应用滤泡素抑制素增加肌肉质量的制作方法

专利名称：应用滤泡素抑制素增加肌肉质量的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及了生长分化因子(GDF)受体，更特别地涉及GDF-8(肌肉生长抑制素(myostatin))受体，以及在细胞中影响肌肉生长抑制素信号转导作用的组合物，和应用这些组合物调节肌肉生长抑制素在细胞中信号转导的方法。
背景技术：
在美国，决定要减肥的个人每年花费的时间、精力和费用是惊人的。对于这些人中的许多人，其目的不仅仅是要更好看些，更重要的是要防止由于超重而产生的无法避免的医学问题。
在美国超过半数以上的成人群体被认为是超重的。而且，美国成年男人的20至30％、成年妇女的30至40％被认为是肥胖症，在穷人和少数民族人种中出现比例是最高的。肥胖症，其定义是超过肥胖平均水平至少大约20％以上，其流行在过去几十年中大幅增加，并已经在儿童人群中成为一种主要的问题。20％的儿童现在被认为是超重的，这个数字意味着在过去5年中增加了一倍。
肥胖症和与其直接相关的医学问题是全世界发病率和死亡率的主要原因。肥胖症是形成许多病理状况的一个主要危险因素，包括动脉粥样硬化、高血压、心脏病发作、II型糖尿病、胆囊疾病、和某些癌症，并引起过早死亡。在美国心脏疾病是死亡率的最主要因素，II型糖尿病使超过1600万美国人受到折磨并是疾病引起死亡的最主要原因之一。
80％以上的II型糖尿病发生在肥胖人中。尽管II型糖尿病影响所有人种，但在本土美国人、非洲美国人和美籍西班牙人中特别普遍。特别是，II型糖尿病，过去几乎只发生在年龄超过40岁的成人中，现在发生在儿童中，在过去5年中报道的病例几乎增至三倍。II型糖尿病也称为非胰岛素依赖型糖尿病，其特征是胰岛素对葡萄糖的反应性分泌降低，以及机体对胰岛素的作用产生抗性，即便是循环中胰岛素水平一般是正常的或升高的。II型糖尿病可影响许多不同组织和器官的功能，可能引起血管疾病、肾衰、视网膜病和神经病。
与肥胖症相关的医学问题相反，患有某些慢性疾病的患者中常常发生的严重的体重减轻对于医学干预也是一种挑战。这种体重减轻的分子基础，就恶病质来说，不是很清楚。但是，很明显，恶病质使这些疾病的处理变得复杂起来，并与患者的不佳预后有关。恶病质的影响在癌症和艾滋病(AIDS)患者中发生的消耗综合征中表现得很明显。
尽管已经做了大量的努力试图阐明体重调节中所涉及的生物学过程，但是所提供的结果较实际应用价值更多的是浮夸。例如，苗条蛋白(leptin)的发现曾经被欢呼为了解人类脂肪聚积分子基础的重大突破，并许诺使用它治疗肥胖症。在动物中的研究表明苗条蛋白涉及传输调节食欲的内部信号，并认为苗条蛋白可能被用于治疗患有肥胖症的人。但是，使用苗条蛋白治疗肥胖症的进程是缓慢的，迄今苗条蛋白没有达到最初的期望。
病态肥胖的治疗目前限制于手术去除部分小肠，从而减少食物(和卡路里)吸收的量。对于中等肥胖，仅有的“治疗方法”是摄入健康饮食和规律地锻炼，这种方法已经证明至多一定程度地有效。因此，需要确定涉及体重调节，包括肌肉发育和脂肪聚积的生物学因子，由此可以开发用于治疗失调如肥胖症和恶病质的方法。本发明满足了这种需求，并提供了其它的优势。
发明概述本发明涉及一种基本上经纯化过的GDF受体。本发明的GDF受体可以是，例如肌生长抑制素受体、GDF-11受体、或其它GDF受体。例如肌生长抑制素受体可至少与肌生长抑制素(myostatin)特异地相互作用，也可特异地与一种或另外的一些成熟的GDF肽相互作用。本发明还提供了编码一种GDF受体的多核苷酸、与GDF受体特异地相互作用的抗体以及类似物。
本发明还涉及一种通过影响GDF作用的信号转导调节GDF效应的方法。通过实施例方式，提供了一种通过使细胞与影响细胞中肌生长抑制素信号转导的药剂接触来调节肌生长抑制素对细胞效应的方法。在一个实施方案中，该药剂可改变肌生长抑制素与一种由细胞表达的肌生长抑制素受体之间的特异性相互作用，由此可调节细胞中的肌生长抑制素信号转导。肌生长抑制素受体可以是激活素(activin)受体，或可以是任何其它的受体，该受体可与一种成熟的肌生长抑制素或其功能性肽部分接触，这样可以激活肌生长抑制素信号转导作用。在另一个实施方案中，该药剂与一种肌生长抑制素受体结合，因此可增强肌生长抑制素与受体的结合或与肌生长抑制素竞争受体。象这样，该药剂可增加肌生长抑制素的信号转导作用，或可减少或抑制肌生长抑制素的信号转导作用。仍然在另一个实施方案中，该药剂可在细胞内作用以改变细胞中的肌生长抑制素信号转导作用。
用于调节细胞中GDF信号转导作用的药剂可是一种肽、一种肽模拟体、一种多核苷酸、一种小的有机分子、或任何其它的药剂，可作为GDF信号转导作用的激动剂，或作为GDF信号转导作用的拮抗剂。在一个实施方案中，肽药剂可改变肌生长抑制素与一种肌生长抑制素受体的特异相互作用。这种一种肽药剂可以是，例如，一种可结合或使肌生长抑制素隐蔽的肽，因此可以影响肌生长抑制素与其受体特异相互作用的能力。这样的药剂的实施例是一种突变的肌生长抑制素受体，例如，一种肌生长抑制素受体的可溶的胞外域，它可以与肌生长抑制素特异的相互作用；一种肌生长抑制素前结构域，可与肌生长抑制素特异的相互作用；一种突变的肌生长抑制素多肽，可抵抗蛋白酶剪切成为前结构域和成熟的肌生长抑制素，可与肌生长抑制素特异的相互作用，可用作肌生长抑制素信号转导的拮抗剂，它可减少或抑制细胞中肌生长抑制素的信号转导作用。
在另一个实施方案中，肽药剂可特异的与一种在细胞中表达的肌生长抑制素受体相互作用，因此可与肌生长抑制素竞争受体。这样一种肽药剂的实施例是一种抗肌生长抑制素受体抗体或一种抗肌生长抑制素抗体的抗独特型抗体。这样一种肽药剂具有其它的优势，即不仅可选择其特异与一种肌生长抑制素受体相互作用的能力，因此可与肌生长抑制素竞争受体，也可进一步选择其不活化或不激活肌生长抑制素信号转导作用的能力。因此，一种可特异与细胞表达的一种肌生长抑制素受体相互作用，并激活肌生长抑制素依赖的信号转导作用的肽药剂，可用作一种肌生长抑制素激动剂，增加细胞内的肌生长抑制素信号转导作用，而一种可特异与细胞表达的一种肌生长抑制素受体相互作用，但不能激活肌生长抑制素信号转导的肽药剂可用作肌生长抑制素的拮抗剂，以减少或抑制细胞中的肌生长抑制素的信号转导作用。
一种用在本发明方法中的药剂可是一种多核苷酸。一般来说，但不是必要的，多核苷酸可被引入细胞中，在此可直接发挥其功能，或随着转录，或翻译或两者都在进行时发挥其功能。例如，多核苷酸药剂可编码一种肽，后者可在细胞中表达并调节肌生长抑制素的活性。这样一种表达的肽可以是，例如一种突变的肌生长抑制素受体，如一种可溶性的肌生长抑制素受体胞外域；一种与细胞膜锚着区域有效地连接的肌生长抑制素受体胞外域；或一种缺乏蛋白激酶活性的突变肌生长抑制素受体。
由一种多核苷酸药剂表达的肽也可以是一种影响GDF信号转导通路的细胞内多肽组分水平或活性的肽。细胞内多肽可以是，例如一种Smad多肽，如一种显性失活Smad，如在此公开的，后者可影响细胞内的肌生长抑制素信号转导。因此，一种多核苷酸药剂可编码一种显性失活Smad2，Smad3或Smad4多肽，这些多肽在细胞中表达过程中，可减少或抑制细胞中的肌生长抑制素信号转导；或可编码一种Smad6或Smad7多肽，这些多肽在表达过程中，可减少细胞中的肌生长抑制素信号转导。一种多核苷酸药剂也可编码一种细胞内c-ski多肽，其表达可减少或抑制肌生长抑制素的信号转导。
用于本发明的方法中的一种多核苷酸药剂也可以是，或可以编码一种反义分子，一种核酶或一种三联药剂(triplexing agent)。例如，多核苷酸可以是(或可编码)一种反义核苷酸序列，如一种反义c-ski核苷酸序列，后者可以增加细胞内的肌生长抑制素信号转导；或一种反义Smad核苷酸序列，根据特殊的Smad反义核苷酸序列，可增加肌生长抑制素信号转导或减少或抑制肌生长抑制素信号转导。
本发明也涉及一种改善严重病理状况的方法，该病理状况的特征至少部分是被试者的肌肉或脂肪组织中异常的重量、发育或代谢活性。这样一种方法包括在细胞中调节与病理状况相关的GDF信号转导，例如在被试者的肌肉细胞或脂肪组织细胞中调节肌生长抑制素信号转导。采用本发明的方法可改善多种病理状况，包括，例如消耗综合症如恶病质、厌食症、肌营养不良、神经肌肉疾病；和代谢失调如肥胖症和II型糖尿病。
本发明进一步涉及一种通过给予生物体一种可影响GDF受体介导的信号转导的药剂来调节真核细胞生物体中肌肉组织或脂肪组织的生长的方法。在一个实施方案中，通过给予一种可影响肌生长抑制素信号转导的药剂，施行一种调节肌肉组织或脂肪组织生长的方法。在另一个实施方案中，该药剂可影响GDF-11的信号转导，或肌生长抑制素和GDF-11信号转导。该药剂可以是，例如，可改变肌生长抑制素与肌生长抑制素受体之间的特异相互作用的药剂，可减少或抑制肌生长抑制素与肌生长抑制素受体之间的特异相互作用的药剂，或任何其它在此公开的药剂。真核细胞生物体可以是脊椎动物，例如，哺乳动物、鸟类或鱼类生物，或可以是无脊椎动物，例如，软体动物如虾、扇贝、乌贼、章鱼、蜗牛或蛞蝓。
本发明还涉及一种识别特异地与生长分化因子(GDF)受体相互作用的药剂的方法。本发明的这样一种筛选测定实验可如下进行，例如，通过将一种GDF受体与一种检测药剂接触，并确定该检测药剂可特异地与GDF受体相互作用，因此可以识别出可特异地与GDF受体相互作用的药剂。GDF受体可以是任何GDF受体，特别是肌生长抑制素受体，该药剂可以是GDF受体激动剂，它可以增加GDF信号转导作用，或是GDF受体拮抗剂，它可以减少或抑制GDF的信号转导作用。本发明的这样一种方法可用于筛选检测药剂的文库，特别是检测药剂的组合文库。
本发明还提供了GDF受体或GDF受体的功能性肽部分的虚拟表现形式，例如，GDF 8受体或GDF-11受体的虚拟表现形式。在一个实施方案中，虚拟表现形式包括一种可与GDF受体特异相互作用的药剂。如此，本发明进一步提供了一种采用一个计算机系统识别可特异地与生长分化因子(GDF)受体或一种GDF受体的功能性肽部分相互作用的药剂的方法，。例如，该方法可通过检测一种虚拟的测试药剂与一种虚拟GDF受体或其功能性肽部分特异性相互作用的能力来进行；并检测虚拟测试药剂与虚拟GDF受体或其功能性肽部分的特异相互作用，因此可以识别能与GDF受体或其功能性肽部分特异地相互作用的药剂。


图1显示了小鼠原肌生长抑制素(SEQ ID NO4)；大鼠原肌生长抑制素(SEQ ID NO6)；人原肌生长抑制素(SEQ ID NO2)；狒狒原肌生长抑制素(SEQ ID NO10)；牛原肌生长抑制素(SEQ ID NO12)；猪原肌生长抑制素(SEQ ID NO14)；羊原肌生长抑制素(SEQ ID NO16)；鸡原肌生长抑制素(SEQ ID NO8)；火鸡原肌生长抑制素(SEQ ID NO18)；和斑马鱼原肌生长抑制素(SEQ ID NO20)的氨基酸序列。氨基酸根据人原肌生长抑制素(SEQ ID NO2)进行编号。虚线表示引导最大同源性的间隙。序列中相同的残基被划上阴影。
图2显示了小鼠原肌生长抑制素(SEQ ID NO4)和斑马鱼原肌生长抑制素(SEQ ID NO20)的氨基酸序列，鲑鱼等位基因1原肌生长抑制素(SEQ ID NO27；“鲑鱼1”)和鲑鱼等位基因2原肌生长抑制素(SEQ IDNO29；“鲑鱼2”)的部分氨基酸序列。相应的人原肌生长抑制素的氨基酸部位标记在每排的左侧(比较图1；鲑鱼1的第一个氨基酸对应于人原肌生长抑制素218；鲑鱼2的第一个氨基酸对应于人原肌生长抑制素239)。虚线表示引导最大同源性的间隙。相对的氨基酸位置，包括间隙，沿着每排的上方标记。序列中相同的残基被划上阴影。
发明祥述本发明提供了一种基本上经纯化的原肌生长抑制素(promyostatin)多肽的肽部分。原肌生长抑制素，以前被称为生长分化因子-8(GDF-8)，包括一个氨基末端的功能前区(prodomain)和一个C-末端的成熟的肌生长抑制素(myostatin)肽(见美国专利No.5,827,733)。从原肌生长抑制素中剪切下来后，肌生长抑制素的活性由成熟的肌生长抑制素肽实现。因此，原肌生长抑制素是一个前体多肽(precursor polypeptide)，可被蛋白酶水解剪切产生活性的肌生长抑制素。如在此所公开的，肌生长抑制素的功能前区可抑制肌生长抑制素的活性，GDF-11的活性，或两者的活性。
本发明也提供了一种原-GDF-11多肽的基本上经纯化的肽部分。原-GDF-11(pro-GDF-11)，以前一般被称为GDF-11，包括一个氨基末端的功能前区和一个C-末端的成熟GDF-11肽(见国际公开号WO98/35019，在此引入作为参考文献)。从原-GDF-11中剪切下来后，GDF-11的活性由成熟的GDF-11肽实现。因此，原-GDF-11像原肌生长抑制素一样，是一个前体多肽，可被蛋白水解剪切产生活性的GDF-11。如在此所公开的，GDF-11的功能前区可抑制GDF-11活性，肌生长抑制素活性，或抑制两者的活性。
原肌生长抑制素和原-GDF-11是转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，该超家族由在许多细胞类型中控制增殖、分化和其它功能的多功能多肽组成。TGF-β超家族，包括一组可在胚胎发育过程中对分化过程影响广泛的结构相关蛋白，包括例如，缪勒氏管抑制物质(MIS)，它是正常雄性发育过程中是必需的(Behringer等人，Nature345167，1990)，果蝇decapentaplegic(DPP)基因产物，它是背腹轴形成和成虫盘形态发生所必需的(Padgett等人，Nature 32581-84，1987)，爪蟾Vg-1基因产物，它位于卵的植物极上(Weeks等人，Cell 51861-867，1987)，激活素(Mason等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.135957-964，1986)，它可诱导爪蟾胚的中胚层和前端结构的形成(Thomsen等人，Cell 63485，1990)，和骨形态发生蛋白(BMPs，成骨素，OP-1)，它可重新诱导软骨和骨的形成(Sampath等人，J.Biol.Chem.26513198，1990)。TGF-β家族成员可影响许多分化过程，包括脂肪形成、肌形成、软骨发生、血细胞生成、和上皮细胞分化(Massague，Cell49437，1987；Massague，Ann.Rev.Biochem.67753-791，1998；每一篇在此都引入作为参考文献)。
许多TGF-β家族成员对其它肽生长因子具有调节作用(正调节作用或负调节作用)。特别的是，TGF-β超家族的某些成员具有与神经系统功能相关的表达方式或活性。例如，抑制素和激活素都在脑中表达(Meunier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85247，1988；Sawchenko等人，Nature 344615，1988)，激活素可作为一个神经细胞生存分子而起作用(Schubert等人，Nature 344868，1990)。另一个家族成员，生长分化因子-1(GDF-1)，在其表达方式上是神经系统特异性的(Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 884250，1991)，和其它家族成员如Vgr-1(Lyons等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 864554，1989；Jones等人，Development111531，1991)、OP-1(Ozkaynak等人，J.Biol.Chem.26725220，1992)、和BMP-4(Jones等人，Development 111531，1991)，也在神经系统中表达。因为骨骼肌可产生促进运动神经元存活的一种因子或多种因子，(Brown，Trends Neurosci.710，1984)，肌生长抑制素(GDF-8)和GDF-11在肌肉中的表达表明肌生长抑制素和GDF-11是神经元的营养因子。像这样，调节肌生长抑制素，GDF-11或两者活性的方法可用于治疗神经变性疾病，如肌萎缩侧索硬化症或肌营养不良，或在移植前在培养物中保存细胞或组织。
TGF-β家族的蛋白可合成为大的前体蛋白，它随后经历蛋白水解，从C-末端切除一簇大约110至140个氨基酸碱性残基，形成一个功能前区肽和一个C-末端的成熟肽。这个蛋白家族成员的C-末端成熟肽在结构上是相关的，不同家族成员根据其同源性可分成不同的亚组。尽管在特殊的亚组内的同源性范围为70％至90％的氨基酸序列同一性，在亚组之间的同源性明显更低，一般在20％至50％范围内。在每个成员中，有活性的类型似乎是一个二硫键联接的C-末端肽片断的二聚体。
原肌生长抑制素和原-GDF-11多肽在哺乳动物、鸟类和鱼类中已经被鉴定，肌生长抑制素在许多其它的物种，包括脊椎动物和无脊椎动物中是有活性的。在胚胎发育过程中和在成体动物中，例如，由肌源性谱系中的细胞特异地表达肌生长抑制素(McPherron等人，Nature38783-90，1997，在此引入作为参考文献)。在早期胚胎生成过程中，由发育体节的生肌节室中的细胞表达肌生长抑制素。在晚期胚胎期和成体动物中，肌生长抑制素广泛地表达在骨骼肌组织中，尽管在肌肉之间的表达水平变化非常大。肌生长抑制素的表达也可在脂肪组织中检测到，尽管比在肌肉中的水平更低。类似地，GDF-11在骨骼肌和脂肪组织，以及成人胸腺、脾脏和子宫中表达，也在不同发育时期的脑内表达。
来自多个物种的原肌生长抑制素多肽具有实质上相同的序列，人、小鼠、大鼠和鸡的成熟肌生长抑制素C-末端序列的氨基酸序列100％相同(见图1)。在此原肌生长抑制素多肽的实例(见图1)为人的原肌生长抑制素(SEQ ID NO2)；鼠肌生长抑制素(SEQ ID NO4)；大鼠肌生长抑制素(SEQ ID NO6)；狒狒原肌生长抑制素(SEQ ID NO10)；牛原肌生长抑制素(SEQ ID NO12)；猪原肌生长抑制素(SEQ ID NO14)；羊原肌生长抑制素(SEQ ID NO16)；鸡原肌生长抑制素(SEQ ID NO8)；火鸡原肌生长抑制素(SEQ ID NO18)；和斑马鱼原肌生长抑制素(SEQ IDNO20)的氨基酸序列。在此原肌生长抑制素多肽的实例也可以包括部分的鲑鱼等位基因1(SEQ ID NO27；“鲑鱼1”)和鲑鱼等位基因2(SEQID NO29；“鲑鱼2”，见图2)的一种多肽。在此公开的编码这些原肌生长抑制素多肽的核酸分子分别是SEQ ID NOS1，3，5，9，11，13，15，7，17，19，26和28(也见，McPherron和Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9412457，1997，在此引入作为参考文献)。在此一个原-GDF-11多肽的实例是人的原-GDF-11(SEQ ID NO25)，它由SEQ ID NO24编码。
考虑到在原肌生长抑制素多肽中的广泛保守性，特别是在如同具有像人和鱼之间的差别性的物种中，从任何物种中获得编码肌生长抑制素的多核苷酸和在任何物种中识别原肌生长抑制素或肌生长抑制素的表达将是很普通的，其中这些多核苷酸包括鲑鱼1和鲑鱼2序列的剩余部分。特别的是，成熟的肌生长抑制素序列与TGF-β超家族的其它成员具有明显的同源性，肌生长抑制素含有大多数在其它家族成员间和其它物种内高度保守的残基。而且，像TGF-βs和抑制素βs一样，除了实际上存在于所有其它家族成员中的7个半胱氨酸残基以外，肌生长抑制素含有额外的一对半胱氨酸残基。肌生长抑制素与Vgr-1(45％序列同一性)是最同源的。像TGF-β超家族的其它成员，肌生长抑制素被合成为一个较大的前体原肌生长抑制素多肽，它可被蛋白水解剪切成一种有活性的肌生长抑制素肽。
编码多种生物体的原肌生长抑制素多肽的多核苷酸可用熟知的程序和算法基于与公开序列的同一性(或同源性)来识别。同源性或同一性经常采用序列分析软件来测定，这些软件如遗传学计算机集团的序列分析软件包(威斯康星大学生物技术学中心，大学路1710号，Madison，WI53705)。这样的软件可通过对多种删除，替代和其它修饰作用赋予不同程度的同源性值，从而匹配相似的序列。术语“同源性”和“同一性”，当在这里应用在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中时，是指当被比较和被排列以最大的对应于比较窗或指定区域时，采用任何数量的序列比较算法测量或通过人工排列和目测时，两个或更多个相同的序列或子序列，或具有特殊比例的相同的氨基酸残基或核苷酸。
为了比较序列，一般一个序列可作为一个参考序列，将待测序列与它比较。当采用一种序列比较算法时，将待测和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列的坐标，并指定序列算法程序的参数。采用缺省的程序参数或指定可选的参数。然后序列比较算法基于程序参数计算待测序列与参考序列等同的序列百分比。
在此广泛使用的术语“比较窗”包括所指定的连续位点数目中任一数目的一个片段，例如，大约20至600个位点，例如，氨基酸或核苷酸位点普遍是大约50至大约200个位点，更普遍的是大约100至大约150个位点，其中在两个序列被最佳的排列之后，一个序列可与相同数目连续位点的一个参考序列进行比较。进行比较的序列排列的方法在本领域中是为人熟知的。进行比较的最佳序列排列可通过，例如Smith和Waterman局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2482，1981)，Needleman和Wunsch的同源性排列算法(J.Mol.Biol.48443，1970)，Person和Lipman的相似法检索(Proe.Natl.Acad.Sci.，USA 852444，1988)，上述每种方法在此均引入作为参考文献；这些算法的计算机化应用(威斯康星遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，遗传学计算机集团，575 Science Dr.，Madison，WI)；或人工排列和目测。确定同源性或同一性的其它算法包括，例如，除BLAST程序以外(国立生物学信息中心的基本局部排列检索工具)，有ALIGN，AMAS(多次排列序列分析)，AMPS(蛋白质多次序列排列)，ASSET(排列片段统计估算工具)，BANDS，BESTSCOR，BIOSCAN(生物学序列比较分析结点)，BLIMPS(Blocks IMProved检索器)，FASTA，Intervals & Points，BMB，CLUSTAL V，CLUSTAL W，CONSENSUS，LCONSENSUS，WCONSENSUS，Smith-Waterman算法，DARWIN，Las Vegas算法，FNAT(强制核苷酸排列工具)，框架排列，框架检索，DYNAMIC，FILTER，FSAP(Fristensky序列分析包)，GAP(球形排列程序)，GENAL，GIBBS，GenQuest，ISSC(敏感性序列比较)，LALIGN(局部序列排列)，LCP(局部容量程序)，MACAW(多次排列构建和分析工作台)，MAP(多次排列程序)，MBLKP，MBLKN，PIMA(图形引导的多次序列排列)，SAGA(遗传算法的序列排列)和WHAT-IF。这样的排列程序也可用于筛选基因组数据库以识别具有实质上相同序列的多核苷酸序列。
许多基因组数据库可用于比较，包括，例如作为人类基因组测序项目(J.Roach，http//weber.u.Washington.e一部分的人类基因组的主要部分。另外，至少有21个基因组已经完全被测序，包括，例如，生殖器支原体(M.genitalium)，甲烷球菌(M.jannaschii)，流感嗜血杆菌(H.influenzae)，大肠杆菌，酵母(酿酒酵母)，和果蝇(D.melanogaster)。在如鼠，秀丽新小杆线虫(C.elegans)和拟南芥(Arabadopsis sp.)等生物体模型基因组的测序中已经获得了明显的进展。几个含有一些功能性信息说明的基因组信息数据库由不同的机构维护，也经互联网上获得，例如，http//wwwtigr.org/tdb；http//www.genetics.wisc.edu；http//genome-www.stanford.edu/～ball；http//hiv-web.lanl.gov；http//www.ncbi.nlm.nih.gov；http//www.ebi.ac.uk；http//Pasteur.fr/other/biology；http//www.genome.wi.mit.edu。
有用的算法的一个实施方案是BLAST和BLAST2.0算法，由Altschul等人所描述(Nucleic Acids Res.253389-3402，1977；J.Mol.Biol.215403-410，1990，每一篇文献在此都引入作为参考文献)。执行BLAST分析的软件可公开地从国家生物技术学信息中心获得(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。这种算法首先通过在查询序列中识别短的长度为W的字符串，识别出高分值序列配对(HSP)，当在一个数据库序列中与相同长度的字符串排列时，该序列配对匹配或满足一些阳性意义的阈值评分T。T被称为是邻近的字符串分值的阈值(Altschul等人，见前，1977，1990)。这些最初的邻近字符串点击可作为启动检索寻找含有它们的更长的HSP的开端。字符串点击可沿着每个序列两个方向延伸，只要累计的排列分值增加。对核苷酸序列的累计分值的计算可以采用参数M(对一对相匹配的残基的奖励分值；一般＞0)。对于氨基酸序列，采用一种评分矩阵来计算累计的分值。字符串点击在每个方向的延伸当出现以下情况时停止累计排列分值从达到的最大值下降至数量X时；由于一个或多个负分的残基排列分值的积累，导致累计的分值到达0或之下时；或达到每个序列的末端时。BLAST算法参数W，T和X决定了排列的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用的缺省字符串长度(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的缺省字符串长度为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 8910915，1989)排列(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。
BLAST算法也在两个序列之间进行相似性的统计学分析(见，例如，Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873，1993，在此引入作为参考)。由BLAST算法提供的一种相似性的测量方法是最小和数概率(P(N))，它提供了一种概率的指示法，根据它在两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生。例如，如果在比较待测核酸与参考核酸之间的最小和数概率少于大约0.2，更优选少于大约0.01，最优选少于大约0.001时，该核酸被认为与参考序列是相似的。
在一个实施方案中，蛋白质和核酸序列同源性是采用基本局部排列检索工具(“BLAST”)进行评价的。尤其是，5个特殊的BLAST程序用来进行下列的工作(1)BLASTP和BLAST3将一种氨基酸查询序列与一个蛋白质序列数据库进行比较；(2)BLASTN将一种核苷酸查询序列与一个核苷酸序列数据库进行比较；(3)BLASTX将一个查询核苷酸序列(两条链)的6框的概念翻译产物与一个蛋白质序列数据库进行比较；(4)TBLASTN将一个查询蛋白质序列与一个在所有六个阅读框(两条链)中翻译的核苷酸序列数据库进行比较；和(5)TBLASTX将一个核苷酸查询序列的6框翻译与一个核苷酸序列数据库的6框翻译进行比较。
BLAST程序通过识别相似片段来鉴定同源序列，这里所指的相似片段是指在查询氨基酸或核酸序列和一种待测序列之间的“高分值的片段对”，该待测序列优选从一种蛋白质或核酸序列数据库中获得。高分值的片段对优选采用一种评分矩阵的方法进行鉴定(即排列)，在本领域中许多这样的矩阵是已知的。优选地，使用的评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet等人，Science 2561443-1445，1992；Henikoff和Henikoff，Proteins 1749-61，1993，两文在此均引入作为参考)。不太优选的是，也可使用PAM或PAM250矩阵(Schwartz和Dayhoff，主编，“检测距离关系的矩阵蛋白质序列和结构图集”(Matrices for Detecting DistanceRelationshipsAtlas of Protein Sequence and Structure)(Washington，国家生物医学研究基金会1978))。BLAST程序可通过美国国家医学图书馆访问，例如，在www.ncbi.nlm.nih.gov。
在上述算法中使用的参数可根据研究的序列长度和同源性程度进行调整。在一些实施方案中，没有用户指令时，参数可以是算法所提供的缺省参数。
编码一种原肌生长抑制素的多核苷酸可来自任何生物体，包括例如，小鼠、大鼠、牛、猪、人、鸡、火鸡、斑马鱼、鲑鱼、有鳍的水族、其它水生生物和其它物种。水生生物的实例包括那些属于鱼塘鱼类的生物，如鲑鱼、红点鲑、香鱼、鲤鱼、鲫鱼、金鱼、昏白鱼、银鱼、鳝鱼、海鳗、沙丁鱼、飞鱼、巴西刺鲈、鲷、鹦鹉鲈鱼、新西兰真鲷、鲭、白腹鲭、鲔鱼、鲣鱼、、鲱鱼、岩鱼、平鱼(fluke)、鳎鱼、比目鱼、河豚、纯鱼；那些属于头足类的生物，如鱿鱼、墨鱼、章鱼；那些属于斧足类的生物，如蛤(如，硬壳蛤、蛤仔、圆蛤、海蛤蜊、软壳蛤)；乌蛤、蛤贝、海螺；扇贝(如，海扇贝、海湾扇贝、calloo)；海螺、蜗牛、海参、赤贝；牡蛎(如贞洁巨牡蛎(C.virginica)，海湾牡蛎，新西兰牡蛎，太平洋牡蛎)；那些属于腹足类的生物，如螺旋贝、鲍鱼(如绿鲍鱼、粉红鲍鱼、红鲍鱼)；和那些属于甲壳类的生物，如龙虾，包括但不限于刺蜥、岩蜥和美洲蜥；对虾；河虾，包括但不限于罗氏对虾(M.rosenbergii)，P.styllrolls，印度对虾(P.indicus)，日本对虾(P.jeponious)，斑节对虾(P.monodon)，P.vannemel，M.ensis，S.melantho，N.norvegious，冷水河虾；蟹，包括但不限于蓝蟹、白嘴蟹、石蟹、王蟹、雪花蟹、雪蟹、褐蟹、邓杰内斯蟹、约拿蟹、红树蟹、软壳蟹；虾蛄、磷虾、河蝥虾(langostinos)；小龙虾/龙虾，包括但不限于蓝色的、栗色的、红爪的、红沼泽的、软壳的、白色的；环节动物门的动物；脊索动物门的动物，包括但不限于爬虫类如美洲鳄鱼和龟；两栖类生物，包括蛙；和棘皮类，包括但不限于海胆。
本发明提供一种基本上经纯化的原肌生长抑制素多肽的肽部分，和一个基本上经纯化的原-GDF-11多肽的的肽部分。如在此所使用的，提到“原-GDF”，例如原肌生长抑制素或原-GDF-11，它意味着全长的多肽，包括氨基末端的功能前区和羧基末端的生物学活性GDF肽。另外，功能前区包括一个信号肽(引导序列)，它由功能前区氨基末端的起始15至30个氨基酸组成。信号肽可从全长的原-GDF多肽中剪切下来，后者可进一步在一个Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)蛋白质水解剪切位点上被剪切。
在此所提到的氨基酸残基的参照物是根据图1和2(也见序列列表)中显示的全长原-GDF多肽而言。也应该认识到在此所提到的特定多肽是开始或者终止在“大约”一个特殊的氨基酸残基处。在此文中使用术语“大约”是因为认识到在蛋白水解剪切识别位点处或邻近部位，一个特殊的蛋白酶可切断原-GDF多肽，或从识别位点切下一个或几个氨基酸。如此，例如，所提到的一个具有SEQ ID NO4的大约1至263氨基酸残基的序列的肌生长抑制素功能前区包括原肌生长抑制素的一个氨基末端肽部分，包括信号肽，并具有在氨基酸残基257至氨基酸残基269，优选在氨基酸残基260至氨基酸残基266终止的一个羧基末端。
类似地，信号肽可从一个原-GDF多肽的大约15至30氨基酸残基的任何位置上被切断，例如，在残基15，20，25或30上切断，不影响剩余功能前区的功能。因此，为方便起见，在此一般谈到一个原-GDF多肽的肽部分时，信号肽已经从中被切下来，其起始在大约氨基酸残基20处。但是，将要认识到的是信号肽的剪切可以在一个原-GDF多肽氨基末端大约起始15至30个氨基酸之中的任意氨基酸位置处进行。如此，例如，所提到的一个具有SEQ ID NO4的大约20至263个氨基酸残基的序列的肌生长抑制素功能前区包括原肌生长抑制素的一个肽部分，它缺少原肌生长抑制素的大约起始的15至30个氨基酸，包含信号肽，并具有在氨基酸残基257至氨基酸残基269，优选在氨基酸残基260至氨基酸残基266终止的一个羧基末端。
一般来说，在此提到的一个原-GDF多肽或一个GDF功能前区其开始在大约氨基酸1处。但考虑到上述的公开内容，将认识到这样的缺少信号肽的原GDF多肽或GDF功能前区也包括在本发明中。在此方面应进一步认识到在本发明的肽中存在或缺少信号肽可影响，例如，细胞的区室，该细胞是一种肽，例如原肌生长抑制素功能前区将穿过它，并且该肽将最终定位在此的细胞，包括该肽是否可从细胞中被分泌出来。因此，本发明进一步提供了一个基本上经纯化的原-GDF多肽的信号肽部分。如在此所公开的，这样一种信号肽可用来将一种药剂，特别是一种肽药剂，引导到产生该信号肽的天然合成GDF的相同细胞区室中。
术语“肽”或“肽部分”在此广泛用来指通过肽键连接的两个或更多个的氨基酸。术语“片段”或“蛋白水解片段”在此也用来指一种可通过在一个多肽上进行蛋白水解反应产生的产物，即一种通过切断多肽中的肽键所产生的肽。尽管术语“蛋白水解片段”一般在此用来指通过蛋白水解反应产生的一种多肽，应该认识到该片段不仅不必必须通过蛋白水解反应来产生，而且也可采用化学合成或重组DNA技术的方法来产生，如在下面所详述的，这些方法可产生一种合成肽，它与蛋白水解片段是相同的。考虑到原肌生长抑制素和其它TGF-β超家族成员之间已公开的同源性，将要认识到本发明所述肽的特征部分地在于它不存在于以前公开的该超家族的成员之中。采用上述的计算机算法可很容易地确定，一个原肌生长抑制素或原-GDF-11多肽的肽部分是否存在于以前所公开的TGF-β超家族成员中。
一般来说，本发明所述肽含有至少6个氨基酸，一般含有大约10个氨基酸，可含有15个或更多的氨基酸，特别是20个或更多的氨基酸。应该认识到术语“肽”在此并不用来说明组成分子的氨基酸的特定的大小或数目，本发明所述肽含有可达几个氨基酸残基或更多的残基数目。例如，全长的成熟C-末端肌生长抑制素肽含有超过100个氨基酸，一个全长的功能前区肽可含有超过260个氨基酸。
如在此所使用的，术语“基本上经纯化的”或“基本上纯的”或“分离的”是指所提到的分子，例如一种肽或一种多核苷酸，其形式相对地不含有蛋白质、核酸、脂类、碳水化合物或其它与其天然相关的物质。一般来说，基本上纯的肽、多核苷酸、或其它分子其含量至少是样品量的20％。一般至少占样品量的大约50％，通常至少占样品量的大约80％，尤其是占样品量的大约90％或95％或更多。判断本发明所述肽或所述多核苷酸基本上是纯的，可以采用熟知的方法来进行，例如通过进行电泳，将相对分离的条带鉴定特定的分子。一种基本上纯的多核苷酸，例如可通过克隆该多核苷酸或化学或酶合成的方法获得。一种基本上纯的肽，例如可通过化学合成的方法，或采用蛋白质纯化的方法来获得，然后进行蛋白质水解，如果需要，通过色谱或电泳的方法来进一步纯化。
本发明的肽可分别通过与原肌生长抑制素或原-GDF-11序列的比较并确定该肽的氨基酸序列包含在原肌生长抑制素或原-GDF-11多肽序列中来鉴定。但应该认识到，本发明的肽不需要与原肌生长抑制素或原-GDF-11的相应氨基酸序列相等同。因此，例如，本发明的肽可对应原肌生长抑制素多肽的氨基酸序列，但可与天然发生序列有所不同，例如在对应的L-氨基酸的位置含有一个或多个D-氨基酸；或含有一个或多个氨基酸类似物，例如，已经发生衍生化作用或者是在其活性侧链上具有被修饰的氨基酸。类似地，在肽的一个或多个肽键上可以被修饰。另外，在氨基末端或羧基末端或两者上的活性基团可以被修饰。这样的肽被修饰后，例如，可提高对蛋白酶、氧化剂或该肽在生物学环境中可能遇到的其它活性物质的稳定性，并因此在本发明所述方法的实施过程中特别有用。当然肽可以被修饰使其在生物学环境中降低稳定性，以便减少该肽在环境中具有活性的时间。
与原肌生长抑制素或原-GDF-11多肽中的相应序列相比较，本发明的肽序列也可通过插入一种保守的氨基酸替代肽中的一个或几个氨基酸而进行修饰。保守的氨基酸替代作用包括用具有相对相同化学特性的另一个氨基酸残基替代一个氨基酸残基，例如一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代另一个，或一个极性残基替代另一个，例如精氨酸替代赖氨酸；或谷氨酸替代天冬氨酸；或谷氨酰胺替代天冬酰胺；或类似的情况。细查图1，原肌生长抑制素多肽可被修饰位置的实例是很明显的，它显示了实质上不影响原肌生长抑制素或肌生长抑制素活性的肌生长抑制素功能前区和成熟肌生长抑制素肽中的多个氨基酸差异。
本发明也提供了一种生长分化因子(GDF)多肽(原-GDF多肽)或其功能性肽部分的一种基本上经纯化的蛋白水解片段。原-GDF多肽的蛋白水解片段在此的实例是原肌生长抑制素多肽的蛋白水解片段和原-GDF-11多肽的蛋白水解片段。如在此所公开的，与原-GDF蛋白水解片段相同的原-GDF多肽的肽部分可通过一种化学的方法或一种重组DNA的方法来产生。考虑到此处公开的内容，其它GDF多肽的蛋白水解片段可很容易的进行制备和使用。
总体来说，对应原-GDF多肽蛋白水解片段的肽的实例是一个羧基末端(C-末端)成熟GDF片段，它可特异地与一个GDF受体相互作用，并影响GDF的信号转导，以及一个氨基末端功能前区片段，它可包括一个信号肽，如在此所公开的，它可特异地与原-GDF多肽或成熟的GDF肽相互作用，并影响其引发GDF信号转导作用的能力。例如，原肌生长抑制素多肽的蛋白水解片段包括一个C-末端成熟肌生长抑制素肽，它可特异地与一个肌生长抑制素受体相互作用，并诱导肌生长抑制素信号转导作用；以及一个氨基末端功能前区片段，它可特异地与肌生长抑制素相互作用，因此减少或抑制肌生长抑制素诱发肌生长抑制素信号转导作用的能力。
原-GDF多肽的蛋白水解片段或其功能性肽部分一个的特性部分地在于具有或影响与GDF信号转导作用刺激或抑制作用相关的活性。例如，一个原肌生长抑制素多肽或其功能性肽部分具有肌生长抑制素受体结合活性，肌生长抑制素信号转导作用刺激或抑制活性，肌生长抑制素结合活性，原肌生长抑制素结合活性，或其联合作用。因此，术语“功能性肽部分”，当在此用来说明原-GDF多肽时，是指可与其受体特异地相互作用，并刺激或抑制GDF信号转导作用的原-GDF多肽的一个肽部分；可特异的与一个成熟的GDF或原-GDF相互作用的原-GDF多肽的一个肽部分；或可发挥细胞定位活性的原-GDF多肽的一个肽部分，即信号肽的活性。应该认识到，例如，全长成熟的肌生长抑制素肽的功能性肽部分，不需要具有与成熟肌生长抑制素相同的活性，包括刺激肌生长抑制素信号转导作用的能力，因为成熟肽的功能性肽部分，例如，具有特异地与肌生长抑制素受体相互作用的能力，而不需要具有激活信号转导作用通路的能力。鉴定这样一种可用作肌生长抑制素拮抗剂的原-GDF多肽的功能性肽部分的方法，在此被公开或在本领域是已知的。因此，在一个实施方案中，原肌生长抑制素多肽的一种功能性肽部分可特异地与一种肌生长抑制素受体相互作用，并可作为刺激肌生长抑制素信号转导作用的一种激动剂或减少或抑制肌生长抑制素信号转导作用的一种拮抗剂。
在另一个实施方案中，原肌生长抑制素多肽的一种功能性肽部分可特异地与一种原肌生长抑制素多肽或一种成熟的肌生长抑制素肽相互作用，因此可阻断肌生长抑制素信号转导作用。这样的一种原肌生长抑制素的功能性肽部分的作用有，例如，可阻止原肌生长抑制素多肽断裂成为成熟的肌生长抑制素；与成熟的肌生长抑制素肽形成一个复合体；或有其它一些机制。在肽-肌生长抑制素复合体形成的部位，复合体可阻断肌生长抑制素的信号转导，例如通过减少或抑制肌生长抑制素与其受体特异地相互作用的能力，或通过与受体结合，该结合形式缺乏诱导肌生长抑制素信号转导作用的能力。
原-GDF多肽的蛋白水解片段可通过在蛋白水解剪切位点剪切多肽来产生，该位点具有共有氨基酸序列Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ IDNO21)。这样的蛋白水解识别位点的实例是Arg-Ser-Arg-Arg(SEQ IDNO22)序列，在SEQ ID NO1(原肌生长抑制素)中显示为氨基酸残基263至266，或SEQ ID NO25(人原-GDF-11；也见，图2的相对位置267至270)中的氨基酸残基295至298，在SEQ ID NO20显示为氨基酸残基263至266的Arg-Ile-Arg-Arg(SEQ ID NO23)序列。
除了信号肽的蛋白水解位点以外，例如原肌生长抑制素多肽，含有其它两个潜在的蛋白酶解加工位点(Lys-Arg和Arg-Arg)。在后一个蛋白酶解加工位点或其附近剪切原肌生长抑制素多肽，可产生一个生物学活性的C-末端成熟人肌生长抑制素片段，其中该位点包含在共有Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)蛋白水解剪切识别位点之中(见，例如，SEQ ID NO2的氨基酸残基263至266)。全长的成熟肌生长抑制素肽的实例含有大约103至大约109个氨基酸，其预测分子量为大约12,400道尔顿(Da)。另外，肌生长抑制素可形成二聚体，后者的预期分子量大约为23至30千道尔顿(kDa)。二聚体可以是肌生长抑制素同型二聚体，或是杂二聚体，例如，与GDF-11或另一个GDF或TGF-β家族成员一起。
本发明的一个蛋白水解片段的实例是GDF功能前区(GDFprodomain)，例如一个肌生长抑制素功能前区，它包括大约原肌生长抑制素多肽的氨基酸残基20至262，或其功能性肽部分，或GDF-11的功能前区，它包括原-GDF-11多肽的大约氨基酸残基20至295，或其功能性肽部分，两者都进一步含有信号肽，该信号肽由各自的原-GDF多肽的大约氨基酸1至20组成。肌生长抑制素功能前区的进一步实例是，在SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中列出的氨基酸残基大约20至263；以及在SEQ ID NO2，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQID NO8，SEQ ID NO18，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16，SEQ ID NO20中列出的氨基酸残基大约20至262，它们可通过相应的原肌生长抑制素多肽的蛋白水解剪切，通过化学合成，或可从编码蛋白水解片段的重组多核苷酸的表达而产生。肌生长抑制素功能前区的功能性肽部分的实例是可特异与肌生长抑制素或原肌生长抑制素相互作用的原肌生长抑制素功能前区的肽部分。一个GDF-11功能前区的实例是SEQ IDNO25的大约氨基酸残基20至295，它可进一步包括信号肽，该信号肽由SEQ ID NO25的大约氨基酸残基1至20组成，GDF-11功能前区的功能性肽部分的实例是可特异与成熟GDF-11或原-GDF-11多肽相互作用的GDF-11功能前区的肽部分。优选的是，GDF功能前区的功能性肽部分可抑制相应GDF或相关GDF刺激信号转导作用的能力，例如通过减少或抑制GDF特异地与其受体相互作用的能力，或通过与受体结合成为一个无活性复合体。在一个实施方案中，本发明提供了一个原-GDF多肽的功能性片段，特别是一个GDF功能前区的功能性片段，可有效地连接于一个GDF信号肽，优选一个肌生长抑制素信号肽或GDF-11信号肽，分别由原肌生长抑制素或原-GDF-11的起始大约15至30个末端氨基酸组成。
如在此所公开的，肌生长抑制素功能前区或GDF-11功能前区可与成熟的肌生长抑制素，GDF-11或两者相互作用，因此可减少或抑制成熟GDF与其受体特异相互作用的能力(见实施例7和8)。因此，获得肌生长抑制素功能前区的一个功能性肽部分的方法，例如，可采用在此提供的方法，通过检测肌生长抑制素功能前区的肽部分，并鉴定可特异地与肌生长抑制素或与原肌生长抑制素相互作用并且减少或抑制肌生长抑制素与肌生长抑制素受体的相互作用或肌生长抑制素刺激肌生长抑制素信号转导作用的能力的功能前区功能性肽部分。
可特异地与肌生长抑制素相互作用的肌生长抑制素功能前区的一个功能性肽部分，或另一个GDF功能前区的一个功能性肽部分，也可采用任何已知用于识别特异的蛋白质-蛋白质相互作用的测定方法来鉴定。这样的测定方法包括，例如，凝胶电泳法，亲合层析法，Fields和Song的双杂种系统法(the two hybrid system)(Nature 340245-246，1989；也见美国专利5,283,173；Fearon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA897958-7962，1992；Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 889578-9582，1991；Young，Biol.Reprod.58302-311(1998)，每一篇文献都在此引入作为参考文献)，逆向双杂种测定方法(Leanna和Hannink，Nucl.Acid Res.243341-3347，1996，在此引入作为参考文献)，阻遏型反式激活蛋白系统(美国专利No.5,885,779，在此引入作为参考)，噬菌体展示系统(Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-424，1997，在此引入作为参考)，GST/HIS破坏测定，突变体操纵子(WO 98/01879，在此引入作为参考文献)，蛋白补充系统(美国专利No.5,776,689，在此引入作为参考文献)，以及类似方法(见，例如，Mathis，Clin.Chem.，41139-147，1995 Lam，Anticancer Drug Res.12145-167，1997；Phizicky等人，Microbiol.Rev.5994-123，1995；每一篇文献在此都引入作为参考文献)。
GDF功能前区的一个功能性肽部分也可采用制作分子模型的方法进行鉴定。例如，一个成熟的肌生长抑制素肽的一个氨基酸序列可输入具有合适的模拟软件的计算机系统中，可产生肌生长抑制素的三维表象(“虚拟的肌生长抑制素”)。原肌生长抑制素的氨基酸序列也可被输入至计算机系统中，这样模拟软件可模拟原肌生长抑制素序列的部分，例如，功能前区的部分，可鉴定出能与虚拟肌生长抑制素特异相互作用的功能前区的这些肽部分。特异相互作用的基线可通过模拟虚拟的肌生长抑制素和全长的原肌生长抑制素功能前区而预先确定，鉴定在虚拟肌生长抑制素中被功能前区“接触”的氨基酸残基，因为这样的一个相互作用已知可抑制肌生长抑制素的活性。
应该认识到，这样的方法，包括双杂种体系测定法和制作分子模型方法，也可用来鉴定包括在本发明中的其它特异性相互作用的分子。因此诸如双杂种体系测定法可用来鉴定GDF受体如肌生长抑制素受体，例如可采用能特异地与一个Act RIIA或Act RIIB受体相互作用的肌生长抑制素肽或其肽部分作为测定中的一个结合成分，并鉴定能与肌生长抑制素肽特异相互作用的GDF受体。类似地，制作分子模型的方法可用来鉴定能与一个成熟GDF肽如成熟的肌生长抑制素，或与一个GDF受体，特异性相互作用的药剂，因此该药剂可用作GDF或GDF受体介导的信号转导作用的激动剂或拮抗剂。这样一种药剂可以是，例如肌生长抑制素功能前区或GDF-11功能前区的一个功能性肽部分，或一种可模拟GDF功能前区作用的化学药剂。
用于在此公开的目的的模拟系统是基于通过例如结晶学分析或核磁共振分析得到的结构信息，或根据一级结构序列信息(见，例如，Dunbrack等人，“会议综述蛋白质结构预测技术关键性评价第二次会议(Meeting reviewthe Second meeting on the Critical Assessment ofTechniques for Protein Structure Prediction)(CASP2)(Asilomar，加利福尼亚，1996年12月13-16日)”Fold Des.2(2)R27-42，(1997)；Fischer和Eisenberg，Protein Sci.5947-55，1996；(也见美国专利5,436,850)；Havel，Prog.Biophys.Mol.Biol.5643-78，1991；Lichtarge等人，J.Mol.Biol.274325-37，1997；Matsumoto等人，J.Biol.chem.27019524-31，1995；Sali等人，J.Biol.Chem.2689023-34，1993；Sali，Molec.Med.Today 1270-7，1995a；Sali，Curr.Opin.Biotechnol.6437-51，1995b；Sali等人，Proteins23318-26，1995c；Sali，Nature Struct.Biol.51029-1032，1998；美国专利No.5,933,819；美国专利No.5,265,030，每一篇在此都引入作为参考文献)。
原肌生长抑制素多肽或GDF受体的晶体结构坐标可用来设计可与该蛋白质结合的化合物，并可用多种方法改变其物理或生理学特性。蛋白质的结构坐标也可用来在小分子数据库中计算机筛选可与该多肽结合的药剂，以便开发调节或结合的药剂，它可作为GDF信号转导作用的激动剂或拮抗剂发挥作用。这样的药剂可通过计算机采用标准的方程匹配动力学数据来鉴定(见，例如，Segel，“酶动力学”(J.Wiley & Sons1975)，在此引入作为参考文献)。
采用晶体结构数据来设计抑制剂或结合剂的方法在本领域是已知的。例如，GDF受体坐标可添加到其它可获得的相似受体的坐标上，包括具有一个结合抑制物的受体，可为抑制物与受体的相互作用提供最接近的方式。在合理化药剂设计实践中，使用的计算机程序也可用来鉴定一些化合物，这些化合物可复制类似于已发现的相互作用特性，例如在成熟肌生长抑制素和共结晶的肌生长抑制素功能前区之间发现的相互作用特性。详细了解特异性相互作用的性质有助于修饰化合物以改变或改善其可溶性，药剂动力学和类似特性，而不影响结合活性。
执行应用晶体结构信息设计药剂所需功能的计算机程序是为人熟知的。这样程序的实例包括，Catalyst DatabasesTM-一个可访问化学数据库如BioByte Master File，Derwent WDI和ACD的信息检索程序；Catalyst/HYPOTM-产生化合物的模型，并可用药剂侯选物的结构推测解释活性的变化；LudiTM-通过鉴定和匹配互补极性和疏水基团，将分子插入到蛋白质的活性位点中；以及LeapfrogTM-采用遗传学算法在用户控制的参数下“生成”新的配体。
许多普通用途的机器均可使用这种程序，或更方便的是组建更专业化的仪器来执行这种操作。一般来说，实例的实施可在一个或多个在可编程的系统中运行的计算机程序中执行，每个系统至少包含一个处理器，至少一个数据存储系统(包括易失性存储器和非易失性储器和/或存储元件)，至少一个输入装置，至少一个输出装置。程序在处理器上运行以执行在此所述的各种功能。
每个这样的程序都可以以任何所需的计算机语言，包括例如，机器语言，汇编语言，高等程序语言，或面向目标的程序语言，来实现与计算机系统的交流。在任何情况下，语言都可以是一个已编译或解释语言。计算机程序典型地将被储存在存储介质或装置中，例如，只读存储器(ROM)，大容量只读存储器(CD-ROM)，磁性或光学介质，或类似物，当存储介质或装置被计算机读取执行在此所述的步骤时，这些介质可以被一般或特殊用途程序计算机所读取以配置和运行计算机。该系统也可被认为是当作一个计算机可读取的存储介质，用计算机程序配置，其中这样配置的存储介质可使计算机以一种特殊的和预定的方式运行以执行在此所述的各种功能。
本发明的实例包括一些系统，例如，基于互联网的系统，特别是存储和处理坐标信息的计算机系统，如在此所述，这些信息来自结晶学或NMR分析，或氨基酸或核苷酸序列信息。如在此所使用的，术语“计算机系统”是指用来分析在此出现的坐标或序列的硬件部件，软件部件和数据存储部件。典型地计算机系统包括一个处理、访问和操纵序列数据的处理器。处理器可以是任何已知类型的中央处理器，例如Intel公司的奔腾II或奔腾III处理器，或太阳，摩托罗拉，康柏，先进微装置(AMD)或国际商用机器的类似处理器。
典型地计算机系统是一个一般用途的系统，包括处理器和一个或多个存储数据的内部数据存储部件，以及一个或多个在数据存储部件中检索数据的数据检索装置。专业技术人员可很容易的理解现在可见到的任何一个计算机系统都是适合的。
在一个实施方案中，计算机系统包括连接于系统总线的一个处理器，该总线与主存储器相连接，优选用RAM来实现，和一个或多个内部数据存储装置，如一个硬盘驱动器或其它记录数据的计算机可读介质。在一些实施方案中，计算机系统进一步包括一个或多个可在内部数据存储装置上读取存储数据的数据检索装置。
数据检索装置可能代表，例如，一个软盘驱动器，一个光盘驱动器，一个磁带驱动器，或一个能与远程数据存储系统连接的调制解调器(如，通过互联网)。在一些实施方案中，内部的数据存储装置是一种可移动的计算机可读介质，如一张软盘，一张光盘，一张磁带等等，上面包含已记录的控制逻辑和/或数据。有利地是计算机系统可以包含或编有适当的软件，以便一旦插入数据检索装置，就从数据存储部件中读取控制逻辑和/或数据。
计算机系统一般包含一个显示器，它可用来对计算机用户进行显示输出数据。也应该指出的是计算机系统可在一个网络或广域网络中连接到其它的计算机系统上以便提供对该计算机系统的集中式访问。
只要需要鉴定一种可特异地与肌生长抑制素或与GDF受体相互作用的化学实体时，可以使用任何能筛选其具有与该分子的特异相互作用能力的化学实体或片段的方法。这种过程的开始可通过，例如，在计算机屏幕上观察肌生长抑制素和肌生长抑制素功能前区。然后选择的功能前区的肽部分或可作为模拟物的化学实体，可被定位在多种方向，或插入至肌生长抑制素的单个结合位点中。可采用软件如Quanta和Sybyl完成插入过程，然后进行能量最小化，并用标准的分子力学力场，如CHARMM和AMBER完成分子动力学。
可特别采用专门的计算机程序来选择功能前区的肽部分，或有用的化学实体，例如GDF受体激动剂或拮抗剂。例如，这样的程序包括GRID(Goodford，J.Med.Chem.，28849-857，1985；可从牛津大学获得，牛津，英国)；MCSS(Miranker和Karplus，ProteinsStructure.Function andGenetics 1129-34，1991，可从Molecular Simulation获得，Burlington MA)；AUTODOCK(Goodsell和Olsen，ProteinsStructure.Function andGenetics 8195-202，1990，可从Scipps Research Institute，La Jolla CA获得)；DOCK(Kuntz等人，J.Mol.Biol.161269-288，1982，可从加利福尼亚大学获得，旧金山CA)，每一篇文献在此都引入作为参考文献。
已经被选择的合适的肽或药剂可组装成一个单一的化合物或结合药剂。装配可通过观察显示在计算机屏幕的三维影像上片段之间的相互关系来进行，然后采用软件如Quanta或Sybyl进行人工模型构建。能辅助本领域专业技术人员连接单个化学实体或片段的有用的程序，包括，例如，CAVEAT(Bartlett等人，Special Pub.，Royal Chem.Soc.78182-196，1989，可从加利福尼亚大学获得，伯克利CA)；3D数据库系统如MACCS-3D(MDL信息系统，圣莱昂纳多CA；综述，见Martin，J.Med.Chem.352145-2154，1992)；HOOK(可从Molecular Simulations获得，Burlington，Mass.)，每一篇在此均引入作为参考文献。
除了采用逐步剔除的方式，如上所述每次一个片段或一个化学实体，构建或鉴定这样特异相互作用的药剂的方法以外，药剂可设计成一个整体或重新采用一个空闲的活性位点，或任意的包含一个已知的可特异相互作用的药剂的一部分，例如一个全长的肌生长抑制素功能前区，其与肌生长抑制素特异地相互作用。这样的方法包括，例如，LUDI(Bohm，J.Comp.Aid.Molec.Design 661-78，1992，可从BiosymTechnologies获得，圣地亚哥CA)；LEGEND(Nishibata和Itai，Tetrahedron 478985，1991，可从Molecular Smiulations，Burlington MA获得)；LeapFrog(可从Tripos Associates获得，圣路易MO)，以及那些由Cohen等人(J.Med.Chem.33883-894，1990)和Navia和Murcko(Curr.Opin.Struct.Biol.2202-210，1992)所描述的，每一篇在此均引入作为参考文献。
在本领域中可得到专门的计算机软件来评价化合物的形变能和静电相互作用。设计用于这些目的的程序的实例包括Gaussian 92，修正版C(Frisch，Gaussian公司，Pittsburgh PA，1992)；AMBER，4.0版(Kollman，加利福尼亚大学旧金山分校，1994)；QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations公司，Burlington MA，1994)和Insight II/Discover(Biosysm Technologies公司，圣地亚哥CA，1994)。这些程序可采用，例如Silicon图形工作站，IRIS 4D/35或IBM RISC/6000工作站550型来执行。其它的硬件系统和软件包对本领域专业技术人员是已知的，其速度和容量可不断的更改。
鉴定一种可与目标分子，例如与一个成熟的GDF肽如成熟的肌生长抑制素，或与一个GDF受体特异相互作用的药剂的制作分子模型过程，可如在此所公开的那样进行。第一步，执行一个靶分子，例如肌生长抑制素的虚拟表现形式。因此，在一个实施方案中，本发明可提供一个靶分子的虚拟表现形式，其中靶分子选自原-GDF多肽，例如，原肌生长抑制素；原-GDF多肽的肽部分；GDF受体；以及GDF受体的一个相关功能区，例如，GDF结合功能区。靶分子的虚拟表现形式可被显示出来或保存在计算机系统存储器中。该过程以起始状态启动，含有虚拟的靶分子，然后转换至一种状态，其中含有一个或多个虚拟受检分子的数据库存储至计算机系统的一个存储器中。如上所述，存储器可以是任何类型的存储器，包括RAM或其它内部的存储装置。
然后该过程转换至一种状态，其中第一个虚拟的受检分子对虚拟的靶分子特异相互作用的能力被确定，其中含有虚拟受检分子的数据库被开放以分析虚拟靶分子和虚拟受检分子的相互作用，并进行分析，其中受检分子可以是一组受检分子中的一个。确定特异性相互作用是基于维持在计算机系统中的软件所进行的计算，或通过与一个预先确定的特异相互作用进行比较，后者可存储在计算机系统的存储器内，在适当时可被访问。
然后该过程转换至一种状态，其中特异的相互作用在此被检测到，虚拟的受检分子被显示，或被存储在计算机上的第二个数据库中。如果合适，在需要时，重复该过程检测虚拟的靶分子和第二个虚拟的受检分子，第三个虚拟的受检分子，等等。
如果确定一个虚拟的受检分子能特异地与虚拟的靶分子相互作用，所鉴定的虚拟受检分子从数据库中移出，并显示给用户。这种状态通知用户，在被输入的范围内显示名称或结构的分子可与靶分子特异的相互作用。一旦所鉴定的受检分子的名称显示给用户，该过程转换至判定状态，其中可得出结论是否在数据库中是否存在更多的虚拟受检分子或要被检测。如果在数据库中不存在更多的分子，该过程终止在结束状态。但是，如果在数据库中存在更多的受检分子，该过程转换至一种状态，其中指示器指向数据库中的下一个受检分子以便检测其特异的结合活性。以这种方式，检测新分子与虚拟的靶分子特异相互作用的能力。
如上所述，这样的方法可用在包括在本发明权利要求范围内的多个方面。因此，这些方法可用来鉴定一个原肌生长抑制素功能前区的肽部分，该功能区可与肌生长抑制素特异地相互作用，可减少或抑制肌生长抑制素与其受体相互作用的能力或影响肌生长抑制素引发信号转导作用的能力。类似地，这些方法可用来鉴定小的有机分子，它们可模拟GDF功能前区的作用，因此可减少或抑制肌生长抑制素或GDF-11的信号转导作用。这些方法也可用来鉴定可与GDF受体特异相互作用的药剂，例如，Act RIIA，Act RIIB或其它GDF受体，这样的药剂可用作GDF受体激动剂或拮抗剂，它们可在细胞中调节GDF信号转导作用。另外，这些方法提供了一种手段来鉴定以前未知的原-GDF多肽或GDF受体，例如，通过鉴定特殊多肽的保守结构特征。
类似TGF-β超家族的其它成员，活性的GDF肽可作为前体多肽表达，它可被剪切成为成熟的、生物学活性的形式。因此，仍然在另一个实施方案中，原-GDF多肽的蛋白水解片段是一个成熟的GDF肽，或一个成熟GDF肽的功能性肽部分，其中如上所述，该功能性肽部分可具有GDF激动剂或拮抗剂的活性。蛋白水解片段可以是一个成熟的C-末端肌生长抑制素肽，它包括原肌生长抑制素多肽的大约氨基酸残基268至374(见图1；也见图2)，或一个成熟的C-末端GDF-11多肽，它包括原-GDF-11多肽的大约氨基酸残基299至407。全长的成熟肌生长抑制素肽的实例是在SEQ ID NO4和SEQ ID NO6中列出的氨基酸残基大约268至375；在SEQ ID NO2，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12，SEQ ID NO8，SEQ ID NO18，SEQ ID NO14，SEQ ID NO16和SEQ IDNO20中列出的氨基酸残基大约267至374，以及SEQ ID NO27中的氨基酸残基大约49至157和SEQ ID NO29中的氨基酸残基大约28至136。全长的成熟GDF-11肽的实例是SEQ ID NO25的氨基酸残基大约299至407。成熟GDF肽的功能性肽部分的实例是成熟肌生长抑制素或成熟GDF-11的肽部分，与成熟的GDF肽相比它们具有激动剂或拮抗剂活性。优选的，成熟的GDF肽活性具有与其受体特异相互作用的能力。
如在此所公开的，成熟的肌生长抑制素肽(在此一般是指“肌生长抑制素”)可通过与表达在细胞表面上的肌生长抑制素受体的特异相互作用(见实施例7)而诱发肌生长抑制素的信号转导活性。因此肌生长抑制素的功能性肽部分可通过采用在此描述的一种方法(实施例7)或本领域已知的方法，检测成熟肌生长抑制素肽的肽部分而获得，并鉴定能特异与一个肌生长抑制素受体，例如，表达在细胞上的激活素IIA型受体(Act RIIA)或Act RIIB受体相互作用的肌生长抑制素的功能性肽部分(Act RIIA，Cell 65973-982，1991；Act RIIB，Cell 6897-108，1992，二者在此全文引入以供参考)。
肌生长抑制素功能前区可减少或抑制肌生长抑制素信号转导活性。在一个实施方案中，肌生长抑制素功能前区可与肌生长抑制素特异的相互作用，因此减少或抑制了肌生长抑制素肽与其受体特异相互作用的能力。如在此所公开的，一个前体原肌生长抑制素也缺乏与肌生长抑制素受体特异相互作用的能力，因此可减少或抑制原肌生长抑制素断裂成为成熟肌生长抑制素的原肌生长抑制素突变体提供了一种减少或抑制肌生长抑制素信号转导作用的方法。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一个突变体原-GDF多肽，它含有一个或多个氨基酸突变，这些突变可阻止突变体原-GDF蛋白水解成为活性成熟的GDF肽。
本发明的突变体原-GDF多肽发生的突变，可影响蛋白水解位点如共有的蛋白水解切割识别位点Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)处的断裂，该位点存在于原-GDF多肽中。因此，突变可以是SEQ ID NO21的一个Arg残基的突变，这样以致于突变体原肌生长抑制素，例如，不能剪切成为肌生长抑制素功能前区和成熟的肌生长抑制素肽。但是，突变也可发生在不是蛋白水解剪切位点的位点上，可改变蛋白酶结合原-GDF多肽的能力，以致影响在剪切位点上的蛋白水解作用。本发明的突变体原-GDF多肽，例如，一个突变体原肌生长抑制素或突变体原-GDF-11相对肌生长抑制素或GDF-11具有显性失活活性，因此可用来减少或抑制肌生长抑制素或GDF-11在细胞中的信号转导作用。
本发明也提供了一个基本上纯化的多核苷酸，如上所述，它编码一个原肌生长抑制素多肽或一个突变体原肌生长抑制素的肽部分，或一个原-GDF-11多肽或突变体原-GDF-11的肽部分。如在下面更详细公开的，本发明也提供了可用作调节细胞上肌生长抑制素效应的药剂的多核苷酸，并进一步提供了一个编码GDF受体的多核苷酸，或其功能性肽部分。在下面的公开书中也提供了这样多核苷酸的实例。同样地，应该认识到下面的公开内容与在此公开的本发明的许多实施方案是相关的。
术语“多核苷酸”在此广泛用于表示两个或更多的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的序列，它们通过磷酸二酯键联系在一起。像这样，术语“多核苷酸”包括RNA和DNA，可以是一条基因或其一部分，cDNA，合成的多聚脱氧核糖核酸序列，或类似物，可以是单链或双链，也可以是DNA/RNA杂交链。而且，在此所使用的术语“多核苷酸”包括天然存在的核酸分子，可从细胞中分离，也可以是合成的分子，例如，可通过化学合成或酶学的方法如通过聚合酶链式反应(PCR)来制备。在许多实施方案中，本发明的多核苷酸含有核苷类似物或核苷酸类似物，或主链键而不是磷酸二酯键(见上)。
一般来说，包含多核苷酸的核苷酸是天然存在的脱氧核糖核苷酸，如与2’-脱氧核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶，或核糖核苷酸如与核糖连接的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶。但是，多核苷酸也可含有核苷酸类似物，包括非天然存在的合成核苷酸或修饰的天然核苷酸。这样的核苷酸类似物在本领域内是为人熟知的，并在市面上可购得，含有这样的核苷酸类似物的多核苷酸也是一样(Lin等人，Nucl.Acids Res.225220-5234(1994)；Jellinek等人，Biochemistry3411363-11372(1995)；Pagratis等人，Nature Biotechnol.1568-73(1997)，每一篇文献在此均引入作为参考文献)。
连接多核苷酸的核苷酸的共价键一般是磷酸二酯键。但是，共价键也可以是许多其它键中的任意一种，包括硫二酯键、硫代磷酸键、类似肽键或任何其它本领域已知可用于连接核苷酸产生合成多核苷酸的键(见，例如，Tam等人，Nucl.Acids.Res.22977-986(1994)；Ecker和Crooke，BioTechnology 13351360(1995)，每一篇在此均引入作为参考文献)。掺入非天然存在的核苷酸类似物或连接核苷酸或类似物的化学键，在多核苷酸暴露于含有核酸降解活性的环境中时特别有用，这种环境包括，例如一种组织培养基或在给一个活体给药时，因为被修饰的多核苷酸不太容易被降解。
由天然存在的核苷酸和磷酸二酯键组成的多核苷酸可被化学合成来产生，或采用重组DNA的方法，使用一个合适的多核苷酸作为模板来产生。相对比的是，由核苷酸类似物或不是磷酸二酯键的共价键组成的多核苷酸一般采用化学合成，尽管如T7聚合酶的酶可以将某种类型的核苷酸类似物掺入到多核苷酸中，因此可用来从一个合适的模板重组产生一个这样的多核苷酸(Jellinek等人，见前，1995)。
当一种多核苷酸编码一种肽，例如，原肌生长抑制素的肽部分或一个肽药剂，编码的序列一般包含在一个载体中，并可操作性地与合适的调控元件相连接，后者包括，如果需要，一个组织特异性启动子或增强子。编码肽可进一步被操作性地与，例如，肽标记如His-6标记或类似物连接，后者便于在靶细胞上鉴定该药剂的表达。多聚组氨酸标记肽如His-6可采用二价阳离子如镍离子，钴离子或类似物来进行检测。其它的肽标记包括，例如，FLAG抗原表位，它可采用抗FLAG抗体来检测(见，例如，Hopp等人，BioTechnology 61204(1988)；美国专利No.5,011,912，每一篇均在此引入作为参考文献)；c-myc抗原表位，它可采用该抗原表位的特异抗体来检测；生物素，它可采用链霉抗生物素或抗生物素蛋白来检测；和谷胱甘肽S-转移酶，它可采用谷胱甘肽来检测。这样的标记可提供其它的优势，即它们可便于分离可操作的连接的肽或肽药剂，例如，在需要获得一个对应于肌生长抑制素多肽的蛋白水解片段的基本上纯化的肽。
如在此所使用的，术语“可操作的连接”或“可操作的结合”的意思是两个或更多的分子根据相互的位置进行定位，这样它们可作为一个单一的单位，并可产生一种属于一个或两个分子或其联合体的功能。例如，编码本发明一种肽的一个多核苷酸序列可操作地与一个调控元件连接，其中调控元件可将其调节效应赋予该多核苷酸，这种方法类似于该调控元件作用于在细胞中与该调控元件相联系的一种多核苷酸序列。第一个多核苷酸编码序列也可操作地与第二个(或更多的)编码序列连接，这样嵌合的多肽可从可操作地连接的编码序列中表达。嵌合的多肽可以是一个融合多肽，其中两个(或更多的)编码肽被翻译成一个单一多肽，即通过一个肽键共价结合；或可被翻译成两个单独的多肽，在翻译中，可操作地的互相连接形成一个稳定的复合体。
一个嵌合多肽一般可表现其肽组分的一些或所有特性。像这样，如在此所公开的，嵌合多肽在实施本发明的方法中是特别有用的。例如，在一个实施方案中，本发明的一种方法可在细胞中调节肌生长抑制素的信号转导。因此，当一个嵌合多肽的一个肽组分编码细胞区室的定位结构域，并且第二个肽组分编码显性失活的Smad多肽时，该功能性嵌合多肽可被转运到由细胞区室定位结构域指定的细胞的区室中，并具有Smad多肽的显性失活活性，因此可调节细胞中的肌生长抑制素信号转导作用。
细胞区室化分结构域是为人所熟知的，包括，例如质膜定位结构域，核定位信号，线粒体膜定位信号和内质网定位信号，或类似物(见，例如，Hancock等人，EMBO J.104033-4039，1991；Buss等人，Mol.Cell.Biol.83960-3963，1988；美国专利No.5,776,689，每一篇文献在此均加入作为参考)。这种结构域可用来将一种药剂靶向至细胞中的一个特殊区室中，或引导该药剂从细胞中分泌出来。例如，肌生长抑制素受体的激酶结构域如Act RIIB一般与质膜的内表面是相联系的。因此，包含显性失活肌生长抑制素受体激酶结构域的嵌合多肽，例如缺乏激酶活性的显性失活Act RIIB受体，可进一步包含质膜定位结构域，因此可将显性失活Act RIIB激酶结构域定位在细胞膜的内表面。
如在此所公开的，原-GDF信号肽具有细胞定位活性。如在此所使用的，术语“细胞定位活性”是指信号肽指引可操作地与之连接的肽转运至一个或多个特异的细胞内区室中，或引导分子从细胞中分泌出来。像这样，原-GDF信号肽可特殊地用于指引肽或其它与信号肽可操作连接的药剂转运至与具有实质上同一信号肽的天然表达的GDF相同的细胞内区室中，。而且，信号肽，例如一个原肌生长抑制素信号肽包含原肌生长抑制素的大约起始15至30个氨基酸，可引导一个可操作连接的药剂从细胞中分泌出来，其分泌途径与含有信号肽的天然存在的原-GDF分泌途径相同。因此，实施本发明的一种方法的特别有用的药剂包括一个GDF功能前区，或其与GDF信号肽可操作连接的功能性肽部分，优选原肌生长抑制素或原-GDF-11信号肽。
本发明的一种多核苷酸，包括用于实施本发明方法中的一种多核苷酸，可直接与一种靶细胞接触。例如，用作反义分子的寡核苷酸，核酶，或三联药剂(triplexing agent)可直接与一种靶细胞接触，因此进入细胞并影响它们的功能。一个多核苷酸药剂也可特异地与一种多肽相互作用，例如，肌生长抑制素受体(或肌生长抑制素)，因此可改变肌生长抑制素与受体特异性相互作用的能力。这样的多核苷酸，以及制备和鉴定这种多核苷酸的方法在此被公开或在本领域中是已知的(见，例如，O□Connell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 935883-5887，1996；Tuerk和Gold，Science 249505-510，1990；Gold等人，Ann.Rev.Biochem.64763-797，1995；每一篇在此均引入作为参考文献)。
本发明的多核苷酸，可编码原-GDF多肽如原肌生长抑制素的肽部分，或编码突变体原肌生长抑制素多肽，或编码GDF受体或其功能性肽部分，或是可用在实施本发明方法中的多核苷酸药剂，可被包含在一个载体中，这样可便于多核苷酸的操作，包括将多核苷酸引入一个靶细胞中。载体可以是一个克隆载体，可用于保留多核苷酸，或可以是一个表达载体，它除了含有多核苷酸以外，还含有用于表达多核苷酸的调控元件，当多核苷酸编码一种肽时，用以在一种特殊的细胞中表达所编码的肽。一种表达载体可以包含表达元件，例如这些元件是，维持编码的多核苷酸的转录所必须的，或在被克隆进载体前，调控元件可操作地与多核苷酸连接。
一个表达载体(或多核苷酸)一般含有或编码一个启动子序列，它能提供组成型，或如果需要，诱导性或组织特异性或发育期特异性的编码多核苷酸的表达，一个聚腺苷酸(poly-A)识别序列，以及一个核糖体识别位点或内部核糖体进入位点，或其它的调控元件如一个增强子，它可以是组织特异性的。如果需要，载体也可含有原核或真核宿主系统复制所需的元件，或两者都有。这样的载体，包括质粒载体和病毒载体如细菌噬菌体，杆状病毒，逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，痘苗病毒，塞姆利基森林病毒和腺伴随病毒载体，都是已知的，并可从商业渠道中获得(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)或由本领域的专业技术人员来构建(见，例如，Meth.Enzymol.185卷，Goeddel，主编(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.Gene Ther.151-64，1994；Flotte，J.Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum等人，J.Clin.Invest.92381-387，1993；每一篇在此均引入作为参考文献)。
四环素(tet)诱导型启动子可特别用于驱动本发明的多核苷酸的表达，例如，一个编码肌生长抑制素的显性失活形式的多核苷酸，其中蛋白酶解加工位点已经突变，或编码肌生长抑制素功能前区的多核苷酸，它可与一个成熟的肌生长抑制素肽形成复合体，或编码GDF受体的显性失活形式的多核苷酸。在将四环素，或四环素类似物给与一个含有与tet诱导型启动子可操作连接的多核苷酸的受试者的过程中，可诱导编码肽的表达，由此肽可以影响其活性，例如，由此一种肽药剂可减少或抑制肌生长抑制素的信号转导作用。可采用这样一种方法，例如，来诱导成体生物体的肌肉过度生长。
多核苷酸也可操作地与组织特异性调控元件相连接，例如，一个肌肉细胞特异性调控元件，这样编码肽的表达被限制在个体的肌肉细胞中，或培养细胞中，例如器官培养的混合细胞群体中的肌肉细胞中。肌肉细胞特异调控元件包括，例如，肌肉肌酸肌酶启动子(Sternberg等人，Mol.Cell.Biol.82896-2909，1988，在此引入作为参考文献)和肌球蛋白轻链增强子/启动子(Donoghue等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA885847-5851，1991，在此引入作为参考文献)，在本领域均是为人熟知的。
病毒表达载体可特别用来将多核苷酸引入细胞中，特别是受试者的细胞中。病毒载体提供了这样的优势，即它们可以以相对高的效率感染宿主细胞，并可感染特殊的细胞类型。例如，编码原肌生长抑制素功能前区或其功能性肽部分的多核苷酸可被克隆进一个杆状病毒载体中，然后它被用于感染一个昆虫宿主细胞，因此提供了一种产生大量编码功能前区的方法。病毒载体也可来自一种感染目标生物体细胞的病毒，该生物体，如脊椎动物如哺乳动物、鸟类或鱼类宿主细胞。病毒载体可特别地用于将一个用在实施本发明方法中的多核苷酸引入一个靶细胞中。已经开发出了用于特殊宿主系统的病毒载体，特别是哺乳动物系统，包括，例如逆转录病毒载体，其它的慢病毒如那些以人免疫缺陷型病毒(HIV)为基础的病毒载体，腺病毒载体，腺伴随病毒载体，疱疹病毒载体，痘苗病毒载体，和类似载体(见Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson等人，Nature 39225-30Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature 389239-242，1997；Wilson，NewEngl.J.Med.3341185-1187(1996)，每一篇文献在此均引入作为参考文献)。
当逆转录病毒，例如，用于基因转移时，理论上是可以开发出复制逆转录病毒，因为在用来产生逆转录病毒载体的包装细胞系中重组逆转录载体和病毒基因序列。包装细胞系，其中该包装细胞系中已经减少或消除了由重组产生的复制病毒，可用来将复制逆转录病毒产生的可能性降至最低。所有用来感染细胞的逆转录病毒载体上清液均被采用标准的测定方法如PCR和逆转录酶测定来筛选复制病毒。逆转录病毒载体可允许异源基因整合进入宿主细胞基因组中，这可允许基因在细胞分裂后传递给子细胞。
包含在一个载体中的一种多核苷酸，可通过任何本领域已知的各种方法引入到细胞中(Sambrook等人，分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；Ausubel等人，现代分子生物学方法(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley和Sons，Baltimore，MD(1987，和1995年增刊)，每一篇文献在此均加入作为参考)。这样的方法包括，例如，转染、脂质转染法、微注射、电穿孔和用病毒载体，感染；可能包括使用脂质体、微乳剂或类似物，它们可促进多核苷酸进入细胞中，并可保护多核苷酸在进入细胞前免遭降解。特殊方法的选择将依赖于，例如多核苷酸要引入的细胞，以及细胞是否从培养物中分离，或存在于培养的组织或器官或原位中。
通过用病毒载体感染将多核苷酸引入细胞中是特别有益处的，因为它可有效的将核酸分子在离体或体内引入细胞内(见，例如，美国专利No.5,399,346，在此引入作为参考)。而且，病毒是非常专一性的，被选为载体是基于它在一种或几种特殊类型细胞中感染和增殖的能力。因此，它们的天然特异性可用来将包含在载体中的核酸分子靶向至特殊类型的细胞中。像这样，基于HIV的载体可用来感染T细胞，基于腺病毒的载体可用来，例如，感染呼吸上皮细胞，基于疱疹病毒的载体可用来感染神经元细胞，和类似情况。其它载体，如腺伴随病毒具有更大的宿主细胞范围，因此可用来感染多种细胞类型，尽管病毒或非病毒载体也可用特殊的受体或配体修饰通过受体介导的形式改变靶向的特异性。
本发明也提供了一些抗体，它们可特异地与原肌生长抑制素多肽或突变体原肌生长抑制素多肽的肽部分结合。本发明中特别有用的抗体包括可特异与肌生长抑制素功能前区，或其功能性肽部分结合的抗体，和可与原肌生长抑制素多肽结合并减少或抑制原肌生长抑制素蛋白水解断裂为成熟肌生长抑制素肽的抗体。另外，本发明的一种抗体可以是与GDF受体特异结合的抗体，或其功能性肽部分，如下面所描述的。制备和分离本发明的抗体的方法在下面更详细的进行描述，其公开内容在此引入作为参考文献。
肌生长抑制素对于骨胳肌质量的正常调节是很重要的。相对于野生型的小鼠，敲除肌生长抑制素的小鼠，缺乏肌生长抑制素，因为增生和肥大的联合作用，其肌肉的量是前者的两至三倍。如在此所公开的，敲除肌生长抑制素的小鼠的脂肪聚积大幅度减少，至少部分是因为全身骨胳肌组织合成代谢增加。相反的是，在裸鼠中肌生长抑制素的过度表达诱导了消耗综合征，类似于在人类慢性疾病如癌症或AIDS的患者中所观察到的恶病质状态。如在此进一步公开的，肌生长抑制素活性可通过一种具有Smad信号转导通路特性的信号转导作用进行介导。因此，本发明提供了调节细胞肌生长抑制素效应的方法，其方法是将细胞与一种可影响细胞内肌生长抑制素信号转导的药剂接触。
如在此所使用的，术语“调节”，当用来指肌生长抑制素在细胞上的作用时，其意思是细胞中的肌生长抑制素信号转导作用是增加的或减少或抑制的。术语“增加”和“减少或抑制”用来指相对于肌生长抑制素信号转导活性的基线水平，它是在缺乏肌生长抑制素时的信号转导通路的水平，或在存在肌生长抑制素时是正常细胞的活性水平。例如，肌生长抑制素信号转导通路可在与肌生长抑制素接触的肌肉细胞中表现特殊的活性，在肌肉细胞与肌生长抑制素功能前区的进一步的接触中，肌生长抑制素信号转导活性被减少或抑制。像这样，肌生长抑制素功能前区是一种可用来减少或抑制肌生长抑制素信号转导作用的药剂。类似地，另一个GDF家族成员的功能前区如GDF-11功能前区，或另一个TGF-β家族成员如激活素功能前区，MIS功能前区，或类似物，可用来降低肌生长抑制素的信号转导作用。术语“减少或抑制”在此一起使用，是因为认识到，在一些情况下，肌生长抑制素信号转导作用的水平可降低至用一种特殊检测方法可检测到的水平之下。像这样，采用这种测定方法来确定是否保持低水平的肌生长抑制素信号转导作用，或信号转导作用是否完全被抑制是不可能的。
如在此所使用的，术语“肌生长抑制素信号转导作用”是指一系列事件，一般是发生在细胞中的一系列蛋白-蛋白的相互作用，其原因是肌生长抑制素与表达在细胞表面上的肌生长抑制素受体之间的特异相互作用。像这样，肌生长抑制素信号转导作用可被检测，例如，可通过检测肌生长抑制素与细胞上其受体的特异相互作用，通过检测在细胞中肌生长抑制素信号转导作用中涉及的一个或多个多肽的磷酸化，通过检测一个或多个由于肌生长抑制素信号转导所特定诱导的基因的表达，或通过检测对肌生长抑制素信号转导作用反应而发生的表型改变(见实施例)。如在此所公开的，一种用在本发明方法中的药剂可作为刺激肌生长抑制素信号转导的激动剂或作为减少或抑制肌生长抑制素信号转导的拮抗剂。
本发明的方法在此一般以关于肌生长抑制素为例。但应该认识到，本发明的方法可更广泛地包括通过将细胞与影响细胞内由GDF产生的信号转导的药剂接触，调节其它GDF肽，例如GDF-11，对细胞的作用。实行本发明所有范围的方法因为本公开内容而很容易地理解，包括例如，识别GDF受体的方法，鉴定药剂的方法，该药剂调节由于GDF与其受体特异性相互作用而产生的信号转导，和类似方法。
肌生长抑制素信号转导通路在此的实例是Smad通路，它是在肌生长抑制素特异地与一个激活素II型受体的细胞外结构域作用过程中启动的，通过细胞内多肽的相互作用而进行传导，多肽包括细胞中的Smad蛋白。一般来说，肌生长抑制素信号转导与特殊的细胞内多肽如Smad多肽的磷酸化或去磷酸化有关。因此，在存在肌生长抑制素时，细胞中的肌生长抑制素信号转导可通过与缺少肌生长抑制素时多肽磷酸化水平比较，检测一个或多个Smad多肽磷酸化增加的水平来进行检测。本发明的一种方法提供了增加或减少肌生长抑制素信号转导作用0的手段，因此涉及肌生长抑制素信号转导通路中的Smad多肽的磷酸化水平将分别增加至正常的水平之上或降低至期望的水平之下。
本发明的方法的实施，例如，可通过在合适的条件下，将靶细胞和一种影响细胞肌生长抑制素信号转导的药剂相接触。合适的条件可通过将细胞置于合适的培养基中，该细胞可以是一种分离的细胞或是一种组织或器官的成分，或与生物体中的原位细胞接触。例如，含有细胞的培养基可与影响肌生长抑制素与表达在细胞上的肌生长抑制素受体特异相互作用的能力的一种药剂接触，或者与影响细胞内肌生长抑制素信号转导通路的一种药剂接触。一般来说，细胞可以是受试者一种组织或器官的成分，在这种情况下，接触细胞可包括将该药剂给与受试者。但是，细胞也可在培养液中处理，然后保存在培养液中，给与一个受试者，或用来产生转基因的非人动物。
用在本发明方法中的一种药剂可以是任何类型的分子，例如，一种多核苷酸，一种肽，一种肽模拟体(peptidominetic)，类肽(peptoids)如vinylogous类肽，一种小的有机分子，或类似物，可以以任何方式作用影响肌生长抑制素的信号转导。该药剂可通过结合肌生长抑制素或肌生长抑制素受体如激活素受体在细胞外作用，因此可改变肌生长抑制素与其受体特异相互作用的能力，或可在细胞内作用改变细胞内的肌生长抑制素信号转导。另外，该药剂可以是一种激动剂，可模仿或增强细胞上肌生长抑制素的作用，例如，肌生长抑制素与其受体特异相互作用的能力，因此增加了细胞中的肌生长抑制素信号转导作用；或可以是一个拮抗剂，它可减少或抑制肌生长抑制素在细胞上的作用，因此减少或抑制细胞中的肌生长抑制素的信号转导。
如在此所使用的，术语“特异的相互作用”或“特异的结合”或类似的情况意味着两种分子形成一种复合体，在生理环境下该复合体是相对稳定的。在此所使用的术语涉及多种相互作用，包括，例如，肌生长抑制素与肌生长抑制素受体的相互作用，肌生长抑制素信号转导通路细胞内组分的相互作用，抗体与其抗原的相互作用，以及肌生长抑制素功能前区与肌生长抑制素的相互作用。一种特异的相互作用的特征是，解离常数至少为大约1×10-6M，一般至少为大约1×10-7M，通常至少大约1×10-8M，特殊的是至少大约1×10-9M或1×10-10M或更大。一般一种特异的相互作用在生理条件下是稳定的，包括，例如，在活个体如人类或其它脊椎动物或无脊椎动物中发生的条件，以及发生在细胞培养中的条件，细胞培养如用来保留哺乳动物细胞或来自另一个脊椎动物机体或无脊椎动物机体的细胞。另外，一种特异的相互作用如肌生长抑制素功能前区和肌生长抑制素的细胞外相互作用一般在一定条件下是稳定的，例如那些用来水产养殖具有商业价值的海生生物的条件。确定两个目的分子是否特异的相互作用的方法是为人所熟知的，包括，例如平衡透析，表面胞质团共振(surface plasmon resonance)和类似方法。
一种可改变肌生长抑制素与其受体特异相互作用的药剂可通过，例如，与肌生长抑制素的结合来发挥作用，这样肌生长抑制素不能特异地与其细胞受体相互作用，通过与肌生长抑制素竞争结合其受体，或通过绕过肌生长抑制素与其受体的特异相互作用的需求以便诱发肌生长抑制素的信号转导。截短型肌生长抑制素受体如肌生长抑制素受体的一种可溶性细胞外结构域是可与肌生长抑制素结合的药剂一个实施方案，因此可隐蔽肌生长抑制素，并减少或抑制其与细胞表面肌生长抑制素受体特异相互作用的能力。肌生长抑制素功能前区或其功能性肽部分是可结合肌生长抑制素的药剂的另一个实施方案，因此可减少或抑制肌生长抑制素与细胞表面肌生长抑制素受体特异的相互作用的能力。这样的肌生长抑制素拮抗剂可用于本发明方法的实践中，特别是减少或抑制细胞中的肌生长抑制素信号转导作用。
滤泡素抑制素(follistatin)是可与肌生长抑制素结合的药剂的另一个实施方案，因此可减少或抑制肌生长抑制素与其受体特异相互作用的能力。滤泡素抑制素可结合并抑制多种TGF-β家族成员的活性，包括肌生长抑制素(GDF-8；美国专利No.6,004,937)和GDF-11(Gamer等人，Devel.Biol.208222-232，1999)和，因此可用来实施如所公开的方法。尽管以前已经有人描述使用滤泡素抑制素来调节肌生长抑制素的作用(美国专利No.6,004,937)，但在本公开书之前并不了解滤泡素抑制素可减少或抑制肌生长抑制素与肌生长抑制素受体如Act RIIB的特异相互作用的能力。
一种可用在本发明的方法中的药剂也可与一种细胞肌生长抑制素受体相互作用，因此可与肌生长抑制素竞争受体。这样的药剂可以是，例如，一种可特异结合细胞表面肌生长抑制素受体的一种抗体，包括肌生长抑制素结合区的所有或一部分，因此可阻止肌生长抑制素与受体的特异相互作用。这样一种抗肌生长抑制素受体抗体的选择是以其特异结合受体而不激活肌生长抑制素信号转导作用的能力，因此它可用作减少或抑制肌生长抑制素信号转导作用的一种肌生长抑制素拮抗剂；或选择是以其特异结合受体并激活肌生长抑制素信号转导作用的能力，因此它可作为肌生长抑制素的一种激动剂。抗体可以采用一种肌生长抑制素受体，或受体的细胞外结构域作为免疫原来产生，或是一种抗独特型抗体，可针对抗肌生长抑制素抗体，模拟肌生长抑制素。抗GDF受体抗体在下面更为详细的讨论。
在本发明方法中使用的一种药剂也可以是一种减少或抑制原-GDF多肽蛋白水解剪切成为一个活性的成熟GDF肽的药剂，因此可减少或抑制GDF信号转导作用。这样一种药剂可以是一种蛋白酶抑制剂，特别是一种能抑制可识别并剪切Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ ID NO21)蛋白水解识别位点的蛋白酶活性的抑制剂。当原-GDF是原肌生长抑制素，可减少或抑制蛋白酶与肌生长抑制素中Arg-Xaa-Xaa-Arg(SEQ IDNO21)蛋白水解断裂位点特异结合的抗肌生长抑制素抗体也可用来减少或抑制原肌生长抑制素的蛋白水解作用，因此可降低所产生的成熟肌生长抑制素的量。这样一种抗体可结合蛋白水解剪切位点，或可结合一些原-GDF多肽上的其它位点，这样蛋白酶的结合和剪切被减少或抑制。
另外，在本发明方法中使用的一种药剂可以是一种突变体肌生长抑制素受体，例如，它对肌生长抑制素结合的反应缺乏肌生长抑制素信号转导活性，或具有组成型肌生长抑制素信号转导活性。例如，突变体肌生长抑制素受体在其激酶结构域具有一个点突变，即缺失，或类似情况，这样该受体缺乏激酶活性。这样一种显性失活突变体肌生长抑制素受体缺乏传递肌生长抑制素信号转导的能力，尽管它可具有与肌生长抑制素特异结合这样的事实。
在本发明方法中使用的一种药剂也可调节涉及肌生长抑制素信号转导通路中的一种细胞内多肽的水平或活性。如在此所公开的，肌生长抑制素对肌肉生长的调节涉及一种信号转导通路的成分，该通路可被激活素II型受体激活(见实施例7和9；也见实施例14)。肌生长抑制素可特异的与表达在培养COS细胞上(实施例7)的激活素II型受体(ActRIIB)相互作用。低亲和性结合表明肌生长抑制素在体内与Act RIIB的结合可能涉及其它因子，类似于TGF-β，后者当I型受体也存在时，它与II型受体具有更高的亲和性(Attisano等人，Cell 75671-680，1993)，或类似其它的系统，需要其它的分子来将配体递呈给信号受体(Massague，见前，1998；Wang等人，Cell 67795-805，1991)。
肌生长抑制素与Act RIIB的特异相互作用表明肌生长抑制素信号转导涉及Smad信号转导通路的组分。因此，Smad信号转导通路提供了在细胞上调节肌生长抑制素作用的靶标，影响Smad通路的药剂可用来调节细胞中的肌生长抑制素信号转导。
用来调节GDF信号转导的细胞内多肽组分的水平或活性的药剂包括激动剂，它可增加信号转导活性，和拮抗剂，它可减少或抑制信号转导活性。对于肌生长抑制素，例如，可增加肌生长抑制素信号转导活性的药剂的实例是磷酸酶抑制剂，它可减少或抑制Smad多肽的去磷酸化，因此可延长Smad的信号转导活性。显性失活Smad 6或Smad 7多肽，它能消除Smad 6和Smad 7对肌生长抑制素信号转导的抑制效应，是可通过增加Smad信号转导而增加肌生长抑制素信号转导活性的药剂的另外的实例。
可减少或抑制肌生长抑制素信号转导活性的拮抗剂的实例是显性失活Smad多肽如显性失活Smad 2，Smad 3或Smad 4，其中C末端磷酸化位点已经突变。抑制性的Smad多肽如Smad 6和Smad 7，可抑制Smad 2和Smad 3的激活；以及c-ski多肽，可结合Smad多肽并抑制信号转导作用，是用来通过减少Smad信号转导作用来减少或抑制肌生长抑制素信号转导作用的拮抗剂的另外的实例。
当在细胞内作用的药剂是一种肽，它可与细胞直接接触，或一种编码该肽(或多肽)的多核苷酸可引入细胞中，该肽可在细胞中表达。可认识到的是一些用在本发明方法中的肽相对是较大的，因此可能不容易穿过细胞膜。但是，已知多种方法可将肽引入细胞内。选择将这样的肽引入细胞中的方法部分取决于该多肽要进入的靶细胞的特性。例如，当靶细胞，或包括靶细胞的几种细胞类型，表达一种受体，该受体在结合一种特殊配体过程中被内化至细胞中时，肽药剂可操作地与配体相连接。一旦与受体的结合，肽可通过受体介导的内吞作用转运至细胞中。肽药剂也可被封装在一个脂质体或配制在一种液体复合体中，它可便于肽进入细胞中，可进一步被修饰以如上所述表达一种受体(或配体)。肽药剂也可通过肽的改造而被引入至细胞中，这种改造使其含有蛋白转导结构域如人免疫缺陷型病毒TAT蛋白转导结构域，这样便于肽转运进入细胞中(见Schwarze等人，Science2851569-1572(1999)，在此引入作为参考；也见Derossi等人，J.Biol.Chem.27118188(1996))。
靶细胞也可与编码肽药剂的多核苷酸接触，后者可在细胞中表达。表达的肽药剂可以是一个突变体GDF受体或其肽部分。突变体GDF受体的实例包括肌生长抑制素受体的激酶缺陷形式，如一种显性失活Act RIIA或Act RIIB，它们可以但不需要具有与配体(如，肌生长抑制素)特异结合的能力；一种截短型肌生长抑制素或其它GDF受体，如一种肌生长抑制素受体的可溶形式，可与肌生长抑制素结合，由此可阻止肌生长抑制素与细胞肌生长抑制素受体的特异相互作用；Smad多肽的显性失活形式如显性失活Smad 3，其中C-末端磷酸化位点已经突变(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 9410669-10674，1997)；Smad 7多肽，可抑制Smad 2和Smad 3的激活作用(Heldin等人，Nature390465-471，1997)；或c-ski多肽，可结合Smad多肽并抑制Smad的信号转导作用(Sutrave等人，Genes Devel.41462-1472，1990)。
c-ski肽药剂在细胞中的表达可特别用来调节肌生长抑制素的信号转导。缺乏c-ski的小鼠显示骨胳肌群严重减少(Berk等人，Genes Devel.112029-2039，1997)，而在肌肉中过度表达c-ski的转基因小鼠显示大量的肌肉肥大(Sutrave等人，见前，1990)。c-ski作用并阻断一些Smad蛋白的活性，包括Smad 2，Smad 3和Smad 4，它们可介导TGF-β和激活素II型受体的信号(Luo等人，Genes Devel.132196-1106，1999；Stroschein等人，Science 286771-774，1999；Sun等人，Mol.Cell4499-509，1999a；Sun等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 96112442-12447，1999b；Akiyoshi等人，J.Biol.Chem.27435269，1999)。因此根据本发明的公开书，肌生长抑制素活性可通过Act RIIB的结合而被介导，将要认识到使用Smad通路的肌生长抑制素或任何GDF的活性，可通过在靶细胞中增加或降低c-ski的表达而被调节。
用于本发明方法中的药剂可以是一种多核苷酸，它可与上述的细胞接触或被引入其中。一般来说，但不是必须的，该多核苷酸被引入细胞中，在此它可直接，或在转录或翻译后，或两者都存在的情况下影响其功能。例如，如上所述，多核苷酸可编码一种肽药剂，后者在细胞中表达，可调节肌生长抑制素活性。这样一种表达的肽，例如，可以是一个突变体原肌生长抑制素多肽，它不能被剪切形成活性的肌生长抑制素；或可以是一个突变体肌生长抑制素受体，例如，一个截短型肌生长抑制素受体细胞外结构域；一个可操作地与膜锚着结构域连接的肌生长抑制素受体细胞外结构域；或一个缺乏蛋白激酶活性的突变体肌生长抑制素受体。将一种多核苷酸引入细胞的方法的实例见下或在本领域中已知。
用在本发明方法中的一种多核苷酸药剂也可以是，或编码，一个反义分子，一个核酶或一个三联药剂。例如，该多核苷酸可以是(或编码)一个反义核苷酸序列，如一个反义c-ski核苷酸序列，它可作为一个激动剂增加细胞中肌生长抑制素的信号转导；或一个反义Smad核苷酸序列，根据特殊的Smad反义核苷酸序列，它可作为一个激动剂增加肌生长抑制素的信号转导或作为一个拮抗剂减少或抑制肌生长抑制素信号转导。这样的多核苷酸可直接与靶细胞接触，一旦被细胞摄取，可影响它们的反义、核酶或三联活性；或可被一个引入细胞中的多核苷酸编码，因此一旦表达多核苷酸即可以产生，例如，一个反义RNA分子或核酶，其可以影响它的活性。
一种反义多核苷酸，核酶或三联药剂与靶序列互补，后者可以是一个DNA或RNA序列，例如，信使RNA，可以是一个编码序列，一个包含内含子-外显子连接的核苷酸序列，一个调控序列如一个SD序列(Shine-Delgrno序列)，或类似物。互补的程度为多核苷酸，例如，一个反义多核苷酸可与细胞内的靶序列特异性相互作用。根据反义或其它多核苷酸的总长度，对于靶序列一个或几个错配是可被耐受的，不丢失其靶序列多核苷酸的特异性。因此，如果有错配的话，在一个由，例如20个核苷酸组成的反义分子中能耐受的错配很少但是几个错配将不影响反义分子的杂交效率，该反义分子，例如，可与编码一个细胞多肽的靶mRNA的全长互补。可耐受的错配数目是可被估计的，例如，采用已知的公式确定杂交动力学(见Sambrook等人，见前，1989)或采用如在此所公开的方法或本领域已知的方法来经验性的确定，特别是确定细胞中反义多核苷酸，核酶或三联药剂的存在可降低靶序列的水平或细胞中靶序列编码的多肽的表达。
用作反义分子，核酶或三联药剂的多核苷酸，可抑制翻译或剪切核酸分子，因此可在细胞中调节肌生长抑制素的信号转导。一种反义分子，例如，可与一个mRNA结合形成一个不能在细胞中翻译的双链分子。优选至少含有大约15至25个核苷酸的反义寡核苷酸，因为它们可很容易地被合成，并可特异地与靶序列杂交，尽管从引入靶细胞的多核苷酸也可表达更长的反义分子。用作反义分子的特异核苷酸序列可采用已知的方法来鉴定，例如，基因步移法(见，例如，Seimiya等人，J.Biol.Chem.2724361-4636(1997)，在此引入作为参考文献)。当反义分子直接与靶细胞接触，它可操作地与化学活性基团如铁联EDTA相连接，这样可在杂交位点上剪切靶RNA。作为比较，一个三联药剂可使转录停止(Maher等人，Antisense Res.Devel.1227(1991)；Helene，Anticancer Drug Design 6569(1991))。因此，三联药剂可被设计成，例如可识别Smad基因调控元件的序列，因此可降低或抑制细胞中Smad多肽的表达，从而可调节靶细胞中肌生长抑制素的信号转导。
本发明也提供了一种方法，它可鉴定能改变GDF如肌生长抑制素在细胞中作用的药剂，特别是可改变GDF与其细胞受体特异相互作用能力的药剂。这样的药剂可通过增加或降低GDF与其受体特异相互作用的能力来起作用，因此可分别用于增加或降低GDF信号转导作用。在此本发明的一种筛选方法的实例是采用一种肌生长抑制素受体，例如，一种激活素II型受体如Act RIIA或Act RIIB。
实施本发明的一种筛选方法可，例如，通过在合适的条件下与肌生长抑制素，或其功能性肽部分，一种肌生长抑制素受体如Act RIIA或Act RIIB，和要检测的药剂接触来进行。肌生长抑制素，受体和药剂可以以任何所需要的顺序接触。像这样，筛选的方法可用来鉴定竞争性或非竞争性抑制肌生长抑制素与受体结合的药剂，可介导或增强肌生长抑制素与受体结合的药剂，可诱导特异结合的肌生长抑制素从受体上解离下来的药剂，和影响肌生长抑制素诱导信号转导能力的药剂，这类药剂具有激动剂或拮抗剂活性。进行适当的反应控制以证实的的作用是对肌生长抑制素或其它GDF受体特异的。
实施本发明筛选方法的合适条件可以是任何可允许肌生长抑制素特异与其受体相互作用的条件，包括在此公开的方法(见实施例7和9)或本领域已知的方法。因此，实施筛选测定的合适条件可以是，例如，采用基本上纯化的肌生长抑制素受体的体外条件；细胞培养条件，使用正常表达肌生长抑制素受体的细胞，例如一种脂肪细胞或一种肌肉细胞，或一种已经被基因工程修饰以在其表面表达功能性肌生长抑制素受体的细胞；或在象生物体内发生的原位条件下。
本发明的一种筛选方法也可采用如上所述的制作分子模型的方法来实施。采用制作分子模型的方法提供了一种便利，经济有效的方法来在大量的群体如一个潜在药剂的组合文库中识别那些药剂，这些潜在药剂最有可能特异的与GDF受体相互作用，因此降低了采用生物测定方法需要筛选的潜在药剂数量。采用制作分子模型的方法鉴定可与GDF受体如Act RIIB特异相互作用的药剂过程中，采用在此公开的方法检测所选择的药剂调节GDF如细胞上的肌生长抑制素的作用的能力。
采用在此公开的方法(见实施例7和9)或本领域已知的方法检测待侧药剂调节肌生长抑制素作用的能力。在此广泛使用的术语“待测药剂”或“待测分子”是指被检测以寻找具有本发明方法中的激动剂或拮抗剂活性任何药剂。尽管该方法一般用作筛选测定法以鉴定以前未知的分子，这些分子如在此所述可作为激动剂或拮抗剂药剂，该方法也可用来证实事实上已知具有特殊活性的药剂具有这样的活性，例如使药剂活性标准化。
本发明的方法的实施可以，例如通过将肌生长抑制素与一种细胞接触，该细胞已经被基因工程修饰以表达Act RIIB受体，并通过检测参与肌生长抑制素信号转导通路中Smad多肽磷酸化来确定药剂的作用，例如一种显性失活Act RIIB的作用。如果需要，该细胞可进一步被基因工程修饰以包含一种报道核苷酸序列，其表达依赖于肌生长抑制素信号转导通路，例如，依赖于Smad通路的激活，待测药剂的作用可通过比较存在和不存在该药剂，肌生长抑制素或两者的情况下报道核苷酸序列的表达来确定。检测报道核苷酸序列的表达可以，例如通过检测该报道核苷酸序列的RNA转录物，或通过检测该报道核苷酸序列编码的多肽来进行。一种多肽报道分子可以是，例如，一种β-内酰胺酶，氯霉素乙酰基转移酶，腺苷脱氨酶，氨基糖甙磷酸转移酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素-B磷酸转移酶，胸苷激酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶或黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶多肽或类似物，其检测可以通过，例如检测放射活性，发光，化学发光，荧光，酶活性，或由于报道多肽引起的特异结合来进行。
本发明的一种筛选方法可提供这样的优势，即它可适应高通量分析，因此可用于筛选待测药剂的组合文库以鉴定那些能调节肌生长抑制素对细胞作用的药剂，包括那些可改变肌生长抑制素与肌生长抑制素受体的特异相互作用的药剂。制备能检测所需活性的分子组合文库的方法在本领域是为人熟知的，并包括，例如，制备噬菌体展示肽库的方法，该肽可以是限制性的肽(见，例如，美国专利No.5,622,699；美国专利No.5,206,347；Seott和Smith，Scienc249386-390，1992；Markland等人，Gene 10913-19，1991；每一篇文献在此均引入作为参考文献)；一个肽文库(美国专利No.5,264,563，在此引入作为参考文献e)；一个肽模拟文库(Blondelle等人，Trends Anal.Chem.1483-92，1995)；一个核酸文库(O□Connell等人，见前，1996；Tuerk和Gold，见前，1990；Gold等人，见前，1995；每一篇在此都引入作为参考文献)；一个寡糖文库(York等人，Carb.Res.，28599-128，1996；Liang等人，Science，2741520-1522，1996；Ding等人，Adv.Expt.Med.Biol.，376261-269，1995；每一篇在此都引入作为参考文献)；一个脂蛋白文库(de Kruif等人，FEBS Lett.399232-236，1996，在此引入作为参考文献)；一个糖蛋白或糖脂文库(Karaoglu等人，J.Cell.Biol.，130567-577，1995，在此引入作为参考文献)；或一个含有，例如药剂或其它药剂的化学文库(Gordon等人，J.Med.Chem.371385-1401，1994；Ecker和Crooke，Bio/Technology，13351-360，1995；每一篇在此都引入作为参考文献)。多核苷酸可特别用作能调节肌生长抑制素与其受体特异相互作用的药剂，因为核酸分子具有细胞靶位的结合特异性，该靶位包括天然存在的细胞多肽，并且因为具有这样特异性的合成分子可很容易的被制备和被鉴定(见，例如，美国专利No.5,750,342，在此引入作为参考文献)。
考虑到本公开书，将要认识到多种动物模型系统可用作研究工具以鉴定用于实施本发明方法的药剂。例如，转基因小鼠或其它实验动物可采用在此公开的多种肌生长抑制素抑制剂构建物来制备，转基因非人生物体可直接被检测以确定由生物体中一种特殊药剂不同水平的表达所产生的作用。另外，转基因生物体，例如，一种转基因小鼠，可与其它小鼠，例如，与ob/ob，db/db，或野灰色的致死黄色突变体小鼠杂交，以确定用于治疗或防止如肥胖症、II型糖尿病或类似的疾病的一种肌生长抑制素抑制剂表达的最佳水平。像这样，本发明提供了转基因的非人生物体，特别是含有编码肌生长抑制素功能前区的多核苷酸，或编码突变体原肌生长抑制素多肽的一种多核苷酸的转基因生物体，该生长抑制素功能前区包含肌生长抑制素信号肽，是一种前肽(见实施例)而且，本发明还提供了表达高水平滤泡素抑制素(follistatin)或表达显性失活的Act IIB受体(见实施例)的转基因非人生物体。这些生物体显示肌肉质量的明显增加，类似于在肌生长抑制素敲除小鼠中所看到的结果(见例如，美国专利号No.5,994,618，在此引入以供参考)。如在此所讨论的，这种动物模型对识别用于因治疗目的和农业应用的增加肌肉生长的制剂是重要的。产生转基因非人类动物的方法是本领域已知的(见例如美国专利号No.6,140,552；5,998,698；6,218,596，其在此全部引入以供参考)。
本发明的肌生长抑制素多核苷酸来自任何生物体，包括小鼠、大鼠、乳牛、猪、人类、鸡、羊、火鸡、有鳍的水族、其它水生生物和其它物种。这些多核苷酸可以用于制备此处描述的转基因动物。可以制备转基因(并且从中获得肌生长抑制素多核苷酸)的水生生物的实例包括那些属于鱼塘鱼类的生物，如鲑鱼、鲑鱼、红点鲑、香鱼、鲤鱼、鲫鱼、金鱼、昏白鱼、银鱼、鳝鱼、海鳗、沙丁鱼、斑马鱼、飞鱼、巴西刺鲈、鲷、鹦鹉鲈鱼、新西兰真鲷、鲭、白腹鲭、鲔鱼、金枪鱼、鲣鱼、鲱鱼、岩鱼、平鱼(fluke)、鳎鱼、比目鱼、河豚、鲀鱼；那些属于头足类的生物，如鱿鱼、墨鱼、章鱼；那些属于斧足类的生物，如蛤(如，硬壳蛤、蛤仔、圆蛤、海蛤蜊、软壳蛤)；乌蛤、蛤贝、海螺；扇贝(如，海扇贝、海湾扇贝、calloo)；海螺、蜗牛、海参、赤贝；牡蛎(如贞洁巨牡蛎(C.virginica)，海湾牡蛎，新西兰牡蛎，太平洋牡蛎)；那些属于腹足类的生物，如螺旋贝、鲍鱼(如绿鲍鱼、粉红鲍鱼、红鲍鱼)；和那些属于甲壳类的生物，如龙虾，包括但不限于刺蜥、岩蜥和美洲蜥；对虾；河虾，包括但不限于罗氏对虾(M.rosenbergii)，P.styllrolls，印度对虾(P.indicus)，日本对虾(P.jeponious)，斑节对虾(P.monodon)，P.vannemel，M.ensis，S.melantho，N.norvegious，冷水河虾；蟹，包括但不限于蓝蟹、白嘴蟹、石蟹、王蟹、雪花蟹、雪蟹、褐蟹、邓杰内斯蟹、约拿蟹、红树蟹、软壳蟹；虾蛄、磷虾、河蝥虾(langostinos)；小龙虾/龙虾，包括但不限于蓝色的、栗色的、红爪的、红沼泽的、软壳的、白色的；环节动物门；脊索动物门，包括但不限于爬虫类如美洲鳄鱼和龟；两栖类生物，包括蛙；和棘皮类，包括但不限于海胆。
已知有多种方法来产生转基因动物。在一种方法中，将前核期的胚胎(“单细胞胚”)从雌性生物中取出，转基因被微注射进该胚胎中，其中转基因经染色体整合入所得成熟动物体的生殖细胞和体细胞中。在另一种方法中，分离胚胎干细胞，转基因通过电穿孔法、质粒转染或微注射的方法掺入至干细胞中；干细胞然后再导入到胚胎中，在此它们定居并形成生殖细胞系。将多核苷酸微注射入哺乳动物物种中的方法在，例如美国专利4,873,191中进行了描述，该文在此引入作为参考文献。仍然在另一个方法中，胚胎细胞用含有转基因的逆转录病毒进行感染，其中胚胎的生殖细胞含有染色体上整合的转基因。
当转基因的动物是鸟类时，向受精卵的前核进行微注射是有问题的，因为鸟的受精卵一般在输卵管中的第一个24小时进行细胞分裂，因此前核是不易接近的。因此，逆转录病毒感染的方法优选制备转基因鸟类(见美国专利5,162,215，在此引入作为参考文献)。但如果要在鸟类进行微注射，胚胎要在前次产卵后的大约2.5小时从处死的雌鸟中获得，转基因被微注射进入胚盘的细胞浆中，胚胎在宿主的壳中培育直至成熟(Love等，Biotechnology 12，1994)。当转基因的动物是牛或猪时，微注射可因为卵不透明而受到妨碍，这样使核很难被传统的相差显微镜所鉴别。为了克服这种问题，卵首先被离心分离出前核以便更好的观察。
本发明的非人转基因动物可以是牛、猪、羊、鱼、鸟或其它生物。转基因可在不同的发育时期被引入胚胎靶细胞中，根据胚胎靶细胞的发育时期可选择不同的方法。受精卵是最佳的微注射的靶标。使用受精卵作为基因转移的靶标有一个主要的优势是注射的DNA可在第一次分裂前整合入宿主的基因中(Brinster等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA824438-4442，1985)。结果，所有转基因非人动物的细胞可携带掺入的转基因，因此可有效的将转基因传递给转基因者的后代，因为50％的生殖细胞可携带转基因。
一种转基因动物可通过杂交两种嵌合动物而产生，每一种动物在用于繁殖的细胞中都包含外源基因物质。得到的后代25％将是具有纯合的外源基因物质的转基因动物，获得的动物的50％是杂合的，剩余的25％缺少外源基因物质，具有野生型的表现型。
在微注射方法中，转基因例如通过凝胶电泳的方法被消化和纯化而不含任何载体DNA。转基因可含有一个有效相连的启动子，它可与转录中涉及的细胞蛋白相互作用，并提供了组成型表达、组织特异性表达、发育期特异性表达、或类似情况。这样的启动子包括那些来自巨细胞病毒(CMV)、莫罗尼白血病病毒(MLV)和疱疹病毒，以及来自编码金属硫蛋白、骨骼激动蛋白、磷酸苯丙酮酸羧化酶(PEPCK)、磷酸甘油酸(PGK)、二氢叶酸酶(DHFR)和胸苷激酶(TK)的基因。也可使用来自病毒长末端重复顺序(LTR)的启动子如罗斯肉瘤病毒LTR。当要转基因的动物是鸟时，优选的启动子包括那些来自鸡□-球蛋白基因、鸡溶菌酶基因和鸟造白细胞组织增生病毒。用于胚胎干细胞质粒转染的构建物将使用其它的调控元件，包括例如，刺激转录的增强子元件、剪接受体、终止和多腺苷酸化信号、允许转录的核糖体结合位点、和类似物。
在逆转录病毒感染方法中，发育中的非人胚胎可在体外培养至囊胚期。在此期间，分裂球可以是逆转录病毒的靶标(Jaenich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 731260-1264，1976)。可通过酶学处理去除透明带来有效感染分裂球(Hogan等人，Manipulating the Mouse Embryo(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1986))。用来引入转基因的病毒载体系统典型的是一个装载转基因的复制缺陷型逆转录病毒(Jahner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826927-6931，1985；Van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 826148-6152，1985)。通过在一个产生病毒的细胞单层上培养分裂球可容易地和有效地获得转染(Van der Putten等人，见前，1985；Stewart等人，EMBO J.6383-388，1987)。可选择的是，可在后面的时期中进行感染。病毒或产生病毒的细胞可注射进囊胚腔中(Jahner等人，Nature 298623-628，1982)。大多数原代转基因细胞是转基因的嵌合体，因为掺入作用仅发生在形成转基因的非人动物的一个细胞亚群中。进一步，原代转基因细胞可在基因组的不同位置上含有多种转基因的逆转录插入物，它们通常在后代中发生分离。另外，还可能通过在子宫内对中期妊娠的胚胎进行逆转录病毒感染，将转基因引入生殖细胞系中，尽管效率低(Jahner等人，见前，1982)。
胚胎干细胞(ES)也可作为引入转基因的靶标。ES细胞可从体外培养的植入前胚胎中获得，并可与胚胎融合(Evans等人，Nature292154-156，1981；Bradley等人，Nature 309255-258，1984；Gossler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 839065-9069，1986；Robertson等人，Nature322455-448，1986)。转基因可通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导作用被有效地导入ES细胞中。这样转化的ES细胞然后可与来自非人动物的囊胚结合在一起。然后ES细胞定居到胚胎中，形成所得嵌合体动物的生殖细胞系(见Jaenisch，Science 2401468-1474，1988)。
如在此所公开的，肌生长抑制素可至少部分地通过Smad信号转导通路发挥其活性，肌生长抑制素的表达与多种病理状况是相关的。像这样，本发明提供了治疗多种与肌生长抑制素相关的病理状况的新靶位，这些病理状况包括代谢性状况如肥胖症和II型糖尿病。相应地，本发明提供了通过调节受试者肌肉细胞或脂肪组织细胞中肌生长抑制素信号转导作用来缓解一个受试者病理状况严重性的方法，其中病理状况的特征至少部分地是肌肉或脂肪组织异常的重量、发育或代谢活性。
肌生长抑制素可作为肌肉生长的负性调节物(McPherron等人，见前，1997)。肌生长抑制素敲除小鼠的重量大约超出野生型同窝出生仔25％至30％，这种检测到的小鼠体重增加完全是由于骨骼肌组织重量的大幅增加。在缺乏肌生长抑制素的小鼠中，骨骼肌的重量是相应野生型同窝出生仔的大约2至3倍。在纯合子基因敲除小鼠中，这种肌肉量的增加是增生和肥大联合作用的结果。
如在此所公开的，杂合肌生长抑制素敲除小鼠也有骨骼肌重量增加，尽管在程度上少于纯合子突变体小鼠所观察到的程度，这样可证明肌生长抑制素在体内是剂量依赖性的(见实施例1)。而且，肌生长抑制素在动物中的过度表达对肌肉生长具有相反的效应。例如，荷载表达肌生长抑制素的肿瘤的裸鼠发展成消耗综合征，其特征是肌肉和脂肪重量的大幅丢失(见实施例8)。这种在裸鼠中的综合征类似于患有慢性疾病如癌症或AIDS的患者中发生的恶病质状态。
肌生长抑制素免疫反应物质的血清水平在肌肉消耗方面与患者的状态是相关的(Gonzalez-Kadavid等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA9514938-14943，1998，在此引入作为参考文献)。因此，患有AIDS的患者，也显示恶病质的征象，测量只有全身体重的减轻，其肌生长抑制素免疫反应物质的血清水平较没有AIDS的正常男性或没有体重减轻的AIDS患者有轻微的升高。但是，这些结果的解释是复杂的，因为在血清样品中检测到的肌生长抑制素免疫反应物质在SDS胶上没有所预期的经可靠性加工的肌生长抑制素的迁移率。
如在此所公开的，肌生长抑制素不仅影响肌肉的重量，而且影响生物体的总体代谢。例如，肌生长抑制素在脂肪组织中表达，当动物年老时，肌生长抑制素缺陷小鼠的脂肪聚积有大幅降低(见实施例II和III)。尽管在此没有提议肌生长抑制素作用的机制，但肌生长抑制素的作用可以是肌生长抑制素对脂肪组织的直接作用，或可以是由于缺少肌生长抑制素活性对骨骼肌组织引起的间接作用。不管何种机制，因肌生长抑制素活性降低导致的总体合成代谢对肌肉组织的影响，可改变生物体的总体代谢，并影响能量以脂肪的形式储备，如通过在肥胖小鼠株(棕灰色的黄色致死(Ay)小鼠)中导入肌生长抑制素突变所显示的，它的脂肪聚积可被抑制5倍(见实施例5)。在含有肌生长抑制素突变的刺鼠中，异常的葡萄糖代谢也被部分抑制。这些结果表明抑制肌生长抑制素的方法可用于治疗或防止如肥胖症和II型糖尿病的代谢疾病。
例如，本发明的方法可用于减轻多种病理状况的严重性，包括例如，与如癌症(见Norton等人，Crit.Rev.Oncol.Hematol.7289-327，1987)的慢性疾病相关的恶病质，以及如II型糖尿病、肥胖症和其它代谢性疾病的病态。如在此使用的，术语“病理状况”是指一种疾病，其特征在于至少部分是肌肉或脂肪组织异常的重量、发育或代谢活性。这样的病理状况，包括例如，肥胖症；与肥胖相关的状况例如，动脉粥样硬化、高血压、和心肌梗塞；肌肉消耗性疾病如肌营养不良、神经肌肉疾病、恶病质和厌食症；和代谢性疾病如II型糖尿病，它通常但并不一定是与肥胖症相关，这些病理状况对采用本发明方法的治疗是特别有反应的。
如在此使用的，术语“异常”，当用于指肌肉或脂肪组织的数量、发育或代谢活性时，是与专业临床医生或其它相关的技术人员会认为正常的或理想的数量、发育或代谢活性相比较的相对意义而使用的。这种正常或理想的数值对于临床医生是已知的，是基于一般在相应人群中的健康个体中观察到或需要的平均数值。例如，临床医生知道，一个具有特定高度和体型的人，肥胖症与体重大约超过“理想”体重范围20％以上相关。但临床医生应当认识到，仅仅是体重超过相应人群中同样高度和体型者期望体重20％或以上的健身者并不一定是肥胖的。类似地，技术人员会知道，通过例如让患者接受多种力量检测并与相应人群中平均的健康个体的期望结果进行比较，可确定一个表现出肌肉活动异常地减少的患者具有异常的肌肉发育。
本发明的一种方法可缓解一种病理状况的严重性，该状况的特征至少部分是肌肉或脂肪组织异常的重量、发育或代谢活性，该法通过在与该状况病因学相关的肌肉或脂肪细胞中调节肌生长抑制素信号转导作用。如在此使用的，术语“减轻”，当用在关于病理状况的严重性时，是指与该状况相关的体征或症状被减轻。要监测的体征或症状是一种特定病理状况的特征，并为专业临床医生所熟知，监测该体征或症状的方法也一样。例如，当病理状况是II型糖尿病时，专业临床医生可检测受试者的葡萄糖水平、葡萄糖清除率以及类似指标。当病理状况是肥胖症或恶病质时，临床医生可简单的监测受试者的体重。
要给与受试者的药剂是在促进药剂与靶细胞接触的条件下用药的，如果合适，可进入细胞中。例如，可通过将多核苷酸加入一个可感染细胞的病毒载体中推动多核苷酸药剂进入细胞。如果不能得到对细胞类型特异的病毒载体，载体可被修饰以表达一种对靶细胞上表达的配体(或受体)特异的受体(或配体)，或可封装在一个脂质体中，它也可被修饰以包含这样一种配体(或受体)。一种肽药剂可通过许多方法被引入细胞中，包括例如，通过将肽工程改造以含有一个蛋白转导功能区如人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导功能区，它可加速肽转运至细胞中(见Schwarze等人，见前，1999；Derossi等人，见前，1996)。
药剂在靶细胞中的存在可被直接鉴定，例如通过可操作性地将一个可检测的标记物连接到药剂上，通过采用对药剂、特别是一种肽药剂有特异性的抗体，或通过检测由于药剂造成的下游效应，例如细胞中Smad多肽磷酸化的减少。一种药剂可被标记以便采用本领域已知的方法检测到(Hermanson，“生物连接技术”(Bioconjugate Techniques)(Academic Press 1996)，在此引入作为参考；也见，Harlow和Lane，见前，1988)。例如，肽或多核苷酸药剂可用多种可检测到的部分标记，包括放射性标记、酶如碱性磷酸酶、生物素、荧光色素和类似物。当药剂包含在一个试剂盒中时，标记药剂的试剂也可包含在该试剂盒中，或可单独从商业渠道购买到该试剂。
用在本发明方法中的一种药剂可被应用到病理状况的位置，或用任何给靶细胞提供多核苷酸或肽的方法。如在此所使用的，术语“靶细胞”是指要接触药剂的肌肉细胞或脂肪细胞。为了给一个活的受试者用药，药剂一般被制成适合给与受试者的药学组合物。因此，发明提供了含有一种药剂的药学组合物，该药剂在药学可接受的载体中被用来调节细胞内肌生长抑制素的信号转导作用。像这样，此药剂可用作治疗患有如在此定义的病理状况的受试者的药剂。
药学可接受的载体是本领域中熟知的，包括例如，水溶液如水或生理缓冲盐水或其它溶剂或媒介物如乙二醇、甘油、油如橄榄油、或可注射的有机酯。一种药学可接受的载体可含有生理学可接受的化合物，其作用是例如稳定或增加缀合物的吸收。这样的生理学可接受的化合物包括例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白或其它的稳定剂或赋形剂。本领域的专业技术人员会了解，包括生理学可接受化合物的药理学可接受载体的选择，依赖于例如治疗药剂的生理-化学特性和组合物给药的途径，该途径可以是，例如口服或胃肠外如静脉内，通过注射、插管、或其它本领域已知的方法。药学组合物也可包含第二种药剂如诊断药剂、营养物质、毒素、或治疗药剂如一种癌症化疗药剂。
药剂可被并入封装材料中，成为如水包油的乳剂、微乳剂、微胶粒、混合微胶粒、脂质体、微球体或其它聚合物基质(见，例如，Gregoriadis，Liposome Technology，第1卷(CRC出版社，Boca Raton，FL 1984)；Fraley等人，Trends Biochem.Sci.，677(1981)，每一篇在此均引入作为参考文献)。例如由磷脂或其它脂类组成的脂质体是无毒的、生理学可接受的和可代谢的载体，相对易于制备和应用。“隐形”脂质体(见，例如，美国专利5,882,679；5,395,619；和5,225,212，每一篇都在此引入作为参考文献)是这种特别用来制备药学组合物的封装材料的实施例，该组合物可用来实行本发明的方法，可使用其它类似的“掩蔽”脂质体，这种脂质体延长了治疗药剂保留在循环中的时间。例如阳离子脂质体也可被特异的受体或配体修饰(Morishita等人，J.Clin.Invest.，912580-2585(1993)，在此引入作为参考文献)。另外，一种多核苷酸药剂可采用例如腺病毒-聚赖氨酸DNA复合体被引入细胞中(见，例如，Michael等人，J.Biol.Chem.2686866-6869(1993)，在此引入作为参考文献)。
含有改变肌生长抑制素信号转导作用的药剂的药学组合物，其给药途径部分地依赖于该分子的化学结构。例如多肽和多核苷酸，当口服给药时不是特别地有用，因为它们可在消化道中被降解。但是，例如化学修饰多肽的方法是熟知的，使它们对内源性蛋白酶的降解不太敏感，或在经过消化道时更易被吸收(见，例如，Blondelle等人，见前，1995；Ecker和Crook，见前，1995)。另外，肽药剂可采用D-氨基酸来制备，或可含有一种或多种基于肽模拟体的功能区，肽模拟体是模拟了肽功能区结构的有机分子；或基于一种类肽如vinylogous类肽。
如在此所公开的药学组合物可通过多种途径分别给一个个体用药，包括例如，经口服或胃肠外如静脉内、肌肉内、皮下、眼窝内、囊内、腹膜内、直肠内、池内，或采用例如皮肤贴片或经皮电离子透入疗法，经过皮肤被动的或易化吸收。此外，药学组合物可通过注射、插管、口服或局部给药，后者可以是被动的，例如通过直接涂敷一种药膏，或例如采用一种鼻喷雾剂或吸入剂而起效，在这种情况下，组合物中的一个组分是一种合适的抛射剂。药学组合物也可被用在病理状况的部位，例如通过静脉或动脉内进入供应肿瘤的血管中。
在实行本发明方法中要给与的药剂总量可以单次剂量给与受试者，或者通过大丸剂或者在相对较短的时间内输注，或可以采用分段治疗方案给药，其中可在较长的时间内多次用药。本领域的技术人员会知道，在一个受试者中治疗一种病理状况所需的药学组合物的量依赖于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康状况，以及给药途径和要给药的治疗次数。考虑到这些因素，本专业的技术人员会在必要时调整特定的剂量。一般来说，药学组合物的剂型、给药途径和频率，最初是采用I期和II期临床试验来确定的。
药学组合物可被制成口服剂型，如片剂、或溶液或悬液形式；或可与一种有机或无机的载体、或适合肠或胃肠外应用的赋形剂组成混合物，并可例如与通常的无毒性的、药学可接受的载体复合成片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、溶液、乳剂、悬液、或其它适合应用的形式。除了以上公开的以外，载体还包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯树胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、云母、玉米淀粉、角质素、硅胶、马铃薯淀粉、尿素、中链甘油三酯、葡聚糖，和其它适合用于制造制剂的载体，其形式是固体、半固体或液体。另外的辅剂可使用稳定剂、增稠剂或着色剂和香料，例如一种稳定干燥剂如triulose(见，例如，美国专利5,314,695)。
本发明也提供了一种在受试者体内调节肌肉组织或脂肪组织生长的方法。如在此所公开的，GDF受体如Act RIIA和Act RIIB参与了介导GDF的效应，GDF如肌生长抑制素，它参与了肌肉组织和脂肪组织的形成。因此，在一个实施方案中，调节肌肉组织或脂肪组织生长的方法包括影响来自GDF受体如一个激活素受体，例如Act RIIA或ActRIIB的信号转导作用。这样一种方法的实施可通过用突变体GDF受体接触组织中的细胞，或在细胞中表达突变体GDF受体，它具有显性失活活性、组成型活性、或类似活性。
在另一个实施方案中，在一个生物体中调节肌肉组织或脂肪组织生长的方法可通过给与该生物体一种药剂来实施，该药剂影响肌生长抑制素的信号转导。优选地，该药剂是一个或编码一个肌生长抑制素功能前区或一个突变体原肌生长抑制素多肽，它们每一个都可包含肌生长抑制素的信号肽。如在此使用的，术语“生长”是以相对含义使用的，是指已经接受本发明方法的生物体中肌肉组织重量或脂肪组织重量与相应的未接受本发明方法的生物体相比较。因此，当本发明方法的实施使肌生长抑制素的信号转导被减少或抑制时，将要认识到与相应的肌生长抑制素信号转导作用没有受影响的生物体(或生物体群体)的肌肉量相比，该生物体中肌肉组织的生长会导致肌肉量的增加。
本发明的一种方法可用来增加肌肉的重量或减少生物体的脂肪含量或两者均有。例如，当这样一种方法在一种可用作食物来源的生物体上实施时，食物的蛋白含量可被增加，胆固醇水平可被降低，食品的品质可被改善。本发明的一种方法也可被用来减少一种生物体中肌肉组织的生长，例如一种对环境有害的生物体，使该生物体在环境中几乎不能进行竞争。因此，本发明的方法可在任何表达肌生长抑制素的真核生物上实施，包括脊椎动物生物例如哺乳动物、鸟类或鱼类，或可以是无脊椎动物例如软体动物、棘皮动物、腹足动物或头足类动物。
药剂可以是如在此所公开的任何可改变肌生长抑制素信号转导的药剂，并可以任何方便的方式给与生物体。例如当要处理的生物体是在水中养殖的鱼、虾、扇贝、或类似物时，药剂可加到供养生物体的水中，或掺进它们的食物中，特别是当药剂是一种可溶性的肽或是小的有机分子时。
当在本发明的方法中使用的药剂是编码一种肽药剂、一种反义药剂或类似物的多核苷酸时，可选择含多核苷酸的非人生物体的生殖细胞，并可产生表达该药剂的转基因生物体。优选地，多核苷酸是在一个可诱导的调控元件的控制下，这样被多核苷酸编码的药剂可在所需的时间和时间段内表达。相应地，本发明提供了转基因的非人生物体，以及由这些生物体产生的食品。这样的食品因为肌肉组织增加而具有增加的营养价值。转基因的非人动物可以是在此公开的任何物种，包括脊椎动物生物如牛、猪、羊、鸡、火鸡和鱼，以及无脊椎动物类如虾、龙虾、蟹、乌贼、牡蛎和鲍鱼。
TGF-β家族成员的调节及其与细胞表面受体特异性相互作用将要被开始被阐明。因此TGF-β家族一个成员的功能前区和TGF-β家族另一个成员的成熟区的共同表达与细胞内二聚作用相关，并发生生物学活性的同型二聚体的分泌(Gray等人，Science 2471328，1990)。例如，BMP-2(骨形态发生蛋白-2)功能前区和BMP-4(骨形态发生蛋白-4)成熟功能区的一起使用可引起BMP-4成熟区的表达大幅度增加(Hammonds等人，Mol.Endocrinol.5149，1991)。对于已经研究的大多数家族成员来说，同型二聚体类是有生物学活性的，而对于其它家族成员如抑制素类(Ling等人，Nature 321779，1986)和TGF-β(Cheifetz等人，Cell48409，1987)，杂二聚体也已经被检测到且似乎与相应的同型二聚体具有不同的生物学特性。
受体-配体相互作用的研究已经揭示了大量关于细胞如何对外界刺激发生反应的信息，并已导致开发出治疗性重要化合物，如红细胞生成素、集落刺激因子和血小板源生长因子(PDGF)。因此在鉴定介导TGF-β家族成员作用的受体方面已经进行了不断的努力。如在此所公开的，肌生长抑制素与一个激活素II型受体特异地相互作用。对这种相互作用的证实为检定用于农业和人类治疗目的的拮抗剂和激动剂提供了靶标，例如，治疗多种病理状况如肥胖症、II型糖尿病和恶病质。这种特异的相互作用的证实也为检定其它的肌生长抑制素受体、以及其它生长分化因子的特异性受体提供了一种方法。相应地，本发明提供了GDF受体，它可与一种GDF或GDF的混合物，例如与肌生长抑制素、GDF-11、或两者的混合物，发生特异地相互作用。
本发明的一个GDF受体在此以肌生长抑制素受体为例，特别是激活素II型受体，它特异地与肌生长抑制素和GDF-11相互作用。但是，包括在本发明中的还有，与肌生长抑制素特异地相互作用、但不与GDF-11相互作用的肌生长抑制素受体，以及特异地与GDF-11而不是肌生长抑制素相互作用的GDF-11受体，等。为了便于讨论，本发明的受体在此一般地以“GDF受体”被提及，并以肌生长抑制素受体为例，它是至少与肌生长抑制素特异性相互作用的受体。像这样，当文献一般地提到肌生长抑制素与肌生长抑制素受体的特异性相互作用时，要认识到本公开书更广泛的包括任何GDF受体，包括至少与GDF-11特异地相互作用的GDF-11受体。
也提供了一个表达GDF受体多肽的重组细胞系，以及特异地与受体结合的抗体，编码受体的基本上纯化的多核苷酸，和基本上纯化的GDF受体多肽。也提供了GDF受体的肽部分，包括例如，GDF受体如肌生长抑制素受体的可溶性细胞外功能区，如在此所公开的，它可改变肌生长抑制素与细胞肌生长抑制素受体的特异性相互作用；GDF受体的组成型活性细胞内激酶功能区，它可在细胞内诱导、刺激，或者换句话是维持GDF信号转导作用；或GDF受体的其它截短型部分，它具有调节肌生长抑制素或其它GDF信号转导作用的能力。
本发明还提供了鉴定GDF受体多肽的方法，包括采用核苷酸探针或抗体探针筛选基因组或cDNA文库的方法，该文库是表达文库；应用例如GDF，如肌生长抑制素或其功能性肽部分筛选对其有反应的细胞，从而表达该受体的方法；双杂种体系试验，如上所述，采用例如GDF肽作为一个杂交的组成成分，从表达GDF受体的细胞中制备的cDNA文库表达的肽作为第二个杂交的组成成分，和类似的情况。
如上所述，与GDF受体，例如肌生长抑制素受体如Act RIIB，特异性相互作用的药剂可以采用该受体鉴定，以筛选这种药剂。相反地，已经被确定具有与肌生长抑制素受体如Act RIIB受体特异性相互作用的物质，可以被用于筛选其他的肌生长抑制素受体或其它GDF受体。这样一种方法可包括，将诸如该物质(或肌生长抑制素或其它GDF)的成分与表达GDF受体的细胞，在足以使该物质(或GDF)与受体特异相互作用的条件下孵育，GDF受体可以是截短型膜结合受体或一个可溶性受体；测量结合到受体上的该物质(或GDF)；并分离受体。如上所述的制作分子模型方法也可以被用作筛选方法以鉴定一个GDF受体或其功能性肽部分。
还提供了非人转基因动物，具有以表达GDF受体为特征的表现型，其表现型是通过动物体细胞和生殖细胞中含有的转基因赋予的。该转基因含有编码GDF受体如肌生长抑制素受体多肽的多核苷酸。产生这种转基因动物的方法在这里公开，或者为本领域已知。
本发明提供了一个基本纯化的、编码GDF受体全部或一个肽部分的多核苷酸。尽管GDF受体在这里用一个激活素II型受体作为例证，但编码激活素II型受体的多核苷酸以前曾经被描述过(美国专利No.5,885,794)。因此，应当认识到，这种激活素II型受体并不包含在本发明中(Massague，见前，1998；Heldin等人，见前，1997)。类似地，激活素I型受体，包括Act RIB；TGF-β受体，包括TGF-βRI和TGF-βRII；和BMP受体，包括BMP RIA、BMP RIB和BMP RII受体已经被描述过并为本领域熟知(Massague，见前，1998；Heldin等人，见前，1997)，因此不包含在本发明的GDF受体中。
本发明的一个多核苷酸可以编码一个具有肌生长抑制素受体活性的多肽，例如肌生长抑制素结合活性，或可以编码一个突变体肌生长抑制素受体，例如在激酶功能结构区中有突变的突变体肌生长抑制素受体，这样使该突变体充当一个显性失活的肌生长抑制素受体(见上)。因此，本发明的多核苷酸可以是天然存在的、合成的或有意操作的多核苷酸。例如，mRNA序列部分可以因RNA剪接方式的替换或替换RNA转录启动子而被改变。作为另一个实施方案，多核苷酸可以接受定点诱变。多核苷酸也可以是反义核苷酸序列。本发明的GDF受体多核苷酸包括由于遗传密码的简并而产生的序列。存在20种天然氨基酸，其中大多数由不止一个密码子编码。因此，假如由多核苷酸编码的GDF受体多肽氨基酸序列在功能上没有改变，那么所有简并的核苷酸序列都包括在本发明中。编码肌生长抑制素受体多肽的核苷酸序列也包括在内。
编码本发明GDF受体的多核苷酸的寡核苷酸部分也包括在本发明中。这种寡核苷酸通常至少大约15个碱基长，它足以使寡核苷酸选择性地杂交到一个编码受体的多核苷酸上，而且长度可以是至少大约18个核苷酸或21个核苷酸或以上。如这里所用的，术语“选择性杂交作用”或“选择性杂交”是指在中度严格或高度严格生理条件下的杂交，它可以区分相关的核苷酸序列和非相关的核苷酸序列。
在核酸杂交反应中，用于获得特定严格水平的条件会因要杂交的核酸的特性而异。例如，长度、互补性程度、核苷酸序列组成(例如，相对GCAT含量)和核酸类型，即寡核苷酸或靶核酸序列是DNA或是RNA，都可以在选择杂交条件中考虑。一个另外的考虑是核酸之一是否是固定化的，例如在滤器上。选择合适严格条件的方法可以是根据经验确定的或是用各种公式估计的，都是本领域熟知的(见，例如Sambrook等人，见前，1989)。
一个逐步增高的严格条件的实例如下2X SSC/0.1％SDS在大约室温下(杂交条件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大约室温下(低度严格条件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大约42℃下(中度严格条件)；和0.1X SSC在大约68℃下(高度严格条件)。可以仅用这些条件中的一个进行冲洗，例如高度严格条件，或可以使用每一个条件，例如每个10至15分钟，按上面所列的顺序，重复所列的任一或全部步骤。
本发明编码GDF受体的多核苷酸可以通过几种方法中的任一种来获得。例如多核苷酸可以用杂交或以计算机为基础的技术分离，如本领域所熟知的。这些方法包括但不限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检测同源的核苷酸序列；2)表达文库的抗体筛选以检测具有共用结构特征的克隆DNA片段；3)采用能够退火到目的DNA序列上的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；4)序列数据库的计算机搜索以找到相似的序列(见上)；5)扣除DNA文库差示筛选；和6)双杂种体系试验，采用例如一个成熟GDF肽作为杂交物之一。
根据本公开书，即一个激活素受体与肌生长抑制素特异性相互作用，寡核苷酸探针可以根据编码激活素受体的序列而设计，例如编码与肌生长抑制素结合的细胞外功能区的序列，并用于筛选从细胞中制备的文库，如肌肉细胞或脂肪细胞，它们对肌生长抑制素起反应，从而加快编码肌生长抑制素受体的多核苷酸的鉴定。选择出的克隆可以被进一步筛选，例如通过将插入物亚克隆到一个表达载体中，并在克隆序列表达后用肌生长抑制素筛选表达的多肽。
本发明的多核苷酸，例如一个编码肌生长抑制素受体的多核苷酸，可以来源自脊椎动物种属，包括哺乳动物、鸟类或鱼类，或来自无脊椎动物。如果可以获得适合的探针，依赖核酸杂交的筛选步骤可以从任何生物体中分离任何基因序列。相对应于编码所研究蛋白的序列一部分的寡核苷酸探针可以被化学合成。这需要知道氨基酸序列的短寡肽链。考虑到遗传密码的简并性，编码受体的多核苷酸序列可以从遗传密码的一段序列中推导出来。于是，当序列被简并时，可以进行混合的加成反应。这包括变性双链DNA的异种混合物。对于这种筛选，杂交作用优选地在单链DNA或变性的双链DNA上进行。当与有关目的多肽有关的mRNA序列存在极低量时，杂交作用在探测此来源的cDNA克隆中是特别有用的。因此，通过采用严格的杂交条件，以避免非特异结合，在与靶核酸完全互补的混合物中将靶DNA杂交到一个寡核苷酸探针上，使放射自显影成像可被用于识别特异的cDNA克隆(Wallace等人，Nucl.Acid Res.，9879，1981，在此引入作为参考文献)。可选择地，一个扣除文库因而可以被用来排除非特异的cDNA克隆。
当不知道所需多肽的整个氨基酸序列时，DNA序列的直接合成是不可能的，精选的方法是合成cDNA序列。分离目的cDNA序列的标准步骤之一是形成在质粒或噬菌体中制备的cDNA文库，其中文库来自mRNA的逆转录，后者在具有高水平基因表达的供体细胞中是丰富的。当与聚合酶链式反应技术联合使用时，甚至极少表达的产物也可以被克隆。当已知多肽氨基酸序列的重要部分时，在已经变性成单链形式的cDNA克隆拷贝上进行的杂交过程可以使用标记的单链或双链DNA或RNA探针序列，它们复制了推定在靶cDNA中存在的序列(Jay等人，Nucl.Acid Res.，112325，1983，在此引入作为参考文献)。
可以用一个GDF受体特异的抗体，如抗-Act RIIB抗体，筛选cDNA表达文库，如λgtl 1文库寻找GDF受体肽。抗体可以是多克隆或单克隆的，并可被用于检测指示GDF受体cDNA存在的表达产物。也可以用一个GDF肽筛选这样一种表达文库，例如用肌生长抑制素或其一个功能性肽部分鉴定一个克隆，后者编码至少肌生长抑制素受体的肌生长抑制素结合功能区的一部分。
编码突变体GDF受体和突变体GDF受体多肽的多核苷酸也包括在本发明中。编码GDF受体的多核苷酸的改变可以是基因内突变，如点突变、无义(STOP)突变、错义突变、剪接位点突变或移码，或可以是杂合的或纯合的缺失，可以是自发突变或可以是例如用重组DNA方法人工改造的。这种改变可以用本领域专业技术人员已知的标准方法检测，包括但不限于核苷酸序列分析，Southern印迹分析，PCR为基础的分析如多重PCR或序列标记位点(STS)分析、或原位杂交分析。GDF受体多肽可以用标准的SDS-PAGE、免疫沉淀反应分析、western印迹分析或类似方法来分析。突变体GDF受体的实例是截短型GDF受体，包括可溶性细胞外功能区，它可具有特异地结合其同源物GDF的能力但缺少激酶功能区；细胞内GDF受体激酶功能区，它可具有组成型激酶活性；以及含点突变体GDF受体，它破坏了受体的激酶活性或受体的配体结合能力；以及类似物。这种GDF受体突变体用于调节GDF信号转导，并因而用于实施本发明的各种方法。
编码GDF受体的多核苷酸可以通过将该多核苷酸导入适合的宿主细胞而在体外表达。“宿主细胞”可以是任何细胞，特定的载体可以在其中增殖，且在适当的时候载体中包含的多核苷酸可以在其中表达。术语“宿主细胞”包括一个原始宿主细胞的任何子代。应当理解，由于例如在复制过程中发生的突变，宿主细胞的所有子代与亲代细胞可能是不相同的。然而，当使用“宿主细胞”时，这种子代也包括在其中。获得宿主细胞的方法是本领域熟知的，宿主细胞短暂地或稳定地含有导入的本发明多核苷酸。
本发明的GDF受体多核苷酸可被插入一个载体中，该载体可以是克隆载体或重组表达载体。术语“重组表达载体”是指质粒、病毒或本领域已知的其它载体，它们已经通过插入或合并一个多核苷酸而被操作，特别是对于本发明，是编码GDF受体的全部或一个肽部分的多核苷酸。这种表达载体含有一个启动子序列，它加速该宿主的插入基因序列的有效转录。表达载体通常含有一个复制起点，一个启动子，以及可以对转化细胞进行表现型筛选的特殊基因。适合用于本发明的载体包括但不限于，在细菌中表达的以T7为基础的表达载体(Rosenberg等人，基因(Gene)56125，1987)、在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的杆状病毒来源的载体。DNA片段可以存在于载体中，可操作性地与调控元件连接，例如一个启动子，它可以是T7启动子、金属硫蛋白I启动子、多角体蛋白启动子、或其它所需的启动子，特别是组织特异性启动子或诱导性启动子。
编码GDF受体的多核苷酸序列可以在原核细胞或真核细胞中表达。宿主可以包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物生物体。在原核细胞中表达具有真核细胞或病毒序列的多核苷酸的方法是本领域熟知的，同样的是能够在宿主中表达和复制的有生物学功能的病毒和质粒DNA载体。含有本发明多核苷酸的表达载体的构建方法是熟知的，同样的是在选择转录或翻译控制信号中要考虑的因素，包括例如，多核苷酸是否优选在特定的细胞类型中或在特定的条件下表达(见，例如，Sambrook等人，见前，1989)。
各种宿主细胞/表达载体系统可以被用来表达GDF受体编码序列，包括但不限于，微生物如用重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用重组酵母表达载体转化的酵母细胞；用重组病毒表达载体如花椰菜花叶病毒或烟草花叶病毒感染，或用重组质粒表达载体如Ti质粒转化的植物细胞系统；用重组病毒表达载体如杆状病毒感染的昆虫细胞；用重组病毒表达载体如逆转录病毒、腺病毒或痘苗病毒载体感染的动物细胞系统；和为稳定表达而基因工程改造的转化动物细胞系统。当表达的GDF受体是翻译后修饰时，例如通过糖基化作用，选择一个能够影响所需修饰作用的宿主细胞/表达载体系统，例如哺乳动物宿主细胞/表达载体系统，可以是特别有益的。
依据所用的宿主细胞/载体系统，可以在表达载体中使用许多适合的转录和翻译元件中的任何一个，包括组成型和诱导型启动子、转录增强元件、转录终止子，以及类似物(Bitter等人，Meth.Enzymol.153516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子如细菌噬菌体λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂交启动子)，以及类似启动子。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来自哺乳动物细胞基因组的启动子如人或鼠金属硫蛋白启动子，或来自哺乳动物病毒的启动子如逆转录病毒长末端重复顺序、腺病毒晚期启动子或痘苗病毒7.5K启动子。由重组DNA或合成技术产生的启动子也可以被用来提供插入GDF受体编码序列的转录。
在酵母细胞中，可以使用许多含组成型或诱导型启动子的载体(见Ausubel等人，见前，1987，见13章；Grant等人，Meth.Enzymol.153516-544，1987；Glover，DNA克隆(DNA Cloning)第II卷(IRLPress，1986)，见第3章；Bitter，Meth.Enzymol.152673-684，1987；也见，酵母菌属酵母菌的分子生物学(The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces)(Strathem等人主编，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1982)，第I和II卷)。可以使用组成型酵母启动子如ADH或LEU2，或诱导型启动子如GAL(Rothstein，DNA克隆第II卷(见前，1986)，第3章)。可选择地，可以使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体的载体。
真核细胞系统，特别是哺乳动物表达系统，使表达的哺乳动物蛋白得到适当的翻译后修饰。具有正确加工初级转录物、糖基化、磷酸化和基因产物方便地插入质膜的细胞机制的真核细胞可被用作表达GDF受体多肽或其功能性肽部分的宿主细胞。
使用重组病毒或病毒元件以指导表达的哺乳动物细胞系统可被改造。例如，当应用腺病毒表达载体时，GDF受体编码序列可被连接在一个腺病毒转录/翻译控制复合体上，如晚期启动子和三联前导序列。可选择地，可以使用痘苗病毒7.5K启动子(Mackett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 797415-7419，1982；Mackett等人，J.Virol.49857-864，1984；Panicali等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA794927-4931，1982)。特别有用的是牛乳头状瘤病毒载体，它可以作为染色体外遗传因子复制(Sarver等人，Mol.Cell.Biol.1486，1981)。此DNA进入小鼠细胞后不久，质粒复制到大约每个细胞100至200个拷贝。插入的cDNA的转录不需该质粒整合进宿主细胞染色体，因而产生了高水平的表达。通过在质粒中包含一个选择性标记，如新基因，这些载体可被用于稳定表达。可选择地，逆转录病毒基因组可被修饰以用作能够导入和指导GDF受体基因在宿主细胞中表达的载体(Cone和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 816349-6353，1984)。也可以用诱导型启动子获得高水平表达，包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子和热休克启动子。
为长期、高产量生产重组蛋白，优选稳定的表达。宿主细胞可以用GDF受体cDNA转化，而不是使用含病毒复制起点的表达载体，GDF受体cDNA由合适的表达控制元件调控，如启动子、增强子序列、转录终止子和聚腺苷酸化位点，以及一个选择性标记。在重组质粒中的选择性标记可带来对这种选择的抗性，使细胞稳定地将质粒整合进其染色体中并生长形成集落，集落反过来可以被克隆并发展成细胞系。例如，在导入外源DNA后，可以让基因工程改造过的细胞在富集培养基中生长1至2天，然后转移到选择性培养基中。可以使用许多选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(Wigler等人，细胞(Cell)11223，1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 482026，1982)、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，细胞(Cell)22817，1980)。这些基因可分别被用在tk-、hgprt-或aprt-细胞中。此外，抗代谢物抗性可被用作选择下列基因的基础dhfr赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 773567，1980；O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA781527，1981)；gpt赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 782072，1981)；neo赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.1501，1981)；和hygro赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，基因(Gene)30147，1984)。还有对另外的选择性基因的描述，包括trpB使细胞应用吲哚代替色氨酸；hisD使细胞应用histinol代替组氨酸(Hartman和Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA858047，1988)；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO的抗性(McConlogue，Curr.Comm.Mol.Biol.(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1987))。
当宿主是真核细胞时，可以使用这些DNA转染方法，如钙磷共沉淀法，常规的机械方法如微注射、电穿孔、插入包封在脂质体中的质粒，或病毒载体。真核细胞也可以用编码本发明GDF受体的DNA序列和第二个外源DNA分子共转化，后者编码选择性表型如单纯疱疹胸腺嘧啶核苷激酶基因。另一个方法是使用真核细胞病毒载体，如猿病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒，以暂时地感染或转化真核细胞并表达蛋白(Gluzman，真核病毒载体(Eukaryotic Viral Vectors)(Cold SpringHarbor Laboratory出版社，1982))。
本发明还提供了稳定的重组细胞系，该细胞系的细胞表达GDF受体多肽并含有编码GDF受体的DNA。适合的细胞类型包括但不限于，NIH 3T3细胞(小鼠)、C2C12细胞、L6细胞和P19细胞。C2C12和L6成肌细胞在培养基中自行分化并依赖特定的生长条件形成肌管(Yaffe和Saxel，Nature 270725-727，1977；Yaffe，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 61477-483，1968)。P19是一个胚胎癌细胞系。这些细胞被描述在例如美国模式菌种收藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))的细胞系目录中。这些细胞可以用已知的方法稳定地转化(见，例如，Ausubel等人，见前，1995，见9.5.1-9.5.6节)。
GDF受体可以用诱导型或组成型调节元件从本发明的重组多核苷酸表达，如在此所述。所需的蛋白编码序列和一个可操作地连接的启动子可以作为非复制型DNA(或RNA)分子被导入受体细胞，它可以是线性分子或共价闭合环状分子。所需分子的表达可以是由于导入序列的临时性表达，或者是由于稳定地保存在细胞中的多核苷酸，例如通过整合进宿主细胞染色体，因而引起永久表达。因此，细胞可以是稳定地或暂时地转化的(转染的)细胞。
一个可用的载体的实例是能够整合所需的基因序列进入宿主细胞染色体的载体。已稳定地在其染色体中整合了导入DNA的细胞也可以通过导入一个或多个标记来筛选，这些标记可以筛选含有表达载体的宿主细胞。标记可以补充宿主的营养缺陷如leu2或ura3，它们是常见的酵母营养缺陷型标记；可以赋予杀生物剂的抗性，例如对抗生素或重金属离子如铜或类似物的抗性。选择性标记基因可以被直接连接到要表达的DNA基因序列上，或通过共转染被导入同一个细胞。
导入的序列可被合并进能够在受体宿主内自主复制的质粒或病毒载体中。各种载体中的任何一个可被用于此目的。选择特定质粒或病毒载体中的重要因素包括含载体的受体细胞可以容易地被识别并从不含载体的细胞中挑选出来；在特定宿主细胞中所需载体的拷贝数量；和是否是需要载体能够在不同种属的宿主细胞间“穿梭”。
对于哺乳动物宿主，用于表达的载体系统有几种。一类载体应用DNA元件，提供了在自主复制的染色体外质粒，质粒来自动物病毒如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、或SV40病毒。第二类载体包括痘苗病毒表达载体。第三类载体依靠所需的基因序列整合进宿主染色体。已稳定地在其染色体中整合了导入DNA的细胞也可以通过导入一个或多个标记基因(如上所述)来选择，这些标记基因可以选择含有表达载体的宿主细胞。选择性标记基因可以被直接连接到要表达的DNA序列上，或通过共转染被导入同一个细胞。可以包括另外的元件以提供编码的mRNA或肽的最佳合成，包括例如剪接信号、转录启动子或增强子，和转录或翻译终止信号。插入了适当的调控元件的cDNA表达载体是本领域熟知的(见，例如，Okayama，Mol.Cell.Biol.3280，1983)。
一旦制备了用于表达的含构建物的载体或DNA序列，该DNA构建物就可以被导入合适的宿主。可以用各种方法将多核苷酸导入细胞中，包括例如转染或转化的方法，如原生质体融合、钙磷沉淀、和电穿孔或其它常规的技术，例如当载体是病毒载体时的感染。
本发明还提供了具有表达重组GDF受体的细胞的转基因动物。这种转基因动物可以被选择为具有脂肪含量下降或肌肉重量增加，或两者都有，因而这些动物可以被用作高肌肉和蛋白含量、低脂肪和胆固醇含量的食品的来源。它们在生殖细胞和体细胞中已经在染色体上发生了改变，以致GDF特别是肌生长抑制素的产生保持在“正常”水平，但肌生长抑制素受体的产生数量减少或完全破坏，使得动物细胞结合肌生长抑制素的能力下降，结果肌肉组织超过正常水平，优选地脂肪或胆固醇水平没有升高。因此，本发明也包括由动物提供的食品。这种食品因肌肉组织增加而提高了营养价值。本发明的转基因非人动物包括牛、猪、绵羊和禽类动物，以及其它脊椎动物，进一步包括转基因无脊椎动物。
本发明也提供了一种产生具有高肌肉含量的动物食品的方法。这种方法可包括修饰动物原核胚胎生殖细胞的遗传结构，将胚胎植入假妊娠雌性的输卵管中，因而使胚胎成熟为正常分娩子代，检测子代存在的转基因以鉴定转基因阳性的子代，杂交转基因阳性的子代以获得进一步转基因阳性的子代，并加工子代以获得食品。生殖细胞的修饰包括改变遗传组成，以减少或抑制天然存在的、编码产生肌生长抑制素受体蛋白的基因表达。例如，转基因可以包括一个对编码肌生长抑制素受体的多核苷酸特异的反义分子；可以包括一个无功能序列，替换或插入内源性肌生长抑制素受体基因或转基因中；或可以编码一个肌生长抑制素受体拮抗剂，例如，显性失活肌生长抑制素受体如显性失活Act RIIB。
如这里所用的，术语“动物”是指除人之外任何的鸟、鱼或哺乳动物，并包括任何发育阶段，包括胚胎和胎儿阶段。农场动物如猪、山羊、绵羊、母牛、马、兔或类似动物；啮齿类如小鼠；和家养宠物如猫和狗包括在术语“动物”的意思内。此外，在这里使用的术语“生物体”包括如上所述的动物，以及其它真核细胞，包括例如，其它脊椎动物如爬行类和两栖类，以及如上所述的无脊椎动物。
如这里所用的，术语“转基因”，当用来指动物或生物体时，是指动物或生物体的细胞已经被遗传学操作，以获得一个被细胞稳定地保留的外源多核苷酸序列。操作可以是例如，微注射一个多核苷酸，或用含多核苷酸的重组病毒感染。因此，这里所用的术语“转基因”是指其中一个或多个细胞获得重组多核苷酸的动物(生物体)，重组多核苷酸可以在细胞内被整合进染色体，或可以保留为染色体外复制多核苷酸，这样可能被改造成为酵母人工染色体。术语“转基因动物”也包括“生殖细胞系”转基因动物。生殖细胞系转基因动物是遗传信息已经被摄取并合并进生殖系细胞的转基因动物，因而具有将信息传递给子代的能力。如果这种子代事实上具有一些或全部该信息，那么该子代也被认为是转基因动物。本发明进一步包括转基因生物体。
转基因生物体可以是任何生物体，其基因组已经通过对早期阶段胚胎或受精卵的体外操作而被改变，或通过任何转基因技术导致特异基因敲除。术语“基因敲除”是指细胞内或体内基因的定向破坏，导致其功能完全丧失。可以通过在要使之无功能的基因中的插入而使转基因动物的靶基因无功能，例如通过同源重组，或通过任何其它在细胞内破坏基因功能的方法。
可被用于实施本题述发明的转基因可以是一个含修饰的GDF受体编码序列的DNA序列。优选地，修饰的GDF受体基因是通过在胚胎干细胞中的同源定向破坏的基因。例如，可以删除GDF受体基因的整个成熟C-末端区(见实施例13)。任选地，破坏(或删除)可以带有另一个多核苷酸如无功能的GDF受体序列的插入或替换。还可以在生物体的一个细胞中导入或表达反义GDF受体多核苷酸、或通过在细胞中表达抗体或显性失活GDF受体，而使之成为“敲除”表现型。在适当时，可以在此使用编码具有GDF受体活性的蛋白，但在核苷酸序列上由于基因编码的简并性而不同于天然存在的GDF基因序列的多核苷酸，同样可使用截短的形式、等位基因突变体和种间同源物的多核苷酸。
本发明还提供了特异地结合GDF受体并从而阻断GDF与受体结合的抗体。这种抗体可被用于，例如缓解诸如与肌肉组织有关的细胞增殖性异常的病理状况。
与GDF受体，特别是肌生长抑制素受体特异结合的单克隆抗体可以增加骨骼肌的发育。在所述要求保护的方法的优选实例中，GDF受体单克隆抗体、多肽、或多核苷酸被给予有病理状况的患者，如肌肉消耗性疾病、神经肌肉紊乱、肌肉萎缩、衰老、或类似情况。GDF受体抗体，特别是抗肌生长抑制素受体抗体，也可以给予有病理状况的患者，如肌肉营养不良症、脊髓损伤、外伤性损伤、充血性阻塞性肺病(COPD)、AIDS或恶病质。
在一个优选的实施方案中，抗肌生长抑制素受体抗体经静脉内、肌肉内或皮下注射给予有肌肉消耗性疾病或异常的患者；优选地，单克隆抗体以大约0.1ug/kg至大约100mg/kg的剂量范围给药；更优选地在大约1ug/kg至75mg/kg之间；最优选地从大约10mg/kg至50mg/kg。抗体可以通过例如使用大药丸或通过缓慢输注给药。缓慢输注优选在30分钟至2小时之内。抗肌生长抑制素受体抗体，或其它抗GDF受体抗体，可以被制成适于给予患者的制剂。这种制剂是本领域已知的。
给药方案要由主治医生考虑各种因素来确定，这些因素可改变肌生长抑制素受体蛋白的作用，例如需要形成的组织量、组织损伤部位、损伤组织的状况、伤口大小、损伤组织的类型、患者的年龄、性别、和饮食、任何感染的严重性、给药时间和其它临床因素。剂量可以因重制中使用的基质和要在组合物中使用的药剂类型而不同，例如药剂是抗肌生长抑制素受体抗体。通常全身性或可注射的用药，如静脉内、肌肉内或皮下注射。用药通常以最小有效剂量开始，在预先选择的时间内增加剂量直至观察到阳性效果。然后，剂量的逐步增加要限制在这种逐步递增可产生相应的效果增加的水平上，同时顾及可能出现的任何不利影响。在最终组合物中添加可以帮助增加肌肉量的其它已知生长因子，如IGF I(胰岛素样生长因子I)、人、牛或鸡生长激素，也可能影响剂量。在给予抗肌生长抑制素受体抗体的实例中，抗体通常在大约0.1ug/kg至大约100mg/kg的剂量范围给药；更优选地在大约10mg/kg至50mg/kg之间。
如这里所用的，术语“抗体”以其广义使用，包括多克隆和单克隆抗体，以及这些抗体的抗原结合片段。用于本发明方法的抗体或其抗原结合片段具有如下特征，例如具有对GDF受体如肌生长抑制素受体的抗原决定簇的特异性结合活性。此外，如上讨论的，本发明的抗体可以是与原肌生长抑制素多肽的一个肽部分，特别是肌生长抑制素功能前区或其功能性肽部分，特异地结合的抗体。应当认识到，下面的方法举例说明了GDF受体抗体的制备和定性，该方法进一步可应用于本发明中其他抗体的制备和定性，包括特异地结合肌生长抑制素功能前区的抗体、特异地结合原肌生长抑制素多肽并减少或抑制原肌生长抑制素蛋白水解地切割为肌生长抑制素的抗体，和类似情况。
当术语“特异地结合”或“特异性结合活性”用于抗体时，指抗体和特定抗原决定簇间相互作用的解离常数至少大约1×10-6，一般地至少大约1×10-7，通常至少大约1×10-8，特别是至少大约1×10-9或1×10-10或以下。同样地，保留对GDF受体抗原决定簇的特异性结合活性的抗体片段Fab、F(ab’)2、Fd和Fv，包括在抗体的定义中。对本发明的目的来说，如果同TGF-β受体或BMP受体相比，抗体对肌生长抑制素受体的结合亲合力至少大2倍，一般至少大5倍，特别地至少大10倍，那么该特异地与肌生长抑制素受体抗原决定簇起反应的抗体被认为基本上不与TGF-β受体或BMP受体反应。
如这里所用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括例如单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体和人源化抗体，及其抗原结合片段。这些非天然存在的抗体可以用固相肽合成法构建，可以重组地产生，或通过例如筛选由重链可变区和轻链可变区组成的组合文库而获得(见Huse等人，Science 2461275-1281(1989)，在此引入作为参考文献)。制造例如嵌合抗体、人源化抗体、CDR-移植抗体、单链抗体和双功能抗体的这些和其它方法是本领域专业技术人员熟知的(Winter和Harris，Immunol.Today 14243-246，1993；Ward等人，Nature 341544-546，1989；Harlow和Lane，抗体实验室指南(AntibodiesAlaboratory manual)(Cold Spring Harbor Laboratory出版社，1988)；Hilyard等人，蛋白工程实用方法(Protein EngineeringA practical approach)(IRL出版社1992)；Borrabeck，抗体工程(Antibody Engineering)，第2版，(牛津大学出版社1995)；每一篇文章在此均引入作为参考文献)。
与GDF受体特异地结合的抗体可以应用该受体作为免疫原，并通过使用激活素受体如Act RIB、Act RIIA或Act RIIB、或BMP受体如BMP RII、BMP RIA和BMP RIB去除与受体例如TGF-βI型或II型受体发生交叉反应的抗体(见Messague，见前，1998)而产生。本发明的抗体可很方便地用肌生长抑制素受体的肽部分产生，该部分在TGF-β、激活素或BMP受体中不存在。类似地，特异地结合肌生长抑制素功能前区的抗体可以用功能前区或其功能性肽部分作为免疫原而产生。当这种肽无免疫原性时，可以通过下面的方法使之具有免疫原性，将此半抗原偶联到一个载体分子上如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝素(KLH)，或以融合蛋白的方式表达肽部分。偶联半抗原到载体分子上的各种其它载体分子和方法是本领域熟知的(见，例如，Harlow和Lane，见前，1988)。
如果需要，可以制备用于本发明方法的含有抗体或其它药剂的试剂盒。这种除药剂外，试剂盒可以含有一个药学组合物，其中药剂可以经重制以给受试者用药。试剂盒也可以含有，例如检测抗体或检测抗体与GDF受体特异结合的试剂。这些用于标记的试剂或另外识别抗体在这里被描述，并为本领域已知。
在例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物中产生多克隆抗体的方法是本领域熟知的(见，例如，Green等人，“多克隆抗血清的产生”(Productionof Polyclonal Antisera)，在免疫化学规程(Immunochemical Protocols)中(Manson主编，Humana出版社1992)，第1-5页；Coligan等人，“在兔、大鼠、小鼠和仓鼠中生产多克隆抗血清”(Production of PolyclonalAntisera in Rabbits，Rats，Mice and Hamsters)，在Curr.ProtocolsImmunol.(1992)中，第2.4.1节；每一篇文章均在此引入作为参考文献)。此外，单克隆抗体可以用本领域熟知和常规的方法获得(Harlow和Lane，见前，1988)。例如，用肌生长抑制素受体或其抗原决定簇片段免疫小鼠，将脾细胞与一个合适的骨髓瘤细胞系如SP/02骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞。可以用标记抗原筛选克隆的杂交瘤细胞系，以识别分泌具有合适特异性的单克隆抗体的克隆，表达具有所需特异性和亲合力的抗体的杂交瘤可以被分离并用作抗体的持续来源。可以进一步筛选不能与肌生长抑制素受体特异地结合的抗体。例如，这种抗体用于制备临床应用的标准化试剂盒。表达例如抗肌生长抑制素受体单链抗体的重组噬菌体，也提供了可用于制备标准化试剂盒的抗体。
制备单克隆抗体的方法是熟知的(见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256495，1975，在此引入作为参考文献；又见，Coligan等人，见前，1992，见第2.5.1-2.6.7节；Harlow和Lane，见前，1988)。简要地，单克隆抗体可以通过以下步骤获得用含抗原的组合物给小鼠注射，通过取出血清样本证实抗体产生的存在，取出脾脏以获得B淋巴细胞，用骨髓瘤细胞融合B淋巴细胞以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择对抗原产生抗体的阳性克隆，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
单克隆抗体可以通过各种广为接受的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化，例如包括，蛋白-A琼脂糖凝胶亲合层析、尺寸排除层析和离子交换层析(Coligan等人，见前，1992，见第2.7.1-2.7.12节和第2.9.1-2.9.3节；又见，Barnes等人，“免疫球蛋白G(IgG)的纯化”，在Meth.Molec.Biol.1079-104(Humana出版社1992)中，在此引入作为参考文献)。体外和体内操作单克隆抗体的方法为本领域专业技术人员熟知。体外操作可以在适合的培养基中进行，如Dulbecco改进的Eagle培养基或RPMI1640培养基，任选地补充一种哺乳动物血清如胎牛血清或微量元素和生长支持添加剂(growth sustaining supplement)如正常小鼠腹腔渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞。体外生产提供了相对纯的抗体制剂，可以大规模生产大量的所需抗体。大规模杂交瘤的培养可以通过均相悬浮培养在气升式反应器、连续搅拌反应器、或固定化或细胞截留培养器中进行。体内操作可以通过将细胞克隆注射进与亲代细胞组织相容的哺乳动物中，例如同系基因小鼠中进行，以引起产抗体肿瘤的生长。任选地，动物在注射前用烃类，特别是油，例如降植烷(四甲基十五碳烷)进行预致敏。1至3周后，从动物体液中回收所需的单克隆抗体。
这里公开的抗体的治疗应用也是本发明的一部分。例如，本发明的抗体也可以来自低于人类的灵长类的抗体。在狒狒中产生治疗用抗体的一般技术可发现于，例如Goldenberg等人，国际专利出版物WO91/11465(1991)；和Losman等人，Int.J.Cancer 46310，1990中，每一篇文章在此均引入作为参考文献。
治疗用抗GDF受体抗体也可以来自“人源化”单克隆抗体。通过将来自小鼠免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的小鼠互补性决定区移入人的可变区中，然后在小鼠对应物的框架区内替代以人的残基，产生了人源化单克隆抗体。使用来自人源化单克隆抗体的抗体成分消除了小鼠恒定区免疫原性带来的潜在问题。克隆小鼠免疫球蛋白可变区的一般技术是已知的(见，例如，Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA863833，1989，在此整体引入作为参考文献)。生产人源化单克隆抗体的技术也是已知的(见，例如，Jones等人，Nature 321522，1986；Riechmann等人，Nature 332323，1988；Verhoeyen等人，Science 2391534，1988；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 894285，1992；Sandhu，Crit.Rev.Biotechnol.12437，1992；和Singer等人，J.Immunol.1502844，1993；每一篇文章均在此引入作为参考文献)。
本发明的抗体也可以来自从组合免疫球蛋白文库中分离的人抗体片段(见，例如，Barbas等人，方法免疫学方法手册(METHODSACompanion to Methods in Immunology)2119，1991；Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12433，1994；每一篇文章在此引入作为参考文献)。用于产生人免疫球蛋白噬菌体文库的克隆和表达载体可以从例如STRATAGENE克隆系统(La Jolla，CA)中获得。
本发明的抗体也可以来自人单克隆抗体。这种抗体从转基因小鼠中获得，该小鼠已经被“改造”以对抗原激发反应产生特异的人抗体。在此技术中，人的重链基因座和轻链基因座元件被导入来自胚胎干细胞系的小鼠株中，后者含有靶向破坏的内源性重链基因座和轻链链基因座。转基因小鼠可以合成对人抗原特异的人抗体，且小鼠可被用于产生分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法已被描述，例如，Green等人，Nature Genet.713，1994；Lonberg等人，Nature368856，1994；和Taylor等人，Int.Immunol.6579，1994；每一篇文章均在此引入作为参考文献。
本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过编码片段的DNA在大肠杆菌中的表达来制备。抗体片段可以用传统的方法，经胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得。例如，抗体片段可以用胃蛋白酶通过抗体的酶裂解产生，以提供一个表示为F(ab’)2的5S片段。此片段可以进一步用巯基还原剂裂解，和任选具有一种对由二硫键断裂所产生的巯基基团具有封阻作用的基团，裂解以产生3.5S Fab’单价片段。可选择地，用胃蛋白酶的酶裂解直接地产生了2个单价Fab’片段和一个Fc片段(见，例如，Goldenberg，美国专利4,036,945和美国专利4,331,647，每一篇文章在此引入作为参考文献，以及其中包含的参考文献；Nisonhoff等人，Arch.Biochem.Biophys.89230.1960；Porter，Biochem.J.73119，1959；Edelman等人，Meth.Enzymol.，1422(AcademicPress 1967)，每一篇文章在此引入作为参考文献；又见，Coligan等人，见前，1992，见2.8.1-2.8.10和2.10.1-2.10.4节)。
假如片段特异地与被完整抗体识别的抗原结合，也可以使用其它裂解抗体的方法，如分离重链以形成单价轻链/重链片段，进一步裂解片段，或其它酶学的、化学的或遗传学的技术。例如，Fv片段包括VH和VL链的联合。此联合可以是非共价的(Inbar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 692659，1972)。可选择地，可变区链可以被一个分子间二硫键连接，或被一个化学药品如戊二醛交联(Sandhu，见前，1992)。优选地，包括VH和VL链的Fv片段由肽接头连接。这些单链抗原结合蛋白(sFv)通过构建一个结构基因而制备，结构基因包括编码VH和VL功能区的DNA序列，通过一个寡核苷酸连接。结构基因被插入一个表达载体中，随后被导入一个宿主细胞如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成单一的多肽链，有接头肽桥接两个V功能区。产生sFvs的方法被描述于，例如Whitlow等人，方法酶学方法手册(MethodsA Companion to Methodsin Enzymology)297，1991；Bird等人，Science 242423-426，1988；Ladner等人，美国专利4,946,778；Pack等人，Bio/Technology 111271-1277，1993；每一篇文章均在此引入作为参考文献；又见，Sandhu，见前，1992。
抗体片段的另一个形式是编码单一互补性决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体CDR的基因来获得。这种基因通过采用例如聚合酶链式反应来制备，以从产抗体细胞的RNA合成可变区(见，例如，Larrick等人，方法酶学方法手册(MethodsA Companion to Methods in Enzymology)2106，1991，在此引入作为参考文献)。
本发明还提供了一个鉴定GDF受体多肽的方法。这样一种方法可以通过下面的步骤进行，例如，将含GDF多肽的成分，与表达全长受体或截短受体的细胞，在足以令GDF结合到受体上的条件下孵育；检测GDF多肽与受体的结合；并分离受体。GDF可以是任何已知的GDF(如GDF-1-16)，优选地是GDF-8(肌生长抑制素)或GDF-11。分离受体的方法在下面的实施例章节中被更详细地描述。因此，本发明也提供了一个基本纯化的GDF受体，以及比天然存在的GDF受体有较少氨基酸残基的GDF受体肽类和肽衍生物。这种肽类和肽衍生物可在研究肌肉消耗性疾病并开发更有效的治疗方法中用于作为研究和诊断工具。
本发明进一步提供了GDF受体变异体。如这里所用的，术语“GDF受体变异体”是指模仿GDF受体至少部分结构的分子。GDF受体变异体可用于减少或抑制GDF结合，从而如这里公开的，缓解一种病理状况。GDF受体变异体的实例包括但不限于，截短型GDF受体如GDF受体的可溶性细胞外功能区；显性失活的GDF受体如显性失活的ActRIIB受体，它缺少激酶活性；或其它截短型或突变体GDF受体。
本发明不仅涉及天然存在的GDF受体的肽类和肽衍生物，而且涉及GDF变异体，包括突变体GDF受体，和化学合成的、特异地结合GDF，如肌生长抑制素，的GDF受体衍生物。例如，本发明设想改变GDF受体的氨基酸序列。GDF受体可以通过改变编码蛋白的DNA而改变。优选地，采用具有相同或相似特性的氨基酸，仅进行保守氨基酸的改变。氨基酸取代的实例包括丙氨酸改变为丝氨酸；精氨酸改变为赖氨酸；天门冬酰胺改变为谷氨酰胺或组氨酸；天门冬氨酸改变为谷氨酸；半胱氨酸改变为丝氨酸；谷氨酰胺改变为天门冬酰胺；谷氨酸改变为天门冬氨酸；甘氨酸改变为脯氨酸；组氨酸改变为天门冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸改变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸改变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸改变为精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；蛋氨酸改变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸改变为酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸改变为苏氨酸；苏氨酸改变为丝氨酸；色氨酸改变为酪氨酸；酪氨酸改变为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸改变为异亮氨酸或亮氨酸。
用于本发明的变异体包括GDF受体的类似体、同系物、突变蛋白质和模拟体，它们保留了与其各自的GDF特异地结合的能力。在另一个实施方案中，还设想了具有显性失活活性的变异体GDF受体，不管此变异体是否也与其GDF特异地起作用。GDF受体肽类指具有这些活性的GDF受体的氨基酸序列部分。变异体可以通过化学修饰、蛋白水解酶消化、或两者联合，从GDF受体本身直接产生。此外，可以使用遗传工程技术，以及直接从氨基酸残基合成多肽的方法。
肽类可以用这种常用的方法合成，如α-氨基的t-BOC或FMOC保护。两种方法包含通过从肽的C末端开始每一步加入一个氨基酸而逐步合成(Coligan等人，现代免疫学手册(Current Protocols inImmunology)(Wiley Interscience，1991)，第9单元，在此引入作为参考文献)。本发明的肽类也可以采用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，其中每克聚合物含0.1-1.0mMol胺，通过熟知的固相肽合成方法合成(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149，1962；Stewart和Young，固相肽合成(Solid Phase Peptides Synthesis)(Freeman，旧金山，1969)，见27-62页，每一篇文章在此均引入作为参考文献)。在化学合成完成时，该肽类可以解保护，并通过用液态HF-10％苯甲醚在0℃处理大约1/4-1小时而从聚合物上裂解。在药剂蒸发后，用1％醋酸溶液从聚合物中提取肽类，然后冻干产生粗原料。通常地，这样可以在Sephadex G-15上，用5％醋酸作为溶剂，通过如凝胶过滤技术而纯化。柱中的适当组分冻干将产生均一的肽或肽衍生物，它们然后通过标准的技术而被定性，如氨基酸分析、薄层层析、高效液相色谱、紫外吸收光谱法、摩尔旋光、溶解度，并通过固相埃德曼降解来定量。
模拟GDF受体的结合和功能的非肽化合物(“模拟体(mimetics)”)可以用Saragovi等人概括的方法产生(Science 253792-95，1991，在此引入作为参考文献)。模拟体是模拟蛋白二级结构成分的分子(Johnson等人，“肽全长模拟体”(Peptide Turn Mimetics)，在生物技术和药剂学(Biotechnology and Pharmacy)(Pezzuto等人主编；Chapman和Hall，纽约1993)中，在此引入作为参考文献)。应用肽模拟体的基本原理是，蛋白的肽骨骼主要地以使氨基酸侧链促进分子间相互作用的方式存在。对于本发明来说，一个合适的模拟体可以认为相当于一个GDF受体的等同物。
较长的肽类可以通过“天然化学”连接技术将肽类连接在一起而产生(Dawson等人，Science 266776，1994，在此引入作为参考文献)。变异体可以通过应用基因组或cDNA克隆方法的重组技术而产生。可以应用位点特异和区域定向诱变技术(Ausuble等人，见前，1989和1990至1993增刊)，见第1卷，第8章；蛋白工程(Protein Engineering)(Oxender和Fox主编，A.Liss，Inc.，1987))。此外，可以应用接头扫描和PCR介导技术来诱变(Erlich，PCR技术(Stockton出版社1989)；Ausuble等人，见前，1989至1993)。应用上面任何技术的蛋白测序、结构和建模方法公开在上面引用的参考文献中。
本发明还提供了阻断GDF特异结合到其受体上的GDF受体结合剂。例如，这种结合剂在研究上面描述的肌肉消耗性疾病中，作为研究和诊断的工具以及用于有效的治疗方法中，并可以用这里公开的方法鉴定，例如制作分子模型方法。此外，含GDF受体结合剂的药学组合物可以代表有效的疗法。在本发明的上下文中，词组“GDF受体结合剂”表示GDF受体的天然存在的配体，例如GDF-1至GDF-16；GDF受体的合成配体，或天然或合成配体的适当衍生物。配体的确定和分离是本领域熟知的(Lerner，Trends Neurosci.17142-146，1994，在此引入作为参考文献)。
在另一个实施方案中，本发明涉及阻碍GDF受体和GDF间结合的GDF受体结合剂。这种结合剂可以通过竞争性抑制、非竞争性抑制或无竞争性抑制进行阻碍。GDF受体和一个或多个GDF间正常结合的阻碍可以产生有用的药理学效果。
本发明还提供了一个鉴定与GDF受体结合的组合物的方法。此方法包括，将含该组合物的成分与GDF受体在足以使组成成分特异地相互作用的条件下孵育，并检测组合物与GDF受体的结合。如上所述，结合到GDF受体上的组合物包括肽类、肽模拟体、多肽、化学化合物和生物药剂。孵育包括将反应物置于使所测组合物与GDF受体接触的条件下，并如会在体内发生的那样，提供适于特异性相互作用的条件。接触可以在溶液中或在固相内进行。如上所述，所测的配体/组合物可以任选地是一个组合文库，以筛选大量组合物。在本发明方法中鉴定的组合物，在溶液中或在结合到一个固体支持物上之后，通过一般用于检测特定DNA序列的任一方法如PCR、寡聚物限制性(Saiki等人，Bio/Technology 31008-1012，1985，在此引入作为参考文献)、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 80278，1983，在此引入作为参考文献)、寡核苷酸连接测定(OLA)(Landegren等人，Science 2411077，1988，在此引入作为参考文献)、和类似方法(见Landegren等人，Science 242229-237，1988.在此引入作为参考文献)，被进一步评价、检测、克隆、测序等。
为确定一个组合物是否可以功能性地与受体蛋白复合，可以通过监测外源基因编码蛋白的蛋白水平的改变，或通过这里公开的任何其它方法，监测外源基因的诱导。当鉴定一个组合物可以诱导外源基因的转录时，可以得出的结论是，此组合物可以特异地结合到受体蛋白上，该受体蛋白由编码原始样本测定组合物的核酸编码。
外源基因的表达可以通过例如功能试验或蛋白产物分析来监测。因此，外源基因是一个提供可分析/可测定的表达产物的基因，以使外源基因的表达可以检测。这种外源基因包括但不限于，报告基因如氯霉素乙酰基转移酶基因、碱性磷酸酶基因、β-半乳糖激酶、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、鸟嘌呤黄嘌呤磷酸核糖基转移酶、碱性磷酸酶，和抗生素抗性基因如新霉素磷酸转移酶(见上)。
外源基因的表达表示组合物和GDF受体特异性的相互作用；因此，结合性或阻断性组合物可以被鉴定和分离。本发明的组合物可以用已知的、常用的蛋白纯化技术，如提取、沉淀、离子交换层析、亲合层析、凝胶过滤和类似方法，从培养基或细胞中提取和纯化。组合物可以用结合到柱基质上的、修饰的受体蛋白细胞外功能区，通过亲合层析，或通过肝素层析而分离。
如上所述，组合化学方法也包括在本发明的筛选方法中，该法可鉴定结合到GDF受体上的化合物。因此，筛选方法也具有鉴定变异体、结合剂或阻断剂等的用途，它们如果不是物理地(如，空间地)，就是功能性地作为所需要的拮抗剂或激动剂起作用。
下面的实施例试图举例说明，但并不限制本发明。
实施例1肌生长抑制素以剂量依赖的方式起作用此实施例表明，肌生长抑制素抑制肌肉生长的活性依赖于肌生长抑制素的体内表达水平。
肌生长抑制素是骨骼肌质量的负性调节物(McPherron等人，见前，1997；McPherron和Lee，见前，1997)。属肌生长抑制素基因缺失纯合子的肌生长抑制素敲除小鼠，总体重增加25-30％。对纯合子敲除小鼠的检查显示，肌肉量的增加是由于全身骨骼肌大约增加100-200％。
肌生长抑制素突变杂合子的小鼠，总体重也增加。然而，杂合子增加的量小于纯合子增加的量，且在许多检测中仅有一个年龄和性别组有统计学显著性。为确定杂合子小鼠是否在野生型小鼠和纯合子小鼠之间具有中间的表现型，对肌肉重量的分析扩展到杂合子小鼠。杂合子小鼠的单个肌肉标本比野生型小鼠重大约25-50％。这些结果显示，肌生长抑制素基因缺失的杂合小鼠在野生型小鼠和纯合的肌生长抑制素敲除小鼠之间具有一个中间的表现型，表明肌生长抑制素在体内产生一个剂量依赖的效应。
这些结果提示，肌生长抑制素活性的调节可以用于治疗肌肉消耗性疾病和其它伴随肌生长抑制素活动的代谢性异常。而且，肌生长抑制素的剂量依赖作用提示，可以在肌生长抑制素活性没有达到完全抑制的情况下获得治疗效果，因此，假如例如某种活性水平产生了受试者不需要的作用，可以调节肌生长抑制素的活性。
实施例2肌生长抑制素的作用随敲除小鼠的年龄而下降此实施例表明，伴随着突变体小鼠肌肉重量的下降，野生型小鼠和纯合的肌生长抑制素敲除小鼠间体重的差异减小。
肌生长抑制素敲除小鼠在5月龄时比野生型小鼠重大约25-30％(McPherron等人，见前，1997)。然而，当动物变老时，这个总体重的差异显著地变小或完全地消失。为了确定此效果是否是由于敲除小鼠体重的相对丢失，因为例如肌肉衰退，或因为野生型小鼠获得的体重相对较大，将肌肉重量作为年龄的函数对其进行了详细分析。
在从2个月到17个月检测的所有年龄中，纯合突变的小鼠胸肌重量显著高于同窝出生的野生型小鼠。在5个月时观察到最显著的差异，此时突变体小鼠的胸肌重量大约多200％。尽管在较大的年龄，胸肌重量略有下降，但突变体小鼠此肌肉的重量仍然比野生型小鼠大2倍。在检测的所有其它肌肉中观察到同样的基本倾向，包括肱三头肌、四头肌、腓肠肌和跖肌、和胫骨前肌。在雄性和雌性小鼠中都观察到相似的倾向。这些结果表明，突变体和野生型小鼠间随年龄观察到的总体重差别的下降，是由于突变体小鼠肌肉重量的轻度下降。
实施例3肌生长抑制素以剂量依赖的方式影响脂肪聚积此实施例表明，肌生长抑制素敲除小鼠不能聚积脂肪，且脂肪聚积的减少与肌生长抑制素体内表达的水平相关。
如实施例2所示，由于肌生长抑制素突变体肌肉重量的下降没有完全解释所观察到的，野生型动物最终重量与突变体小鼠大致相同，于是检测了野生型和突变体小鼠脂肪聚积的量。检测雄性小鼠腹股沟、附睾和腹膜后的脂肪垫。在2月龄时，这些脂肪垫中任何一个的重量在野生型和突变体小鼠间没有差异。到5至6月龄时，野生型和杂合的敲除小鼠都具有较大范围的脂肪垫重量，平均，当动物达到9至10月龄时，脂肪垫重量增加大约3至5倍。由于在这些动物中观察到的大范围脂肪垫重量，一些动物显示比其它动物更大的增加(高达10倍)。
与野生型和杂合的敲除小鼠相反，肌生长抑制素纯合突变体小鼠的脂肪垫重量在相对窄的范围内，在2月龄小鼠与9至10月龄小鼠中实际上是相同的。因此，野生型小鼠中随着年龄而增加的脂肪聚积在纯合的肌生长抑制素敲除小鼠中观察不到。在纯合突变体小鼠中，此脂肪聚积的差异与肌肉重量轻度下降一起，作为年龄的函数，完全解释了观察到的野生型动物最终与突变体动物具有相同的总体重。
在9至10月龄，杂合敲除小鼠的平均脂肪垫重量介于野生型小鼠和纯合突变体小鼠的中间。尽管由于在这些小鼠和野生型小鼠中脂肪垫的重量范围宽，使这个差异没有统计学显著性，但这些结果仍然提示肌生长抑制素对脂肪聚积具有剂量依赖的作用，与其对肌肉生长的作用相似。
实施例4肌生长抑制素对代谢的影响此实施例表明，血清胰岛素和葡萄糖水平、以及代谢活动受肌生长抑制素表达水平的影响。
为确定肌生长抑制素突变体小鼠中的骨骼肌肥大和缺少脂肪聚积是否是由于对总体代谢的影响，检测了突变体小鼠的代谢概况。同野生型对照小鼠相比(表1)，肌生长抑制素突变体小鼠的血清甘油三酯和胆固醇水平显著地降低。肌生长抑制素突变体小鼠的血清胰岛素水平也显示较低。但在纯合突变体小鼠和野生型小鼠之间，喂食和空腹葡萄糖水平都没有区别(表1)，且两组小鼠在糖耐量试验中都有正常的反应。结果显示，尽管纯合肌生长抑制素敲除小鼠的血清胰岛素水平低于野生型动物，但它能够保持血清葡萄糖的正常水平。
表1.血清参数+/+ -/-甘油三酯(mg/dl)131.5+/-16.5 66.8+/-11.4 p＝0.012胆固醇(mg/dl) 138.3+/-8.1 94.5+/-6.8 p＝0.0034
喂食葡萄糖(mg/dl) 114.0+/-4.8 119.3+/-5.2 n.s.(p＝0.43)空腹葡萄糖(mg/dl) 86.5+/-3.8103.3+9.3 n.s.(p＝0.13)+/+代表野生型小鼠；-/-代表纯合敲除小鼠为确定代谢率的差异是否可以解释突变体小鼠缺少脂肪聚积，用热量计比较了野生型和突变体小鼠的耗氧率。突变体小鼠的基础代谢率和总代谢率比野生型对照小鼠低。这些结果提示，突变体小鼠缺少脂肪聚积不是由于代谢活动率较高。
实施例5肌生长抑制素在遗传肥胖的小鼠中影响脂肪聚积此实施例表明，在肥胖遗传学模型小鼠中，肌生长抑制素表达缺乏抑制脂肪的聚积。
为确定肌生长抑制素活性缺乏是否不仅在正常小鼠，而且在肥胖小鼠中抑制脂肪聚积，检测了代表肥胖遗传学模型的棕灰色的黄色致死(Ay)小鼠(Yen等人，FASEB J.8479-488，1994)中肌生长抑制素突变的影响。产生致死性黄色和肌生长抑制素突变的双重杂合小鼠，并检测这些双重杂合小鼠杂交的子代小鼠。
与Ay/a，肌生长抑制素+/+小鼠相比，Ay/a，肌生长抑制素-/-双突变小鼠的总体重令人注目地下降(大约9克)。考虑到Ay/a，肌生长抑制素-/-双突变体的骨骼肌比Ay/a，肌生长抑制素+/+小鼠多大约2至3倍，此总体重的下降更突出。双突变体的肌肉比Ay/a，肌生长抑制素+/+小鼠多大约10克，因此，其余组织的总重量减少大约是19克。
总体重下降由总体脂肪含量减少引起。如表2所示，与Ay/a，肌生长抑制素+/+小鼠相比，Ay/a，肌生长抑制素-/-双突变体的子宫旁和腹膜后脂肪垫重量减少5倍至6倍。这些结果提示，肌生长抑制素突变的存在显著地抑制肥胖症的脂肪聚积。
肌生长抑制素突变的存在也显著地影响葡萄糖代谢。缺少肌生长抑制素突变的野灰色致死性小鼠有很不正常的糖耐量试验结果，其血糖水平常常达到450至600mg/dl并在4个小时时间内仅仅慢慢恢复到基线水平。如前所述，对雌性野灰色致死性小鼠的影响小于雄性小鼠，一些雌性在此试验中的反应几乎正常(见，Yen等人，见前，1994)。相反，尽管Ay/a，肌生长抑制素-/-小鼠的糖耐量试验轻度异常，但在Ay/a，肌生长抑制素+/+小鼠中没有一只观察到很大的异常。
这些结果提示，肌生长抑制素突变在野灰色致死性小鼠中至少部分地抑制异常糖代谢的形成。显著地，肌生长抑制素突变杂合子的小鼠同肌生长抑制素+/+和肌生长抑制素-/-小鼠相比，具有中间的反应，因此证实了肌生长抑制素的剂量依赖作用。
实施例6重组肌生长抑制素的纯化此实施例提供了一个制备和分离重组肌生长抑制素的方法。
为阐明肌生长抑制素的生物学活性，纯化了大量肌生长抑制素蛋白以进行生物试验。稳定的产生高水平肌生长抑制素蛋白的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，采用甲氨喋呤选择方案，通过共扩增一个含二氢叶酸还原酶盒的肌生长抑制素表达盒来产生(McPherron等人，见前，1997)。通过在羟磷灰石、刀豆植物血凝素琼脂糖凝胶、DEAE琼脂糖和肝素琼脂糖凝胶上的连续分级分离，从最高生产细胞系的条件培养基中纯化肌生长抑制素。银染色分析显示，在这4个柱层析步骤后获得的纯化蛋白(称作“肝素洗脱物”)，由分子量大约35千道尔顿(kDa)和12kDa的两种成分组成。
纯化的蛋白制剂用各种标准测定，表明是两个肌生长抑制素功能前区肽的复合体，和一个二硫键连接的肌生长抑制素肽成熟C末端的二聚体。首先，western印迹分析，用针对原肌生长抑制素序列特异部分而产生的抗体鉴定作为功能前区的35kDa带和作为成熟C末端肽的12kDa带。其次，在非还原条件下，与直接抗成熟C末端肽的抗体起作用的种类，具有与二硫键连接的二聚体一致的电泳迁移率。第三，功能前区与成熟C末端肽的摩尔比率大约为1∶1。第四，功能前区和成熟C末端肽也能经过4柱层析步骤共纯化。最后，即使C末端区不含公认的N-连接的糖基化信号，成熟的C末端肽结合到刀豆植物血凝素柱上，提示成熟的C末端肽由于其与功能前区肽相互作用而结合到该柱上，功能前区含有潜在的N-连接的糖基化位点。
这些结果提示，由遗传学修饰的CHO细胞产生的肌生长抑制素，以蛋白酶水解加工的形式分泌，得到的功能前区和成熟C末端区非共价地联合，以形成一个复合体，它含有两个功能前区肽和一个二硫键连接的C末端蛋白水解片段二聚体，与TGF-β的描述相似。在TGF-β复合体中，C末端二聚体以无活性的潜在形式存在(Miyazono等人，J.Biol.Chem.2636407-6415，1988)，通过用酸、离液剂、活性氧类、或纤溶酶处理，或通过与其它蛋白相互作用包括血小板反应蛋白和整连蛋白Ivβ6，可以从此潜在复合体中释放活性种类(Lawrence等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.1331026-1034，1985；Lyons等人，J.Cell.Biol.1061659-1665，1988；Schultz-Cherry和Murphy-Ullrich，J.Cell.Biol.122923-932，1993；Barcellos-Hoff和Dix，Mol.Endocrinol.101077-1083，1996；Munger等人，细胞(Cell)96319-328，1999)。进一步，将纯化的功能前区肽(还已知为潜伏期伴随肽或LAP)加到TGF-β复合体中抑制了纯化的C末端二聚体在体外和体内的生物学活性(Gentry和Nash，生物化学296851-6857，1990；Bottinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935877-5882，1996)。
由功能前区和成熟C末端肽组成的肝素洗脱物用HPLC C4反相柱进一步纯化。C末端二聚体早于功能前区从HPLC柱上洗脱，因此，可以分离不含功能前区的C末端二聚体。也可以获得主要含功能前区的级分，尽管这些级分含有少量的C末端二聚体。这些蛋白中的一些也表现为高分子量复合体。高分子量复合体的性质尚不清楚，但根据有或无还原剂的western印迹分析，这些复合体可至少含有一个功能前区肽和一个C末端成熟肌生长抑制素肽，两者由一个或更多二硫键连接。事实上，在富含前肽的HPLC级分(HPLC级分35-37)中出现的成熟C末端肽，大多数存在于这些高分子量复合体中。这些较高分子量的复合体似乎代表由遗传学修饰的CHO细胞分泌的不正确折叠的蛋白。
实施例7肌生长抑制素与激活素受体特异地相互作用此实施例表明，肌生长抑制素特异地结合一个在培养的细胞上表达的激活素II型受体，且此特异性结合被肌生长抑制素功能前区抑制。
已经鉴定了一些TGF-β家族成员的受体，大多数是单一的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶(Massague和Weis-Garcia，Cancer Surveys2741-64，1996)。例如，已知激活素II型受体(Act RIIA和/或Act RIIB)结合TGF-β超家族的成员。缺少Act RIIB受体小鼠的表现型显示前/后轴型缺陷和肾脏异常，与GDF-11敲除小鼠中观察到的非常相似(McPherron等人，Nat.Genet.22260-264，1999；Oh和Li，Genes Devel.111812-1826，1997)。因为在成熟C末端区，GDF-11和肌生长抑制素(GDF-8)的氨基酸序列有90％同一性，所以检测了肌生长抑制素特异地与激活素II型受体相互作用的能力。
肌生长抑制素通过放射性碘化作用标记，用转染了Act RIIB表达构建物的COS细胞进行结合性研究。肌生长抑制素特异地与转染的COS细胞相互作用。肌生长抑制素的结合性被过量未标记的肌生长抑制素以剂量依赖的方式竞争，且在用空载体转染的对照COS细胞中显著地降低。对用BMP RII或TGF-βRII表达构建物转染的细胞没有发生有效的结合。肌生长抑制素对Act RIIB转染细胞的结合是可饱和的，通过斯卡查德分析测定的结合亲合力为大约5nM。
受体结合试验也被用于检测肌生长抑制素功能前区抑制成熟C末端二聚体与此系统中Act RIIB特异地相互作用的能力。添加纯化的功能前区肽以剂量依赖的方式阻断了C末端二聚体结合Act RIIB转染的COS细胞的能力。这些结果提示，肌生长抑制素功能前区是肌生长抑制素的天然抑制剂。
实施例8增高的肌生长抑制素水平导致重量减轻此实施例表明，体内肌生长抑制素水平升高可以引起相当大的重量减轻。
在一组实验中，表达肌生长抑制素的CHO细胞被注射给裸鼠。有表达肌生长抑制素的CHO细胞瘤的裸鼠，在细胞注射后大约12至16天的过程中显示出严重的消瘦。此消瘦症状在注射了任何各种对照CHO细胞系的裸鼠中没有观察到，这些对照细胞系经过了相似的选择处理但不表达肌生长抑制素。此外，用于转染CHO细胞的构建物中的肌生长抑制素编码序列是受金属硫蛋白启动子控制的，当给带肌生长抑制素表达瘤的小鼠供应含硫酸锌的水时，消瘦症状加重。Western印迹分析显示，带有表达肌生长抑制素的CHO细胞的裸鼠，血清中有高水平的肌生长抑制素蛋白。这些结果提示，裸鼠的消瘦症状是对肌生长抑制素水平升高而引起的反应，如下面讨论的，用纯化的肌生长抑制素注射小鼠观察到的相似作用证实了此结果。
在带有表达肌生长抑制素的CHO细胞的裸鼠中观察到的令人注目的体重减轻，主要地是由于脂肪和肌肉重量都不成比例的减轻。同带对照CHO细胞瘤的小鼠相比，白脂肪垫重量(肩胛内白、子宫和腹膜后脂肪)减少超过90％。肌肉重量也严重地下降，在16天时，表达肌生长抑制素小鼠的单个肌肉重量大约是对照小鼠的一半。此肌肉重量的减轻反映在纤维体积和蛋白含量的相应下降。
带有表达肌生长抑制素的CHO细胞瘤的小鼠还形成了严重的低血糖症。然而，体重减轻和低血糖症不是由于进食的差异，因为在16天研究过程中的每一个检测时间段内，所有小鼠消耗相同量的食物。这些结果提示，肌生长抑制素过度表达引起显著的体重减轻，这与患有慢性疾病，如癌症或AIDS，的病人中发生的恶病质消瘦症状是相似的。
随着用低剂量肌生长抑制素的更慢性的给药，观察到了脂肪重量的改变。例如，每天2次注射1μg肌生长抑制素蛋白7天，导致许多不同白脂肪垫(肩胛内白、子宫和腹膜后脂肪垫)的重量下降大约50％，而对褐色脂肪(肩胛内褐)没有显著影响。这些结果证实，肌生长抑制素可以引起体重减轻，并在极端的情况下，引起活体消瘦症状。
实施例9结合到激活素受体的肌生长抑制素的定性此实施例描述了在体内鉴定肌生长抑制素结合激活素受体与肌生长抑制素产生的生物学作用之间关系的方法。
Act RIIA或Act RIIB敲除小鼠可被用于在体内证实Act RIIA或Act RIIB是肌生长抑制素的受体。对这些小鼠详细的肌肉分析可以确定激活素受体敲除是否与肌肉纤维数量或大小的改变有关。由于ActRIIA/Act RIIB双纯合突变体在胚胎形成过程中早期死亡(Song等人，Devel.Biol.213157-169，1999)，因此只能检测各种纯合/杂合的组合。但是，可以产生组织特异的或条件性敲除小鼠，使得两种基因可以仅在肌肉中都“删除”，因而可以在出生后检测双纯合的敲除小鼠。
可以随小鼠的年龄检测对脂肪组织的作用，以确定在敲除小鼠中脂肪细胞数量或这些脂肪细胞中的脂质聚积是否改变。用从胶原酶处理的组织中制备的细胞悬液测定脂肪细胞数量和大小(Rodbell，J.Biol.Chem.239375-380，1964；Hirsch和Gallian，J.Lipid Res.9110-119，1968)。通过测量干尸重量以及提取脂质后残余的干尸重量来确定动物的总脂质含量(Folch等人，J.Biol.Chem.226497-509，1957)。
还可以检测各种血清参数，包括喂食和空腹葡萄糖和胰岛素、甘油三酯、胆固醇和苗条蛋白。如上面公开的，血清甘油三酯和血清胰岛素在肌生长抑制素突变体动物中下降。还可以用糖耐量试验检测激活素受体敲除小鼠对外源葡萄糖负荷的反应能力。如上面公开的，5月龄野生型和肌生长抑制素突变体小鼠对葡萄糖负荷的反应基本上是相同的。通过测量小鼠年老时的这些参数可以扩展此观察。在糖耐量试验过程中的不同时间还可以测量血清胰岛素水平。
也可以用一个热量计(Columbus Instruments)监测基础代谢率。如上面公开的，3月龄时，肌生长抑制素突变体小鼠的代谢率较其对应的野生型低。此分析可以扩展到年老小鼠，而且还可以测量这些动物的呼吸商。通过测量基础体温以及当置于4℃时它们保持体温的能力，可以确定保持正常生热作用的能力。也可以检测褐色脂肪的重量，及UCP1、UCP2和UCP3在褐色脂肪、白脂肪、肌肉和其它组织中的表达水平(Schrauwen等人，1999)。
可以监测相对于体重增加的食物摄取量，并可以计算喂养效率。此外，可以监测在高脂膳食下动物的体重增加。保持高脂膳食的野生型小鼠迅速地聚积脂肪，然而这里公开的结果提示，激活素受体突变动物将相对地保持瘦态。
这些研究的结果可以提供肌生长抑制素对小鼠影响的更完全的概观，特别是有关其总体代谢状态，从而理解关于肌生长抑制素敲除小鼠抑制脂肪聚积的能力是否是肌肉中肌生长抑制素突变的合成代谢作用，它引起能量应用的变换，使得很少能量可被用来以脂肪的形式储存。例如，脂肪聚积的减少可以是由于生热作用速度增加。这些结果也会提供一个基础，以比较在肥胖症和II型糖尿病的不同遗传学模型范围内，肌生长抑制素活性的作用。
实施例10在肥胖症和II型糖尿病遗传学模型中，肌生长抑制素作用的特性此实施例描述了确定肌生长抑制素在治疗肥胖症或II型糖尿病中的作用的方法。
同野生型小鼠相比，肌生长抑制素突变体小鼠的总体脂肪聚积令人注目地减少，提示可以改变肌生长抑制素活性以治疗或预防肥胖症或II型糖尿病。可以在这些代谢性疾病的几个特性清楚的小鼠模型背景中检测肌生长抑制素突变的作用，这些模型包括，例如“肥胖”小鼠(ob/ob)、“糖尿病”小鼠(db/db)、和野灰色黄色致死性(Ay)突变品系。上面描述的每个参数和试验在所有这些品系实际上是异常的(见，例如，Yen等人，见前，1994，Friedman和Halaas，Nature 395763-770，1998)。通过构建双重突变体，然后对双重突变体动物与合适的仅携带ob/ob、db/db、或野灰色黄色致死性突变的对照同窝出生仔一起进行各种试验，可以检测肌生长抑制素突变在携带这些其它突变的小鼠中减缓或抑制这些异常形成的能力。
如上面公开的，Ay小鼠中肌生长抑制素突变与肌生长抑制素突变Ay小鼠大约5倍的脂肪聚积抑制相关，并如糖耐量试验所评定的，与部分抑制糖代谢异常的形成有关。这些结果可以扩展到包括另外各种年龄的动物，且可以用ob/ob和db/db突变体进行相似的研究。由于这些突变都是隐性的，可以产生肌生长抑制素突变和ob或db突变双重纯合的小鼠。为检测肌生长抑制素功能部分缺失在这些遗传学模型系统中的作用，也检测了ob或db突变纯合和肌生长抑制素突变杂合的小鼠。已经产生了肌生长抑制素和ob突变双重杂合的小鼠，可以检测来自这些双重杂合小鼠交配的子代，特别是关于脂肪聚积和糖代谢。在肥胖突变体中，这些异常之一或两者都部分抑制，可能提示肌生长抑制素是治疗肥胖症和II型糖尿病的靶标。
实施例11表达能够影响肌生长抑制素活性的显性失活多肽的转基因小鼠的特性此实施例描述了通过表达显性失活多肽，在出生后鉴定肌生长抑制素作用的方法，该显性失活多肽可以阻断肌生长抑制素表达或肌生长抑制素信号转导。
肌生长抑制素抑制剂在出生后调节肌生长抑制素活性，可被用来确定肌生长抑制素对肌肉纤维数量(增生)和肌肉纤维大小(肥大)的作用。条件性肌生长抑制素敲除小鼠，其肌生长抑制素基因在动物生命的限定时间被删除，可被用于这些研究。tet调节物和cre重组酶一起提供了产生这种小鼠的系统。在此系统中，cre的表达是由给予强力霉素进行诱导的。
也可以产生一个从可诱导的启动子表达肌生长抑制素抑制剂的转基因小鼠，这样可以在动物生命过程中的限定时间减弱或抑制肌生长抑制素的活性。四环素调节物被用于产生这种转基因小鼠，其中肌生长抑制素的表达由强力霉素诱导。
一个tet系统的修饰，应用杂交逆向tet-反式激活剂(VP16活化功能区与突变体逆向tet阻遏物的融合蛋白)和杂交逆向tet-反式阻遏物(哺乳动物Koxl的KRAB阻遏物功能区与天然tet阻遏物的融合蛋白)的共表达，可以特别地用来产生转基因小鼠(Rossi等人，Nat.Genet.20389-393，1998；Forster等人，Nucl.Acids Res.27708-710，1999)。在此系统中，杂交逆向tet-反式阻遏物结合tet操纵基因序列，并仅在四环素存在时激活转录；杂交逆向tet-反式阻遏物结合tet操纵基因序列并仅在没有四环素时抑制转录。通过这两个融合蛋白的共表达，靶启动子的基础活性在没有四环素时被tet-反式阻遏物沉默，并在给予四环素时被逆向tet-反式激活剂激活。
可以产生两型转基因系。在第一型中，在肌肉特异的启动子，例如肌肉肌酸激酶启动子(Sternberg等人，见前，1988)或肌球蛋白轻链增强子/启动子(Donoghue等人，见前，1991)的控制下，转基因编码肌生长抑制素抑制剂多肽。筛选在骨骼肌中tet调节物特异性表达的单个转基因系，为两个启动子中的每一个选择几个独立的系并检测，以证实观察到的任何作用不是由于例如整合位点特异的作用。已经构建了一个含2个在肌球蛋白轻链启动子/增强子控制下的tet调节物的构建物，并可以用于前核注射。在第二型系中，转基因含有在最小CMV启动子控制下的肌生长抑制素抑制剂多肽，它进一步含有tet操纵基因序列。
肌生长抑制素抑制剂可以是显性失活形式的肌生长抑制素，或肌生长抑制素功能前区，如这里公开的，后者可以抑制肌生长抑制素活性。TGF-β家族成员的显性失活形式已经被描述(见，例如，Lopez等人，Mol.Cell Biol.121674-14679，1992；Wittbrodt和Rosa，Genes Devel.81448-1462，1994)，并含有例如突变的蛋白水解切割位点，从而防止蛋白被加工成生物活性形式。当在细胞内与内源性野生型基因共表达时，突变体蛋白与野生型蛋白一起形成无功能杂合二聚体，因此作为显性失活起作用。已经构建了一个在原肌生长抑制素切割位点内含有突变的突变体肌生长抑制素多肽，并在293细胞中，通过以不同的比率与野生型肌生长抑制素共表达，可以检测显性失活的作用。可以用western印迹分析检测暂时转染了构建物的293细胞的条件培养基，并可以检测突变体阻断成熟C末端二聚体形成的能力。
还可以使用仅编码肌生长抑制素功能前区的表达构建物。如上面公开的，功能前区与成熟C末端二聚体形成一个紧密的复合体，并阻断成熟C末端肌生长抑制素二聚体在表达受体的培养细胞中结合ActRIIB的能力。通过与TGF-β类比，肌生长抑制素功能前区也能够以无活性潜在复合体形式在体内保留成熟C末端二聚体。
这些转基因动物可以与表达tet调节物的动物一起培育，产生含tet调节物和抑制剂靶标的构建物的双重转基因系。这些双重转基因系可以被筛选，以找到其中所有不同的成分都合适地表达的系。在饮水中给予强力霉素前和后，采用获取自各系中有代表性小鼠的各种肌肉和对照组织的RNA，进行Northern印迹分析，可以用来鉴定这种转基因系。在没有强力霉素的情况下不表达任何转基因，而有强力霉素时仅在肌肉中表达转基因的转基因系将被选择。
对选择的转基因动物给予强力霉素并检测其对肌肉量的影响。给怀孕的母体使用强力霉素以在胚胎形成过程中诱导抑制剂的表达。在转基因动物发育过程中，阻断肌生长抑制素活性的效果可以与肌生长抑制素敲除小鼠中观察到的效果相比。由于同肌生长抑制素最初表达的时间相比，驱动tet调节物表达的启动子可以在发育过程的较晚时间被诱导，因此对转基因小鼠肌肉量的影响可以与肌生长抑制素敲除小鼠中发生的效果相比。
通过在出生后不同的时间给双重转基因小鼠使用强力霉素，可以检测出生后抑制肌生长抑制素活性的效果。强力霉素处理可以在例如3周龄时开始，并可以在5月龄时分析动物，此时，肌生长抑制素敲除小鼠与野生型小鼠肌肉重量的差异最大。检测了抑制剂对动物肌肉量的影响。也可以对肌肉进行组织学检测以确定对纤维数量和纤维大小的影响。此外，可以进行转基因动物各种肌肉的纤维类型分析，以确定对I型和II型纤维是否具有选择性作用。
强力霉素可以用不同的剂量并在不同的时间用药，以鉴定肌生长抑制素抑制剂的作用。双重转基因小鼠也可以被慢性地维持使用强力霉素，然后如上所述检测对脂肪垫和其它相关代谢参数的影响。这些研究的结果可以证实，出生后调节肌生长抑制素活性可以增加肌肉量或减少脂肪聚积，因而提示，靶向肌生长抑制素可以用于临床治疗各种肌肉消耗性和代谢性疾病。
肌生长抑制素也可以检测含肌生长抑制素转基因的转基因小鼠，并可以将肌生长抑制素表达产生的影响与含表达肌生长抑制素的CHO细胞的裸鼠中的观察效果进行比较。与上面描述的相似，肌生长抑制素可被置于条件性(tet)和组织特异性调控元件的控制之下，可以检测转基因小鼠中肌生长抑制素的表达以确定发生的消瘦症状是否与裸鼠中的观察相似。肌生长抑制素转基因可以包括例如来自SV40的加工信号，使转基因能够与内源性肌生长抑制素基因相区别。
在给予强力霉素后的各时间点，可以从肌生长抑制素转基因小鼠中分离血清样本，并可以测定血清中肌生长抑制素转基因产物的水平。随着时间监测动物的总体重以确定动物是否表现显著的重量减轻。此外，分离和称重了单个肌肉和脂肪垫，并在选择的肌肉样本中测定肌肉纤维的数量、大小和类型。
肌生长抑制素转基因表达的水平可以因给予动物的强力霉素的剂量不同而变化。转基因表达可以被监测，采用例如，肌肉中转基因RNA水平的northern印迹分析，或血清中肌生长抑制素蛋白的水平。测定肌生长抑制素转基因表达的特定水平可以确定与肌生长抑制素引起的消瘦程度的相关性。转基因系也可以与肌生长抑制素敲除小鼠杂交，以产生转基因为唯一肌生长抑制素表达源的小鼠。可以监测发育过程中各时间点的肌生长抑制素表达，并确定肌生长抑制素对纤维数量、纤维大小、和纤维类型的影响。获得可精确和迅速控制肌生长抑制素表达的小鼠提供了一个有力的工具，以进一步鉴定肌生长抑制素信号转导通路，并检测各种潜在地可能用于调节肌生长抑制素信号转导的药剂的效果。
肌生长抑制素信号转导的效应物可以产生含肌生长抑制素信号转导通路任一显性失活形式的转基因小鼠，该信号转导通路可以包括TGF-β信号转导通路的成分，它特异地在骨骼肌中表达。如这里公开的，通过由激活素II型受体诱导的通路介导信号转导的Smad蛋白，可能涉及肌生长抑制素信号转导。
Act RIIB可以结合与肌生长抑制素高度相关的GDF-11(McPherron等人，见前，1997；Gamer等人，见前，1999；Nakashima等人，Mech.Devel.80185-189，1999)，且能够结合抑制Smad2、Smad3、和Smad4的c-ski的表达令人注目地影响肌肉生长(Sutrave等人，见前，1990；Berk等人，见前，1997；又见，Luo等人，见前，1999；Stroschein等人，见前，1999；Sun等人，见前，1999a和b；Akiyoshi等人，见前，1999)。如这里公开的，肌生长抑制素特异地与Act RIIB相互作用，因此能够发挥其生物学作用，至少部分通过体内结合激活素II型受体并激活Smad信号通路。
采用在Act RIIB/Smad信号转导通路的特定点上阻断或能够被阻断的转基因小鼠系，可以检测Smad信号转导通路在调节肌肉生长中的作用。肌肉肌酸激酶启动子或肌球蛋白轻链增强子/启动子可被用于驱动Smad信号转导通路各种抑制剂的表达。
用于此系统中的抑制剂可以包括例如，滤泡素抑制素；显性失活的Act RIIB受体；显性失活的Smad多肽如Smad3；c-ski；或抑制性Smad多肽如Smad7。滤泡素抑制素可以结合并抑制某种TGF-β家族成员的活性，包括GDF-11(Garmer等人，见前，1999)。例如通过表达截短的GDF受体，例如通过表达细胞外功能区，特别是Act RIIB细胞外功能区的可溶性形式，或通过表达缺少激酶功能区或含有使突变体受体缺少激酶活性的突变的截短型Act RIIB受体，可以获得显性失活形式的激活素II型受体。Smad7作为一个抑制性Smad起作用，它可以阻断由激活素、TGF-β、和BMP诱导的信号转导通路。例如，通过突变Smad3的C末端磷酸化位点可以构建Smad3的显性失活形式，从而阻断Smad3的功能(Liu等人，见前，1997)。在转基因小鼠中，c-ski过度表达已经发现与肌肉肥大有关联(Sutrave等人，见前，1990)。
可以制备转基因小鼠并检测每一个起始系，以使转基因适当的、肌肉特异性的表达。检测被选择小鼠的总体重、个体肌肉重量、及肌肉纤维大小、数量和类型。如上所述，那些显示对肌肉量有明显影响的系可以进一步检测脂肪聚积和其它相关的代谢参数。应用这些不同的药剂寻靶激活素受体/Smad信号转导通路中的特定步骤，是特别有信息价值的，因为不同药剂的信号转导通路在不同的步骤中有重叠。例如，滤泡素抑制素结合并抑制激活素和GDF-11活性但不影响TGF-β，而显性失活的Smad3可以通过激活素和TGF-β受体阻断信号传导。Smad7可能是更多向性的，因为它还阻断通过BMP受体的信号传导。本研究可使调节肌生长抑制素活性的特定靶位得以确定，从而提供了开发药剂和其它药剂的各种策略，这些药剂和药剂调节肌生长抑制素的信号转导并进而调控肌生长抑制素的活性。
特别地，这里描述的转基因系可以用于确定出生后阻断肌生长抑制素功能或Smad信号转导通路对形成肥胖症或II型糖尿病的作用。例如，抑制性转基因可以杂交进ob/ob、db/db和Ay突变体小鼠中。在没有强力霉素时，抑制剂转基因不表达，因此动物与每个亲代突变体小鼠没有差别。在强力霉素存在的情况下，抑制剂被表达并可以阻断肌生长抑制素活性。可以检测在这些突变体动物中阻断肌生长抑制素活性对形成代谢性异常的影响。
抑制剂的表达可以在较早年龄时诱导，例如在3周龄，以使效果最大化。此外，可以在代谢性异常严重到不可逆转之前阻断肌生长抑制素活性。动物可以维持给予强力霉素，并在不同的年龄用上面描述的试验测评，包括涉及脂肪聚积和葡萄糖代谢的试验。在ob/ob、db/db和Ay突变体动物中，可以发现在一个或多个试验结果出现异常的年龄组中存在延迟。可以用已经形成一些肥胖症或II型糖尿病迹象的老年动物进行相似的研究，并测定肌生长抑制素活性阻断对各种参数的影响，包括脂肪重量和葡萄糖代谢。这些研究结果可以进一步确定特异性靶标，它们在预防或治疗肥胖症或II型糖尿病的努力中可以被操作控制。
实施例12肌生长抑制素特性对诱导恶病质的影响此实施例描述了确定肌生长抑制素信号转导在恶病质形成和进展中的作用的方法。
在正常个体中，激活素受体和Smad通路可以构成涉及介导肌生长抑制素活性的至少部分信号转导通路，因此，可以涉及介导个体中因肌生长抑制素过高水平而发生的影响。如这里公开的，例如恶病质，至少可以部分地通过异常的高水平肌生长抑制素介导。如此，通过Smad通路调控信号转导的方法可以提供一个开发药剂的新策略，以开发治疗全身肌肉消耗、特别是恶病质的药剂。
Smad信号转导通路在恶病质中的作用，可以通过检测上面描述的各种转基因系对恶病质的易感性而确定，恶病质可以由以下因子诱导，如白介素-6(IL-6；Black等人，内分泌学1282657-2659，1991，在此引入作为参考文献)、肿瘤坏死因子-I(TNF-I；Oliff等人，细胞50555-563，1987，在此引入作为参考文献)、或某种肿瘤细胞。就IL-6和TNF-I来说，抑制剂转基因可被杂交进裸鼠背景中，然后用产生IL-6或TNF-I的CHO细胞激发动物，当IL-6或TNF-I以此方式过度表达时，导致裸鼠消瘦。可以采用上面描述的、用于制备过度产生肌生长抑制素的细胞的方法，制备过度产生IL-6或TNF-I的CHO细胞。例如，TNF-I cDNA可被克隆进pMSXND表达载体(Lee和Nathans，J.Biol.Chem.2633521-3527，1988)，然后可以在逐渐增加甲氨喋呤浓度的情况下，逐步选择携带表达构建物扩增拷贝的细胞。
肿瘤细胞如Lewis肺癌细胞(Matthys等人，Eur.J.Cancer27182-187，1991，在此引入作为参考文献)或结肠26腺癌细胞(Tanaka等人，J.Cancer Res.502290-2295，1990，在此引入作为参考文献)，可以导致小鼠恶病质，也可被用于这些研究。当这些细胞系在小鼠中长成肿瘤时，引起严重的消瘦。于是，可以在这里描述的各种转基因小鼠中检测这些肿瘤的影响。应当认识到，各种肿瘤细胞将仅在一定的遗传背景下生长。例如，Lewis肺癌细胞常规地在C57 BL/6小鼠中生长，而结肠26癌细胞常规地在BALB/c小鼠中生长。因此，转基因可被回交进这些或其它遗传学背景中，以使肿瘤细胞生长。
可以监测各种参数包括总体重、单个肌肉重量、肌纤维大小和数量、食物摄取量和血清参数包括葡萄糖水平。此外，可以检测血清肌生长抑制素水平和肌肉中肌生长抑制素RNA的水平，以证实增高的肌生长抑制素表达与恶病质相关。这些研究的结果可以证实，在这些实验模型中，肌生长抑制素的作用是恶病质诱导剂的下游。结果还可证实，在这些模型中，Smad信号转导通路对于恶病质的形成是必须的，并可表明通过调节Smad信号传送可以在恶病质的治疗中获得治疗益处。
实施例13生长分化因子-8(GDF-8)和GDF-11受体的鉴定和特性描述此实施例描述了GDF-8(肌生长抑制素)和GDF-11的细胞表面受体鉴定和特性描述的方法。
纯化的GDF-8和GDF-11蛋白将主要用于评定生物学活性。为鉴定GDF-8和GDF-11作用的潜在靶细胞，要寻找表达其受体的细胞。为此，纯化的蛋白将用氯胺T方法进行放射性碘化，此方法已成功地用于标记此超家族的其它成员如TGF-β(Cheifetz等人，见前，1987)、激活素(Sugino等人，J.Biol.Chem.26315249-15252，1988)和骨形态发生蛋白(Paralkar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 883397-3401，1991)，以进行受体结合研究。每个成熟加工形式的GDF-8和GDF-11都含有多个酪氨酸残基。将采用两个不同的方法鉴定这些蛋白的受体。
一个方法将确定受体的数量、亲合力和分布。在细胞培养中生长的全细胞、胚胎或成年组织的冷冻切片、或从组织或培养的细胞中制备的全膜组分将与标记的蛋白孵育，并将测定结合蛋白的数量或分布。对于涉及细胞系或细胞膜的试验，结合量的测定将通过在数次冲洗后测量结合到培养皿上的细胞上的放射活性，或就细胞膜而言，在离心或用滤器保留膜后，测量与膜一起沉积的放射活性。对于涉及原代培养的试验，细胞数量可以更有限，将通过用照相乳剂覆盖而直接地显示结合部位。对于涉及冷冻切片的试验，将通过暴露这些切片于高分辨Beta-max超级胶片而显示配体结合部位；如果需要更好的定位，将把切片浸泡于照相乳剂中。对于所有这些试验，将通过添加过量未标记蛋白作为竞争者来确定特异性结合(例如，见Lee和Nathans，见前，1988)。
第二个方法将用生物化学的方法描述受体的特性。细胞膜制剂或在细胞培养中生长的潜在靶细胞将与标记的配体一起孵育，受体/配体复合物将用双琥珀酰亚胺辛二酸酯共价地交联，双琥珀酰亚胺辛二酸酯已经被普遍地用于鉴定各种配体的受体，包括TGF-β超家族成员的受体(Massague和Like，J.Biol.Chem.2602636-2645，1985)。交联的复合体通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳被分离，以寻找过量未标记蛋白的条带，在没有过量未标记蛋白存在时不会有该标记条带；而在过量未标记蛋白存在时会有该标记条带。推定受体的分子量将通过减去配体的分子量而估算。这些试验将解决的一个重要问题是，GDF-8和GDF-11是否像其它TGF-β超家族成员一样，通过I型和II型受体传递信号(Massague和Weis-Garcia，见前，1996)。
一旦检测这些分子的受体的一个方法已经完成，将进行更详细的分析以确定结合亲合性和特异性。将使用斯卡查德分析确定结合部位的数量和解离常数。通过进行GDF-8和GDF-11之间的交叉竞争分析，将有可能确定它们是否能够结合到同一个受体上及它们的相对亲合性。这些研究将给出关于分子是否经过相同或不同的受体发送信号的提示。将用其它TGF-β家族成员进行竞争试验以确定特异性。这些配体中的某一些从商业途径获得，其它一些从Genetics Institute，Inc.获得。
对于这些试验，将检测各种胚胎和成年组织以及细胞系。根据GDF-8特异地表达在骨骼肌上和GDF-8敲除小鼠的表现型，最初的研究集中在胚胎和成年的肌肉组织以制备细胞膜，并用冷冻切片研究受体。此外，如所述，将在妊娠期的不同天数从胚胎中分离和培养成肌细胞，或从成年肌肉中分离和培养卫星细胞(Vivarelli和Cossu，Devel.Biol.117319-325，1986；Cossu等人，Cell Diff.9357-368，1980)。在细胞培养后各天，将在这些原代细胞上进行结合研究，通过放射自显影定位结合部位，使得结合部位可以与各种肌原性的标记物如肌肉肌球蛋白共同被定位(Vivarelli等人，J.Cell.Biol.1072191-2197，1988)，并将与细胞的分化状态如多核肌小管的形成与结合相关联。除应用原代细胞以外，将应用细胞系寻找受体。特别是，最初集中在3个细胞系上，C2C12、L6和P19。C2C12和L6成肌细胞在细胞培养中自发分化并依赖特定的生长条件形成肌小管(Yaffe和Saxel，见前，1977；Yaffe，见前，1968)。P19胚胎瘤细胞可被诱导分化成各种细胞类型，包括在有DMSO的情况下分化成骨骼肌细胞(Rudnicki和McBurney，畸胎癌和胚胎干细胞一个实用方法(Teratocarcinomas andEmbryonic Stem CellA practical approach)(E.J.Robertson，IRL出版社，剑桥1987)。将在各种生长条件下及各种分化阶段对这些细胞系进行受体结合研究。尽管最初的研究集中在肌肉细胞上，但也将检测其它组织和细胞类型的GDF-8和GDF-11受体的存在情况。
重组人GDF-8(rhGDF-8)同型二聚体将被用在这些结合研究中。RhGDF-8用CHO细胞表达，并纯化到大约90％的纯度。rhGDF-8具有期望的25kDa至27kDa的分子量，一旦还原，还原成12kDa的单体。在受体-配体结合试验中采用I-125标记的GDF-8，两个成肌细胞系，L6和G-8，与GDF-8结合。结合是特异性的，因为非标记的GDF-8有效地竞争标记配体的结合。解离常数(Kd)是370pM，且L6成肌细胞具有较高数量(5,000受体/细胞)的细胞表面结合蛋白。GDF-11(BMP-11)与GDF-8是高度同源的(＞90％)。受体结合研究显示，GDF-8和GDF-11结合到L6成肌细胞上的相同结合蛋白上。重要的是要确立GDF-8是否与已知的TGF-β受体结合。TGF-β不竞争GDF-8的结合，提示GDF-8受体与TGF-β受体不同。GDF-8受体不在所有的成肌细胞系上表达，包括4个成肌细胞系，C2C12、G7、MLB13MYCc14和BC3H1，它们不结合GDF-8。
可以获得编码GDF-8和GDF-11受体的基因。作为理解GDF-8和GDF-11发挥其生物学作用的机制的第一步，重要的是克隆编码其受体的基因。从上面的实验中，对GDF-8和GDF-11是否结合相同的或不同的受体将会更清楚。还会有关于这些受体的组织和细胞类型分布的重要信息。应用此信息，将采取两个不同的方法克隆受体基因。
第一个方法将使用表达克隆策略。事实上，这是最初由Mathews和Vale(细胞65973-982，1991)及Lin等人(细胞68775-785，1992)用来克隆第一个激活素和TGF-β受体的策略。从表达最高相对数目的高亲合力结合部位的组织或细胞类型中将获得Poly-A选择的RNA，并用于在哺乳动物表达载体pcDNA-1中制备一个cDNA文库，pcDNA-1含有一个CMV启动子和SV40复制起点。文库将被铺平板，来自每个平板的细胞将汇入肉汤并冷冻。来自每个库的等分试样将生长以制备DNA。每一个库将在小室玻片中被暂时地转染进COS细胞，转染的细胞将与碘化的GDF-8或GDF-11一起孵育。在冲走未结合的蛋白后，配体结合部位将通过放射自显影显示。一旦识别一个阳性库，来自该库的细胞将以较低的密度重新铺平板，并将重复此步骤。然后将阳性库铺平板，将每个克隆精选进并如所述再分析(Wong等人，Science228810-815，1985)。
最初，将使用大小为1500个菌落的库进行筛选。为确信在这样复杂的混合物中鉴定出一个阳性克隆，将进行采用TGF-β和克隆的II型受体的对照实验。编码TGF-βII型受体的编码序列将被克隆进pcDNA-1载体中，用此构建物转化的细菌将与来自我们文库的细菌以各种比例混合，包括1∶1500。然后，由此混合物制备的DNA将转染进COS细胞，与碘化的TGF-β一起孵育，并通过放射自显影显示。如果在1∶1500比例下观察到阳性信号，那么将筛选含有1500个克隆的库。否则，将使用与相应比率相对应的较小的库，在这种情况下，在对照实验中，该操作过程足以敏感到鉴定到一个阳性信号。
大多数TGF-β超家族成员的受体已经被鉴定属于跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶家族(Massague和Weis-Garcia，见前，1996)，利用此事实还将使用第二个相似的尝试克隆GDF-8和GDF-11受体的策略。由于这些受体的胞浆功能区在序列上相关，将使用简并PCR探针以克隆此受体家族的成员，它们在含有GDF-8和GDF-11结合部位的组织中表达。事实上，这是已经被用于鉴定此受体家族大多数成员的方法。一般的策略将是，设计与已知受体保守区相应的简并引物，将这些引物用于对制备自合适的RNA样本(最可能来自骨骼肌)的cDNA进行PCR，亚克隆PCR产物，最后对单个亚克隆测序。当序列被鉴定时，它们将被用作杂交探针以从进一步分析中消除重复的克隆。然后，将测试被鉴定的受体结合纯化的GDF-8和GDF-11的能力。由于此筛选将仅产生小的PCR产物，因此将从制备自合适组织的cDNA文库中获得每个受体的全长cDNA克隆，插入pcDNA-1载体中，转染进COS细胞，并将测试转染的细胞结合碘化GDF-8或GDF-11的能力。理想地，在此筛选中鉴定的每一个受体将检测与这些配体结合的能力。然而，被鉴定受体的数量可以很大，分离所有全长cDNA，检测它们需要相当大的努力。几乎肯定地说，一些被鉴定受体会相当于已知的受体，对于它们，或者从其它研究者那里获得全长cDNA克隆，或者根据公开发表的序列通过PCR扩增编码序列，应当是简单的。对于新的序列，将通过northern印迹分析确定组织分布，最优先考虑的事是指向那些表达方式与上面确定的GDF-8和/或GDF-11结合部位的分布最紧密相似的受体。
特别地，已知这些受体分成两类，I型和II型，它们可以根据序列区分并均需完全的活性。某些配体在没有II型受体时不能结合I型受体，而其它则能够与两型受体都结合(Massague和Weis-Garcia，见前，1996)。上面概述的交联实验应当给出有关I型和II型受体是否也都涉及GDF-8和GDF-11信号发送的一些指示。如果如此，为全面理解GDF-8和GDF-11如何传输其信号，克隆这两个受体亚型将是重要的。由于不能预测在没有II型受体时，I型受体是否能够与GDF-8和GDF-11相互作用，所以将首先克隆II型受体。只有当这些配体的至少一个II型受体已经被鉴定后，才会进行鉴定GDF-8和GDF-11I型受体的尝试。一般的策略将是，II型受体与PCR筛选中鉴定的每一个I型受体共转染，然后通过交联检测转染的细胞。如果I型受体是GDF-8或GDF-11受体复合体的一部分，将在转染的细胞中应当探测到两个交联的受体种类，一个相当于I型受体，另一个相当于II型受体。
由于至少一个称作GDNF的TGF-β超家族成员能够通过一个完全不同类型的、涉及GPI-联成分(糖基磷脂酰肌醇联成分)(GDNFR-α)和受体酪氨酸激酶(c-ret；Trupp等人，Nature 381785-789，1996；Durbec等人，Nature 381789-793，1996；Treanor等人，Nature 38280-83，1996；Jing等人，细胞851113-1124，1996)的受体复合体发送信号，对GDF-8和GDF-11受体的寻找进一步复杂化。尽管GDNF是TGF-β超家族成员在相关性上最遥远的，其它TGF-β家族成员也能通过类似的受体系统发送信号肯定是可能的。如果GDF-8和GDF-11确实通过相似的受体复合体发送信号，表达筛选方法应当至少能够鉴定出此复合体中GPI-联成分(实际上，GDNFR-α采用表达筛选方法来鉴定)。就GDNF来说，GDNF-和c-ret-缺陷型小鼠的相似表现型提示c-ret是GDNF的潜在受体。
实施例14
GDF-11敲除小鼠的制备和特性GDF-11敲除小鼠的表现型在许多方面与携带一种对某些TGF-β超家族成员受体的受体的存在缺失的小鼠表现型相似，包括激活素IIB型受体(Act RIIB)。为确定GDF-11的生物学功能，GDF-11基因胚胎干细胞被同源定位破坏。
根据Stratagene(La Jolla，CA)提供的产品说明书，在λFIXII中制备小鼠129 SvJ基因组文库。GDF-11基因的结构从限制性图谱和从文库中分离的噬菌体克隆的部分测序中推导。制备靶向构建物的载体由Philip Soriano和Kirk Thomsa惠赠。为保证得到的小鼠不具有GDF-11功能，去除了完整的成熟C末端区并置换成一个neo基因盒。用靶向构建物转染R1 ES细胞，用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(2uM)和G418(250ug/ml)选择，并通过Southern印迹分析法分析。
GDF-11基因的同源定位在8/115 9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤/G418双重抗性ES细胞克隆中观察到。在将几种靶向克隆注射进C57BL/6J胚胎后，从一个ES克隆中获得了嵌合体，当与雌性C57BL/6J和129/SvJ杂交时，产生杂合仔。C57BL/6J/129/SvJ杂种F1杂合体的杂交产生49个野生型(34％)、94个杂合子(66％)，没有纯合突变体成年子代。相似地，在129/SvJ背景中没有见到成年纯合无效动物(32个野生型(36％)和56个杂合子突变体(64％)动物)。
为确定纯合突变体死亡的年龄，在不同妊娠年龄，从曾经与杂合雄性交配的杂合雌性中分离成窝胚胎，测定基因型。在检测的所有胚胎阶段，纯合突变体胚胎以接近预期的频率25％出现。在杂种新生小鼠中，不同基因型也以预期的孟德尔比率出现，1∶2∶1(34+/+(28％)，61+/-(50％)和28-/-(23％))。纯合突变体小鼠活着出生并能够呼吸和喂奶。但所有纯合突变体在出生后第一个24小时内死亡。准确的死亡原因不清楚，但死亡率可能与纯合突变体的肾脏严重的发育不良或完全缺失有关。
纯合突变体动物可以通过其极短或缺失的尾巴而被容易地识别。为进一步鉴定这些纯合突变体动物的尾巴缺陷，检测了它们的骨骼以确定尾椎骨破坏的程度。但是，对胚胎晚期和新生小鼠的野生型和突变体骨骼标本的比较显示，差异不仅存在于动物的尾部区域，而且也存在于许多其它区域。几乎在记录了差异的每一例中，异常看起来表现为脊柱节段一致的变形，其中特定的节段看起来具有更前面节段的形态特征。这些变形在从颈部区域到尾部区域的整个轴向骨骼中是明显的。除轴向骨骼中见到的缺陷以外，骨骼的其余部分，如头盖骨和四肢骨看起来是正常的。
突变体新生动物中的脊柱前变形最容易表现在胸区，那里有显著的胸椎(T)节段数量的增加。所有检测的野生型动物显示典型的13个胸椎，每一个伴有一对肋骨。相反，纯合突变体小鼠显示胸椎数量惊人的增加。所有检测的纯合突变体有另外4至5对肋骨，总共17至18对，尽管在这些动物当中，超过1/3当中，第18肋显示为不发育。因此，正常应当对应于腰椎(L)的L1至L4或L5节段在突变体动物中看起来已经变形为胸椎节段。
此外，胸部区域内的变形也是明显的，其中一个胸椎具有另一个胸椎的形态学特征。例如，在野生型小鼠中，第7对肋骨与胸骨附着，剩下的6对不附着或游离。在纯合突变体中，附着和游离的肋骨对数量分别增加至10-11和7-8。因此，在野生型动物中都有游离肋骨的胸椎节段T8、T9、T10，在某些情况下甚至有T11，在突变体动物中都变形为具有更前面的胸椎的典型特征，即出现肋骨附着到胸骨上。与此发现一致，正常在野生型动物的T10上发现的过渡性棘突和过渡性关节突，在纯合突变体中发现在T13上。在某些突变体动物中还记录了胸部区域内另外的变形。例如，在野生型小鼠中，来自T1的肋骨一般地接触到胸骨的顶端。但是，在检测的2/23杂种和2/3 129/SvJ纯合突变体小鼠中，T2看起来已经变形为具有与T1相似的形态；即，在这些动物中，来自T2的肋骨延长到与胸骨顶端接触。在这些情况下，来自T1的肋骨看起来与第二对肋骨融合。最后，在82％的纯合突变体中，一般出现在T2上的长棘突移到T3位置上。在某些其它纯合突变体中，见到在其它的胸椎水平有脊柱胸骨肋骨对的不对称融合。
前变形不限于胸部区域。我们观察到的前部的最大变形在第6颈椎(C6)水平。在野生型小鼠中，通过腹侧存在的两个前结节可以容易地识别C6。在几个纯合突变体小鼠中，尽管这两个前结节中的一个存在于C6上，但另一个却出现在C7的位置。因此，在这些小鼠中，C7看起来已经部分变形为具有与C6相似的形态。另外一个纯合突变体在C7上有2个前结节，但在C6上保留了一个前结节，成为一个完全的C7到C6变形，但部分的C6到C5变形。
轴向骨骼的变形也延伸到腰部区域。野生型动物一般地仅有6个腰椎，而纯合突变体有8至9个。由于上面描述的数据提示，4至5个腰椎节段变形成胸椎节段，所以在突变体中，至少有6个腰椎一定来自通常由骶椎和尾椎产生的节段。因此，纯合突变体小鼠具有总共33-34个骶前椎骨，相比在野生型小鼠中一般存在26个骶前椎骨。最常见的骶前椎骨类型是，突变体小鼠C7/T18/L8和C7/T18/L9，相比野生型小鼠是C7/T13/L6。由于后肢相对于前肢的位置后移了7至8个节段，因此甚至在没有详细的检查骨骼的情况下，就观察到在突变体动物中存在额外的骶前椎骨。
在纯合突变体小鼠中，尽管骶椎和尾椎也被影响，但每个变形的确切性质不是容易识别的。在野生型小鼠中，尾部节段S1和S2同S3和S4相比，具有典型的宽横突。在突变体中，没有看起来是可识别的S1或S2椎骨。取而代之，突变体动物有几个看起来具有与S3形态相似的椎骨。此外，所有4个骶椎的横突通常相互融合在一起，尽管在新生时经常仅见到前3个椎骨的融合。然而，在纯合突变体中，骶椎的横突通常是不融合的。在最尾的区域，所有突变体动物还有严重的椎骨畸形及广泛的软骨融合。尽管融合的严重性使计数尾部区域椎骨的数量很困难，但在几个动物中数出高达15个横突。不能确定这些是否代表了突变体的骶或尾椎，因为区分S4和尾椎的形态学标准即使在野生型新生动物中也没有建立。不管其身份，此区域椎骨的总数量显著地少于大约30的正常数量。因此，尽管突变体较野生型小鼠有显著多的胸椎和腰椎，但由于尾巴的截短，突变体节段的总数量是减少的。
杂合小鼠在轴向骨骼中也显示异常，尽管其表现型比纯合小鼠更像野生型。杂合小鼠中最明显的异常是存在一个额外的带有一对肋骨的胸椎节段。此变形存在于受检的每一个杂合动物中，且在每一例中额外的肋骨对都附着在胸骨上。因此，T8，其伴随的肋骨一般不与胸骨接触，看起来已变形为更前胸椎的形态学特征，且L1看起来已变形为后胸椎的形态学特征。在杂合小鼠中也见到各种程度的表现出前变形的其它异常。这些包括，T2特征性的长棘突移动一个节段到T3，关节突和棘突从T10移到T11，C6上的前结节移到C7，T2变形到T1，T2伴随的肋骨与胸骨顶端接触。
为理解GDF-11突变体小鼠中见到的轴向型异常的基础，检测了在发育各阶段分离的突变体胚胎，并与野生型胚胎比较。通过大体形态学检查，直到妊娠期第9.5天分离的纯合突变体胚胎不易与相应的野生型胚胎区分。特别地，在任何特定的发育年龄，存在的体节数目在突变体和野生型胚胎间是一样的，提示体节形成的速率在突变体中是没有改变的。在妊娠期后第10.5-11.5天，通过后肢后移7-8体节，可以容易地区分突变体胚胎和野生型胚胎。在此阶段，尾部发育异常也容易显现。合起来看，这些数据提示，在突变体骨骼中观察到的异常代表了节段本身的真正变形，而不是通过例如增加体节生成速率插入额外的节段。
已知含同源异形框的基因表达改变引起果蝇和脊椎动物的变形。为了解Hox基因(脊椎动物含同源异形框的基因)的表达模式在GDF-11零突变体中是否改变，在妊娠期后第12.5天的野生型、杂合子和纯合子突变体胚胎中，通过全样原位杂交，测定了3个代表性Hox基因，Hoxc-6、Hoxc-8和Hoxc-11的表达模式。Hoxc-6的表达模式在野生型胚胎中横跨原脊椎8-15，对应于胸部节段T1-T8。但在纯合突变体中，Hoxc-6表达模式向后迁移并延伸至原脊椎9-18(T2-T11)。用Hoxc-8探针见到相似的迁移。在野生型胚胎中，Hoxc-8在原脊椎13-18(T6-T11)中表达，但在纯合突变体胚胎中，Hoxc-8在原脊椎14-22(T7-T15)中表达。最后，Hoxc-11表达也向后迁移，因为表达的前界从野生型胚胎中的原脊椎28改变到突变体胚胎中的原脊椎36(注意到，由于后肢的位置在突变体胚胎中也向后迁移，Hoxc-11的表达模式在野生型和突变体中相对于后肢看起来是相似的)。这些数据提供了进一步的证据，即突变体动物中见到的骨骼异常代表着相同的改变。
GDF-11小鼠的表现型提示，GDF-11在胚胎形成的早期作为轴向结构的整体调节物起作用。为开始调查GDF-11发挥其作用的机制，通过全样原位杂交在小鼠早期胚胎中检测了GDF-11的表达模式。在这些阶段，GDF-11表达的原始部位与已知的中胚层细胞产生的位置准确地相关。GDF-11的表达首先在妊娠期后第8.25-8.5天(8-10体节)的原条区探测到，这是内移细胞形成发育胚胎的中胚层的部位。在8.75天时，表达保持在原条中，但在妊娠期后第9.5天时，尾芽代替原条成为新的中胚层细胞来源，GDF-11的表达迁移到尾芽。因此，在这些早期阶段，GDF-11看起来在发育中的胚胎区域内合成，在此新的中胚层细胞产生并可能获得其位置的认同。
GDF-11敲除小鼠的表现型在几个方面与TGF-β超家族某些成员的受体，如激活素IIB型受体(Act RIIB)，缺失小鼠的表现型相似。与GDF-11敲除小鼠的情况一样，Act RIIB敲除小鼠具有额外的肋骨对，且肾脏缺陷的范围从肾脏发育不良到完全缺失。这些小鼠表现型的相似性提出了Act RIIB可以是GDF-11受体的可能性。但是，Act RIIB可能不是GDF-11的唯一受体，因为GDF-11敲除小鼠的表现型比ActRIIB小鼠的表现型更严重。例如，尽管GDF-11敲除动物有4-5对额外的肋骨并在整个轴向骨骼上显示相同的变形，但Act RIIB敲除动物仅有3对额外的肋骨且不在其它轴水平显示变形。此外，数据提示，GDF-11敲除小鼠的肾脏缺陷也比Act RIIB敲除小鼠更严重。Act RIIB敲除小鼠在左/右轴形成中显示缺陷，如肺异构和心脏范围的缺陷，这些我们还没有在GDF-11敲除小鼠中观察到。尽管产生的这些配体的敲除小鼠中没有一个显示左/右轴形成的缺陷，但Act RIIB可以结合激活素和某些骨形态发生蛋白(BMP)。
如果GDF-11确实直接作用于中胚层细胞以建立位置认同，那么这里给出的数据将与GDF-11作用的短范围或形态发生素模式一致。即，当中胚层细胞在GDF-11表达的部位产生时，GDF-11可以作用在中胚层前体上以建立Hox基因表达的模式，或可选择地，在胚胎后端产生的GDF-11可以扩散以形成形态发生素梯度。无论GDF-11的作用机制是什么，在GDF-11敲除动物中仍然出现大体的前/后结构图式发育，提示GDF-11可能不是前/后结构特化的唯一调节物。不过，GDF-11作为轴向结构图式发育的整体调节物而发挥重要作用是明确的，对此分子的进一步研究将导致关于脊椎动物胚胎中如何沿前/后轴建立位置认同的重要的新认识。
预期在GDF-8敲除动物中有相似的表现型。例如，当与野生型比较时，预期GDF-8敲除动物有肋骨数目增加、肾脏缺陷和解剖差异。
实施例15表达肌生长抑制素前肽、滤泡素抑制素或负显性ACT RIIB的转基因小鼠的产生肌生长抑制素的纯化 用furin蛋白酶PACE表达构建体(由Monique Davies惠赠)转染携带肌生长抑制素表达载体的扩增拷贝的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以改善前体蛋白的加工。条件介质(由Cell Trends，Middletown，MD制备)连续通过羟磷灰石(用200mM磷酸钠洗提，pH7.2)、lentil植物凝集素sepharose(用50mM pH7.4的Tris、500mM的NaCl、500mM的甲基甘露糖)、DEAE琼脂糖(通过50mMpH7.4的Tris、50mM NaCl的柱收集的物质)和Sepharose肝素(用50mM mM pH7.4的Tris、200mM NaCl洗提)。然后将从肝素柱获得的洗提物与反相C4 HPLC柱结合并用0.1％三氟乙酸中的乙肼洗提。抗成熟C-末端蛋白抗体见前述(见美国专利号5,827,733，在此引入以供参考)。为了升高抗前肽抗体，人肌生长抑制素蛋白全长氨基酸122-261部分使用RSET载体(Invitrogen，San Diego，CA)在细菌中表达，通过镍螯合色镨仪纯化，并给兔注射。通过Spring Valley Labs(Woodbine，MD)进行免疫分析。
受体结合.使用氯胺T方法(Frolik，C.A.，Wakefild，L.M.，Smith，D.M.& Spom，M.B.(1984)J Biol Chem 259，10995-11000)对纯化的肌生长抑制素进行放射性碘示踪。生长在6或12孔板的COS-7细胞用1-2μgpCMV5或pCMV5/受体构建物利用脂胺法(Gibco，Rockville，MD)进行转染。转染后进行2天交叉实验，见(Franzen，P.，ten Dijke，P.，Ichijo，H.，Yamashita，H.，Schultz，P.，Heldin，C.-H.& Miyazono，K.(1993)Cell75，681-692)的描述。对定量受体结合测定，用含有1mg/ml BSA的PBS洗2次细胞单层，在4℃，有或没有多种浓度的未标记肌生长抑制素、前肽或滤泡素抑制素存在下与标记的肌生长抑制素孵育。然后用相同的缓冲液冲洗细胞3次，在0.5N NaOH中溶解，并在γ计数仪中计数。在用Act RIIB转染的细胞和用载体转染的细胞之间结合肌生长抑制素的差异计算特异性结合。计算特异性结合的方法在评价前肽的效果中特别重要，因为加入前肽也降低浓度-依赖方式中的非特异性结合。
转基因小鼠.编码截短形式的小鼠Act RIIB全长氨基酸1-174、小鼠肌生长抑制素前肽全长氨基酸1-267以及人滤泡素抑制素短形式的DNA被克隆进MDAF2载体中，该载体中含有肌球蛋白轻链启动子和1/3的增强子(McPherron，A.C.& Lee，S.-J(1993)J Biol Chem 268，3444-3449)。包含肌球蛋白轻链调节序列和SV40加工区的纯化的转基因用于微注射。所有的微注射和胚胎转染物由Johns Hopkins School ofedicine Transgenic Core Facility进行。杂交体SJL/C57BL/6背景的转基因标记配进野生型C57BL/6小鼠中，使用F1子代进行所有的研究。为了分析肌肉重量，从几乎所有的动物的两侧分离个体肌肉标本，使用左侧和右侧肌肉重量的平均值。根据描述(McPherron，A.C.，Lawler，A.M.& Lee，S.-J.(1997)Nature 387，83-90)分析县委的数目和大小。如所述(McPherron，A.C.& Lee，S.-J.(1993)J Biol Chem 268，3444-3449)进行RNA分离和Northern分析。
为了过多的产生肌生长抑制素蛋白，产生携带扩增的肌生长抑制素表达构建体的CHO细胞系(McPherron，A.C.，Lawler，A.M.& Lee，S.-J.(1997)Nature 387，83-90)。通过在羟磷灰石、Ientil植物凝集素sepharose(用50mM pH7.4的Tris、500mM的NaCl、500mM的甲基甘露糖)、DEAE琼脂糖和Sepharose肝素上连续分离，从该细胞系的条件介质纯化肌生长抑制素。纯化蛋白制备的银染分析显示存在29kd和12.5kd的两种蛋白种类。多种数据表明，该纯化蛋白是由与二硫化物-连接的C-末端二聚体结合的两种前肽分子的非共价复合物组成的。首先，通过Western，29kd和12.5kd的两种蛋白种类与抗体有免疫反应，该抗体分别是抗细菌表达的肌生长抑制素全长前肽和C-末端成熟区片段。其次，在没有还原药剂下，C-末端区域与二聚体一致的电泳移动。第三，两种种类存在的摩尔比大约为1∶1。第四，C-末端二聚体保留在植物凝集素柱上，可以用甲基甘露糖洗脱，即使该蛋白部分没有含有潜在的N-连接糖苷化区域；这些数据的最简要的解释就是，C-末端区域通过与前肽紧密复合物内存在间接与有糖苷化信号的植物凝集素结合。
因为C-末端二聚体已知是其他TGF-β家族成员的活性分子，所以通过反相HPLC将C-末端肌生长抑制素二聚体从其前肽中纯化出来。含有纯化的C-末端二聚体(32-34)部分似乎是同源物。然而，最富含前肽(35-37)的部分被少量的C-末端二聚体和最代表未折叠蛋白的高分子量复合物污染。
TGF-β超家族的大多数成员传递信号是通过结合丝氨酸/苏氨酸激酶受体，然后激活Smad蛋白进行的(Heldin，C.-H.，Miyazono，K.& tenDijke，P.(1997)Nature 390，465-471；Massague，J.，Blain，S.W.& Lo，R.S.(2000)cell 103，295-309)。触发信号通路的初始事件配体与II型受体结合。为了决定肌生长抑制素是否能使任何已知的II型受体与相关配体结合，交叉研究用放射碘示踪用TGF-β、BMP或激活素II型受体的表达构建体转染的COS-7细胞肌生长抑制素C-末端二聚体进行。测定表达Act RIIA或ActRIIB的预定大小(与肌生长抑制素结合的全长受体)的交叉复合物。在交叉和标准受体结合实验中观察到与ActRIIB结合的水平比与Act RIIA结合的水平高，因此受体结合实验集中在ActRIIB进行。肌生长抑制素与ActRIIB的结合是特异的(可以通过过量未标记肌生长抑制素竞争结合)和可饱和的，假设所有的肌生长抑制素蛋白是有生物活性的，我们估计通过Scatchard分析的解离常数是大约10nM。已知在TGF-β情况下，II型受体的亲和力在合适的I型受体存在存在下明显高，并且其他分子参与了将配体提呈给受体。
为了确定激活素II型受体参与了体内肌生长抑制素信号通路，研究了小鼠表达ActRIIB负显性形式的作用。为了这一目的，我们产生了一个构建体，其中，将缺少激酶区的ActRIIB截短形式放入骨骼肌特异的肌动蛋白轻链启动子/增强子的下游。将该构建体前核注入，识别了总共7个转基因的标记阳性动物。这些标记动物在7月时的分析显示，所有的7个动物的骨骼肌重量明显增加，这些标记动物的个体肌肉与来自相同注射的对照非转基因动物相比增重125％(表2)。
三组数据表明，这些标记动物的肌肉重量增加来自转基因的表达。首先，三个标记动物与野生型C57BL/6小鼠交配子代分析(其他4个标记动物没有产生足够用于分析数目的子代)显示与转基因存在相关的肌肉重量的增加(表3)。第二，虽然在不同的转基因系中肌肉重量有不同，增加的程度在任何给定的动物系中高度一致，不管是对所有的肌肉或对雄性或雌性(表3)。例如，来自C5系的雄性和雌性小鼠的所有肌肉比对照动物重大约30-60％，而来自C11小鼠的所有肌肉大约重110-180％。第三，从转基因动物制备的RNA标本的Northern分析显示，转基因的表达局限于骨骼肌，转基因表达的相对水平与肌肉重量增加的相对程度相关(表3)。例如，来自C11系的动物的转基因表达水平最高，C11系的肌肉重量增加最多。
这些数据显示，ActRIIB的负显性形式的表达可以引起肌肉重量的增加，类似于在肌生长抑制素敲除小鼠中观察到的那样。在肌生长抑制素敲除小鼠中，肌肉重量的增加显示可以获得纤维数目和纤维长短的增加。为了确定ActRIIB表达是否还引起增生和肥大，分析了来自C27系的动物的腓肠肌和跖肌切片。对对照肌肉相比，C27动物的肌肉显示总横切面积的明显增加。该面积增加部分是由于纤维数目的增加。在更广意义上，腓肠肌和跖肌在C27系(n＝3)动物共有10015+1143纤维，而对照动物(n＝3)中为7871+364纤维。然而，肌肉纤维肥大也归因于总面积的增加。在C27系动物的平均纤维直径为51μm，对照动物为43μm。因此，肌肉重量的增加似乎是由于纤维数目增加大约27％，纤维直径增加大约19％(假设纤维大致是圆柱形，该直径的增加导致横切面积增加了大约40％)。然而，除了纤维数目和大小的增加，转基因动物的肌肉看起来总体正常。特别是，没有明显的退化指征，如纤维大小广泛改变(对照和转基因动物之间的纤维大小的标准偏差相似)或广泛的纤维变性或脂肪浸润。
这些方法是用来探索其他抑制肌生长抑制素的可能的策略。首先，我们研究了肌生长抑制素前肽的作用。在TGF-β情况下，已知C-末端二聚体是在无活性、潜在的与其他蛋白的复合物中存在的，包括其前肽，TGF-β的前肽可以对TGF-β的体内和体外活性有抑制作用(Miyazono，K.，Hellman，U.，Wemstedt，C.& Heldin，C.-H.(1988)J BiolChem 263，6407-6415；Gentry，L.E.& Nash，B.W.(1990)Biochem.29，6851-6857；B6ttinger，E.P.，FactoV.M.，Tsang，M.L.-S.，Weatherbee，J.A.，Kopp，J.B.，Qian，S.W.，Wakefield，L.M.，Roberts，A.B.，Thorgeirsson，S.S.& Sporn，M.B.(1996)Proc Natl Acad Sci，USA 93，5877-5882)。对肌生长抑制素C-末端二聚体和前肽共纯化的观察增加了肌生长抑制素可以正常在相似的潜在的复合物中存在的可能以及肌生长抑制素前肽可能有抑制活性。第二，我们测定了滤泡素抑制素的作用，其已经显示能结合并抑制多种TGF-β家族。特别是，滤泡素抑制素可以阻断GDF-11的活性，GDF-11与肌生长抑制素高度相关，而且已经显示滤泡素抑制素敲除小鼠在出生时肌肉量减少，这与肌生长抑制素过度活性一致(Gamer，L.，Wolfman，N.，Celeste，A.，Hattersley，G，Hewick，R.&Rosen，V.(1999)Dev BioI 208，222-232；Matzuk，M.M.，Lu，N.，Vogel，H.，Sell.heyer，K.，Roop，D.R.& Bradley，A.(1995)Nature 374，360-363)。
前肽和滤泡素抑制素在体外的作用进行了研究。肌生长抑制素前肽和滤泡素抑制素二者都能阻断C-末端二聚体与Act RIIB的结合。估计滤泡素抑制素的Ki大约是470pM，高于其前肽至少50倍。然而，前肽Ki的计算被认为是代表生物活性前肽在最终制备的所有的蛋白，因此似乎被过度估计了。如上所述，前肽的制备被少量的C-末端二聚体和错误折叠的高分子量物质污染。
为了确定这些分子能否在体内阻断肌生长抑制素活性，产生了转基因小鼠，其中肌动蛋白轻链启动子/增强子被用于驱动肌生长抑制素前肽或滤泡素抑制素的表达。从前肽构建体的前核注射，鉴定了三种显示肌肉增加的转基因小鼠系(其中两个是B32A和B32B，独立代表一个原始标记动物的分离的转基因插入区)。如表3所示，与未转基因对照动物相比，每一系动物的肌肉重量增加了大约20-110％。从每一系的代表性动物制备的RNA标本的Northern分析显示，转基因表达水平与肌肉重量增加的程度相关。特别地，来自B32A系的动物的肌肉量仅增加了大约20-40％，其具有最低的转基因表达，而来自B32B和B53系的动物的肌肉量增加了大约70-110，其具有最高的转基因表达。也许，尽管成倍转基因动物似乎具有更高的转基因表达水平的事实，对B32A和B32B插入区的成倍转基因动物的肌肉重量明显类似于仅有B32B插入区的转基因动物中所观察到的(表3)。这些发现提示，在B32B(和B53系)中看到的效果从过度表达前肽中最大。如在表达负显性形式的Act RIIB表达动物的情况，表达前肽的动物显示肌纤维数目和大小的增加。来自成倍转基因的B32A和B32B插入区的两只动物的腓肠肌和跖肌的分析显示，纤维数目增加了大约40％(这两种动物有11940和10420纤维)，与对照动物相比，纤维直径增加了大约21％(至52μm)。
使用滤泡素抑制素构建体获得了最惊人的骨骼肌效果。两个标记动物(F3和F6)显示增加的肌肉生成(表2)。在这些动物(F3)的一个中，与对照组相比，其肌肉的重量增加了194-327％，来自增生(66％纤维数目增加，在腓肠肌/跖肌中增加至13051)和肥大(纤维直径增加了28％至55μm)。虽然我们没有分析在肌生长抑制素敲除小鼠杂交体SJL/C57BL/6背景的肌肉重量，在F3标记动物上观察的肌肉量的增加明显大于在其他基因背景的肌生长抑制素无效动物中看到的增加。这些结果提示知道部分滤泡素抑制素的功能来自除了肌生长抑制素的其他配体的抑制。明显地，其他滤泡素抑制素转基因系的分析在确定其他配体是否参与肌肉生长的负调节中起了关键作用。
在水解加工以后，肌生长抑制素C-末端二聚体似乎保持在与其前肽或也许其他蛋白的潜在复合物中。肌生长抑制素也能被滤泡素抑制素负调节，滤泡素抑制素与C-末端二聚体结合，抑制了其与受体结合的能力。通过已知的机制从这些抑制蛋白中释放C-末端二聚体使肌生长抑制素与激活素II型受体结合。通过模拟其他家族成员，我们假设这些受体活化，然后导致I型受体和Smad蛋白的激活。
不仅此此处描述的数据，而且其他遗传数据所观察到的总的肌生长抑制素和信号模型都是一致的。如前所述，已经显示滤泡素抑制素敲除小鼠的肌肉量在出生时降低，而这种降低可能排除了未被抑制的肌生长抑制素活性。类似的肌肉表型已经在ski缺乏小鼠被报告，而这种小鼠已经显示能抑制Smad2和3的活性，而名称为过多骨骼肌的相反的表型已经在过度表达ski的小鼠中观察到。基于这些发现，可以假设的是，这些观察到的表型反映了这些小鼠中的高活性和低活性。
虽然体外和基因数据与我们此处展示的总模型是一致的，但是这些数据与参与其他受体和配体模型也是一致的。例如，我们不知道通过截短形式的Act RIIB机制在我们的转基因小鼠中增加了肌肉生长。可能截短的受体对阻断靶细胞的信号起作用，而仅仅是作为衰竭的胞外肌生长抑制素浓度的下降物(sink)。可能其他截短的受体阻断了除了肌生长抑制素以外其他的配体。从这一点来说，已经显示负显性形式的II型激活素受体可以阻断其他属的多种不同的TGF-β相关配体的信号。相似地，我们的数据并不明确显示滤泡素抑制素阻断体内肌生长抑制素活性促进肌肉的生长。从这一点来说，在其中一个滤泡素抑制素表达标记动物中观察到的肌肉生长的矛盾程度提示其他滤泡素抑制素-敏感配体可能参与了肌肉生长的调节。
然而，迄今为止，肌生长抑制素是仅有的显示在体内调节肌肉量中有负作用分泌蛋白。虽然可能需要其他的实验证明该总体模型方面，并鉴定其他信号成分，但是我们的数据显示肌生长抑制素拮抗剂，如滤泡素抑制素和肌生长抑制素前肽或激活素II型受体拮抗剂可能是有效的肌肉增加剂，可以用于人和农业应用。
表2.肌肉量(mg)转基因动物 胸肌 三肉肌 四头肌腓肠肌/跖肌雄性对照(7mo.，n＝10) 100.8±5.4 115.6±5.5 243.8±12.5 168.1±7.6显性失活Act RIIB(7mo.)C5雄性标记 148 155 318 252C11雄性标记 227 250 454 338C33雄性标记 158 176 352 244C42雄性标记 196 212 309 269雌性对照(7mo.，n＝10) 68.9±2.796.9±3.5208.3±7.1140.3±4.3显性失活Act RIIB(7mo.)C5雄性标记 104 163 352 263C5雄性标记 103 139 303 194C5雄性标记 135 117 181 256雄性对照(4mo.，n＝12) 98.3±3.3110.9±2.9 251.7±8.5169.3±4.7滤泡素抑制素(4mo.)F3雄性标记 296 494 736 568
F66雄性标记 169 263 421 409所有的动物(包括对照组)代表来自注射的胚胎的杂交体SJL/C57BL/6F0小鼠。
表3肌肉量(mg)1.雄性

2.雌性

*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。所有的动物(包括对照)代表与野生型C57B1/6小鼠交配的转基因标记(SJL/C57BL/6)的4月龄子代。
尽管本发明根据上面的实施例中已经得到描述，应当理解，修饰和变化都包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅仅被以下的权利要求所限制。
序列表<110>约翰斯霍普金斯大学<120>应用卵泡素抑制素增加肌肉质量<130>JHU1470-2<150>09/485,046<151>2000-01-31<150>PCT/US98/15598<151>1998-07-28<150>60/054,461<151>1997-08-01<160>29<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2743<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(59)...(1183)<400>1aagaaaagta aaaggaagaa acaagaacaa gaaaaaagat tatattgatt ttaaaatc58atg caa aaa ctg caa ctc tgt gtt tat att tac ctg ttt atg ctg att106Met Gln Lys Leu Gln Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile1 5 10 15gtt gct ggt cca gtg gat cta aat gag aac agt gag caa aaa gaa aat154Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn20 25 30gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gca tgt act tgg aga caa aac act202Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45aaa tct tca aga ata gaa gcc att aag ata caa atc ctc agt aaa ctt250Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60cgt ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gtt ata aga caa ctt298Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gln Leu65 70 75 80tta ccc aaa gct cct cca ctc cgg gaa ctg att gat cag tat gat gtc346Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95
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<221>CDS<222>(104)...(1231)<400>3gtctctcgga cggtacatgc actaatattt cacttggcat tactcaaaag caaaaagaag 60aaataagaac aagggaaaaa aaaagattgt gctgattttt aaa atg atg caa aaa115Met Met Gln Lys1ctg caa atg tat gtt tat att tac ctg ttc atg ctg att gct gct ggc163Leu Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile Ala Ala Gly5 10 15 20cca gtg gat cta aat gag ggc agt gag aga gaa gaa aat gtg gaa aaa211Pro Val Asp Leu Asn Glu Gly Ser Glu Arg Glu Glu Asn Val Glu Lys25 30 35gag ggg ctg tgt aat gca tgt gcg tgg aga caa aac acg agg tac tcc259Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn Thr Arg Tyr Ser40 45 50
aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agt aag ctg cgc ctg gaa307Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu55 60 65aca gct cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa ctt ctg cca aga355Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu Leu Pro Arg70 75 80gcg cct cca ctc cgg gaa ctg atc gat cag tac gac gtc cag agg gat403Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val Gln Arg Asp85 90 95 100gac agc agt gat ggc tct ttg gaa gat gac gat tat cac gct acc acg451Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr105 110 115gaa aca atc att acc atg cct aca gag tct gac ttt cta atg caa gcg499Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gln Ala120 125 130gat ggc aag ccc aaa tgt tgc ttt ttt aaa ttt agc tct aaa ata cag547Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gln135 140 145tac aac aaa gta gta aaa gcc caa ctg tgg ata tat ctc aga ccc gtc595Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val150 155 160aag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc atc aaa ccc643Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro165 170 175 180atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg aaa ctt gac691Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu Lys Leu Asp185 190 195atg agc cca ggc act ggt att tgg cag agt att gat gtg aag aca gtg739Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys Thr Val200 205 210ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aac tta ggc att gaa atc787Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly Ile Glu Ile215 220 225aaa gct ttg gat gag aat ggc cat gat ctt gct gta acc ttc cca gga835Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr Phe Pro Gly230 235 240cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gaa gtc aag gtg aca gac883Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys Val Thr Asp245 250 255 260aca ccc aag agg tcc cgg aga gac ttt ggg ctt gac tgc gat gag cac931Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His265 270 275tcc acg gaa tcc cgg tgc tgc cgc tac ccc ctc acg gtc gat ttt gaa979Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu280 285 290
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Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn35 40 45Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65 70 75 80Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp85 90 95Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr100 105 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe115 120 125Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser130 135 140Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145 150 155 160Leu Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg165 170 175Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser180 185 190Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp195 200 205Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu210 215 220Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225 230 235 240Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val245 250 255Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp260 265 270Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr275 280 285Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg290 295 300Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305 310 315 320Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325 330 335Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu340 345 350Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met355 360 365Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375<210>5<211>1131<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1128)<400>5atg att caa aaa ccg caa atg tat gtt tat att tac ctg ttt gtg ctg48Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu1 5 10 15att gct gct ggc cca gtg gat cta aat gag gac agt gag aga gag gcg96
Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala20 25 30aat gtg gaa aaa gag ggg ctg tgt aat gcg tgt gcg tgg aga caa aac144Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn35 40 45aca agg tac tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agt aaa192Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60ctc cgc ctg gaa aca gcg cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa240Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65 70 75 80ctt ctg ccc aga gcg cct cca ctc cgg gaa ctg atc gat cag tac gac288Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp85 90 95gtc cag agg gat gac agc agt gac ggc tct ttg gaa gat gac gat tat336Val Gln Arg Asp Asp Set Ser Asp Gly Set Leu Glu Asp Asp Asp Tyr100 105 110cac gct acc acg gaa aca atc att acc atg cct acc gag tct gac ttt384His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe115 120 125cta atg caa gcg gat gga aag ccc aaa tgt tgc ttt ttt aaa ttt agc432Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser130 135 140tct aaa ata cag tac aac aaa gtg gta aag gcc cag ctg tgg ata tat480Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145 150 155 160ctg aga gcc gtc aag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga528Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg165 170 175ctc atc aaa ccc atg aaa gac ggt aca agg tat acc gga atc cga tct576Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Set180 185 190ctg aaa ctt gac atg agc cca ggc act ggt att tgg cag agt att gat624Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp195 200 205gtg aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aac tta672Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu210 215 220ggc att gaa atc aaa gct ttg gat gag aat ggg cat gat ctt gct gta720Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225 230 235 240acc ttc cca gga cca gga gaa gat ggg ctg aat ccc ttt tta gaa gtc768Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val245 250 255aaa gta aca gac aca ccc aag agg tcc cgg aga gac ttt ggg ctt gac816
Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp260 265 270tgc gat gaa cac tcc acg gaa tcg cgg tgc tgt cgc tac ccc ctc acg864Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr275 280 285gtc gat ttc gaa gcc ttt gga tgg gac tgg att att gca ccc aaa aga912Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg290 295 300tat aag gct aat tac tgc tct gga gag tgt gaa ttt gtg ttc tta caa960Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305 310 315 320aaa tat ccg cat act cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aga ggc tcg1008Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325 330 335gca ggc cct tgc tgc acg cca aca aaa atg tct ccc att aat atg cta1056Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu340 345 350tat ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aaa att cca gcc atg1104Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met355 360 365gta gta gac cgg tgt ggg tgc tcg tga1131Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375<210>6<211>376<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>6Met Ile Gln Lys Pro Gln Met Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Val Leu1 5 10 15Ile Ala Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asp Ser Glu Arg Glu Ala20 25 30Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Ala Trp Arg Gln Asn35 40 45Thr Arg Tyr Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln65 70 75 80Leu Leu Pro Arg Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp85 90 95Val Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr100 105 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe115 120 125Leu Met Gln Ala Asp Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser130 135 140Ser Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr145 150 155 160Leu Arg Ala Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg165 170 175
Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser180 185 190Leu Lys Leu Asp Met Ser Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp195 200 205Val Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu210 215 220Gly Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val225 230 235 240Thr Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val245 250 255Lys Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp260 265 270Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr275 280 285Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg290 295 300Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln305 310 315 320Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser325 330 335Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu340 345 350Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met355 360 365Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375<210>7<211>1128<212>DNA<213>红原鸡(Gallus gallus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1125)<400>7atg caa aag ctg gca gtc tat gtt tat att tac ctg ttc atg cag atc48Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile1 5 10 15gcg gtt gat ccg gtg gct ctg gat ggc agt agt cag ccc aca gag aac96Ala Val Asp Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn20 25 30gct gaa aaa gac gga ctg tgc aat gct tgt acg tgg aga cag aat aca144Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45aaa tcc tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agc aaa ctg192Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60cgc ctg gaa caa gca cct aac att agc agg gac gtt att aag cag ctt240Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu65 70 75 80tta ccc aaa gct cct cca ctg cag gaa ctg att gat cag tat gat gtc288Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95
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<221>CDS<222>(1)...(1125)<400>15atg caa aaa ctg caa atc ttt gtt tat att tac cta ttt atg ctg ctt48Met Gln Lys Leu Gln Ile Phe Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Leu1 5 10 15gtt gct ggc cca gtg gat ctg aat gag aac agc gag cag aag gaa aat96Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn20 25 30gtg gaa aaa aag ggg ctg tgt aat gca tgc ttg tgg aga caa aac aat144Val Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gln Asn Asn35 40 45aaa tcc tca aga cta gaa gcc ata aaa atc caa atc ctc agt aag ctt192Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60cgc ctg gaa aca gct cct aac atc agc aaa gat gct ata aga caa ctt240Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu65 70 75 80ttg ccc aag gct cct cca ctc cgg gaa ctg att gat cag tac gat gtc288Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95cag aga gat gac agc agc gac ggc tcc ttg gaa gac gat gac tac cac336Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110gtt acg acg gaa acg gtc att acc atg ccc acg gag tct gat ctt cta384Val Thr Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu115 120 125gca gaa gtg caa gaa aaa ccc aaa tgt tgc ttc ttt aaa ttt agc tct432Ala Glu Val Gln Glu Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140
aag ata caa cac aat aaa gta gta aag gcc caa ctg tgg ata tat ctg480Lys Ile Gln His Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160aga cct gtc aag act cct aca aca gtg ttt gtg caa atc ctg aga ctc528Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175atc aaa ccc atg aaa gac ggt aca agg tat act gga atc cga tct ctg576Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt att tgg cag agc att gat gtg624Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205aag aca gtg ttg caa aac tgg ctc aaa caa cct gaa tcc aac tta ggc672Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220att gaa atc aaa gct tta gat gag aat ggt cat gat ctt gct gta acc720Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240ttc cca gaa cca gga gaa gaa gga ctg aat cct ttt tta gaa gtc aag768Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys245 250 255gta aca gac aca cca aaa aga tct agg aga gat ttt ggg ctt gat tgt816Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270gat gag cac tcc aca gaa tct cga tgc tgt cgt tac cct cta act gtg864Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285gat ttt gaa gct ttt gga tgg gat tgg att att gca cct aaa aga tat912Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300aag gcc aat tac tgc tct gga gaa tgt gaa ttt tta ttt ttg caa aag960Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gln Lys305 310 315 320tat cct cat acc cat ctt gtg cac caa gca aac ccc aaa ggt tca gcc1008Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala325 330 335ggc cct tgc tgt act cct aca aag atg tct cca att aat atg cta tat1056Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg aag att cca ggc atg gta1104Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val355 360 365gta gat cgc tgt ggg tgc tca tga1128Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375
<210>16<211>375<212>PRT<213>羊<400>16Met Gln Lys Leu Gln Ile Phe Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Leu1 5 10 15Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gln Lys Glu Asn20 25 30Val Glu Lys Lys Gly Leu Cys Asn Ala Cys Leu Trp Arg Gln Asn Asn35 40 45Lys Ser Ser Arg Leu Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Ala Ile Arg Gln Leu65 70 75 80Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Arg Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110Val Thr Thr Glu Thr Val Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Leu Leu115 120 125Ala Glu Val Gln Glu Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140Lys Ile Gln His Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160Arg Pro Val Lys Thr Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220Ile Glu Ile Lys Ala Leu Asp Glu Asn Gly His Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240Phe Pro Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Lys245 250 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Leu Phe Leu Gln Lys305 310 315 320TyT Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Lys Gly Ser Ala325 330 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val355 360 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375<210>17<211>1128<212>DNA
<213>火鸡(Meleagris Gallopavo)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1125)<400>17atg caa aag cta gca gtc tat gtt tat att tac ctg ttc atg cag att48Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile1 5 10 15tta gtt cat ccg gtg gct ctt gat ggc agt agt cag ccc aca gag aac96Leu Val His Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn20 25 30gct gaa aaa gac gga ctg tgc aat gct tgc acg tgg aga cag aat act144Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45aaa tcc tcc aga ata gaa gcc ata aaa att caa atc ctc agc aaa ctg192Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60cgc ctg gaa caa gca cct aac att agc agg gac gtt att aaa caa ctt240Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu65 70 75 80tta ccc aaa gct cct ccg ctg cag gaa ctg att gat cag tat gac gtc288Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95cag aga gac gac agt agc gat ggc tct ttg gaa gac gat gac tat cat336Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110gcc aca acc gaa acg att atc aca atg cct acg gag tct gat ttt ctt384Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu115 120 125gta caa atg gag gga aaa cca aaa tgt tgc ttc ttt aag ttt agc tct432Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140aaa ata caa tat aac aaa gta gta aag gca caa tta tgg ata tac ttg480Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160agg caa gtc caa aaa cct aca acg gtg ttt gtg cag atc ctg aga ctc528Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175att aaa ccc atg aaa gac ggt aca aga tat act gga att cga tct ttg576Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190aaa ctt gac atg aac cca ggc act ggt atc tgg cag agt att gat gtg624Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205aag aca gtg ttg caa aat tgg ctc aaa cag cct gaa tcc aat tta ggc672
Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220atc gaa ata aaa gct ttt gat gag aat gga cga gat ctt gct gta aca720Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240ttc cca gga cca ggt gaa gat gga ctg aac cca ttt tta gag gtc aga768Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg245 250 255gtt aca gac aca cca aaa cgg tcc cgc aga gat ttt ggc ctt gac tgc816Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270gac gag cac tca acg gaa tct cga tgt tgt cgc tac ccg ctg aca gtg864Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285gat ttt gaa gct ttt gga tgg gac tgg att ata gca cct aaa aga tac912Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300aaa gcc aat tac tgc tct gga gaa tgt gaa ttc gta ttt cta cag aaa960Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320tac ccg cac act cac ctg gta cac caa gca aat cca aga ggc tca gca1008Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335ggc cct tgc tgc aca ccc acc aag atg tcc cct ata aac atg ctg tat1056Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350ttc aat gga aaa gaa caa ata ata tat gga aag ata cca gcc atg gtt1104Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val355 360 365gta gat cgt tgc ggg tgc tca tga1128Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375<210>18<211>375<212>PRT<213>火鸡(Meleagris Gallopavo)<400>18Met Gln Lys Leu Ala Val Tyr Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Gln Ile1 5 10 15Leu Val His Pro Val Ala Leu Asp Gly Ser Ser Gln Pro Thr Glu Asn20 25 30Ala Glu Lys Asp Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gln Asn Thr35 40 45Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gln Ile Leu Ser Lys Leu50 55 60Arg Leu Glu Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Ile Lys Gln Leu65 70 75 80
Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Glu Leu Ile Asp Gln Tyr Asp Val85 90 95Gln Arg Asp Asp Ser Ser Asp Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His100 105 110Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu115 120 125Val Gln Met Glu Gly Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser130 135 140Lys Ile Gln Tyr Asn Lys Val Val Lys Ala Gln Leu Trp Ile Tyr Leu145 150 155 160Arg Gln Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Phe Val Gln Ile Leu Arg Leu165 170 175Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly Thr Arg Tyr Thr Gly Ile Arg Ser Leu180 185 190Lys Leu Asp Met Asn Pro Gly Thr Gly Ile Trp Gln Ser Ile Asp Val195 200 205Lys Thr Val Leu Gln Asn Trp Leu Lys Gln Pro Glu Ser Asn Leu Gly210 215 220Ile Glu Ile Lys Ala Phe Asp Glu Asn Gly Arg Asp Leu Ala Val Thr225 230 235 240Phe Pro Gly Pro Gly Glu Asp Gly Leu Asn Pro Phe Leu Glu Val Arg245 250 255Val Thr Asp Thr Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Phe Gly Leu Asp Cys260 265 270Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val275 280 285Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr290 295 300Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys305 310 315 320Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala325 330 335Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr340 345 350Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val355 360 365Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser370 375<210>19<211>1125<212>DNA<213>斑马鱼(Danio rerio)<220>
<221>CDS<222>(1)…(1122)<400>19atg cat ttt aca cag gtt tta att tct cta agt gta tta att gca tgt48Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys1 5 10 15ggt cca gtg ggt tat gga gat ata acg gcg cac cag cag cct tcc aca96Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr20 25 30gcc acg gag gaa agc gag ctg tgt tcc aca tgt gag ttc aga caa cac144Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His35 40 45
agc aag ctg atg aga ctg cat gcc atc aag tcc caa att ctt agc aaa192Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60ctc cga ctc aag cag gct cca aac atc agc cgg gac gtg gtc aag cag240Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln65 70 75 80ctg tta ccc aaa gca ccg cct ttg caa caa ctt ctg gat cag tac gat288Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp85 90 95gtt tta gga gat gac agt aag gat gga gct gtg gaa gag gac gat gaa336Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu100 105 110cat gcc acc aca gag acc atc atg acc atg gcc aca gaa cct gac ccc384His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro115 120 125att gtt caa gta gat cgg aaa ccg aag tgt tgc ttt ttc tcc ttc agt432Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser130 135 140ccg aag atc caa gcg aac cgg atc gta aga gcg cag ctc tgg gtt cat480Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His145 150 155 160ctg aga ccg gcg gag gag gcg acc acc gtc ttc tta cag ata tct cgg528Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg165 170 175ctg atg ccc gtt aag gac gga gga aga cac cga ata cga tcc ctg aaa576Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys180 185 190atc gac gtg aac gca gga gtc acg tct tgg cag agt ata gac gta aag624Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys195 200 205cag gtg ctc acg gtg tgg tta aaa caa ccg gag acc aac cga ggc atc672Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile210 215 220gag att aac gca tat gac gcg aag gga aac gac ttg gcc gtc act tca720Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser225 230 235 240acc gag act ggg gag gat gga ctg ctc ccc ttt atg gag gtg aaa ata768Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile245 250 255tca gag ggc cca aaa cga atc cgg agg gac tcc gga ctg gac tgc gat816Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp260 265 270gag aat tcc tca gag tct cgc tgc tgc agg tac cct ctc act gtg gac864Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp275 280 285
ttc gag gac ttt ggc tgg gac tgg att att gct cca aaa cgc tat aag912Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys290 295 300gcg aat tac tgt tca gga gaa tgc gac tac atg tac ctg cag aag tat960Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr305 310 315 320ccc cac acc cat ctg gtg aac aag gcc agt ccg aga gga acg gct ggg1008Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly325 330 335ccc tgc tgc act ccc acc aag atg tct ccc atc aac atg ctt tac ttt1056Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe340 345 350aac ggc aaa gag cag atc atc tac ggc aag atc cct tcg atg gta gta1104Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val355 360 365gac cgc tgt ggc tgc tca tga1125Asp Arg Cys Gly Cys Ser370<210>20<211>374<212>PRT<213>斑马鱼(Danio rerio)<400>20Met His Phe Thr Gln Val Leu Ile Ser Leu Ser Val Leu Ile Ala Cys1 5 10 15Gly Pro Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Ala His Gln Gln Pro Ser Thr20 25 30Ala Thr Glu Glu Ser Glu Leu Cys Ser Thr Cys Glu Phe Arg Gln His35 40 45Ser Lys Leu Met Arg Leu His Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys50 55 60Leu Arg Leu Lys Gln Ala Pro Asn Ile Ser Arg Asp Val Val Lys Gln65 70 75 80Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp85 90 95Val Leu Gly Asp Asp Ser Lys Asp Gly Ala Val Glu Glu Asp Asp Glu100 105 110His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Met Thr Met Ala Thr Glu Pro Asp Pro115120 125Ile Val Gln Val Asp Arg Lys Pro Lys Cys Cys Phe Phe Ser Phe Ser130 135 140Pro Lys Ile Gln Ala Asn Arg Ile Val Arg Ala Gln Leu Trp Val His145 150 155 160Leu Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile Ser Arg165 170 175Leu Met Pro Val Lys Asp Gly Gly Arg His Arg Ile Arg Ser Leu Lys180 185 190Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Thr Ser Trp Gln Ser Ile Asp Val Lys195 200 205Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Lys Gln Pro Glu Thr Asn Arg Gly Ile210 215 220
Glu Ile Asn Ala Tyr Asp Ala Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser225 230 235 240Thr Glu Thr Gly Glu Asp Gly Leu Leu Pro Phe Met Glu Val Lys Ile245 250 255Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ile Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp260 265 270Glu Asn Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp275 280 285Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys290 295 300Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Asp Tyr Met Tyr Leu Gln Lys Tyr305 310 315 320Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Ser Pro Arg Gly Thr Ala Gly325 330 335Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe340 345 350Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val355 360 365Asp Arg Cys Gly Cys Ser370<210>21<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>蛋白质水解反应裂解位点<221>VARIANT<222>(0)...(0)<223>Xaa＝任意氨基酸<400>21Arg Xaa Xaa Arg1<210>22<211>4<212>PRT<213>真核细胞<220>
<221>SITE<222>(0)...(0)<223>蛋白质水解应加工位点<400>22Arg Ser Arg Arg1<210>23<211>4<212>PRT<213>真核细胞<220>
<221>SITE<222>(0)...(0)<223>蛋白质水解反应加工位点
<400>23Arg Ile Arg Arg1<210>24<211>1393<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(54)...(1274)<223>GDF-11<400>24ccgcgggact ccggcgtccc cgccccccag tcctccctcc cctcccctcc agc atg 56Met1gtg ctc gcg gcc ccg ctg ctg ctg ggc ttc ctg ctc ctc gcc ctg gag104Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu Glu5 10 15ctg cgg ccc cgg ggg gag gcg gcc gag ggc ccc gcg gcg gcg gcg gcg152Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala20 25 30gcg gcg gcg gcg gcg gca gcg gcg ggg gtc ggg ggg gag cgc tcc agc200Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser Ser35 40 45cgg cca gcc ccg tcc gtg gcg ccc gag ccg gac ggc tgc ccc gtg tgc248Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val Cys50 55 60 65gtt tgg cgg cag cac agc cgc gag ctg cgc cta gag agc atc aag tcg296Val Trp Arg Gln His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys Ser70 75 80cag atc ttg agc aaa ctg cgg ctc aag gag gcg ccc aac atc agc cgc344Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser Arg85 90 95gag gtg gtg aag cag ctg ctg ccc aag gcg ccg ccg ctg cag cag atc392Glu Val Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gln Gln Ile100 105 110ctg gac cta cac gac ttc cag ggc gac gcg ctg cag ccc gag gac ttc440Leu Asp Leu His Asp Phe Gln Gly Asp Ala Leu Gln Pro Glu Asp Phe115 120 125ctg gag gag gac gag tac cac gcc acc acc gag acc gtc att agc atg488Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser Met130 135 140 145gcc cag gag acg gac cca gca gta cag aca gat ggc agc cct ctc tgc536Ala Gln Glu Thr Asp Pro Ala Val Gln Thr Asp Gly Ser Pro Leu Cys150 155 160
tgc cat ttt cac ttc agc ccc aag gtg atg ttc aca aag gta ctg aag584Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu Lys165 170 175gcc cag ctg tgg gtg tac cta cgg cct gta ccc cgc cca gcc aca gtc632Ala Gln Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr Val180 185 190tac ctg cag atc ttg cga cta aaa ccc cta act ggg gaa ggg acc gca680Tyr Leu Gln Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr Ala195 200 205ggg gga ggg ggc gga ggc cgg cgt cac atc cgt atc cgc tca ctg aag728Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu Lys210 215 220 225att gag ctg cac tca cgc tca ggc cat tgg cag agc atc gac ttc aag776Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gln Ser Ile Asp Phe Lys230 235 240caa gtg cta cac agc tgg ttc cgc cag cca cag agc aac tgg ggc atc824Gln Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gln Pro Gln Ser Asn Trp Gly Ile245 250 255gag atc aac gcc ttt gat ccc agt ggc aca gac ctg gct gtc acc tcc872Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr Ser260 265 270ctg ggg ccg gga gcc gag ggg ctg cat cca ttc atg gag ctt cga gtc920Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg Val275 280 285cta gag aac aca aaa cgt tcc cgg cgg aac ctg ggt ctg gac tgc gac968Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp290 295 300 305gag cac tca agc gag tcc cgc tgc tgc cga tat ccc ctc aca gtg gac1016Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp310 315 320ttt gag gct ttc ggc tgg gac tgg atc atc gca cct aag cgc tac aag1064Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys325 330 335gcc aac tac tgc tcc ggc cag tgc gag tac atg ttc atg caa aaa tat1112Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr340 345 350ccg cat acc cat ttg gtg cag cag gcc aat cca aga ggc tct gct ggg1160Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly355 360 365ccc tgt tgt acc ccc acc aag atg tcc cca atc aac atg ctc tac ttc1208Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe370 375 380 385aat gac aag cag cag att atc tac ggc aag atc cct ggc atg gtg gtg1256Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met val val390 395 400
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370 375380Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val385 390 395 400Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser405<210>26<211>476<212>DNA<213>鲑鱼-1<220>
<221>CDS<222>(3)...(473)<400>26gg cag ccg gag acg aat tgg ggg atc gag att aat gcg ttc gac tcg 47Gln Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser1 5 10 15aag gga aat gat ctg gcc gtt acc tca gca gaa gcg gga gaa gga ctg95Lys Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser Ala Glu Ala Gly Glu Gly Leu20 25 30caa ccc ttc atg gag gtg acg att tca gag ggc ccg aag cgc tcc agg143Gln Pro Phe Met Glu Val Thr Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg35 40 45aga gac tcg ggc ctg gac tgt gac gag aac tcc ccc gag tcc cgc tgt191Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys50 55 60tgc cgc tac ccc ctc acg gta gac ttt gaa gac ttt ggc tgg gac tgg239Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp65 70 75att att gcc ccc aag cgc tac aag gcc aac tac tgc tct ggt gag tgt287Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys80 85 90 95gag tac atg cac ctg cag aag tac ccc cac acc cac ctg gtg aac aag335Glu Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys100 105 110gct aac cct cgc ggc acc gca ggg ccc tgc tgc acc ccc acc aag atg383Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met115 120 125tcc ccc atc aac atg ctc tac ttc aac cgc aaa gag cag atc atc tac431Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr130 135 140ggc aag atc ccc tcc atg gtg gtg gac cgt tgc gga tgc tcg473Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser145 150 155tga476<210>27<211>157
<212>PRT<213>鲑鱼-1<400>27Gln Pro Glu Thr Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser Lys1 5 10 15Gly Asn Asp Leu Ala Val Thr Ser Ala Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln20 25 30Pro Phe Met Glu Val Thr Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg35 40 45Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys50 55 60Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile65 70 75 80Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu85 90 95Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala100 105 110Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser115 120 125Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly130 135 140Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser145 150 155<210>28<211>412<212>DNA<213>鲑鱼-2<220>
<221>CDS<222>(2)...(409)<400>28g gtt acc tca act gaa gcc gga gaa gga ctg caa ccc ttc atg gag gtg 49Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln Pro Phe Met Glu Val1 5 10 15aag att tcg gag ggc ccg aag cgc tcc agg aga gat tcg ggc ctg gac97Lys Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp20 25 30tgt gat gag aac tcc ccc gag tcc cgc tgc tgc cgg tac ccc ctc acg145Cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr35 40 45gtg gac ttt gaa gac ttt ggc tgg gac tgg att att gcc ccc aag cgc193Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg50 55 60tac aag gcc aac tac tgc tct ggt gag tgc gag tac atg cac ctg cag241Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln65 70 75 80aag tac ccc cac acc cac ctg gtg aac aag gct aac cct cgc ggc acc289Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr85 90 95gcg ggg ccc tgc tgc acc ccc acc aag atg tcc ccc atc aac atg ctc337
Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu100 105 110tac ttc aac cgc aaa gag cag atc atc tac ggc aag atc ccc tcc atg385Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met115 120 125gtg gtg gac cgc tgc ggc tgc tcg tga12Val Val Asp Arg cys Gly Cys Ser130 135<210>29<211>136<212>PRT<213>鲑鱼-2<400>29Val Thr Ser Thr Glu Ala Gly Glu Gly Leu Gln Pro Phe Met Glu Val1 5 10 15Lys Ile Ser Glu Gly Pro Lys Arg Ser Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp20 25 30cys Asp Glu Asn Ser Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr35 40 45Val Asp Phe Glu Asp Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg50 55 60Tyr Lys Ala Asu Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln65 70 75 80Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr85 90 95Ala Gly Pro cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu100 105 110Tyr Phe Asn Arg Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met115 120 125Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser130 1权利要求
1.一种转基因非人类动物，其基因组含有一段包含截短的激活素II型受体基因和可操作连接至并整合进动物基因组的肌肉特异启动子的序列，其中所述的核酸序列的表达使得与相应的非转基因动物相比，转基因动物中截短的激活素II型受体水平升高，肌肉量增加。
2.根据权利要求1所述的转基因动物，其中所述的肌肉特异启动子是肌动蛋白轻链启动子/增强子。
3.根据权利要求1所述的转基因动物，其中所述的激活素II型受体是RIIA或RIIB。
4.根据权利要求3所述的转基因动物，其中所述的截短的激活素RIIB受体缺乏激酶活性。
5.根据权利要求1所述的转基因动物，其中所述的截短的激活素RIIB受体含有激活素RIIB的氨基酸残基1-174。
6.一种非人类转基因动物，其基因组含有一段包含肌生长抑制素前区和可操作连接至并整合进动物的基因组的肌肉特异启动子的核酸序列，其中所述的核酸序列的表达使得与相应的非转基因动物相比，转基因动物中肌生长抑制素前区水平升高，肌肉量增加。
7.根据权利要求6所述的转基因动物，其中所述的肌生长抑制素前区含有选自SEQ ID NOS2、4、6、8、10、12、14、16、18和20的前肌生长抑制素多肽的大约1-262氨基酸残基。
8.根据权利要求6所述的转基因动物，其中所述的肌生长抑制素前区包含选自以下的氨基酸序列如SEQ ID NO4列出的大约20-263氨基酸残基；如SEQ ID NO2列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO10列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO12列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO8列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO6列出的大约20-263氨基酸残基；如SEQ ID NO18列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO14列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO16列出的大约20-262氨基酸残基；如SEQ ID NO20列出的大约20-262氨基酸残基；及其功能肽部分。
9.根据权利要求6所述的转基因动物，其中所述的肌生长抑制素前区进一步包括肌生长抑制素信号肽。
10.根据权利要求6所述的转基因动物，其中所述的肌肉特异启动子是肌动蛋白轻链启动子/增强子。
11.一种非人类转基因动物，其基因组含有一段包含滤泡素抑制素基因和可操作连接至并整合进动物的基因组的肌肉特异启动子的核酸序列，其中所述的核酸序列的表达使得与相应的非转基因动物相比，转基因动物中滤泡素抑制素水平升高，肌肉量增加。
12.根据权利要求11所述的转基因动物，其中所述的肌肉特异启动子是肌动蛋白轻链启动子/增强子。
13.一种表达盒，其包括编码可操作连接至肌肉特异控制序列的截短的激活素RIIB受体基因的DNA片段。
14.根据权利要求13所述的表达盒，其中所述的肌肉特异启动子是肌动蛋白轻链启动子/增强子。
15.一种表达盒，其包括编码可操作连接至肌肉特异控制序列的肌生长抑制素前区基因的DNA片段。
16.根据权利要求15所述的表达盒，其中所述的肌肉特异启动子是肌动蛋白轻链启动子/增强子。
17.一种表达盒，其包括编码可操作连接至肌肉特异控制序列的滤泡素抑制素基因的DNA片段。
18.根据权利要求17所述的表达盒，其中所述的肌肉特异启动子是肌动蛋白轻链启动子/增强子。
19.一种使滤泡素抑制素在转基因动物中组织特异表达的方法，包括在转基因动物的细胞中表达如权利要求17所述的表达盒，其中所述的表达盒被整合进动物的基因组，其中所述的盒的表达使得与相应的非转基因动物相比，在转基因动物中的滤泡素抑制素水平升高，因此导致其肌肉量增加。
20.一种从权利要求1、6或11中的任一项所述的动物中分离的细胞或细胞系，其中所述的细胞分别表达截短的激活素II型受体、肌生长抑制素前区或滤泡素抑制素。
21.一种抑制肌生长抑制素与激活素II型受体结合的方法，包括将肌生长抑制素与滤泡素抑制素接触，因此抑制与所述受体的结合。
22.根据权利要求21所述的方法，其中抑制结合是通过肌生长抑制素的C-末端实现的。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述的激活素受体是Act RIIA或Act RIIB。
24.一种非人类转基因动物，其基因组包含含有能在肌细胞中表达的编码滤泡素抑制素蛋白的可操作连接至与内源性滤泡素抑制素基因异源的启动子上的DNA片段的DNA构建体，其中所述的DNA构建体在肌细胞中的表达导致所述的动物的肌肉量增加。
25.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的DNA构建体已经被引入所述动物的祖细胞中。
26.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的DNA构建体是在胚胎期被引入所述的动物或所述的动物的祖细胞中。
27.根据权利要求24所述的非人类动物，其中与野生型相比，所述的滤泡素抑制素蛋白是截短的、突变的或滤泡素抑制素蛋白的其他变体形式。
28.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的构建体是在含有编码滤泡素抑制素蛋白的所述的DNA片段的MDAF2表达质粒中。
29.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的动物是哺乳动物。
30.根据权利要求29所述的非人类动物，其中所述的哺乳动物是小鼠。
31.根据权利要求29所述的非人类动物，其中所述的哺乳动物是猪。
32.根据权利要求29所述的非人类动物，其中所述的哺乳动物是牛。
33.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的动物是鸟类。
34.根据权利要求33所述的非人类动物，其中所述的鸟类是鸡或火鸡。
35.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的动物是水生动物。
36.根据权利要求35所述的非人类动物，其中所述的水生动物是有鳍的水族。
37.根据权利要求36所述的非人类动物，其中所述的有鳍水族是鲑鱼、鳟鱼、红点鲑、香鱼、鲤鱼、鲫鱼、金鱼、昏白鱼、银鱼、鳝鱼、海鳗、沙丁鱼、斑马鱼、飞鱼、巴西刺鲈、鲷、鹦鹉鲈鱼、新西兰真鲷、鲭、白腹鲭、鲔鱼、金枪鱼、鲣鱼、鲱鱼、岩鱼、平鱼(fluke)、鳎鱼、比目鱼、河豚或鲀鱼。
38.根据权利要求35所述的非人类动物，其中所述的水生动物是蛤、乌蛤、蛤贝、海螺；扇贝、海螺、蜗牛、海参、赤贝、牡蛎、螺旋贝、鲍鱼、龙虾、对虾、河虾、蟹、虾蛄、磷虾、河蝥虾(langostinos)、小龙虾/龙虾、环节动物门动物、美洲鳄鱼、龟、蛙或海胆。
39.根据权利要求24所述的非人类动物，其中所述的动物是羊。
40.一种产生嵌合非人类动物的方法，所述方法包括从动物卵巢获得卵子；体外成熟卵子；体外受精成熟的卵子以形成合子；在合子内，体外引入一含有可操作连接的编码截短的激活素II型受体、肌生长抑制素前肽或滤泡素抑制素的DNA序列，和促进编码多肽的DNA序列表达的调节序列的核酸构建体；体外成熟合子成为移植前期的胚胎；和将胚胎移植入受体雌性动物中，其中所述的雌性动物妊娠胚胎以产生嵌合动物。
41.一种产生具有增加的肌肉量的动物食物产品的方法，包括a)将编码滤泡素抑制素、肌生长抑制素前肽或截短的激活素II型受体的转基因引入动物前核胚胎的生殖细胞中；b)将胚胎植入假孕雌性的输卵管中，因此使胚胎成熟成怀孕足月子代；c)测试子代存在转基因以鉴别转基因阳性子代；d)杂交转基因阳性子代以获得进一步的阳性子代；和e)加工子代以获得食品。
42.一种产生具有增加的肌肉量的鸟、猪、鱼、或牛类食品的方法，包括a)将编码滤泡素抑制素、肌生长抑制素前肽或截短的激活素II型受体的转基因引入鸟、猪、鱼、或牛的动物的胚胎中；b)在孵育子代的条件下培养胚胎；c)测试子代存在转基因以鉴别转基因阳性子代；d)杂交转基因阳性子代；和e)加工子代以获得食品。
全文摘要
本发明提供了一种基本上纯化的生长分化因子(GDF)受体，包括GDF－8(肌生长抑制素(myostatin))受体，以及其功能性肽部分。另外，本发明提供了GDF受体或其功能性肽部分的一种虚拟表现(virtual representation)形式。本发明还提供了一种通过将细胞与影响肌生长抑制素在细胞中信号转导的药剂接触调节肌生长抑制素细胞效应的方法。另外，本发明提供了一种通过在受者肌肉细胞或脂肪组织细胞中调节肌生长抑制素信号转导改善严重病理状况的方法，该病理状况至少部分地以受者肌肉或脂肪组织中异常的量、发育或代谢活性为特征。本发明也提供了一种在真核细胞生物体中，通过给生物体使用一种影响肌生长抑制素信号转导的药剂，调节肌肉组织或脂肪组织生长的方法。
文档编号C12N15/85GK1520256SQ02812610
公开日2004年8月11日 申请日期2002年4月24日 优先权日2001年4月24日
发明者李瑟瑾, A·C·麦克弗伦, 麦克弗伦 申请人:约翰斯·霍普金斯大学, 约翰斯 霍普金斯大学