新的内切葡聚糖酶的制作方法

文档序号:2467141阅读:235来源:国知局
专利名称:新的内切葡聚糖酶的制作方法
新的内切葡聚糖酶本申请是申请日为1996年3月18日、申请号为96193494. 8、发明名称为“新的内 切葡聚糖酶”的发明专利申请的分案申请。本发明涉及新的酶制剂,该酶制剂包含显示内切葡聚糖酶活性的酶,其在工业应 用(如洗衣组合物、生物抛光(biopolishing)新制造的织物、提供纤维素织物或衣物磨损 的外观和处理纸浆)中性能良好。此外,本发明涉及编码这种酶的DNA构建体、提供编码这 种酶的基因的方法、产生所述酶的方法、包含这种酶的酶制剂以及这些酶在许多工业应用 中的用途。
背景技术
纤维素酶或溶纤酶是涉及纤维素水解的酶。在天然纤维素的水解中,已知涉 及三种主要类型的纤维素酶,即纤维二糖水解酶(1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶EC 3.2. 1.91)、内切-β-l,4-葡聚糖酶(内切l,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶EC 3.2. 1.4) 和β-葡萄糖苷酶(EC 3.2. 1.21)。纤维素酶由大量微生物(包括真菌,放线菌,粘细菌和真细菌)合成,也由植物合 成。已鉴别了各种特异性的特定的内切葡聚糖酶。溶纤酶的一种十分重要的工业用途是用来处理纤维素织物原料或织物,例如作为 洗涤剂组合物或织物软化剂组合物中的组分、用于生物-抛光新织物(衣物修饰)和用于 获得含纤维素织物(尤其斜纹粗棉布)的"石洗(stone-washing)"外观。在例如下列 文献中提出了几种这样的处理方法GB-A-1368599,EP-A-O 307564和EP-A-O 435876, WO 91/172431W0 91/10732,WO 91/17244,PCT/DK95/000108 和 PCT/DK95/00132。溶纤酶的另一个重要的工业用途是用于纸浆处理,例如为了改善导液(drainage) 或使再利用纸脱墨。尤其是,对所论及的工业用途而言,内切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)构成了有意义的 一组水解酶。内切葡聚糖酶催化下列键的内切水解纤维素、纤维素衍生物(如羧基甲基纤 维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-配糖键;混合的β_1,3葡聚糖(如谷类 β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖)和其它含纤维素部分的植物材料中的β_1,4键。公认的名 称是内切-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖基(glucano)水解酶,本发明中使用缩写术语内切 葡聚糖酶(endoglucanase)。可以参见T. _M. Enveri,"微生物纤维素酶"W. M. Fogarty, 微生物酶和生物技术,应用科学出版社,P. 183-224(1983);酶学方法,(1988)Vol. 160, p. 200-391 (Wood,W. Α.和 Kellogg, S. Τ.编);Beguin,P.,“纤维素降解的分子生物学,微 生物学年评(1990),Vol. 44,pp. 219-248 ;Beguin, P.和 Aubert, J-P.,“纤维素的生物降 解〃,FEMS微生物学回顾13(1994)p. 25-58 ;Henrissat, B.,“纤维素酶和它们与纤维素 的相互作用〃,纤维素(1994),Vol. 1,ρρ· 169-196。许多出版物中已描述了真菌内切葡聚糖酶,特别是来源于例如尖镰孢、 Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, $$ 包 曲 _, Neocallimastix patriciarum和例如Piromyces、腐质霉属,毁丝霉属,Geotricum,青霉属,耙菌属,鬼伞属 的种的那些内切葡聚糖酶。
例如,真菌内切葡聚糖酶已由下列文献描述Skppard P.O.,等,用保守纤维 素酶家族-特异性的序列从尖镰孢克隆纤维素酶同系物cDNA,基因,(1994),vol. 15, pp. 163-167 ;Saloheimo, Α.,等,“在酵母中表达的Trichoderma reesei的新小内切葡聚 糖酶基因 egI5〃,分子微生物学,(1994) vol. 13 (2), pp. 219-228 ;van Arsdel 1, J.N.等, (1987),Trichoderma reesei在啤酒糖酵母内切葡聚糖酶I的克隆,特征确定和表达,生 物 / 技术 5 :60-64; Penttila, M.等,(1986),“ Trichoderma reesei 纤维素酶基因
之间的同源性内切葡聚糖酶I基因的完整的核苷酸序列〃,基因45 =253263 ;Saloheimo, Μ.等,(1988),‘‘ EGIII,一种新的"Trichoderma reesei内切葡聚糖酶基因和酶两者的鉴 定〃,基因 63 :1121 ;Gonzales,R.等·,〃 Trichoderma longibrachiatum egll 基因的克 隆、序列分析和酵母表达",应用微生物学和生物技术,(1992),vol. 38,pp. 370-375 ;Ooi, Τ.等棘孢曲霉纤维素酶(FI-CMCase) cDNA的克隆和序列分析〃,Curr. Genet.,(1990), vol. 18,pp.217222 ;Ooi, Τ.等,编码棘孢曲霉纤维素酶(FI-CMCase)的基因的完整的核 苷酸序列",核酸研究,(1990),vol. 18,No. 19,P. 5884 ;Xue, G.等,“多种厌氧瘤胃真 菌Neocallimastix patriciarum纤维素酶cDNA在大肠杆菌中的克隆和表达〃,J. Gen. Microbiol.,(1992),vol. 138,pp. 1413-1420 ;Xue G.等,“编码具有高内切葡聚糖酶、 纤维二糖水解酶和木聚糖酶活性的三个多功能催化区的Neocallimastix patriciarum的 新的多糖类水解酶 cDNA(celD) “,J. Gen. Microbiol.,(1992),vol. 138,pp. 2397-2403 ; Zhou, L.等,“来源于厌氧真菌Neocallimastix patriciarum的编码模式家族内切葡 聚糖酶的无内含子celB",生物化学杂志,(1994),vol. 297, pp. 359364 ;Dalb Φ ge, H.和 Heldt-Hansen, H. P.,“有效表达克隆真菌酶基因的新方法",Mol. Gen. Genet.,(1994), vol. 243,pp. 253260 ;Ali, B. R. S.等,“厌氧真菌Piromyces纤维素酶和半纤维素酶构成 多蛋白纤维素-结合复合物和由多基因族编码",FEMS微生物学通讯,(1995),vol. 125, Νο,Ι, pp. 15' -21。此外,日本DNA数据库(公众可从hternet上获得的DDBJ数据库) 包括从微紫青霉克隆的编码内切葡聚糖酶的两个DNA序列(分别由A. Koch和G. Mernitz 克隆)和从灰腐质霉变种thermoidea克隆的编码内切葡聚糖酶DNA序列(由T. Uozumi 克隆)。两种Macrophomina phaseolina的内切葡聚糖酶已被克隆和测序,参见Wang, H. Y.和Jones,R. W.“植物致病真菌Macrophomina phaseolina的内切葡聚糖酶-编码 基因的克隆,特征确定和功能性表达",基因,158 :125128,1995 ;和Wang,H. Y.和Jones, R. W.“从植物致病真菌Macrophomina phaseolina克隆的单一内切葡聚糖酶-编码基 因〃,应用和环境微生物学,61 :2004-2006,1995。这些内切葡聚糖酶中的一个显示与真 菌Trichoderma reesei egl3内切葡聚糖酶的高同源性,另一个显示与微生物植物病原体 Pseudomonas solanacearum egll的同源性,说明两种内切葡聚糖酶都属于糖基水解酶5族 (B. Henrissat,生物化学 J 280:309-316(1991))。Schauwecker F.等(1995)公开了二态 真菌玉米黑粉菌的纤维素酶基因的丝-特异性(filament-specific)表达。WO 91/17243 (Nordisk A/S)公开了一种纤维素酶制剂,该制剂由与抗高度纯化的 43kDa内切葡聚糖酶(得自Humicola insolens DSM1800)的抗体免疫反应性的同源内切葡 聚糖酶组成。WO 91/17244(Nordisk A/S)公开了一种新的(半)纤维素降解酶,如内切葡 聚糖酶、纤维二糖水解酶或葡糖苷酶,其可以来源于非木霉属和展齿革菌属的真菌;WO 93Λ019321公开了可以从棘孢曲霉获得的内切葡聚糖酶;WO 94/21801 (Genencor公司)涉及一种纤维素酶系统,该系统是从显示内切葡聚糖酶活性的Trichodermalongibrachiatum 分离到的;WO 94/26880 (Gist Brocades N. V.)公开了一种分离的纤维素降解酶混合物 (优选地是从木霉属、Rspergillus或Disporotrichum获得的),其具有内切葡聚糖酶,纤 维二糖水解酶和木糖葡聚糖酶活性;WO 95/02043 (Nordisk A/S)描述了一种具有内切葡聚 糖酶活性的来源于iTrichoderma harzianum的酶,该酶可以用于许多目的,包括例如植物细 胞壁的降解或修饰。已知纤维素酶可以也可以不具有纤维素结合域(CBD)。CBD增加酶对包含纤维素 纤维的结合,并增加酶的催化活性部分的功效。仍然需要提供可以用于需要纤维素酶尤其是内切葡聚糖酶活性的场合的新的纤 维素酶制剂。本发明的目的是提供新的酶制剂,该酶制剂实质上在酸性、中性或碱性条件下具 有溶纤活性,并在纸浆处理,织物处理和洗衣过程中或者在动物饲养中具有改进的功效,优 选地是新的纤维素酶,更优选地是性能良好的内切葡聚糖酶的酶制剂,所述酶被尝试由重 组技术生产或产生。发明概述令人惊奇地是,现已发现一组内切葡聚糖酶具有某些独特的特征,在通常使用内 切葡聚糖酶的那些工业应用中性能良好。这些独特的特征可以以酶蛋白质氨基酸序列的保 守区进行描述,本发明发现,具有某些保守区的溶纤酶(即显示溶纤活性的酶)在处理要洗 的衣物、处理新制造的织物和处理造纸纸浆中十分有效。因此,本发明第一方面涉及一种酶制剂,该制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成, 所述酶包含具有以下序列的由14个氨基酸残基组成的第一氨基酸序列Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二氨基酸序列Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5其中,在第一序列的3号位置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的4号位置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的8号位置上,氨基酸是Arg、Lys或His ;在第一序列9、10、12和14号的各位置上,在第二序列的4号位置上,氨基酸是20 个天然氨基酸残基中的任何一个,其条件是在第一氨基酸序列中,(i)当12号位置上的氨 基酸残基是Ser时,14号位置上的氨基酸残基不是义!·,和(ii)当12号位置上的氨基酸残 基是Gly时,14号位置上的氨基酸残基不是Ala。尽管在性能良好的内切葡聚糖酶内发现其它相当显著的变异,但可清楚识别保守 区的这一惊人的发现是大量真菌DNA序列研究的结果,所述DNA序列编码具有有效的溶纤 (尤其是内切葡聚糖酶)活性之酶的特定氨基酸序列。基于这一发现,开发了一种用于特异性筛选以编码本发明的酶为特征的基因组 DNA或cDNA的分子方法。构建了作为其工具的三套简并引物。因此,本发明在其第二方面涉及提供编码具有上述保守区之溶纤酶基因的方法。通过使用这种方法(即供基因组DNA PCR筛选的引物套),令人惊奇地发现编码所 述酶的DNA可以从宽范围的真菌中发现,所述真菌属于分类学上很不相同的生物体,并且 栖息于生态学上十分不同的小生境中。进一步地,通过使用这一方法,发现编码所述酶核心区(催化活性区或域)而无任 何连接的纤维素结合域(CBD)之DNA序列已经可能,所述酶的核心区将不通过采用基于筛 选方法的常规手段来选择。发明人经实验证实CBD区与本发明的酶核心区(包括所述酶的 催化活性区或域)的连接导致多域酶的功效明显改善,例如,高出50倍的功效。因此,本发明提供了新的纤维素酶,尤其内切葡聚糖酶,以其天然形式或者同源或 异源形式产生的这些酶在工业应用中具有改善的功效。另一方面,本发明涉及新的溶纤酶制剂,该制剂是可以从分类学上的特定门 (phyli)、纲、目、科、属和种产生的,例如可以从担子菌门的(Basidiomycotous)层菌纲 (Hymenomycetes)、接合菌门(Zygomycota)、壶菌门(Chytridiomycota);或从纲盘菌纲 (Discomycetes)、 腔菌纲(腔菌纲)、不整囊菌纲(Plectomycetes) ;Archaeascomycetes, 半子囊菌纲(Hemiascomycetes)或者从间座壳目、炭角菌目(Xylariales)、假毛球壳 目(Trichosphaeriales)、黑疲菌目(Phyllachorales)或从禾斗丛赤壳禾斗(Nectriaeae)、 1 ^ (SordariaCeae) > ^ ^ (Chaetomiaceae, )、Ceratostomaceae> ^ ^ (Lasiosphaeriaceae);或从属柱抱属(Cylindrocarpon)、粘帚霉属(Gliocladium)、 周刺座霉属(Volutella)、Scytalidium、顶孢霉属(Acremonium)、或从种番茄镰孢 (Fusariumlycopersicl)、Fusarium passiflora、腐皮键抱(Fusarium solani)、蛇 形镰孢(Fusarium anguioides)、早熟禾镰孢(Fusarium poae)、黑腐质霉(Humicola nigrescens)、灰腐质霉(Humicola grisea)产生的,尤其是实质上由包含选自以下序列的 氨基酸序列的酶组成的那些Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7;Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7 ;和Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7其中,在4号位置上,Xaa是Trp、Tyr或Phe ;和在1和7号位置上,Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。更具体地说,本发明的酶制剂优选地是可以从以上提到的分类学上的特定门 (phyli)、纲、目、科、属和种产生的,所述的所有微生物都产生内切葡聚糖酶,该酶包含具有 以下序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5
其中,在第一序列的3号位置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的4号位 置上,氨基酸是Trp、Tyr或Wie ;在第一序列的8号位置上,氨基酸是Arg、Lys或His ;在第 一序列9、10和12号的各位置上,在第二序列的4号位置上,氨基酸是20个天然氨基酸残 基中的任何一个。本发明另一方面提供了包含编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列之DNA构 建体,所述DNA序列包含分别在SEQ ID NO :1、4、5、10、12、16和19中所示的DNA序列或者 它们的类似物。本发明也涉及包含本发明DNA构建体的重组表达载体;涉及包含本发明DNA构建 体或重组表达载体的细胞;涉及产生本发明酶(例如,重组体酶)的方法;涉及通过使用本 发明的酶使要洗的衣物颜色澄清的方法;涉及包含本发明的酶的洗衣组合物;涉及本发明 的酶在降解或改性植物材料(例如细胞壁),处理织物原料、织物或衣物,处理纸浆中的用 途;并涉及富含本发明的酶的酶制剂。附图简要描述

图1是下列微生物的推定编码的氨基酸序列的序列对比=Acremoniumsp. (I), Volutella colletotrichoides, Crinipellis scabella, Acremonium sp. (II), Myceliophthora thermophila, Thielaviaterrestris, Macrophomina phaseolina。 M Pileup程序(Feng和Doolittle 1987) (GCG包,版本8. 0)产生最好的序列对比。在至少四 个序列中相同的残基(方框中)在相应的氨基酸周围表示出来。图2图加,b,c说明在真菌界内的本文所讨论的所有微生物(其能够产生本发明 的酶制剂和酶)的分类学分类。本文使用的分类学分类基于用于NIH数据库(Entrez 1996春天版)的系统,该 ^^π!Ι^ ,/ΛWorld Wide Web (http://www3. ncbi. nlm. nih. gov/htbin/ef/entrez TAX) 1 得。对未包含在Entrez数据库中的生物体的分类,使用了下列一般可获得的和世界 范围内接受的参考书对于子囊菌纲(Ascomycetes) :Eriksson,0. Ε. &Hawksworth, D. L.子囊菌纲系 统,vol 12(1993)。对于担子菌纲(Basidiomycetes) Julich, W,担子菌纲的较高分类群, Bibliotheca Mycologia 85,485pp (1981)。对于接合菌纲0' Donnell, K.培养中的接合菌纲,佐治亚大学,美国, 257pp(1979)。一般性的微生物学参考书Hawksworth, D. L.,Kirk, P. Μ.,Sutton, B. C.禾口 Pegler,D. N.真菌词典,国际真 菌学研究所,616pp (1995);Von Arx, J. A,培养中形成孢子的真菌属,4Mpp (1981)。迄今仍不清楚腐质霉属(Humicola)的分类学位置(implacement)。然而,粪 壳目(Sordariales)广泛选择的18SRNA的研究已给出腐质霉属归于粪壳目的有力的提 示(Taylor,Clausen&Oxenbcjill,未发表)。此外,这些数据表明腐质霉属与蛾柱霉属 (Scytalidium) 一起与粪壳科、毛壳科,长喙壳科(Ceratostomataceae)和毛球壳科仅有相当远的关系。依据上述,在这里将腐质霉属和Scytalidium置于粪壳目内,科未知。图3是推定的部分氨基酸序列的序列对比,所述序列来源于实施例5中描述的46 种微生物中选择的沈种。发明详述在本文中,术语“20种天然氨基酸残基”指通常在蛋白质中发现的20种氨基酸残 基,照惯例被认为是丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(lie 或I)、脯氨酸(Pro或P)、苯丙氨酸(Phe或F)、色氨酸(Trp或W)、甲硫氨酸(Met或Μ)、甘 氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或幻、苏氨酸(Thr或Τ)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr或 Y)、天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)、天门冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、 赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)、和组氨酸(His或H)。按照本发明,本发明提供了新的性能良好的内切葡聚糖酶,其包含保守氨基酸序 列区,尤其是具有以下序列的由14个氨基酸残基组成的第一氨基酸序列Thr Arg Xaa xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二氨基酸序列Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5其中,在第一序列的3号位置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的4号位置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的8号位置上,氨基酸是Arg、Lys或His ;在第一序列9、10、12和14号的各位置上,在第二序列的4号位置上,氨基酸是20 个天然氨基酸残基中的任何一个,其条件是在第一氨基酸序列中,(i)当12号位置上的氨 基酸残基是Ser时,14号位置上的氨基酸残基不是义!·,和(ii)当12号位置上的氨基酸残 基是Gly时,14号位置上的氨基酸残基不是Ala。优选地,本发明的酶是微生物来源的,即是可以从微生物(如真菌)获得的。在一个优选的实施方案中,在第一序列的9号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、 苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸,优选地选自脯氨酸和苏氨酸。在另一个优选的实施方案中,在第一序列的10号位置上的氨基酸残基选自脯氨 酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸,优选地是丝氨酸。在另一个优选的实施方案,在第一序列的12号位置上氨基酸残基选自脯氨酸、苏 氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸,优选地选自丙氨酸和甘氨酸。在另一个优选的实施方案中,在第一序列的14号位置上的氨基酸残基选自脯氨 酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷 氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,优选地选自脯氨酸、苏氨 酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸。
优选地,在第二序列的4号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,更优选地选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。更优选的实施方案的例子是这样的一些,其中,在第一序列中,第3号位置上的氨 基酸残基是酪氨酸;或在第4号位置上的氨基酸残基是色氨酸;或在第8号位置上的氨基酸残基是赖氨酸。在一个特别优选的实施方案中,本发明的酶包括选自以下序列的氨基酸序列Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ,Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Thr Ser Cys Ala Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ,和Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 .在第二方面,本发明提供了用于发现和克隆编码这种酶的基因的方法,该方法包 括在标准条件下与来源于任何保守区的寡核苷酸杂交(例如PCR扩增),如图1所说明的。一种有用的寡核苷酸包含编码包含在选自以下序列的肽中的至少五肽的核苷酸 序列a.Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14在3或4在号位置上的氨基酸是Trp、Tyr或Wie ;在8号位置上的氨基酸是Arg、 Lys或His ;在9、10、12和14号位置上的氨基酸分别是20个天然氨基酸残基中的任何一 个;和b.Trp Cys Cys Xaa Cys Tyr1 2 3 4 5 6在4号位置上的氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个;和c.Xaa Pro Gly Gly Gly Xaa Gly Xaa Phe1234567891号位置上的氨基酸是Met或Ile ;6和8号位置上的氨基酸分别是Leu、Ile 或 Val;和d.Gly Cys Xaa Xaa Arg Xaa Asp Trp Xaa1 2 3 4 5 6 7 8 9在3号位置上的氨基酸是20个天然氨基酸残基中的任何一个;在4和6号位置上 的氨基酸分别是iTrp、Tyr或Phe ;并且在9号位置上的氨基酸是Phe或Met。
所述有用的寡核苷酸也包括与以上所述序列互补的核苷酸序列。在本发明的方法的一个优选的实施方案中,所述寡核苷酸相应于选自以下PCR引 物的PCR引物有义,5,-CCCCAAGCTTACIa/cGITA7tTGGGA7tTGc/tTG7tAAa/ga/cC-3,反义1,5,CTAGTCTAGATAa/gCAIGCa/gCAa/gCACC-3,;反义2,CTAGTCTAGAAAIAa/g/tICCIAa/c/gICCICCICCIGG-3,;禾口反义3,5,CTAGTCTAGAIAACCAa/gTCAa/gA/tATC7tCC-3.在第三方面,本发明提供了一种酶制剂,该制剂实质上由具有溶纤活性和具有发 明人所发现的保守区的酶组成,该酶包含具有下列序列的由7个氨基酸序列组成的肽Xaa Thr Arg Xaa Phe Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7Xaa Thr Arg Xaa Tyr Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7 ;和Xaa Thr Arg Xaa Trp Asp Xaa1 2 3 4 5 6 7其中,在4号位置上,Xaa是Trp、Tyr或Phe ;和在1和7号位置上,Xaa是20个天然氨基酸残基中的任何一个。这种酶是可以从属于担子菌门的层菌纲菌株优选地属于蘑菇目、木耳目和非褶菌 目的菌株,更优选的属于黑耳科、口蘑科、鬼伞科、裂褶菌科、烟管菌科和多孔菌科的菌株, 特别是属于黑耳属、毛皮伞属、层孔菌属、斑褶菇属、栓菌属、裂褶菌属和绵皮孔菌属的菌株 获得的(参见图2)。特定的例子是可以从属于黑胶耳、Crinipellis scabella、木蹄层孔菌和 Spongipellis sp.的菌株,特别是可以从黑胶耳 CBS 277. 96、Crinipellis scabella CBS 280. 96、木蹄层孔菌CBS 276. 96和Spongipellis sp. CBS 283. 96获得的内切葡聚糖酶。按照布达佩斯条约,黑胶耳于1996年3月12日以保藏号CBS 277. 96保藏在真 菌菌种保藏中心,Oosterstraat 1,Postbus 273,NL_3740AGBaarn,荷兰;Crinipellis scabella于1996年3月12日以保藏号CBS280. 96保藏在真菌菌种保藏中心,Oosterstraat 1,Postbus 273,NL-3740AG Baarn,荷兰;木蹄层孔菌于1996年3月12日以保藏号 CBS276. 96 保藏在真菌菌种保藏中心,Oosterstraat LPostbus 273,NL-3740AG Baarn,荷 兰;Spongipellis sp.于1996年3月12日以保藏号CBS观3. 96保藏在真菌菌种保藏中 心,Oosterstraatl, Postbus273, NL-3740AG Baarn,荷兰。本发明的酶制剂是也可以从属于壶菌门的菌株,优选地属于壶菌纲的菌株,更优 选地属于Spizellomycetales目的菌株,特别优选地属于Spizellomycetaceae科的菌株, 尤其是属于囊壶菌属的菌株获得的。所说菌株的特定的例子是属于红根囊壶菌的菌株,尤其是红根囊壶菌CBS282. 96。按照布达佩斯条约,红根囊壶菌于1996年3月12日以保藏号CBS282. 96保藏在 真菌菌种保藏中心,Oosterstraatl,Postbus 273,NL-3740AG Baarn,荷兰。本发明的酶制剂也可以从属于接合菌门的菌株,优选地从属于接合菌纲的菌株, 更优选地从毛霉目的菌株,尤其是从属于毛霉科和枝霉科的菌株,尤其是属于根毛霉属、须 霉属和刺枝霉属的菌株获得。特定菌株的例子是属于Miizomucor pusillus,闪光须霉和弗 雷生刺枝霉的菌株,特别是Rhizomucor pusillus IFO 4578、闪光须霉IFO 4814和弗雷生 刺枝霉NRRL2305。此外,本发明的酶制剂也可以从属于Archaeascomycetes、盘菌纲,半子囊菌亚 纲,腔菌纲和不整囊菌纲的菌株,优选地从属于由盘菌目、斑痣盘菌目(Miytismatales)、 座囊菌目和散囊菌目的菌株获得。尤其是所述酶可以从属于葫芦霉科、粪盘菌科、斑痣盘 菌科和发菌科的菌株,优选地从属于色二孢属、Microsphaeropsis, Ulospora、壳球孢属, 粪盘菌属,Saccobolus、青霉属和Thermomyces的菌株获得。特定的例子是可以从以下菌 株获得的酶,所述菌株是属于由棉色二孢、Microsphaeropsis sp.、Ulospora bilgramii、 Aureobasidium sp.、Macrophomina phaseolina、Ascobolus stictoides、Saccobolus dilutellus、盘菌属(Peziza)、抚抱青霄、产黄青霄禾口 Thermomyces verrucosus tT、J 囷休, 特别是棉色二孢 CBS274. 96、Ulospora bilgramii NKBC 1444、Macrophomina phaseolina CBS281. 96、Saccobolus dilutellus CBS 275. 96、抚孢青霉 ATCC 62396、产黄青霉 ATCC 9480 禾口 Thermomyces verrucosus CBS 285.96。按照布达佩斯条约,棉色二孢于1996年3月12日以保藏号CBS 274. 96保藏在真 菌菌种保藏中心;Macrophomina phaseolina于1996年3月12日以保藏号CBS 281. 96保 藏在真菌菌种保藏中心;Saccobolus dilutellus于1996年3月12以保藏号CBS 275. 96 保藏在真菌菌种保藏中心;Thermomyces verrucosus于1996年3月12日以保藏号CBS 285. 96保藏在真菌菌种保藏中心。此外,所述酶可以从属于间座壳目、炭角菌目、假毛球壳目和黑痣菌目的菌株, 优选地从属于炭角菌科、黑腐皮壳科和Wiyllachoraceae的菌株,更优选地从属于由间 座壳属、刺盘孢属、黑孢属、炭角菌属、Nodulisporum和孔座壳属的菌株获得。特定的菌 株的例子是属于Diaporthesyngenesia、葫芦科刺盘孢、鹿角团炭角菌、Nigrospora sp.、 Nodulisporum sp.和点孔座壳的菌株,特别是 Diaporthe syngenesia CBS278. 96、葫芦科 刺盘孢 ATCC 52609、Nigrospora sp. CBS 272. 96、鹿角团炭角菌 CBS 284,96。按照布达佩斯条约,Diaporthe syngenesia于1996年3月12日以保藏号CBS 278. 96保藏在真菌菌种保藏中心;Nigrospora sp.于1996年3月12日以保藏号CBS 272. 96保藏在真菌菌种保藏中心;鹿角团炭角菌于1996年3月12日以保藏号CBS 284. 96 保藏在真菌菌种保藏中心。所述酶也可从按照布达佩斯于1996年3月12日分别以保藏号CBS270. 96、 CBS 271. 96和CBS273. 96保藏在真菌菌种保藏中心的未鉴别的真菌(有丝分裂孢子的, coleomycetous)获得。所述酶也可从以下菌株获得,所述菌株是属于柱孢属、粘帚霉属、赤壳属、 M ji β M> ^ ^ M> Scytalidium、 包冑属、Syspastospora> Cladorrhinum> 毛 ^属、Myceliphthora禾口顶抱霄属的菌株,特别是属于Cylindrocarpon sp. 、Neetria pinea、Volutella colletotrichoides、獎生獎壳、大抱獎壳、Thielavia terrestris、 Thielavia thermophila> Syspastospora boninensis> Cladorrhinum foecundissimum> 墙毛壳、Chaetomium virescens> Chaetomium brasiliensis> Chaetomiumcunicolorum> Myceliophthora thermophila、链抱粘帚霉、Scytalidiumthermophila 禾口 Acremonium sp 的菌株,尤其是 Nectria pinea CBS 279. 96> Volutella colletotrichoides CBS 400. 58、粪生粪壳 ATCC 52644、大孢粪壳 ATCC 60255、Thielavia terrestris NRRL 8126、 Thielaviathermophila CBS 174. 70、墙毛壳 CBS 163. 52> Chaetomium virescensCBS 547. 75、Chaetomium brasiliensis CBS 122. 65、Chaetomiumcunicolorum CBS 799. 83、 Syspastospora boninensis NKBC 1515、Cladorrhinum foecrundissimum ATCC 62373> Myceliophthorathermophila CBS 117. 65,Scytalidium thermophila ATCC 28085、链孢粘 帚霉 ATCC 10523 和 Acremonium sp. CBS 478. 94。按照布达佩斯条约,Nectria pinea于1996年3月12日以保藏号CBS279. 96保 藏在真菌菌种保藏中心;Acremonium sp.于1994年9月28日以保藏号CBS 478. 94保藏。所述酶也可以从属于腐皮镰孢、蛇形镰孢、早熟禾镰孢、尖镰孢ssp. Iycopersici, 尖镰孢ssp. passiflora、黑腐质霉和灰腐质霉的菌株,尤其是番茄尖镰孢ssp Iycopersici CBS 645. 78、尖镰孢 ssppassiflora CBS 744. 79、腐皮镰孢 IMI 107. 511、蛇形镰孢 IFO 4467、早熟禾镰孢ATCC 60883、黑腐质霉CBS 819. 73和灰腐质霉ATCC 227 获得。应当注 意灰腐质霉不同于灰腐质霉thermoidea变种。在一个优选的实施方案中,本发明的酶制剂来源于所公开的纲、目、科、属和种,并 且实质上由下述酶组成,所述酶包含具有以下序列的由13个氨基酸残基组成的第一肽Thr Arg Xaa Xaa Asp Cys Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13和具有以下序列的由5个氨基酸残基组成的第二肽Trp Cys Cys Xaa Cys12 3 4 5其中,在第一序列的3号位置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的4号位 置上,氨基酸是Trp、Tyr或Phe ;在第一序列的8号位置上,氨基酸是Arg、Lys或Hi s ;在 第一序列9、10和12号的各位置上,在第二序列的4号位置上,氨基酸是20个天然氨基酸 残基中的任何一个。优选地,在第一序列的9号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨 酸、甲硫氨酸和色氨酸,更优选地选自脯氨酸和苏氨酸;在第一序列的10号位置上的氨基 酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨 酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸,优选地是丝氨酸;在第一序列 的12号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙 氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸和色氨酸,优选地 选自丙氨酸和甘氨酸;在第二序列的4号位置上的氨基酸残基选自脯氨酸、苏氨酸、缬氨 酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,更优选地选自丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺。另一方面,本发明提供了一种DNA构建体,该构建体包含编码显示内切葡聚糖酶 活性之酶的DNA序列,所述DNA序列包括a)分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分 别从啤酒糖酵母 DSM9770、DSM10082、DSM10080、DSM10081,大肠杆菌 DSM10512、DSM10511、 DSM10571、DSM10576中的质粒获得的DNA序列,或者b)分别在SEQ ID NO 1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的类似物或可以 分别从啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的类似物,该类似物i)同源于分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或 可以分别从啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、 DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576 中的质粒获得的 DNA 序列,ii)与分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以 分别从啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的质粒获得的DNA序列的相同核苷酸探针杂交,iii)编码一种多肽,该多肽同源于由一种DNA序列编码的多肽,所述DNA序列包 含分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列和/或可以分别从啤酒 糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571, DSM 10576中的质粒获得的DNA序列,iv)编码一种多肽,该多肽是与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体免疫学反应性的, 所述内切葡聚糖酶由分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或可以 分别从啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM10082、DSM 10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 1051UDSM 10571, DSM 10576中的质粒获得的DNA序列编码。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10512已于1996年2月2日保藏在DSM(德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10511已于1996年2月2日保藏在DSM(德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10571已于1996年3月6日保藏在DSM(德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10576已于1996年3月12日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10583已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10584已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10585已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10586已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。
按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10587已于1996年3月13日保藏在DSM (德意 志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,大肠杆菌DSM 10588于1996年3月13日保藏在DSM (德意志 微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,啤酒糖酵母DSM 9770已于1995年2月M日保藏在DSM(德 意志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,啤酒糖酵母DSM 10082已于1995年6月30日保藏在DSM (德 意志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,啤酒糖酵母DSM 10080已于1995年6月30日保藏在DSM (德 意志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)。按照布达佩斯条约,啤酒糖酵母DSM 10081已于1995年6月30日保藏在DSM(德 意志微生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschwe ig,德国)。与SEQ ID NO 1有关的本发明DNA构建体可以从毁丝霉属的菌株,特别是 M. thermophila的菌株,尤其是M. thermophiIaCBS 117. 65的DNA文库分离或者基于该文库 产生。与SEQ ID NO :4和6有关的本发明DNA构建体可以从顶孢霉属的菌株,尤其是 Acremonium sp. CBS 478. 94的DNA文库分离或者基于该文库产生。与SEQ ID NO 8有关的本发明DNA构建体可以从梭孢壳属的菌株,特别是Thiela viaterrestris的菌株,尤其是Thiela viaterrestris NRRL8126的DNA文库分离或者基于
该文库产生。与SEQ ID NO :10有关的本发明DNA构建体可以从壳球孢属的菌株,特别是 M. phaseolina的菌株,尤其是M. phaseolina CBS沘1. 96的DNA文库分离或者基于该文库产生。与SEQ ID NO :12有关的本发明DNA构建体可以从毛皮伞属的菌株,特别是 C. scabella的菌株,尤其是C. scabelIaCBS 280. 96的DNA文库分离或者基于该文库产生。与SEQ ID NO :19有关的本发明DNA构建体可以从粪壳属的菌株,特别是粪生粪壳 的菌株的DNA文库分离或者基于该文库产生。在本发明中,分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的〃
类似物"意指任何编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的DNA序列,其具有性质i)-iv)的任一 或全部。类似的DNA序列a)可以基于分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列,采用
例如本文所公开的方法,从产生具有内切葡聚糖酶活性之酶的其它或者相关(例如,相同) 生物体分离;同系物可以是包含本文所示的DNA序列的DNA序列的等位变体,即经突变产生 的基因的另一种形式。突变可以是沉默的(在编码的酶上无变化)或可以编码具有改变的 氨基酸序列的酶;所述DNA序列的同系物也可以是属或种同系物,编码来源于另一个种的 具有类似性质的酶。b)可以基于分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列构建,
例如通过引入不产生另一个由所述DNA序列编码的内切葡聚糖酶的氨基酸序列(但其相应于用于产生所述酶的生物体的密码子使用)的核苷酸取代,和能够产生一种不同的氨基酸 序列的核苷酸取代。然而,在后一种情况下,氨基酸的变化优选地是次要性质的改变(其是 保守氨基酸取代,不明显地影响蛋白质的折叠或活性)、小的缺失(典型地是1到约30个 氨基酸);小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨酸残基),至大约20-25个 残基的小的接头肽或有利于纯化的小的延伸(如聚-组氨酸束,抗原表位或结合域),总的 情况参见R)rd等,蛋白质表达和纯化,2 :95-107,1991。保守取代的例子在下列氨基酸的范 围内碱性氨基酸(如精氨酸,赖氨酸,组氨酸),酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸),极性 氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺),疏水氨基酸(如亮氨酸,异亮氨酸,缬氨酸),芳族氨基 酸(如苯丙氨酸,色氨酸,酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨酸,丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸,甲硫氨 酸)。对本领域技术人员明显的是,可以进行这样的取代,其在对所述分子的功能关 键性的区域之外,并且仍然产生活性多肽。可以按照本领域已知的方法鉴别对本发明的 DNA构建体编码的多肽之活性必需的氨基酸,所述方法例如定向诱变或丙氨酸-扫描诱 变(Cunningham和Wells,科学244,1081-1085,1989)。在后一技术中,在分子中的任何残 基上引入突变,试验形成的突变体分子的生物学(即内切葡聚糖酶)活性,以鉴别对所说 分子活性关键性的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也可以通过晶体结构(由核磁 共振、结晶学或光亲和性标记法之类的技术测定的)分析测定。参见例如de Vos等,科 学 255 :306-312,1992 ;Smith 等,分子生物学杂志· 224 :899-904,1992 ;Wlodaver 等,FEBS Lett. 309 :59-64,1992。由本发明的DNA构建体的DNA序列编码的内切葡聚糖酶可以包括纤维素结合域 (CBD),以编码完整酶一部分存在,或者其它来源的CBD可以引入进内切葡聚糖酶酶,由 此产生酶杂合体。在本文中,术语"纤维素-结合域"应如Peter Tomme等“不溶性碳水 化合物的酶促降解”中的“纤维素-结合域分类和性质”,John N. Saddler and Michael H. Penner (编者),ACS专题研讨系列No. 618,1996所定义的来理解。这一定义把120种以 上的纤维素-结合域(CBD)分类成10个家族(I-X),并且其说明CBD在各种酶中发现,如 纤维素酶,木聚糖酶,甘露聚糖酶,阿拉伯呋喃糖苷酶,乙酰酯酶和壳多糖酶。CBD也在藻类 中发现,例如,作为-非水解多糖类-结合的红藻Porphyra purpurea蛋白质,参见Peter Tomme等,同上。然而,大多数CBD来源于纤维素酶和木聚糖酶。CBD在蛋白质的N或C末 端或内部发现。酶杂合体在本领域是已知的,参见例如WO 90/00609和W095/16782,并且可 以通过将包含至少一种编码纤维素-结合域的DNA片段(其带有或不带有接头,与编码目 的酶的DNA序列连接)的DNA构建体转化进宿主细胞中,并培养该宿主细胞以表达融合基 因来制备。酶杂合体可以用下式来描述CBD-MR-X,其中CBD是相应于至少纤维素-结合域的氨基酸序列的N-末端或C-末端区;MR 是中间区(接头),和可以是化学键或者短的连接基团,这些基团优选地具有约2至100个 碳原子,更优选地具有2至40碳原子;或者优选地是约2至约100个氨基酸,更优选地是2 至40个氨基酸;X是由本发明的DNA序列编码的多肽的N-末端或者C-末端区。以两种序列之间的等同性的程度测定以上i)中提及的同源性,表示第一序列和 第二序列的差别。同源性可以用本领域已知的计算机程序合适地测定,例如在GCG程序包中提供的 GAP(Needleman,S. B.和 Wunsch,C. D.,分子生物学杂志,48 :443-453,1970)。采 用GAP和下列设置进行DNA序列比较GAP产生罚分5. 0和GAP延伸罚分0. 3,所述DNA序 列的编码区显示与分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以 分别从啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571或DSM 10576中的质粒获得的DNA序列具有优选地至少60%,更优选地 至少65%,更优选地70%,更优选地至少80%,尤其是至少90%的等同性程度。以上ii)中提及的杂交意指在某些特点的条件下(在此后的材料和方法中详细描 述),类似的DNA序列杂交到编码内切葡聚糖酶的DNA序列的相同探针上。所使用的寡核 苷酸探针是相应于分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以 分别从啤酒糖酵母 DSM9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM
10511、DSM10571或DSM 10576中的质粒获得的DNA序列之内切葡聚糖酶编码部分的DNA 序列。以两种序列之间的等同性的程度测定以上iii)中提及的同源性,表示第一序列 和第二序列的差别。同源性可以用本领域已知的计算机程序合适地测定,例如在GCG程序 包中提供的 GAP (Needleman,S. B.和 Wunsch,C. D.,分子生物学杂志,48 :443-453,1970)。 采用GAP和下列设置进行多肽序列比较GAP产生罚分3. 0和GAP延伸罚分0. 1,类似DNA 序列编码的多肽显示与包含分别在SEQ ID N0:l、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序 列或者可以分别从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM10080、DSM 10081,大肠杆菌DSM
10512、DSM10511、DSM 10571或DSM10576中的质粒获得的DNA序列的DNA构建体所编码 的酶具有优选地至少阳%,更优选地至少60 %,更优选地65 %,更优选地至少70 %,更优选 地至少80 %,尤其是至少90 %的等同性程度。关于以上iv)提及的性质,意指分别由从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM10082、DSM 10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或 DSM 10576 分离的 DNA
序列编码和由用所说DNA序列转化的宿主生物体产生的内切葡聚糖酶酶,或者分别由 Myceliophthora thermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris、Macrophomina phaseolina、Crinipellis scabella、Volutella colletotrichoides 或獎生獎壳天然内切 葡聚糖酶。可以用以下材料和方法部分描述的方法测定免疫学反应性。本发明的另一方面涉及具有本发明的DNA构建体的表达载体、包含所说DNA构建 体和表达载体的细胞以及产生显示内切葡聚糖酶活性之酶的方法,该方法包括在可以产生 所说酶的条件下培养所说的细胞,并从培养物回收所说的酶。本发明的另一方面涉及一种显示内切葡聚糖酶活性的酶,这种酶a)由本发明的DNA构建体编码b)用本发明的方法产生c)与一种抗纯化内切葡聚糖酶的抗体是免疫学反应性的,所述内切葡聚糖酶由分 别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列或者可以分别从啤酒糖酵母 DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或DSM 10576中的质粒获得的DNA序列编码。以上c)中提及的内切葡聚糖酶可以是由从啤酒糖酵母DSM 9770、DSM10082、 DSM 10080、DSM 10081,大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或 DSM 10576 分离的DNA序列编码和由用所说DNA序列转化的宿主生物体产生的内切葡聚糖酶,或 者分别 由 Myceliophthorathermophila、Acremonium sp.、Thielavia terrestris、 Macrophominaphaseolina>Crinipel 1 is scabella、Volutella colletotrichoides 或獎生 粪壳天然相应的内切葡聚糖酶。一般地,在本文中,术语"酶"被理解为包括成熟蛋白质或其前体形式以及其实 质上具有全长酶活性的功能性片段。此外,术语"酶"旨在包括所说酶的同系物。所述酶的同系物可以具有一个或多个氨基酸取代,缺失或者添加。这些变化优选 地是次要性质的改变(其是保守氨基酸取代,不明显地影响蛋白质的折叠或活性)、小的缺 失(典型地是1到约30个氨基酸);小的氨基-或羧基-末端延伸(如氨基-末端甲硫氨 酸残基),多至大约20-25个残基的小的接头肽或有利于纯化的小的延伸(如聚-组氨酸 束,抗原表位或结合域),总的情况参见i^ord等,蛋白质表达和纯化,2 :95-107,1991。保守 取代的例子在下列氨基酸的范围内碱性氨基酸(如精氨酸,赖氨酸,组氨酸),酸性的氨基 酸(如谷氨酸和天冬氨酸),极性氨基酸(如谷氨酰胺和天冬酰胺),疏水氨基酸(如亮氨 酸,异亮氨酸,缬氨酸),芳族氨基酸(如苯丙氨酸,色氨酸,酪氨酸)和小氨基酸(如甘氨 酸,丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸,甲硫氨酸)。对本领域技术人员明显的是,可以进行这样的取代,其在对所述分子的功能关 键性的区域之外,并且仍然产生活性酶。可以按照本领域已知的方法鉴别对本发明的 DNA构建体编码的酶之活性必需的氨基酸,所述方法例如定向诱变或丙氨酸-扫描诱变 (Cunninghan^P flfells,科学M4,1081-1085,1989)。在后一技术中,在分子中的任何残基上 引入突变,试验形成的突变体分子的生物学(即内切葡聚糖酶)活性,以鉴别对所说分子活 性关键性的氨基酸残基。配体-受体相互作用的位点也可以通过晶体结构(由核磁共振、 结晶学或光亲和性标记法之类的技术测定的)分析测定。参见例如de Vos等,1992 ;Smith 等,1992 ;Wlodaver 等,1992。同系物可以是等位变体,即经突变产生的基因的另一种形式或可以是由突变基因 编码的改变的酶(但具有与本发明的酶实质上相同的活性)。由此突变可以是沉默的(编 码的酶无改变)或者可以编码具有改变的氨基酸序列的酶。所述酶的同系物也可以是属或种同系物,即来源于另一物种的具有类似性质的酶。所述酶的同系物可以通过本文描述的方法分离。经聚合酶链反应分子筛选和克隆使用从合适的来源(例如任何本文提及的生物体)分离的基因组DNA或者双链 cDNA和基于本文公开的DNA序列和氨基酸序列制备的合成寡核苷酸引物,经聚合酶链反应 (PCR)进行本发明的DNA序列的分子筛选。例如,合适的寡核苷酸引物可以是在材料和方法 部分中所描述的引物。依据众所周知的方法,在分子筛选中所产生的PCR片段可以被分离和亚克隆进合 适的载体中。经例如菌落或者噬斑杂交,PCR片段可以用于筛选DNA文库。酵母中的克隆表达可以通过一般性的方法分离编码显示内切葡聚糖酶活性的酶的本发明的DNA序 列,所述方法包括
-在合适的载体中从合适的来源(例如任何本文提及的生物体)克隆DNA文库,-用所说的载体转化合适的酵母宿主细胞,-在合适的条件之下培养所说宿主细胞,以表达由DNA文库中的克隆编码的任何 兴趣酶,-通过测定由这些克隆产生的酶的任何内切葡聚糖酶活性筛选阳性克隆,-从这些克隆分离编码所述酶的DNA。在WO 94/14953中进一步公开了一般性的方法,该文献的内容本文一并参考。筛 选方法更详细的描述在以下实施例1中给出。可以分离编码酶的DNA序列,所述分离是例如通过筛 选 Macrophominaphaseolina、Crinipel1 is scabella、 獎 生 獎壳或 Volutellacolletotrichoides的cDNA文库,并选择表达合适的酶活性(即内切葡聚糖酶活 性)的克隆进行分离;或者从按照布达佩斯条约于1996年2月2日保藏在DSM(德意志微 生物保藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)的大肠杆菌 DSM 10512 分离;或者从按照布达佩斯条约于1996年2月2日保藏在DSM的大肠杆菌DSM10511分离; 或者从按照布达佩斯条约于1996年3月12日保藏在DSM的大肠杆菌DSM 10576分离;或者 从按照布达佩斯条约于1996年3月6日保藏在DSM的大肠杆菌DSM10571分离;或者通过 ff 选 Myceliphthora thermophila CBS 117. 65>Acremonium sp. CBS 478. 94 5 Thielavia terrestris NRRL 81 的cDNA文库,并选择表达合适的酶活性(即内切葡聚糖酶活性)的 克隆进行分离;或者从按照布达佩斯条约于1995年2月M日保藏在DSM (德意志微生物保 藏中心,Mascheroder Weg 16,D_38124Braunschweig,德国)的啤酒糖酵母DSM 9770 分离; 或者从按照布达佩斯条约于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10082分离; 或者从按照布达佩斯条约于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10080分离; 或者从按照布达佩斯条约于1995年6月30日保藏在DSM的啤酒糖酵母DSM 10081分离。然后,可以用标准方法(如实施例1中所描述的)从所述克隆分离合适的DNA序 列。核酸构建体本文使用的术语〃核酸构建体〃旨在指任何cDNA、基因组DNA、合成DNA或者RNA 来源的核酸分子。术语"构建体"旨在指核酸区段,其可以是单链或双链,并且其可以是基 于编码兴趣酶的全部或部分天然核苷酸序列。所述构建体可以含有可以不含有其它核酸区 段。编码本发明酶的核酸构建体可以是基因组或cDNA来源的,例如通过制备基因组 或者cDNA文库,并按照标准技术(参见Sambrook等,1989)使用合成寡核苷酸探针经杂交 筛选编码全部或部分酶的DNA序列获得。编码酶的核酸构建体也可以用已建立的标准的方法经合成制备,所述方法例如由 Beaucage和Caruthers (1981)描述的氨基亚磷酸酯方法,或Matthes等(1984)描述的方 法。按照氨基亚磷酸酯方法,在例如自动DNA合成仪中合成寡核苷酸,纯化,退火,连接和在 合适的载体中克隆。此外,所述核酸构建体可以是合成和基因组,合成和cDNA或基因组和cDNA混合来 源的,其是经按照标准技术连接合成、基因组或者cDNA来源的片段(相应于完整的核酸构建体的各种部分的片段)制备(以合适的方式)的。也可以采用特定的引物经聚合酶链反应制备所述的核酸构建体,例如按照美国专 利4,683,202或Saiki等(1988)描述的方法制备。核酸构建体优选地是DNA构建体,这一术语将一直用于本说明书与权利要求书 中。重组载体包含编码本发明的酶的DNA构建体的重组载体可以是任何易于进行DNA操作的载 体,载体的选择常常取决于其所要引入的宿主细胞。这样,载体可以是自主复制载体,即作 为染色体外实体存在的载体,其复制不依赖于染色体复制,例如质粒。另外,载体可以是这 样一种,当其被引入宿主细胞时,整合进宿主细胞基因组,并且与其整合进的染色体一道复 制。所述载体优选地是表达载体,在其中编码本发明的酶的DNA序列可操作地连接到 该DNA转录所需的附加区段上。一般来说,表达载体是来自质粒或病毒DNA的或可以包含 它们的成分。术语"可操作连接"指所述区段排列得使它们对预期的目的协调起作用,例 如转录在启动子开始,并且经由编码酶的DNA序列进行。启动子可以是任何DNA序列,其在所选择的宿主细胞中显示转录活性,并且可以 来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于酵母宿主细胞的合适的启动子的例子包括来源于酵母糖解基因(Hitzeman 等,生物化学杂志.255(1980),12073-12080 ;Alber和Kawasaki,分子应用遗传学杂 志,1(1982),419-434)或酒精脱氢酶基因(Young等,化学品的基因工程和微生物学 (Hollaender 等,编者),Plenum 出版社,纽约,1982)的启动子,或者 TPIl (US 4,599,311) 或 ADH24c (Russell 等,自然,304 (1983),652-654)启动子。用于丝状真菌细胞的合适的启动子是例如ADH3启动子(McKnight等,The EMBO J. 4 (1985) ,2093-2099)或tpiA启动子。其它有用的启动子的例子是来源于编码下列酶的 基因的那些,所述酶是米曲霉TAKA淀粉酶、lihizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉中性 α -淀粉酶、黑曲霉酸稳定α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(gluA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶。优选的是 TAKA-淀粉酶和gluA启动子。用于细菌宿主细胞的合适的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌生麦淀粉酶基 因、地衣形芽孢杆菌α -淀粉酶基因、液解化淀粉杆菌BAN淀粉酶基因、枯草杆菌碱性蛋白 酶基因或短小芽孢杆菌木糖苷酶基因的启动子或噬菌体λ Pk或启动子或者大肠杆菌 lac、trp或tac启动子。如果需要,编码本发明的酶的DNA序列也可以可操作地与合适的终止子连接。本发明的重组载体还可以包含使得所述载体在所说的宿主细胞中复制的DNA序 列。所述载体也可以包含选择性标记,例如,其产物补充宿主细胞缺陷的基因,如编码 二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或粟酒裂殖酵母TPI基因(由P. R. Russell,基因40,1985, pp. 125-130描述)。对于丝状真菌,选择性标记包括amdS、pyrG、argB、niaD、sC。为了引导本发明的酶进入宿主细胞的分泌途径,也可以在重组载体中包含分泌信号序列(也称作前导序列、前序列原或前序列),将分泌信号序列在正确的读框中与编码酶 的DNA序列连接。分泌信号序列一般被置于编码酶的DNA序列的5'。分泌信号序列可以 是通常与所述酶相关的或者可以是来源于编码另一个分泌蛋白质的基因的。为了从酵母细胞分泌,分泌信号序列可以编码任何信号肽,该肽确保所表达的酶 以有效的方向进入细胞的分泌途径。信号肽可以是天然信号肽或其功能性部分,或者其可 以是合成肽。已发现合适的信号肽是α -因子信号肽(参见美国专利4,870,008),小鼠唾液 淀粉酶信号肽(参见0. Hagenbuchle等,自然2891981,pp. 643-646),修饰的羧肽酶信号肽 (参见 L.A. Vails 等,细胞 48,1987,pp. 887-897),酵母 BARl 信号肽(参见 WO 87/02670)或 酵母天冬氨蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M. Egel-Mi tani等,酵母,6,1990,pp. 127-137)。为了在酵母中有效地分泌,也可以将编码前导肽的序列插入到信号序列的下游 和编码酶的DNA序列的上游。前导肽的功能在于允许所表达的酶从内质网被引导到达高 尔基体,并进一步到达分泌泡以便分泌到培养基中(即酶穿过细胞壁或至少穿过细胞膜进 入酵母细胞的周质空间的输出)。前导肽可以是酵母α-因子前导肽(其用途在例如US 4,546,082,EP 16201,ΕΡ123294,EP 123544 和 EP 163529 中描述)。另外,前导肽可以是 合成的前导肽,这就是说前导肽不是天然发现的。合成的前导肽可以按照例如WO 89/02463 或TO 92/11378中的描述构建。对于在丝状真菌中的使用,所述信号肽可以方便地来源于编码Aspergillus sp.淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因,编码Miizomucor miehei脂酶或蛋白酶,Humicola lanuginosa脂酶的基因。所述信号肽优选地是来源于编码米曲霉TAKA淀粉酶,黑曲霉中性 α -淀粉酶,黑曲霉酸-稳定淀粉酶或黑曲霉葡糖淀粉酶的基因。分别用于连接编码所述酶的DNA序列、启动子以及可操作的终止子和/或分泌信 号序列的方法和将它们插入到包含复制所需信息的合适载体中的方法是本领域技术人员 已知的(参见,例如,Sambrook等,以上引用的)。宿主细胞引入到宿主细胞的编码所述酶的DNA序列对所说的宿主细胞而言可以是同源的 或者是异源的。如果对宿主细胞是同源的,即由宿主细胞天然,则其典型地被可操作连接到 另一启动子或者(可用的话)另一分泌信号序列和/或终止子序列上,而不是在其天然环 境中。术语"同源的"旨在包括编码所说宿主细胞天然酶的cDNA序列。术语"异源的" 旨在包括所说宿主细胞天然不表达的DNA序列。这样,所说的DNA序列可以来源于另一个 生物体,或者其可以是合成的序列。本发明的DNA构建体或重组载体引入其中的宿主细胞可以是能够产生本发明的 酶的任何细胞,包括细菌,酵母,真菌和高等真核细胞。经培养能够产生本发明的酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏-阳性菌,例如芽胞 杆菌属的菌株(如枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪 芽孢杆菌、Bacillus alkalophilus、液解化淀粉杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂 芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株)或链霉菌属的菌株(例如浅青紫链霉菌 或鼠灰链霉菌的菌株),或者革兰氏-阴性菌,例如大肠杆菌。可以用已知方法经原生质体 转化或者使用感受态细胞进行细菌的转化(参见Sambrook等,同上)。当在细菌(如大肠杆菌)中表达酶时,酶可以被保留在细胞质中(典型地是以被称作包含体的不溶性颗粒)或由细菌分泌序列引导到周质空间中。在前一种情况下,裂解 细胞,回收颗粒并变性,此后经稀释变性剂使酶再折叠。在后一种情况下,可以经裂解细胞 从周质空间回收所说酶,如通过超声波或渗透冲击以释放周质空间的内含物并回收酶。合适的酵母细胞的例子包括 Saccharomyces spp.或 Schizosaccharomyces spp. 的细胞,啤酒糖酵母或者克鲁弗酵母的特定菌株。用于用异源DNA转化酵母细胞并且从此 产生异源酶的方法在例如 US4,599,311,US 4,931,373,US 4,870,008,5,037,743,和 US 4,845,075(所有这些本文一并参考)中有描述。转化细胞由通过选择性标记确定的表型 选择。所述选择性标记一般是对药物的抗性或者在缺少特殊营养物(例如亮氨酸)的情况 下的生长能力。用于酵母的一个优选的载体是US 4,931,373中公开的POTl载体。编码本 发明的酶的DNA序列可以在信号序列和可有可无的前导序列之前,例如如以上所述的。合 适的酵母细胞的例子是克鲁维酵母属(如乳酸克鲁维酵母)、汉逊酵母属(例如多形汉逊 酵母)或毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母)的菌株(参见Gleeson等,遗传微生物学杂志 1321986,pp. 34593465 ;US 4,882,279)。其它真菌细胞的例子是丝状真菌的细胞,例如Aspergillus spp. , Neurospora spp.,Fusarium spp.或Trichoderma spp.,尤其是米曲霉,构巢曲霉,黑曲霉或禾谷镰孢的 菌株。EP 272277和EP 230023中描述了 Aspergillus spp.用于表达蛋白质的用途。尖镰 孢的转化可以例如按照Malardier等,1989,基因78 :147-156的描述进行。当丝状真菌用作宿主细胞时,其可以用本发明的构建体转化,通常是将所说DNA 构建体整合进宿主染色体中以获得重组体宿主细胞。这一整合一般被认为是有利的,因为 所述DNA构建体很可能稳定保持在细胞中。可以按照常规方法(如同源或者异源重组)将 所述DNA构建体整合进染色体中。然后在可以表达所说酶的条件下在合适的营养培养基中培养以上描述的转化或 转染宿主细胞,接着从培养物中回收所形成的酶。用于培养所说细胞的培养基可以是任何常规的适于培养所说宿主细胞的培养基, 例如含有适当补充物的最小或复合培养基。合适的培养基可以从供应商获得或者可以按照 出版的(例如美国典型培养物保藏中心目录中)配方制备。然后,由所述细胞产生的酶可 以用常规方法从培养基回收,所述方法包括经离心和过滤从培养基分离宿主细胞,借助盐 (如硫酸铵)沉淀上层清液或滤液中的蛋白质组份,依据所述酶的类型,用各种色谱分离方 法(如离子交换色谱,凝胶色谱,亲合色谱)纯化等。另一方面,本发明涉及产生按照本发明的酶的方法,其中在可以产生所述酶的条 件下培养合适的用编码酶的DNA序列转化的宿主细胞,并从培养物中回收所形成的酶。用分类学和牛杰学讲行的酶筛选设计来检测和选择所说类型的兴趣酶的象分子筛选之类的强有力的工具其自身 仍不能满足需要。为了使兴趣发现的机会最大,在这一研究中将分子筛选方法与小心选择 待筛选的真菌组合。通过全面考虑真菌的鉴别法、分类学类别和种系发生关系进行选择。如果包括生态学方法,则可以仅进一步地充分探讨溶纤酶产生的分类学热点。设 计聪明的筛选和取得成功的选择菌株和待研究的生态小生境需要适应各种底物的全面的 知识(尤其植物材料的腐生、神经营养或活体营养降解)。本文所公开的分类学和生态学方法两者的目标都是在分子筛选程序中最多地发现所述酶。然而,仍然有几百(或者如果包括了所有初期工作)几千种真菌被培养,以便检 测本文报道的所说类型的溶纤酶的53个目标。可以按以下所述进行筛选和克隆材料和方法生物体列表啤酒糖酵母 DSM 9770,DSM 10082,DSM 10080,DSM 10081 或大肠杆菌 DSM 10512、 DSM 1051UDSM 1057UDSM 10576分别含有质粒,该质粒包含在穿梭载体pYES 2.0中的编 码本发明的内切葡聚糖酶的全长DNA序列。大肠杆菌DSM 10583、10584、10585、10586、10587 和 10588。棉色二孢Cooke菌株的保藏保藏号CBS 274. 96分类位置子囊菌门(Ascomycota),腔菌纲,座囊菌目,葫芦霉科Ulospora bilgramii (Hawksw 等)Hawksw 等菌株的保藏号NKBC 1444,日本大学,(Prof. Tubaki保藏中心)分类位置子囊菌门,腔菌纲,座囊菌目,(科未分类)Microsphaeropsis sp.分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科,Guttiferales)分类位置子囊菌门,腔菌纲腔菌纲,座囊菌目,(科未分类)Macrophomina phaseolina(Tassi)Goidannich别名=Rhizoctonia bataticola菌株的保藏保藏号CBS 281. 96分离自在泰国生长的Glycine max (Leguminosa) cv CMM 60 的种子,1990分类位置子囊菌门,盘菌纲,斑痣盘菌目,斑痣盘菌科Rscobolus stictoideus SPeg.分离自挪威,Svalbard,鹅粪分类位置子囊菌门,盘菌纲,盘菌目,粪盘菌科Saccobolus dilutellus(Fuck. )Sacc.菌株的保藏保藏号CBS 275. 96分类位置子囊菌门,盘菌纲,盘菌目,粪盘菌科疣孢青霉 Peyronel物种的保藏号ATCC 62396分类位置子囊菌门,不整囊菌纲,散囊菌目,发菌科产黄青霉Hiom菌株的保藏号ATCC 9480分类位置子囊菌门,不整囊菌纲,散囊菌目,发菌科Thermomyces verrucosus Pugh 等菌株的保藏保藏号CBS 285. 96分类位置子囊菌门,不整囊菌纲,散囊菌目,(科未分类;affiliation基于18S RNA,测序以及同源性)
鹿角团炭角菌L. ex Greille菌株的保藏保藏号CBS 284. 96分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,炭角菌目,炭角菌科点孔座壳(Fr.ex L.) Fr.分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,炭角菌目,炭角菌科Nodulisporum sp.分离自在中国云南省昆明植物园中生长的山茶的叶片(茶科,Guttiferales)分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,炭角菌目,炭角菌科Cylindrocarpon sp.分离自海上样品,Bahamas分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,(科未分类)Acremonium sp菌株的保藏保藏号CBS 478. 94分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科蛇形镰孢Sherbakoff菌株的保藏号IF0 4467分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科早熟禾镰孢(Peck) fe.物种的保藏号ATCC 60883分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科腐皮镰孢(Mart. ) Sacc. emnd. Snyd&Hans.菌株的保藏号IMI 107. 511分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科ssp lycopersici (Sacc. ) Snyd. &Hans.菌株的保藏号CBS 645. 78分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科尖镰孢 ssp passiflora菌株的保藏号CBS 744. 79分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科链孢粘帚霉Gi 1 lman&Abbott菌株的保藏号CBS 227. 48分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,肉座菌科Nectria pinea Dingley菌株的保藏保藏号CBS 279. 96分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,小赤壳科Volutella colIetotrichoides菌株的保藏号CBS 400. 58分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,肉座菌目,(科未分类)大孢粪壳 Auerswald
物种的保藏号ATCC 60255分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,粪壳科H^IItE (Roberge)Cesati et De Notaris物种的保藏号ATCC 52644分离自H. Dissing 的粪,ISP,KU,丹麦分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,粪壳科灰腐质霉Traeen物种的保藏号ATCC 22726: ! =Hatfield Polytechnic分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,(科未分类)黑腐质霉Omvik菌株的保藏号CBS 819. 73分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,(科未分类)Scytalidium thermophiIum(Cooney et Emerson)Austwick菌株的保藏号ATCC 28085分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,(科未分类)Thielavia thermophi la Fergus et Sinden (别名 Corynascusthermophi lus)菌株的保藏号=CBS174. 70,IMI 145. 136分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科分离自蘑菇堆肥Thielavia terrestris (Appinis)Malloch et Cain菌株的保藏号NRRL8U6分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科Cladorrhinum foecundissimum Saccardo et Marchal物种的保藏号ATCC 62373分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛球壳科分离自牙买力口达拉斯山 Selandin sp (Compositaceae, Asterales)的叶片Syspastospora boninensis菌株的保藏号NKBC 1515(日本大学,profe Tubaki保藏中心)分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,獎壳目,Cerastoma taceae管毛壳Fuckel菌株的保藏号CBS 799. 83分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科巴西毛壳 Batista et Potual菌株的保藏号CBS 122. 65分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科墙毛壳 Corda菌株的保藏号CBS 163. 52分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科
Chaetomium virescens(von Arx)Udagawa菌株的保藏号CBS 547. 75分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科Myceliophthora thermophila(Apinis)Oorschot菌株的保藏保藏号CBS 117. 65分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,粪壳目,毛壳科Nigrospora sp菌株的保藏保藏号CBS 272. 96分离自在牙买力口 Christiana 中生长的 Artocarpus altilis 的叶片,Moraceae, Urticales分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes, Trichosphaeriales,(禾斗未分类)Nigrospora sp分离自云南昆明植物园的Pinus yuannanensis的叶片分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,假毛球壳目,Abietaceae,Pinales。Diaporthe syngenesia菌株的保藏保藏号CBS 278. 96分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,Diaporthales,黑腐皮壳科葫芦科刺盘孢(Passerini)Ellis et Halsted别名围小丛壳orbiculare变种 Jenkinset Winstead物种的保藏号ATCC 52609分类位置子囊菌门,Pyrenomycetes,黑痣菌目黑胶耳Fr.菌株的保藏保藏号CBS 277. 96分类位置担子菌门,层菌纲,木耳目,黑耳科Crinipellis scabella(ALb. Schw. :Fr.)Murr菌株的保藏号CBS观0. 96分类位置担子菌门,层菌纲,蘑菇目网纹斑褶菇(Fr.)Gill.菌株的保藏号CBS 275. 47分类位置担子菌门,层菌纲,蘑菇目,鬼伞科木蹄层孔菌(L.) Fr.菌株的保藏保藏号CBS 276. 96分类位置担子菌门,层菌纲,非褶菌目,!^mitaceaeSpongipellis sp.菌株的保藏保藏号CBS 283. 96分类位置担子菌门,层菌纲,非褶菌目,烟管菌科(由18S序列和同源性分类学鉴 别和相联系)血红栓菌(Fr. ) Lloyd别名血红多孔菌;血红密孔菌(L. :Fr.)菌株的保藏号AKU 5062 (京都大学培养物保藏中心)
2
分类位置担子菌门,非褶菌目,多孔菌科Schizophyllum commune Fr.物种的保藏号ATCC 38548分类位置担子菌门,非褶菌目,裂褶菌科红根囊壶菌(de Bary&ffor)Fischer菌株的保藏号CBS 282. 96分类位置壶菌门,壶菌纲,Spizellomycetales, SpizellomycetaceaeRhizomucor pusillus (Lindt) SchipperSPl^M菌株的保藏号IF0 4578物种的保藏号ATCC 46883分类位置接合菌门,接合菌纲,毛霉目,毛霉科iHjt^lM (Kunze) vanTieghem&Le Monnier菌株的保藏号IF0 4814物种的保藏号ATCC 16327分类位置接合菌门,接合菌纲,毛霉目,毛霉科^11^vanTieghem&Le Monnier■ Helicostylum fresenii菌株的保藏号NRRL 2305分类位置接合菌门,接合菌纲,毛霉目,rhamnidiaceae未分类的粉红单端孢菌株的保藏号IF0 5372Coniothecium sp植物内寄生菌,分离自在中国云南省昆明的未鉴别的高等植物的叶片未分类和未鉴别的菌株的保藏保藏号CBS 271. 96分离自牙买力口 Christiana 生长 Artocarpus altilis (桑科,Urticales)的叶片菌株的保藏保藏号CBS 273. 96分离自牙买加达拉斯山生长的Pimenta dioica(桃金娘科,Myrtales)的叶片菌株的保藏号CBS 270. 96分离自牙买加达拉斯山生长的Pseudocalymma alliaceum(紫葳科,Solanales) 叶片其它菌株大肠杆菌MC1061 和 DHlOB。酵母菌株所使用的啤酒糖酵母菌株是W3124(MATa ; ura 3-52 ;leu2_3,112 ; his3-D200 ;ρ印4-1137 ;prcl :HIS3 ;prbl :LEU2 ;cir+)。质粒曲霉属表达载体pHD414是质粒p775 (在EP 238023中描述)的衍生物。pHD414 的构建在WO 93/11249中有进一步的描述。pYES 2. O(Invitrogen)。
pA2C477, pA2C193, pA2C357, pA2C371,pA2C385, pA2C475, pA2C488, pA2C502 (参见 实施例1、2、3和4)。分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中所示的DNA序列的分离:通过用本领域已知的方法(Sambrook等(1989)分子克隆实验室手册,冷泉港 实验室,冷泉港,纽约)经抽提质粒,可以分别从保藏的生物体啤酒糖酵母DSM 9770、DSM 10082、DSM 10080、DSM 10081、大肠杆菌 DSM 10512、DSM 10511、DSM 10571 或 DSM 10576 获得全长DNA序列,这些全长DNA序列包含分别在SEQ ID NO :1、4、6、8、10、12、16或19中 所示的编码本发明的内切葡聚糖酶的cDNA序列。分子筛选本发明的纤维素酶的PCR引物四个简并的含脱氧肌苷的寡核苷酸引物(有义;s和反义;asl、as2和as3)相应 于四个高度保守氨基酸区,这些区在Thielavia terrestris纤维素酶、Myceliophthora thermophiIum纤维素酶和两种来源于Acremonium sp.的纤维素酶的推定的氨基酸序列中 发现,按照Myceliophthora thermophilum序列对残基编号。在引物序列中脱氧肌苷由I 表示,限制位点上有下划线。
27
35NH2 -ThrArgTyrTrpAspCysCysLysPro/Thr-C00H
s 5-CCCCAAGCTT ACIAGITACTGGGACTGCTGCAAAAC-3'
HindIIICTTTTGC106111
NH2-TrpCysCysAlaCysTyr--COOH
asl3'-CCACAACACGIACAATAGATCTGATC-5'
GGGXbaI
145152
NH2-ProGlyGlyGlyLeu7/ValGlyIle/LeuPhe--COOH
as23'-GGICCICCICCIAAICCIMIAAAGATCTGATC-
CGXbaI
GT
193198
NH2-TrpArgPhe/Tyr Asp TrpPhe- COOH
as33'-CCGCIAAACTAACCAAAAGATCTGATC-5'
TTGGGXbaI经聚合酶链反应(PCR)进行分子筛选 基因组DNA和双链cDNA的体外扩增按照以下描述从5微克Poly(A)+RNA定向合成双链cDNA。按照klton等的描述 分离基因组DNA。 在PCR缓冲液中经PCR扩增约10至20ng双链纤维素酶-诱导的cDNA或100 至200ng选择的真菌菌株的基因组DNA,所说缓冲液(IOmMTris-HCl (pH8. 3)、50mM KC1、 1. 5mMMgCl2,0. 01% (w/v)明胶)包含200 μ M各dNTP禾口 IOOpmol按以下组合的各简并引 物
术语“除去丸状物”指从织物表面除去丸状物。术语“浸泡液体”指这样的一种含水的液体,要洗的衣物在进行常规洗涤过程前要 浸泡在其中。浸泡液体可包含一种或多种通常用于洗涤或洗涤方法的组分。术语“洗液”指这样的一种含水的液体,在其中要洗的衣物进行洗涤过程,即通常 是一种手工或在洗衣机中的化学或机械结合的作用。通常,洗液是粉剂或液体洗涤剂组合 物的水溶液。术语“冲洗液体”指这样的一种含水的液体,为了冲洗要洗的衣物,即实质上从要 洗的衣物中除去洗涤剂溶液,在其中浸泡并处理要洗的衣物,通常是在洗涤过程之后立即 进行。冲洗液体可包含织物条理或软化组合物。按照本发明的方法要洗的衣物可以是常规的可洗的衣物。优选地,要洗的衣物的 主要部分是缝合或未缝合的织物,包括从棉制造的编织物(knits)、编织物(wovens)、斜纹 粗棉布、纱线和毛巾、棉混纺物或天然或人造纤维素(如制自包含木聚糖的纤维素织物,如 制自木浆)或其混合物。混合物的例子是具有一种或多种辅助材料的棉或人造纤维/纤维 胶(如羊毛、合成纤维(如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤 维、聚偏二氯乙烯纤维、聚氨甲酸乙酯纤维、聚脲纤维、aramid纤维)以及包含纤维素的纤 维(如人造纤维/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、乙酸纤维素纤维、lyocell)。洗涤剂组合物按照本发明的一个方面,本发明的内切葡聚糖酶可典型地是洗涤剂组合物的组 分。同样地,它们可以以非尘状粒剂、稳定液体或受保护的酶形式包括在洗涤剂组合物中。 非尘状粒剂可按照,如在US 4,106,991和4,661,452所(二者都属于Novo Industri A/S) 公开的方法产生并可有可无地按照本领域的方法包衣。蜡状的表面盖覆剂的例子是平均分 子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇,PEG);具有16至50个环氧乙烷 单位的乙氧基化的壬基酚;乙氧基化的脂肪醇(其中醇包含12至20个碳原子,具有15至 80个环氧乙烷单位);脂肪醇;脂肪酸;脂肪酸的甘油单、双和三酸酯。在专利GB 1483591 中给出了通过流化床技术制成的适于应用的形成薄片的表面盖覆剂的例子。如液态酶制剂 可按照已制定的方法通过添加多羟基化合物(如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸)稳定。其 它酶稳定剂在本领域中是已知的。受保护的酶按照在EP 238,216中公开的方法制备。本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式,如粉剂、粒剂、糊剂或液体。液体 洗涤剂可是水溶液,典型地包含多达70%的水和0-30%的有机溶剂,或非水溶液。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂,每种活化剂可以是阴离子、非离子、 阳离子或两性离子的。洗涤剂通常包含0-50%阴离子表面活性剂,如线性烷基苯磺酸盐 (LAS)、α -烯烃磺酸盐(AOS)、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸酯)(AQ、脂肪醇乙氧基硫酸盐 (AE0S或AES)、仲烷烃磺酸盐(SAQ、α -硫代脂肪酸甲基酯、烷基或烯基琥珀酸或皂。它可 以包含0-40%的非离子表面活性剂,如脂肪醇乙氧基化物(ΑΕ0或AE)、羧化的脂肪醇乙氧 基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺、 脂肪酸单乙醇酰胺或聚羟烷脂肪酸酰胺(如如在WO 92/061Μ中所描述的)。洗涤剂组合物还可包含一种或多种其它酶,如淀粉酶、脂酶、角质酶、蛋白酶、过氧 化物酶和氧化酶,如漆酶。洗涤剂可包含1-65%洗涤剂助洗剂或配位剂,如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯、柠檬酸盐、次氨基三乙酸(NTA)、乙二氨四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTMPA)、烷基 或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层硅酸盐(如得自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂也可无助洗 剂,即实质上不含洗涤剂助洗剂。 洗涤剂可包含一种或多种聚合物。例子是羧甲基纤维素(CMC)、聚(乙烯吡咯烷 酮)(PVP)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚羧酸酯,如聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸 共聚物和甲基丙烯酸月桂基酯/丙烯酸共聚物。 洗涤剂可包含漂白系统,该系统包含H2O2源,如与形成过酸的漂白活化剂(如四乙 基乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸盐(NOBQ)结合的过硼酸盐或过碳酸盐。另外,漂白系统 可包含过酸,如酰胺、酰亚胺或砜型。本发明的洗涤剂组合物的酶可以使用常规的稳定剂稳定,如多羟基化合物(如丙 二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物,如芳族硼酸酯,组合物可按照在如WO 92/19708和WO 92/19709中所述制成制剂。洗涤剂也可包含其它常规的洗涤剂组份,如织物调理剂,包括粘土、泡沫辅助剂、 抑泡剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、抗污物再沉积剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂或香料。pH(于使用浓度下在水溶液中测量)通常是中性或碱性的,如在7-11的范围内。在本发明的范围之内洗涤剂组合物的具体形式包括1) 一种制成粒剂的具有至少600g/l的堆密度的洗涤剂组合物,该组合物包含
线性烷基苯磺酸盐(按酸计)7-12%乙氧基脂肪醇硫酸酯(如C12_18醇, 1-2E0)或烷基硫酸盐(如C16_18)1-4%乙氧基脂肪醇(如C14_15醇,"7E0)5-9%碳酸钠(计为Na2CO3)14-20%可溶性硅酸盐(计为N 0,2Si02)2-6%沸石(计为NaAlSiO4)15-22%硫酸钠(计为Na2SO4)0-6%柠檬酸钠/柠檬酸(计为 C6H5Na3(VC6H8O7)0-15%过硼酸钠(计为NaBO3 · H2O)11-18%TAED2-6%羧甲基纤维素0-2%
权利要求
1.一种显示内切葡聚糖酶活性的酶,该酶a)具有SEQID NO. 17所示的氨基酸序列;b)与SEQID NO. 17所示氨基酸序列有至少90%的等同性c)通过对SEQID NO. 17所示氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代,缺失或添加而 获得的氨基酸序列;或d)在于5X SSC中45°C下杂交和于2 X SSC中70°C下洗涤的条件下,与下列序列杂交的 核酸序列所编码的多肽i)SEQID NO 16中所示的DNA序列,ii)从大肠杆菌DSM10571中的质粒获得的DNA序列,或iii)所述i)或ii)的序列的互补链。
2.权利要求1所述的酶,其中该酶由SEQID NO. 17所示的氨基酸序列组成,或由SEQ ID NO. 17所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代,缺失或添加而获得的氨基酸序列 组成。
3.权利要求1或2所述的酶,其中该酶得自Volutellacolletotrichoides的菌株。
4.一种编码权利要求1-3任一项所述的酶的DNA序列。
5.一种DNA构建体,该构建体包含权利要求4所述的DNA序列。
6.一种重组表达载体,该载体包含权利要求5所述的DNA构建体。
7.一种细胞,该细胞包含权利要求5所述的DNA构建体或权利要求6的重组表达载体。
8.一种用于制备权利要求1-3任一项所述的酶的方法,该方法包括在可以产生所述酶 的条件下,培养按照权利要求7所述的细胞,并从培养物中回收所述的酶。
9.一种使要洗的衣物颜色澄清的方法,该方法包括用包含权利要求1-3任一项所述的 酶的制剂的浸泡、洗涤或冲洗液体处理要洗的衣物。
10.权利要求9的方法,其中所说的内切葡聚糖酶在机器循环使用条件下,以每升液体 1到1000S-CEVU的有效量存在于浸泡、洗涤或冲洗液体中。
11.一种洗衣组合物,该组合物包含用权利要求1-3任一项所述酶的制剂,以及选自表 面活性剂、助洗剂化合物和织物软化剂的化合物。
12.权利要求1-3任一项所述的酶在降解或修饰植物材料上的用途。
13.权利要求1-3任一项所述的酶在处理织物原料或织物中的用途。
14.权利要求1-3任一项所述的酶在处理纸浆中的用途。
全文摘要
一种在洗涤剂,洗涤,纺织和造纸纸浆应用中性能良好的酶制剂,该制剂实质上由具有溶纤活性的酶组成,所述酶包含具有序列Thr Arg X3 X4 AspCys Cys X8 X9 X10 Cys X12 Trp X14(其中X3和X4各自分别是Trp、Tyr或Phe;X8是Arg、Lys或His;X9、X10、X12和X13各自是20个天然氨基酸残基中的任何一个)的14个残基的第一氨基酸序列和具有序列TrpCys Cys XX4 Cys(其中XX4是20个天然氨基酸残基中的任何一个)的5个残基的第二氨基酸序列,其条件是在第一氨基酸序列中,(i)当X12是Ser时,X14不是Ser,和(ii)当X12是Gly时,X14不是Ala。
文档编号D21H21/10GK102146362SQ200910253758
公开日2011年8月10日 申请日期1996年3月18日 优先权日1995年3月17日
发明者L·N·安德森, L·朗厄, M·S·考皮宁, M·伊哈拉, M·肖莱恩, R·I·尼尔森, S·F·拉森, S·塔卡基 申请人:诺沃奇梅兹有限公司
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