吸取上清液ImL, 40°C条件下在旋转蒸发仪上浓缩至干，用正己烷定容10mL，进样I μ L气相色谱电子捕获检测器(GC-EOT)测定农药高效氯氰菊酯的残留量。
[0056]2)农药高效氯氰菊酯的残留量检测方法:
[0057]Α)采用外标法
[0058]用正己烷将高效氯氰菊酯标准溶液依次稀释成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10mg/L浓度，然后用气相色谱仪测定，每次进样I μ L，每个样品处理3个重复，取峰面积的平均值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。
[0059]B)高效氯氰菊酯的气相色谱测定条件
[0060]色谱柱:100 %聚甲基硅氧烷DB-1柱，30mX0.25mmX0.25μπι ;进样口温度:200°C;检测器温度:300°C;载气:氮气，纯度≥99.999%，流速为lmL/min ;辅助气:氮气，纯度≥99.999%，流速为60mL/min ;柱温采用程序升温:起始150°C，保持2min，以6°C /min升至270°C，保持8min。
[0061]通过步骤A)的标准曲线得到培养液中高效氯氰菊酯残留量。
[0062]通过残留量可以得到高效氯氰菊酯的降解率，结果参见图1，其中降解率=(对照培养液中高效氯氰菊酯残留量-处理培养液中高效氯氰菊酯残留量)/对照培养液中高效氯氰菊酯残留量X100%。
[0063]3) JZB41C002的生长曲线测定:紫外可见分光光度计测定波长为600nm的培养液的光密度值，结果参见图1。
[0064]图1中可见菌株JZB41C002在50mg/L高效氯氰菊酯浓度的基础无机盐培养基中的生长与降解情况。
[0065]实验结果表明，随着时间的延长，菌株的生长由缓慢上升到快速，5天时达到最高，随后下降。高效氯氰菊酯的浓度随菌株生长速率增加，显著降低，5天时高效氯氰菊酯的残留量为12.7mg/L(此时降解率达到74.6% )，随后降低趋于平缓，可能是随着农药被降解，可供使用的碳源减少，菌株的生长速率下降，对农药的降解也随之减慢。
[0066]实施例4:菌株JZB41C002对不同浓度高效氯氰菊酯的降解效果
[0067]将纯化后的菌株JZB41C002在LB液体培养基中培养至对数周期，以10%接种量(本实施例中“10%的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)分别接入含高效氯氰菊酯浓度依次为l、5、10、20、50、100mg/L的基础无机盐培养基中，在30°C，120r/min的恒温摇床上振荡培养5天，同时设不接菌的培养液作对照，每个样品处理3个重复。培养结束后，气相色谱检测培养液中农药高效氯氰菊酯的残留量，具体检测方法同实施例3。
[0068]菌株JZB41C002在高效氯氰菊酯不同初始浓度下的降解曲线参见图2。
[0069]实验结果表明，菌株对无机盐培养液中I~100mg/L的高效氯氰菊酯均具有降解能力，接种培养5d的降解率高于3天的。其中接种培养5d条件下，对初始浓度5~IOmg/L的高效氯氰菊酯的降解率在90%以上，对20~50mg/L的高效氯氰菊酯的也具有较高的降解能力，降解率在70%以上，其中对浓度50mg/L的高效氯氰菊酯的降解率达到72.5%。
[0070]实施例5:初始pH对菌株JZB41C002降解高效氯氰菊酯的影响
[0071]将纯化后的菌株JZB41C002在LB液体培养基中培养至对数周期，以10%接种量(本实施例中“ 10%的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)接入不同pH的基础无机盐培养基中，基础无机盐培养基中初始高效氯氰菊酯浓度为50mg/L,无机盐培养基的初始 pH 分别设为 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，用 NaOH 和 HCl 水溶液调节 pH，30°C、120r/min摇床中培养，5d后取样测定。吸取上清液2mL，加入IOmL乙腈，2g NaCl，涡旋lmin，静置30min,分层，吸取上清液ImL, 40°C条件下在旋转蒸发仪上浓缩至干,用正己烧定容IOmL,然后参照实施例3的检测方法采用气相色谱检测培养液中农药高效氯氰菊酯的残留量。
[0072]结果如图3所示，表明在不同的pH条件下，菌株JZB41C002对高效氯氰菊酯的降解率不同，在PH6.0~7.0时，降解率较高，超过60% ;在？117.0时，降解率达到最高，为72.4%。
[0073]实施例6:温度对菌株JZB41C002降解高效氯氰菊酯的影响
[0074]将纯化后的菌株JZB41C002在LB液体培养基中培养至对数周期，以10%接种量(本实施例中“ 10%的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)接入pH为7.0的基础无机盐培养基中，该培养基中初始高效氯氰菊酯浓度为50mg/L，在不同温度20、25、30、35、40、45、50°C条件下、120r/min摇床中培养，5d后取样测定。吸取上清液2mL，加入IOmL乙腈，2g NaCl,润旋lmin,静置30min,分层，吸取上清液ImL, 40°C条件下在旋转蒸发仪上浓缩至干，用正己烷定容10mL，然后参照实施例3的检测方法采用气相色谱检测培养液中农药高效氯氰菊酯的残留量。
[0075]结果如图4所示，表明在温度25~35°C时，菌株JZB41C002对高效氯氰菊酯的降解效果较好，可能是此温度范围条件下，较适合菌株的生长；在301:时，降解率为73.2%，达到最佳。
[0076]实施例7:菌株JZB41C002对氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯的降解效果
[0077]将纯化后的菌株JZB41C002在LB液体培养基中培养至对数周期，以10%接种量(本实施例中“10%的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)分别接入含氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯浓度为50mg/L的基础无机盐培养基中进行降解，在30°C，120r/min的恒温摇床上振荡培养5天，同时设不接菌的培养液作对照，每个样品处理3个重复。培养结束后，气相色谱检测农药的残留量。
[0078]农药的残留量的检测方法:
[0079]I)氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯添加回收率测定
[0080]分别在不同的20mL基础无机盐培养基中添加浓度为500mg/L的氰戍菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯标准溶液40 μ L, 400 μ L, 4mL,充分混匀后，取2mL，加入IOmL乙腈，2gNaCl,润旋lmin,静置30min,分层，吸取上清液ImL, 40°C条件下在旋转蒸发仪上浓缩至干，用正己烷定容10mL，GC-E⑶分析测定，进样I μ L，每个样品重复测3次，取其平均值，计算添加回收率和变异系数。回收率为84.2% -97.6%，变异系数为3.2% -6.7%，表明该测定方法符合农药残留分析的要求，是准确、可靠的。[0081 ] 2)氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯标准曲线的绘制
[0082]采用外标法。用正己烷分别将氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯标准溶液依次稀释成0.05,0.1、0.2、0.5、l、2、5、10mg/L浓度，然后用气相色谱仪测定，每次进样lyL，每个处理重复3次，取峰面积的平均值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。
[0083]3)氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯的气相色谱测定条件
[0084]色谱柱:100 %聚甲基硅氧烷DB-1柱，30mX0.25mmX0.25μπι ;进样口温度:200°C;检测器温度:300°C;载气:氮气，纯度≥99.999%，流速为lmL/min ;辅助气:氮气，纯度≥99.999%，流速为60mL/min ;柱温采用程序升温:起始150°C，保持2min，以6°C /min升至270°C，保持8min。
[0085]通过步骤2)的标准曲线分别得到不同培养液中四种菊酯的残留量并通过残留量计算降解率。
[0086]实验结果表明，菌株JZB41C002对基础无机盐培养基中氰戍菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯也具有一定的降解效果，对浓度为50mg/L的氰戍菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯处理5天后降解率分别为72.8%,61.7%,65.4%,73.6%。
[0087]实施例8:模拟土壤菊酯类农药降解试验
[0088]选取未施农药 的北京郊区田间表层土壤(0-20cm) 一定量,每份称取250g 土壤，置于大表面皿中，各份中分别添加高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯，其中每种农药的添加浓度分为两种，分别为10和50mg/kg，然后将制备的降解菌剂(菌剂的制备方法如下:将菌株JZB41C002接种于含IOOmL LB液体培养基的500mL摇瓶中，在30°C、120r/min条件下振荡培养至对数周期，培养时间为36_48h，所获培养液即为菌剂)均匀喷施于上述各份添加有菊酯农药的土壤表面，喷施浓度为1.0X 107CFU/g 土壤，并设清水对照，置于30°C培养箱中，在黑暗条件下培养12天后，取样测定5种菊酯类农药在土壤中的残留量，测定方法如下:取5g 土壤样品，置于50mL塑料离心管中，加入30mL乙腈，超声15min,然后加入4gNaCl,润旋lmin,静置30min,分层,然后在4000r/min离心5min ;取
1.5mL上述离心后的上清液,加入含150mg无水硫酸镁,50mg PSA的小离心管中，在旋润振荡仪上涡旋Imin后静置,然后取ImL上清液过0.22 μ m的膜后,将滤液转入另一试管中,在40°C下氮吹至干，用IOml正已烷定容，超声溶解l_2min后，转入进样小瓶中，待气相色谱仪(GC)分析，气相色谱仪分析条件同实施例7。结果见表1。从表1中可以看出，此降解菌剂可以有效去除高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯与三氟氯氰菊酯在土壤中的残留，去除效果较好。
[0089]表1菌株JZB41C002对土壤中菊酯类农药的降解率
【权利要求】
1.一种用于降解菊酯类农药的真菌菌株，该菌株为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)JZB41C002,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.9202。
2.一种含有权利要求1所述真菌菌株的菌剂。
3.—种权利要求2所述菌剂的制备方法，其特征在于，将腐皮镰孢菌JZB41C002接种于LB液体培养基中，在28~30°C条件下振荡培养至对数周期，培养时间为36-48h，所得培养液即为所述菌剂。
4.权利要求1所述真菌菌株在降解残留菊酯方面的应用。
5.权利要求2所述菌剂在降解残留菊酯方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法如下:将菌剂均匀喷洒于被处理物表面，其中菌剂使用浓度为0.5-5.0X 107CFU/g，所述菌剂在28~30°C条件下于所述被处理物表面停留1-12天。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述菌剂在所述被处理物表面停留4-6天。
8.权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于，所述菊酯选自高效氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯和三氟氯氰菊酯中的一种或多种。
【文档编号】A62D101/28GK103952323SQ201410216332
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月21日 优先权日:2014年5月21日
【发明者】陈莉, 李文华, 贾春虹, 卢彩鸽, 余苹中, 朱晓丹, 贺敏, 赵尔成 申请人:北京市农林科学院