铜绿假单胞菌在降解赭曲霉毒素中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种铜绿假单胞菌的新用途，即铜绿假单胞菌在降解赭曲霉毒素中的应用。本发明通过实验证明铜绿假单胞菌可高效降解赭曲霉毒素，铜绿假单胞菌作为赭曲霉毒素降解的生物材料，在开发新的生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
【专利说明】
铜绿假单胞菌在降解赭曲霉毒素中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种铜绿假单胞菌的新用途，即铜绿假单胞菌在降解赭曲霉毒素中的 应用。
【背景技术】
[0002] 赭曲霉毒素(ochratoxins)是曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的一组结构类似的 有毒代谢产物，广泛存在于各种食品、饲料及其他农副产品中。赭曲霉毒素包括7种有相似 化学结构的化合物，其中赭曲霉毒素 A(ochratoxinA，OTA)在自然界中分布最广泛，毒性最 强，对人类和动植物影响最大。赭曲霉毒素 A具有肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性，以及致畸、 致癌和致突变作用等多种毒性，对动物和人体健康有很大的潜在危害。因此世界各国均重 视对赭曲霉毒素 A的检测和控制，制定了相关限量标准，以便于确保食品安全和消除国际贸 易中的技术壁皇。因此，开展赭曲霉毒素的抑制与去除技术研究，对于保护人类和动物健 康，确保国家食品安全和粮食安全具有重大的意义。
[0003] 赭曲霉毒素去毒方法可分为物理、化学和生物三大类，其中生物法因具有效率高、 特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，利用生物手段进行赭曲霉毒素的降解 则成为近年来赭曲霉毒素毒素降解研究的热点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供提供一种铜绿假单胞菌的新用途，即铜绿假单胞菌在降解赭 曲霉毒素中的应用。
[0005] 本发明保护铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢产 物在降解赭曲霉毒素中的应用。
[0006] 本发明还保护铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢 产物在制备产品中的应用;所述产品的用途为降解赭曲霉毒素。
[0007] 本发明还保护一种降解赭曲霉毒素的方法，为使用铜绿假单胞菌对赭曲霉毒素进 行降解处理。
[0008] 所述方法中，降解处理的方式为将铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或 铜绿假单胞菌代谢产物与含有赭曲霉毒素的样品混合。
[0009] 本发明还保护一种产品，其活性成分为铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液 和/或铜绿假单胞菌代谢产物;所述产品的用途为降解赭曲霉毒素。
[0010] 以上任一所述铜绿假单胞菌，具体为保藏编号为:CGMCC No.8511的铜绿假单胞菌 N17-1。
[0011] 以上任一所述赭曲霉毒素，具体可为赭曲霉毒素 A。
[0012] 本发明通过实验证明，铜绿假单胞菌可高效降解赭曲霉毒素，铜绿假单胞菌作为 赭曲霉毒素降解的生物材料，在开发新的生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面都具有很 好的应用前景。
【附图说明】
[0013]图1为实施例1中LC/MS/MS检测结果图。
【具体实施方式】
[0014] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0015] 铜绿假单胞菌N17-1 (Pseudomonas aeruginosa):保藏编号：CGMCC No .8511。记载 并保护"铜绿假单胞菌Ν17-Γ的专利的申请号为：201410001212.1，授权公告号为CN 103710292 B(授权公告日为2016.01.20)。
[0016] ppm：mg/L〇
[0017] 赭曲霉毒素 A(OTA)标准品：Sigma-Aldrich，产品编号01877。
[0018] 赭曲霉毒素免疫亲和柱:美国VICAM公司，产品编号13012。
[0019] 1 X赭曲霉毒素洗脱缓冲液:美国VICAM公司，产品编号G1112。
[0020] 赭曲霉毒素 A的结构式如下：
[0022]实施例1、铜绿假单胞菌N17-1对赭曲霉毒素出的降解作用 [0023] NB液体培养基：由溶剂和溶质组成;溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水;蛋白 胨在NB液体培养基中的浓度为lg/100ml，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3g/100ml， NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5g/100ml。
[0024] 1、将铜绿假单胞菌N17-1接种于液体NB培养基中至初始0D6Q() = 0.05,37°C条件下， 200rpm(旋转半径20mm)震荡培养24h，收集全部菌液（即含有菌体和上清在内的整个培养体 系)。
[0025] 2、将lmg赭曲霉毒素 A (0ΤΑ)标准品溶解于10ml色谱纯甲醇中获得浓度为1 OOppm的 赭曲霉毒素 A溶液。
[0026] 3、制备实验组溶液：
[0027]取0.5ml步骤1收集的菌液，置于1.5ml离心管中，向离心管中加入5yL步骤2得到的 赭曲霉毒素 A溶液，充分混匀后37°C静置72h，然后10000g离心10min并收集上清，得到实验 组溶液。
[0028] 4、制备对照组溶液：
[0029] 按照步骤3的方法，取0.5ml液体NB培养基替代0.5ml步骤1收集的菌液，其余操作 不变，得到对照组溶液。
[0030] 5、效果检测：
[0031 ]实验组溶液和对照组溶液分别作为待测溶液，进行如下步骤：
[0032] 1、向6体积份待测溶液中加入4体积份无水甲醇，室温振荡提取5分钟，12000r/min 离心5分钟，取上清液用于下一步净化操作。
[0033] 2、取步骤1得到的上清液，使用赭曲霉毒素免疫亲和柱，进行除杂，具体操作过程 如下：
[0034] 取步骤1得到上清液，使其通过赭曲霉毒素免疫亲和柱，调节流速为1-2滴/s，直至 空气完全通过免疫亲和柱。用l〇ml的IX赭曲霉毒素洗脱缓冲液以1-2滴/s的流速通过亲和 柱，对亲和柱进行清洗。取l〇ml纯水以1-2滴/s的流速通过亲和柱，对亲和柱进行清洗。取用 1.5ml甲醇以1-2滴/s的流速淋洗亲和柱，用2ml离心管收集洗脱液，用0.22μπι有机相尼龙膜 过滤后，装入2ml色谱进样小瓶中，得到样品液。
[0035] 3、取步骤2得到的样品液，进行LC/MS/MS(液相色谱串联质谱）。
[0036]液相色谱相关参数：
[0037] 仪器agilent 6460LC/MS/MS;
[0038] 色谱柱：agilent XDB-SB-C18(2.1x50mm，1·8μπι);
[0039] 上样体积：2yL;
[0040] 柱温：30°C;
[0041] 洗脱过程(梯度洗脱）：第〇_lmin，A液在洗脱液中所占的体积百分含量为70%;第 l-8min，A液在洗脱液中所占的体积百分含量为10% ;第8-9min，A液在洗脱液中所占的体积 百分含量为70%;后运行4min，后运行过程继续保持A液在洗脱液中所占的体积百分含量为 70 % ;流速为0.3mL/min;洗脱液由A液和B液组成，A液为体积百分含量为0.1 %的甲酸水溶 液，B液为体积百分含量为0.1%的乙腈水溶液。
[0042]质谱相关参数：ESI+MRM(多反应监测）；雾化气温度为300°C，雾化气流速为6L/ min;气帘气温度为350°C，气帘气流速为10L/min，气帘气压力为45psi;电力电压为4000v; 检测离子对:404.1 > 239.0，404.1 > 358.1;碰撞电压均为30ev。
[0043]用赭曲霉毒素 A(OTA)标准品的梯度稀释液代替样品液进行上述步骤。
[0044] 计算赭曲霉毒素 A(OTA)降解率，计算方法为：
[0045] 0ΤΑ降解率（％ )=(对照组0ΤΑ含量-实验组0ΤΑ含量)/对照组0ΤΑ含量X 100。
[0046] 实验重复五次，结果取平均值。
[0047] LC/MS/MS检测结果如图1所示。图1中，A为赭曲霉毒素 A标准品的分析结果，B为对 照组溶液的分析结果，C为实验组溶液的分析结果。结果表明，铜绿假单胞菌N17-1对赭曲霉 毒素 A有较好的降解效果，经过统计降解率为85.4±4.9%。
【主权项】
1. 铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢产物在降解赭曲 霉毒素中的应用。2. 铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢产物在制备产品 中的应用;所述产品的用途为降解赭曲霉毒素。3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述铜绿假单胞菌的保藏编号为CGMCC No.8511〇4. 如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于:所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素 A。5. -种降解赭曲霉毒素的方法，包括如下步骤:使用铜绿假单胞菌对赭曲霉毒素进行 降解处理。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述降解处理的方式为将铜绿假单胞菌和/ 或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢产物与含有赭曲霉毒素的样品混合。7. 如权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素 A。8. -种产品，其活性成分为铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞 菌代谢产物;所述产品的用途为降解赭曲霉毒素。9. 如权利要求8所述的产品，其特征在于:所述赭曲霉毒素为赭曲霉毒素 A。
【文档编号】A62D101/28GK105833459SQ201610266547
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】刘阳, 赵月菊, 王瑶, 邢福国, 王龑
【申请人】中国农业科学院农产品加工研究所