一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用的制作方法

本发明涉及抗生素生产废料处理技术领域，具体涉及一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用。

背景技术：

头孢菌素类抗生素属于β-内酰胺类抗生素中的7-氨基头孢烷酸衍生物，是目前广泛使用的抗生素。因其通过破坏细菌的细胞壁而达到治疗的目的，具有抗菌谱广、毒害小、对人几乎无毒害等特点，故被人们广泛用于医疗、农业以及畜牧养殖产业，在保障人类健康中发挥着重要的作用。生产抗生素的方法有很多，如生物合成法、发酵法等，但无论采取哪种方法，生产过程均会产生大量的废弃药渣。从1949年，美国首次利用药渣中含有的大量多糖、蛋白质和多种氨基酸及微量元素，将其回收加工生产成生物蛋白粉，作为蛋白饲料(添加剂)或者肥料，1957年以后我国也有数家相关单位开展了抗生素药渣用作高蛋白饲料原料及药物性添加剂的研究并将其成果投入生产，自此这种情况一发不可收拾。近年来，随着人们对生态环境污染问题、生态安全问题的日益重视，抗生素菌渣用于饲料途径的引起了众多非议。科学家们发现生物若长期摄入抗生素，即使摄入量很少，也会使机体产生抗生素耐药性，不仅对机体正常活动产生干扰，还会在食物链中传递，最终影响到人体乃至整个生态系统，对人类的公共健康和生态安全构成潜在威胁。自2002年起，国家有关部门开始禁止将抗生素菌渣用作饲料或饲料添加剂，并在2008年国家环保部门将抗生素菌渣列为危险废弃物，可见抗生素残留问题引起了人们极大的重视，抗生素菌渣直接作为饲料的途径也宣布终止。因此，目前，处理抗生素菌渣的方式有焚烧、填埋，或作为生产有机肥的原料。不仅极大地限制了抗生素药渣的循环利用，造成极大浪费，和严重的二次发酵污染，也给制药企业带来沉重负担。所以，如何安全、有效、合理的利用废弃药渣已成了制药企业亟待解决的重大课题，也是我国制药工业可持续发展战略的要求，更是发展循环经济，搞好末端治理建设、建成环境友好企业的重要保障。目前处理残留抗生素的技术主要集中在以废水残留抗生素为底物应用物理、化学手段进行治理方面的研究，所用方法周期长、成本高、效率低。废弃药渣的处理问题仍不能得到有效解决。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用。本发明方法可行、稳定且环境友好，简单实用，为资源的有效利用及环境的治理提供理论依据。

本发明提供了一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用。

本发明还提供了一种降解废弃药渣中头孢菌素类抗生素的方法，包括以下步骤：

将木糖氧化无色杆菌接种到含头孢菌素类抗生素的废弃药渣中进行发酵培养1～7d；所述发酵培养的ph值为5～9；所述发酵培养的转速为60～180rpm。

优选的是，所述发酵的温度为35～38℃。

优选的是，所述接种的量为8～11％。

优选的是，所述发酵培养的ph值为6～7。

优选的是，所述发酵培养的转速为120rpm。

本发明还提供了一种降解头孢菌素类抗生素的试剂，所述试剂包括木糖氧化无色杆菌和辅料。

优选的是，所述辅料包括蛋白胨、葡萄糖和水中的一种或多种。

本发明提供了一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用。本发明利用木糖氧化无色杆菌对头孢菌素类抗生素进行降解，降解率高，降解能力稳定，可用于处理药渣中残留的头孢菌素类抗生素。试验结果表明，本发明能够实现药渣中头孢菌素类抗生素的高效降解，降解率高达92.71％。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的电镜下菌株形态图；

图2为本发明实施例1提供的电镜下孢子形态图；

图3为本发明实施例1提供的进化树分析结果图；

图4为本发明实施例2提供的木糖氧化无色杆菌降解残留头孢菌素类抗生素的结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用。本发明所述木糖氧化无色杆菌能够降解头孢菌素类抗生素，能够实现废渣或废液中头孢菌素类抗生素的高效降解。

本发明还提供了一种降解废弃药渣中头孢菌素类抗生素的方法，包括以下步骤：

将木糖氧化无色杆菌接种到含头孢菌素类抗生素的废弃药渣中进行发酵培养1～7d；所述发酵培养的ph值为5～9；所述发酵培养的转速为60～180rpm。在本发明中，所述发酵的温度为35～38℃，更优选为37℃。在本发明中，所述接种的量为8～11％，更优选为10％。在本发明中，所述废弃药渣中，头孢菌素类抗生素的浓度范围优选为30～2000mg/l，更优选为500mg/l。在本发明中，所述发酵培养的ph值优选为6～7。在本发明中，所述发酵培养的转速优选为120rpm。

本发明还提供了一种降解头孢菌素类抗生素的试剂，所述试剂包括木糖氧化无色杆菌和辅料。在本发明中，所述辅料优选包括蛋白胨、葡萄糖和水中的一种或多种。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规辅料市售产品即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种木糖氧化无色杆菌在降解头孢菌素类抗生素中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1头孢菌素类药渣大同市威奇达企业供给的长期堆放的头孢菌素类湿性药渣土壤，堆放前，对所用药渣含水量进行检验，得知药渣含水量为75％，残留的头孢菌素500mg/l

头孢克肟分散片：100mg(一片)

1.1.2土壤大同市威奇达企业厂内土壤

1.1.3培养基按周期配置的驯化培养基如表1所示。

表1驯化培养基配比

1.1.4实验试剂与仪器ph＝7.0的nah2po4-na2hpo4缓冲液、apr-80大容量离心机(广州沪瑞明仪器有限公司)，uv-1200紫外可见分光光度计(北京尼雅科技有限公司)，sh2-82水浴恒温振荡器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，spx-1508-z生化培养箱(江苏天由有限公司)，sw-cj-2f洁净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，hzq-f160全温震荡培养箱(江苏太仓市实验仪器厂)，ls-75lj立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨州实验仪器厂)，fei公司tecnaispirit透射电镜，离心机，电泳仪，pcr仪，abi3730xl测序仪。

1.2方法和结果

1.2.1药渣堆放将头孢菌素药渣放于土壤之上进行堆放，每隔一星期在堆放土壤上施浓度为100mg/l头孢克肟溶液，使得土壤保持湿润。持续堆放45d。

1.2.2制备土壤浸出液称取堆放的土壤样品10g，磷酸缓冲液(ph＝7)90ml置于150ml三角瓶中，将其在恒温震荡培养箱中放置24h，使土壤样品充分打散。然后进行过滤，得到土壤浸出液，其中含有待筛选的能降解头孢菌素类抗生素的菌株。

1.2.3废弃药渣中头孢菌素类降解菌的驯化与筛选

1.2.3.1接种以10％的接种量将获得的土壤浸出液接入到含有头孢药品的液体培养基中进行培养。其中头孢药品为是第三代头孢药品头孢克肟。具体配置方案为取10ml土壤浸出液，接入到90ml的含头孢药品的培养基中，在37℃、120r/min的全温震荡培养箱中培养72h。

1.2.3.2菌种的驯化菌种的驯化分为四个周期，每个周期在37℃、120r/min的全温震荡培养箱中培养72h。驯化第一周期，取10ml土壤浸出液，加入到90ml第一周期配比的驯化培养基中，上述条件下培养。驯化第二周期，即取10ml第一周期驯化后所得的菌液，加入到90ml第二周期配比的驯化培养基中，上述条件下培养。驯化第三周期，第四周期菌液依次类推，然后将其加入到各周期的驯化培养基中，其他培养条件不变(如表2所示)。测定每一个驯化周期残留的头孢药品的含量。随着蛋白胨和葡萄糖含量的减少，头孢药品含量的增加，筛选出以头孢药品为唯一碳源的菌株。

表2菌种的驯化

注：a1、a2、a3代表第一周期的处理；b1、b2、b3代表第二周期的处理；c1、c2、c3代表第三周期的处理；d1、d2、d3代表第四周期的处理

1.2.3.3菌种的筛选配置lb固体培养基，加入100mg/l的头孢药品，灭菌，倒平板，待凝固后制备成含有头孢药品的固体培养基。然后对驯化第四周期所得的d1、d2、d3菌液进行稀释，即吸取1ml菌液先稀释10倍，依次直到稀释到10^-8。最后用移液管取1ml稀释菌液均匀涂布到含头孢药品的固体培养基中，37℃恒温培养。

菌株的分离筛选由表3可知，第1驯化周期菌种对头孢菌素类药品的最高降解率为44.51％，第2、第3周期菌种对头孢菌素类药品的降解率逐渐增加，增加的幅度为1.15～4.71％；第4周期中未添加碳源，只添加了少量作为氮源的蛋白胨，并且第4周期降解率最高达到了68.69％，说明头孢菌素类降解菌以高浓度头孢菌素抗生素为主要营养物质。将第四周期所得菌接种到lb固体培养基上，根据菌落形态等特征区分，试验初步分离降解效果明显且稳定的菌株。

表3驯化个周期头孢菌素残留量及降解率

注：“—”表示未接入菌种，故无降解率；a1、a2、a3代表第1周期的处理；b1、b2、b3代表第2周期的处理；c1、c2、c3代表第3周期的处理；d1、d2、d3代表第4周期的处理。

1.2.3.4菌种的纯化对筛选得到的菌种培养72h后，经过2～3次平板划线，得到单个菌落，观察并加以保存。

1.2.4菌种的鉴定

1.2.4.1菌落形态学观察(1)将菌落接在含头孢药品的固体培养基上。72h后，观察菌落的形态和色泽。(2)将分离纯化所得样品于三联兄弟生物医药研究(北京)有限公司进行包埋。在梯度为40℃聚合2h，60℃聚合4h，80℃聚合10h后，制成超薄切片。然后对切片进行双染,即用3％醋酸双氧铀染色15min，柠檬酸铅染色10min。电镜下观察菌丝和孢子形态特征。

菌落的形态观察将筛选分离纯化后的菌种接种在固体培养基上，其形态为圆形，淡黄色，表面光滑，湿润，边缘整齐。电镜检测显示其为杆状或球形，无孢子(如图1-2所示)。

1.2.4.2菌落的分子生物学鉴定对获得的菌株进行细菌dna的粗提，电泳检测后进行pcr扩增。用细菌16srdna通用引物进行pcr扩增。整个反应体系为50μl。10×extaq缓冲液5.0μl，2.5mm四种脱氧核糖核苷4.0μl，10ppm上游引物1.0μl，10ppm下游引物1.0μl，样品2.0μl，双氧水36.5μl。反应条件为，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，进行30个循环。反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。将测序结果与ncbi核酸数据库进行序列blast分析，并利用mega5.0软件进行聚类。

菌种的分子生物学鉴定结果将所得菌株16srdna(1287bp)拼接序列与ncbi数据库中的核酸序列进行比对，通过blast发现该菌株与未培养细菌jpl1_35(14)(ncbi)同源性达100％，与其它多种无色杆菌属achromobactersp.同源性达99％，进一步利用mega7.0软件进行多重序列比对构建进化树，发现该菌与achromobacterxylosoxidansstrain(3)(图3所示)，同源性达99％且处于同一分支，结合形态学观察和16srdna序列分析结果，最终判定菌株是木糖氧化无色杆菌。

实施例2

将木糖氧化无色杆菌与含头孢菌素类抗生素的废弃药渣混合，在ph为6，转速是120r/min、培养温度37℃的条件下发酵培养木糖氧化无色杆菌，1d培养条件下头孢类降解率达到84.76％，培养7d降解率高达92.71％，如图4所示，降解率高，较传统的物理法化学法，反应过程无需有毒试剂、药品，符合当今绿色化学的生产需求，环境友好。

实施例3

将木糖氧化无色杆菌与含头孢菌素类抗生素的废弃药渣混合，在ph为7，转速是110r/min、培养温度36℃的条件下发酵培养木糖氧化无色杆菌，培养6d降解率高达92.03％，降解率高，较传统的物理法化学法，反应过程无需有毒试剂、药品，符合当今绿色化学的生产需求，环境友好。

实施例4

将木糖氧化无色杆菌与含头孢菌素类抗生素的废弃药渣混合，在ph为6.5，转速是130r/min、培养温度38℃的条件下发酵培养木糖氧化无色杆菌，培养6d降解率高达90.28％，降解率高，较传统的物理法化学法，反应过程无需有毒试剂、药品，符合当今绿色化学的生产需求，环境友好。

实施例5

将木糖氧化无色杆菌与含头孢菌素类抗生素的废弃药渣混合，在ph为6.0，转速是150r/min、培养温度35℃的条件下发酵培养木糖氧化无色杆菌，培养7d降解率高达91.26％，降解率高，与传统的物理法、化学法相比，反应过程无需有毒试剂、药品，符合当今绿色生产的需求，环境友好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。