一种降解含金属离子或有机溶剂的邻苯二甲酸酯类的方法与流程

本发明涉及一种降解含金属离子或有机溶剂的邻苯二甲酸酯类的方法，属于酶工程领域。

背景技术：

羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3.1.1.1)是指能够催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特异性酯酶，与单酰丙三醇酯酶、芳酰胺酶及胆碱酯酶等同属于B酯酶，在结构上与脂肪酶同属于α/β水解酶家族。

羧酸酯酶广泛存在动物、植物和微生物中，目前的研究主要集中在动物肝脏中参与药物代谢的羧酸酯酶和昆虫体内具有药物抗性的羧酸酯酶，对微生物源的羧酸酯酶的研究相对较少。但由于来源于微生物源的羧酸酯酶产量高、稳定性好，催化效率高，因此得到越来越多人的关注。

邻苯二甲酸酯(PAEs)作为塑化剂大量应用于生产生活并进入环境，严重威胁到生态环境安全和人体健康。环境中塑化剂残留的高效降解已成为现在环境保护的迫切需要和研究热点。生物修复是环境治理的重要手段之一，目前主要的方法是利用微生物菌株进行降解，从已经分离出的邻苯二甲酸酯降解菌来看，在温度为25-30℃条件下，培养0.5-10天将不同浓度的邻苯二甲酸酯降解率达到50％左右。因此利用微生物菌株降解存在着降解效率低，稳定性差，存在一定的污染性等缺点，从而让研究者们将注意力放在酶法降解上。微生物是自然界中分布最广、种类最多的生物，因此微生物来源的酶类也非常广泛。研究微生物产生的酶类对环境污染物的降解是具有非常有发展前景的。

目前对于酯酶降解邻苯二甲酸酯类的研究相对有限，并且主要关注于其降解机理及降解产物的毒性，在已发现的酯酶中，存在着降解效率低，反应条件要求较严格等缺陷。比如在2015年，王超凡等人从芽孢杆菌中克隆的能够降解邻苯二甲酸酯的羧酸酯酶EstZ22的反应温度需要70℃及以上，并不适用于实际应用中；2016年，Do Kyung Hong等人克隆的酯酶EstSP1在1h内，对1mM邻苯二甲酸二丁酯的降解率仅为30％；2014年，Xiao-Yan Zhang等人克隆的酯酶EstS1最适的降解条件为60℃。但目前大部分羧酸酯酶对于金属离子和有机溶剂的耐受性较低，严重限制了羧酸酯酶的应用。因此，获得反应条件要求不高的细菌来源的羧酸酯酶，在工业应用中将具有十分重要的价值和意义。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种能在较低反应温度下降解含有金属离子或有机溶剂的体系中邻苯二甲酸酯类的方法，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶为催化剂，降解邻苯二甲酸酯类。

在一种实施方式中，所述反应温度为15～50℃。

在一种实施方式中，所述反应温度优选为30～50℃。

在一种实施方式中，所述反应温度优选为40℃。

在一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解条件为：pH5.0～8.0。

在一种实施方式中，所述羧酸酯酶的降解条件优选为：pH 6.5。

在一种实施方式中，所述降解时间为1～6h。

在一种实施方式中，所述金属离子为Na⁺、K⁺、Zn²⁺、NH4⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺或Fe³⁺。

在一种实施方式中，所述金属离子的浓度为0.5～2mM。

在一种实施方式中，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷或异丙醇。

在一种实施方式中，所述有机溶剂的浓度为0.5～2％(v/v)。

在一种实施方式中，所述邻苯二甲酸酯类为：邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二异丁酯。

本发明的第二个目的是提供一种产羧酸酯酶的重组菌，以大肠杆菌为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因。

在一种实施方式中，所述表达是以pColdII为表达载体在大肠杆菌中表达。

本发明的第三个目的是提供一种产羧酸酯酶的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。

本发明还提供所述的重组菌或其生产的羧酸酯酶在环境保护领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧酸酯酶BaCEs01在大肠杆菌中异源表达，得到的羧酸酯酶BaCEs01最适反应温度为40℃，在40℃下放置1小时后，酶活性保持在40％以上，具有良好的温度稳定性。

(2)羧酸酯酶BaCEs01在含有乙醇和乙腈的缓冲液中放置1h后剩余酶活分别为76.9％和71.6％，且有机溶剂(甲醇、丙酮、正己烷、异丙醇)对其酶活没有明显的影响。

(3)纯化得到的羧酸酯酶BaCEs01对邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别高达84.2％、89.6％、81.3％，提供了一种高效降解塑化剂邻苯二甲酸酯类的方法。

附图说明

图1为最适反应温度。

图2为温度稳定性。

图3为最适反应pH。

图4为pH稳定性。

图5为1-乙酸萘酯酶促反应速率图。

图6为2-乙酸萘酯酶促反应速率图。

具体实施方式

(1)以1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯为底物测定羧酸酯酶酶活的方法：

1％的固蓝B盐：称取1g的固蓝B盐溶于蒸馏水中定容至100mL，避光保存。

5％的SDS：称取5g的SDS溶于蒸馏水中，于37℃水浴1小时，待其完全溶解后定容至100mL，于冰箱保存。

0.6M的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯：称取11.17g的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯溶于95％的乙醇中，定容至100mL，避光保存。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液：1/15M磷酸氢二钠与1/15M磷酸二氢钾混合配置至pH7.0。

将15μL的底物1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯加入到1.5mL磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中(pH 7.0)于37℃水浴保温5min，加入250μL纯化后的酶液，反应5min，加入0.5mL终止显色液DBLS(1％固蓝B盐与5％SDS以2:5混合)，摇匀，静置10min，595/555nm下测定吸光值。

酶活定义：在最适反应条件下，1min内从0.6M的1-乙酸萘酯或2-乙酸萘酯溶液中释放1μM的1-萘酚或2-萘酚所需的酶量为一个酶活单位。

(2)羧酸酯酶蛋白浓度的测定：根据Bradford蛋白定量试剂盒方法，将稀释一定倍数的酶液与G250染色液混合，用酶标仪测定595nm处的吸光值，根据蛋白浓度标曲计算蛋白浓度。比酶活(U·mg^-1)＝酶活(U·mL^-1)×[蛋白浓度(mg·mL^-1)]^-1。

(3)邻苯二甲酸酯类高效液相色谱检测条件为：C18柱(Agilent 4.6×250mm)，波长254nm，流动相比例为甲醇：水＝80:20，检测温度为30℃。

(4)邻苯二甲酸酯类降解率计算公式：降解率(％)＝剩余底物浓度/初始底物浓度

实施例1：工程菌株的构建

人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的羧酸酯酶BaCEs01基因序列。将羧酸酯酶BaCEs01基因序列和质粒载体pColdII用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切后连接转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs01。

实施例2：羧酸酯酶(BaCEs01)的表达与纯化

LB培养基g/L：氯化钠10，胰蛋白胨10，Yeast Extract 5，pH 7。

将重组大肠杆菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs01接种于含有100mg·mL^-1氨苄的LB液体培养基中，以原始菌株E.coli BL21(DE3)和空载菌株(E.coli BL21(DE3)中转入pClodII质粒)作为对照，37℃，200rmp培养12h，然后将500μL上述种子液接种于含有50μL氨苄的50mL LB培养液中，37℃培养2.5h，至OD600为0.6，将摇床降温至15℃，静置30min。每瓶加入40μL终浓度为0.4mol/L的IPTG作为诱导剂，以不加诱导剂作为对照组，于15℃200rmp培养24h。

收集菌液，4℃，8000rmp离心10min后得到菌体，加入5mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)重悬菌体，超声破碎仪破碎，离心收集上清液得到粗酶液。将上述得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统进行镍柱纯化得到BaCEs01酶液。

实施例3：羧酸酯酶(BaCEs01)的酶活测定

在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7)中，以2-乙酸萘酯为底物，20～50℃范围内，每隔5℃，测定羧酸酯酶BaCEs01酶活，可知羧酸酯酶BaCEs01的最适温度为40℃。在最适反应温度40℃条件下，pH 5.0～9.0范围内，每隔0.5，测定酶活，确定最佳反应pH为6.5。

在最适反应条件下，即磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，40℃下，分别以0.6M1-乙酸萘酯和2-乙酸萘酯为底物测定实施例2中纯化得到的羧酸酯酶BaCEs01的比酶活分别达到5.20U/mg和1.20U/mg。

温度稳定性：将羧酸酯酶(BaCEs01)酶液250μL，在pH为6.5时分别在10,20,30,40,50,60℃中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：羧酸酯酶BaCEs01在40℃下放置1小时后，酶活性保持在40％以上，具有良好的温度稳定性。

pH稳定性：将250μL羧酸酯酶BaCEs01酶液在温度40℃条件下，分别在pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：羧酸酯酶在pH5.5-7.5酶活性保持在40％以上，具有良好的pH稳定性。

实施例4：金属离子对羧酸酯酶(BaCEs01)的影响

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，40℃下，加入250μL BaCEs01酶液，15μL的0.6M 2-乙酸萘酯，1mM不同金属离子(Na⁺,K⁺,Zn⁺,NH4⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Cu²⁺,Fe³⁺)，测定金属离子对羧酸酯酶BaCEs01酶活的影响。结果如表1所示，可知K⁺，NH4⁺，Mg²⁺对酶活有略微的促进作用，其余金属离子对酶有不同程度的抑制作用。

表1不同金属离子对羧酸酯酶酶活的影响

实施例5：有机溶剂对羧酸酯酶(BaCEs01)的影响

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，40℃下，加入250μL BaCEs01酶液，15μL的0.6M 2-乙酸萘酯，1％(v/v)不同有机溶剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正己烷、异丙醇)，放置1h后，加入DBLS溶液终止反应，测定不同有机溶剂对羧酸酯酶活性的影响。结果如表2所示，可知BaCEs01在含有乙醇和乙腈的缓冲液中放置1h后剩余酶活分别为76.9％和71.6％，其余有机溶剂对其酶活没有明显的影响。

表2不同有机溶剂对羧酸酯酶酶活的影响

实施例6：羧酸酯酶(BaCEs01)的底物特异性

在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，40℃下，加入250μL BaCEs01酶液，测定羧酸酯酶BaCEs01催化0.2-3.4mmol·L^-1的1-乙酸萘酯和0.1-3.2mmol·L^-1的2-乙酸萘酯的反应速率，利用Origin软件进行非线性拟合曲线计算得到Vmax和Km值，进而计算得到Kcat/Km值(见图5、图6)。如表3所示，底物1-乙酸萘酯与2-乙酸萘酯相比，羧酸酯酶对1-乙酸萘酯的亲和力更大(Km越低，亲和力越大)，对1-乙酸萘酯的催化效率(Kcat/Km)更好，达到0.042。

表3不同底物动力学参数

实施例7：羧酸酯酶(BaCEs01)的应用

取50μL纯化后的羧酸酯酶(BaCEs01)酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，以不加羧酸酯酶(BaCEs01)酶液作为对照组，于40℃水浴1h后，在反应体系中加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度。计算得到羧酸酯酶BaCEs01对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别为74.5％、80.3％、70.2％。由此而知，该羧酸酯酶对低浓度的三种塑化剂的降解率均达到70％以上，在环境修复中有很大的应用价值。

表4 BaCEs01对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例8:羧酸酯酶(BaCEs01)的应用

与实施例7中过程相同，所不同的是体系中邻苯二甲酸酯类的终浓度为10mM。

将50μL实施例2中纯化后的羧酸酯酶(BaCEs01)酶液加入到终浓度为10mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，以不加羧酸酯酶(BaCEs01)酶液作为对照组，于40℃水浴1h后，在反应体系中加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)的降解率分别为44.6％、50.4％、40.7％。由此结果可知，在不增加酶量的情况下，该羧酸酯酶对高浓度的3种塑化剂的降解率都达到了40％以上。

表5 BaCEs01对高浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例9:羧酸酯酶(BaCEs01)的应用

与实施例7中过程相同，所不同的水解时间延长至6h。

将50μL纯化后的酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，以不加酶液作为对照组，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中,于40℃水浴6h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂的降解率分别为75.6％、84.7.％、72.3％。该结果说明延长反应时间，该羧酸酯酶对3种塑化剂的降解率均达到了75％以上。

表6 BaCEs01对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例10:羧酸酯酶(BaCEs01)的应用

与实施例7中过程相同，所不同的是羧酸酯酶(BaCEs01)酶液的添加量加大为100μL。

将100μL纯化后的酶液加入到终浓度为1mM的邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，以不加酶液作为对照组，在1.5mL的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)中，于40℃水浴1h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度。经高效液相色谱测定分析剩余底物的量，计算得到该羧酸酯酶对3种塑化剂的降解率分别为84.2％、89.6％、81.3％。该结果说明增加酶量增加降解率。

表7 BaCEs01对低浓度邻苯二甲酸酯类的降解

实施例11：重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs01全细胞催化反应

将实施例1中得到的重组菌E.coli BL21-pColdII-BaCEs01收集后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 6.5)重悬稀释至OD600为1.0，分别加入100μL菌液到终浓度1mM邻苯二甲酸酯类(邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯)中，于40℃水浴1h后，加入100μL浓度为1M HCl溶液终止反应，再用等体积的乙酸乙酯萃取，每组实验设置三个平行实验。通过高效液相色谱测定剩余底物的量，来判断其水解程度，计算得到该重组菌对3种塑化剂的降解率分别为19.8％、15.4％和21.6％。

表8重组菌对邻苯二甲酸酯类的降解

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种降解含金属离子或有机溶剂的邻苯二甲酸酯类的方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 200

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Lys His Val Phe Glu Gln Gly Thr Ser Glu Asn Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu His Gly Thr Gly Gly Asn Glu His Asp Leu Leu Ser Leu Gly Arg

20 25 30

Phe Ile Asp Pro Asn Ala Ser Leu Leu Gly Val Arg Gly Ser Val Ser

35 40 45

Glu Asn Gly Met Pro Arg Phe Phe Lys Arg Leu Lys Glu Gly Val Phe

50 55 60

Asp Glu Lys Asp Leu Ile Glu Arg Thr Glu Glu Leu Lys Asn Phe Ile

65 70 75 80

Asp Glu Ala Ala Gln Met Tyr Gly Phe Ser Arg Glu Asn Val Ile Ala

85 90 95

Ala Gly Tyr Ser Asn Gly Ala Asn Ile Ala Ala Ser Leu Leu Phe His

100 105 110

Tyr Lys Asp Val Leu Lys Gly Ala Val Leu His His Pro Met Val Pro

115 120 125

Ile Arg Gly Val Lys Leu Pro Asp Met Glu Gly Leu Pro Val Phe Ile

130 135 140

Gly Ala Gly Lys Arg Asp Pro Leu Cys Thr Lys Glu Glu Ser Glu Glu

145 150 155 160

Leu Tyr Gln Tyr Leu Thr Asp Ala His Ala Ser Val Ala Leu Glu Trp

165 170 175

Gln Glu Gly Gly His Gln Leu Thr Gln Gln Glu Ala Glu Gln Ala Arg

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atgaaacatg tgtttgaaca gggaacgtca gaaaatgttc tgctgctttt gcacggaacg 60

ggaggaaatg aacatgatct tctgtcgctc ggacgtttta tcgatccgaa cgcaagtctg 120

ctgggggtca gaggatcagt gtcggaaaac ggcatgcccc gtttttttaa gcggctgaaa 180

gaaggggtat ttgacgagaa agatttaatt gaacggacgg aagaattaaa gaattttatt 240

gatgaagcgg cgcaaatgta cgggttcagc agagaaaacg tgattgctgc cggctattca 300

aacggcgcca atattgcagc aagtcttttg tttcattata aagatgtact gaaaggagcg 360

gttctgcatc atccgatggt gccgatacgc ggagtgaagc tgcctgatat ggaagggctg 420

cctgtgttta tcggtgcggg aaaacgcgat cccctatgta caaaagaaga atcggaggag 480

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taa 603