专利名称：一种以4.1r、cd29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物领域，涉及一种抗肿瘤药物筛选模型的制备，即制备 C57BL/6J_4. 1尺-/_1^ 细胞模型，以期作为以4. 1R和CD29为耙标的新药制备和基因治疗的 细胞筛选模型。
背景技术：
蛋白4. 1 (指红细胞膜蛋白经SDS-PAGE后第4. 1条显色带)是红细胞中以血影 蛋白(spectrin)为基础的细胞膜骨架的一个基本成分[1]，是将红细胞跨膜蛋白和血影蛋 白-肌动蛋白骨架网络连接起来的桥梁，对维持红细胞的形状、粘附、脆性及正常生理功能 发挥重要作用[2]。人类蛋白4. 1表达缺失会导致溶血性贫血[3]。因蛋白4. 1最初是在成 熟红细胞中发现的，故命名为4. 1R。最近几年，又相继发现了三种与4. 1R有很高同源性的 蛋白质，分别命名为4. 1G(广泛表达)，4. 1N(主要在神经元中表达)，4. 1B(主要在脑中表 达)，这四种蛋白质的基因即构成了蛋白4. 1基因家族。蛋白4. 1家族成员都具有三个高 度保守的功能性结构域氨基端的膜结合结构域MBD(Membrane binding domain)、血影蛋 白-肌动蛋白结合结构域SABD(Spectrin actin binding domain)和参与细胞信号转导的 羧基末端结构域(C-terminal domain)。其氨基末端膜结合结构域MBD在序列和空间折叠 上都与ERM蛋白(Ezrin radisin moesin)氨基末端膜结合结构域具有同源性，被统称为 FERM结构域(four_point_one， ezrin， radixin， moesin domain)，拥有FERM结构域的蛋白 被称为4. 1蛋白超家族[1]。已有报道表明ERM蛋白在T细胞活化中发挥重要作用[4—5]，且 Tang TK等[6—7]人也观察到人T细胞中4. 1R在微管组织中心(MT0S)高表达。
最近有研究发现，4. 1R的缺失会使小鼠CD4+T细胞大量活化增殖，即提出4. 1R在 T细胞活化中可能起着重要的调控作用[8]。本专利建立的4. 1R敲除小鼠胚胎成纤维细胞， 可在体外研究4. 1R对T细胞依赖性免疫应答的调控，为以4. 1R为药靶研究T细胞相关性 疾病提供实验材料。 在国内，胃癌、结肠癌、食管癌和乳腺癌的发病率较高，且治愈较难，因此寻找有效 的靶点制备抗癌药物对缓解病情具有一定的临床应用价值。有文献报道，在脑膜瘤[9]、室管 膜瘤[1°]、非小细胞肺癌[11]、食管小细胞癌[12]、乳腺癌[13]和胃癌M等多种癌症中，蛋白4. 1 表达下降或表达缺失，并且越来越多的临床和实验证据证实编码蛋白4. 1的基因在多种肿 瘤中表现出抑癌基因的作用[15]，这表明蛋白4. 1与肿瘤的发生和发展有着密切的关系。高 艳峰等报导4. 1B在食管鳞状细胞癌中表达异常[16]。因此，以蛋白4. 1作为药靶进行抗肿 瘤药物的筛选具有一定的临床意义和实用价值。 整合素(Integrins)是广泛存在于动物细胞表面的一类细胞粘附分子，是一种由 a和|3亚基组成的异二聚体穿膜糖蛋白，它介导细胞与细胞外基质(ECM)及细胞与细胞间 的相互作用，参与细胞内外信息传递，在细胞分化、胚胎发育、凝血、组织修补及细胞粘附、 侵袭等各方面起着重要作用[5]。 一般认为，整合素可剌激抗细胞凋亡机制，使肿瘤细胞延迟
3死亡或促进肿瘤细胞生长。整合素与肿瘤的关系主要表现在肿瘤的生长与转移方面在肿
瘤发生早期，整合素表达降低可导致肿瘤细胞与ECM的粘附作用减弱，从而有利于肿瘤在 局部生长和扩散；肿瘤细胞进入血循环后，整合素表达增多有利于肿瘤细胞粘附于血管内 皮，继而发生转移等。整合素表达的上调或下调，是评价肿瘤发生和预后的有效标志。有文 献曾报道，整合素P l(P lintegrin，CD29)在SHG44胶质瘤细胞中高表达，并与胶质瘤细胞 增殖、生存密切相关，抑制整合素P 1的表达可促进胶质瘤细胞的凋亡[17];余小东等人也发 现，食管鳞状细胞癌组织中整合素P 1表达明显下降[18]。最近有研究发现，整合素13 1的 过表达会抑制贺赛汀(trastuz咖ab)对HER-2型乳腺癌的抗癌作用[19—2°]，阻断肿瘤细胞与 细胞外基质的作用可以逆转肿瘤的耐药作用，这也为临床逆转肿瘤耐药提供了新的思路。
我们在前期的研究中首次发现蛋白4. 1R基因敲除小鼠(4. 1R gene knockoutmice)胚胎成纤维细胞(MEF)中CD29表达量上调，但细胞表面被活化的CD29分 布却显著降低。我们已经知道，由于4. 1R基因缺失可使人的红细胞膜骨架结构改变，细胞 膜表面蛋白分子分布异常[21—22]。因此，本发明建立的细胞模型为体外研究4. 1R的缺失和 细胞粘附分子CD29与肿瘤的发生和转移的关系提供了可能，并使其成为研究以4. 1R、CD29 为靶向的抗肿瘤药物不可缺少的筛选模型。 目前我们采用"基因敲除"技术，沉默小鼠基因组中蛋白4. 1R的表达，建立了具有 C57BL/6J遗传背景的4. 1R基因敲除小鼠导入近交系。为研究以4. 1R和CD29为耙向的药 物筛选提供了平台。但是基因敲除小鼠动物模型的饲养管理需要特殊技术要求和环境设 施，日常维持成本过高，不利于运输保存。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术的状况而提供了一种以4. 1R、 CD29为靶点 的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用，即以C57BL/6J遗传背景的4. 1R基因敲除 小鼠为材料制备了 4. 1R基因缺失的小鼠胚胎成纤维细胞系(Miceembryos fibroblast, MEF)，给以蛋白4. 1R和CD29为药耙的新药筛选和基因治疗提供模型。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 本发明的以4. 1R、 CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法，包括以下步 骤 (1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养①取C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠胚胎，去除头、心脏和肝脏，其余部分用PBS洗涤3 次，充分去除红细胞后，剪成组织块，每个胚胎加0. 25%冷胰蛋白酶，41:过夜；
②6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于组织体积的胰蛋白酶，37t:水浴 30min，加含10%胎牛血清的DMEM培养基，充分混匀，沉淀lmin，将上清移到一只新的无菌 离心管中，而沉淀加入新的DMEM培养基，重复该分离步骤； ③将上清合并，以1000rpm/min离心10min，收集细胞，用10mlDMEM培养基重新悬 浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度接种于75cm培养瓶中，于37t: 5% 0)2培养箱内培养过 夜； ④6-12h后，弃培养基，PBS洗2次，加入新的DMEM培养基至长成单层，1 : 5传 代；
4
(2)小鼠胚胎成纤维细胞永生化①865细胞(ATCC Number :CRL_7601)在MDEM培养基中培养48h后，以lOOOrpm/ min离心10Min，收集上清后，进行滤膜(规格为0. 4 y m)过滤，滤液按1 : 5000(体积比 滤液:聚凝胺=1 : 5000)加入聚凝胺(polybrene) (sigmas-2667， 40mg/ml)备用;
②将5X 105个传至第3代的MEF细胞加入5ml上述含聚凝胺的SV40病毒大T抗 原滤液中，培养24h后弃培养液，换成DMEM正常培养基进行传代培养；
③培养至10代后，液氮罐中冻存。 本发明的4. 1尺-/_1￡ (小鼠胚胎成纤维细胞)模型的应用，为以蛋白4. 1R和CD29
为药靶的新药筛选制备和基因治疗提供离体细胞模型。 本发明的优点在于 (1)本发明具有唯一性和原始创新性。目前，国内、外尚未见以蛋白4. 1R为靶标的 新药筛选和基因治疗细胞模型的专利和相关报道。 (2)本发明具有先进性。本发明以蛋白4.1R基因敲除小鼠为实验材料 制备了 C57BL/6J_4. 1R-/-MEF原代细胞，用SV40大T抗原转化法得到的永生化 C57BL/6J_4. 1R-/-MEF在体外已传至第30代，其形态与C57BL/6J_4. 1R+/+小鼠MEF无差 异。经蛋白免疫印记技术检测，建立的C57BL/6J_4. 1R-/-MEF细胞模型，既具有C57BL/6J 遗传背景，又成功沉默了蛋白4. 1R的基因表达，可以为生产以4. 1R为靶向的新药提供筛选 模型。避免了因基因敲除动物饲养成本高，原代细胞在体外传代受限等因素对以4. 1R为治 疗靶向的药物筛选和生产而产生的局限。因此，建立可在体外传代培养的基因敲除MEF工 程细胞系更加符合"减少、替代、优化"的实验动物发展"3R"原则，降低了靶向新药生产成 本。 (3)本发明具有广泛的适用性。本发明建立的C57BL/6J_4. 1R-/-MEF,由于4. 1R的 缺失，其细胞表面CD29的活化被抑制。因此，本发明制备的细胞模型可以成为生产以CD29 为靶向，研究与细胞增殖和迁移、细胞因子分泌、细胞信号转导调控及肿瘤耐药等相关的抗 肿瘤新药的筛选模型。 此外，由于MEF具有体外培养传代易行，分裂增殖迅速，纯度高等特点，可作为一 种体外模型，对外界环境中有害因子(物理、化学和生物)进行检测，评价其对人体可能产 生的危害。已有研究证明将小鼠胚胎成纤维细胞体外暴露于氯化镉、甲醛中，可造成其存 活率下降和遗传损伤。因此，本发明建立的C57BL/6J_4. 1R-/-MEF也可作为一种新的环境 评价因子，来检测环境中镉和甲醛对细胞的毒副作用。
图1为永生化的4. 1R WT/K0 MEF形态学比较图。注WT :C57BL/6J_4. 1R+/+小鼠MEF K0 :C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠MEF 图2为4. 1R、4. 1N、4. 1B、4. 1G， Paxillin和P lintegrin在4. 1R WT/KOMEF中的表达。 图3为4. 1R WT/KO MEF中CD29的活化情况比较图。(A)4. 1R WT/KOMEF中未活 化的CD29含量比较(B)4. 1RWT/K0 MEF中活化的CD29含量比较；图中1 :unstained cells CD29(空白对照)；2 :WT/MEF-CD29 ;3 :K0/MEF_CD29
具体实施例方式本发明以下结合实施例(附图)做进一步描述
1.实验材料 野生型C57BL/6J近交系小鼠(C57BL/6J_4. 1R+/+) 、4. 1R基因敲除C57BL/6J近交 系小鼠(C57BL/6J_4. 1R-/-)，均为2月龄的SPF小鼠(special pathogen freemouses)， 饲养在屏障系统(barrier system)中。含SV40大T抗原的865细胞系(ATCCNumber : CRL-7601)在MDEM(Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium)培养基中，37°C 、5% C02条 件下培养。 2.实验方法 2. 1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养①2月龄C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠在下午6:00按雌雄1 : 1配对合笼，每天早晨 观察雌鼠生殖道有无精栓(乳白色胶状物)，于发现精栓的当日记录胚胎日龄为0. 5d ;
②当小鼠胚胎发育至13. 5d-15. 5d时，用乙醚麻醉妊娠雌鼠，无菌取出妊娠子宫， PBS(磷酸盐缓冲液，pH 7.2，下同)洗涤胎鼠，胎鼠置一无菌培养皿内，去除头、心脏和肝 脏，其余部分用PBS洗涤3次，充分去除红细胞后，剪成组织块，每个胚胎加0. 25%的冷胰蛋
白酶，4t:过夜； ③6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于组织体积的胰蛋白酶，组织块于 37t:水浴30min，加含10%胎牛血清的DMEM培养基，充分混匀，沉淀lmin，将上清移到一只 新的无菌离心管中，而沉淀加入新的匿EM培养基，重复分离步骤③； ④将上清合并，以1000rpm/min离心10min，收集细胞，用10ml DMEM培养基重新 悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度接种于75cm培养瓶中，于37t: 5% 0)2培养箱内培养过 夜； ⑤6-12h后，弃培养基，PBS洗2次，加入新的DMEM培养基至长成单层，1 : 5传 代。 注C57BL/6J_4. 1R+/+小鼠作为基因敲除小鼠对照系，同时建立MEF细胞系。
2. 2小鼠胚胎成纤维细胞永生化 ①865细胞在MDEM培养基中培养48h后，以1000rpm/min离心10min，收集上清后， 进行滤膜(规格为O. 4iim)过滤，滤液按l : 5000加入聚凝胺(polybrene) (sigma s_2667， 40mg/ml)备用; ②将5 X 105个传至第3代的MEF细胞加入5ml上述含聚凝胺的SV40病毒大T抗 原滤液中，培养24h后弃培养液，换成DMEM正常培养基进行传代培养；
③培养至第10代后，液氮罐中冻存。 注C57BL/6J_4. 1R+/+小鼠作为基因敲除小鼠对照系，进行相同处理。
3.检测结果 3. 1C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠MEF原代培养及永生化 我们从C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠分离的MEF在体外传至第7代增殖能力显著降低， 传至第13代则全部死亡，而用SV40大T抗原转化法得到的永生化MEF在体外最多已传至 第30代，其形态与C57BL/6J_4. 1R+/+小鼠MEF无差异。见图1。
3. 2C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠MEF相关基因表达检测 用蛋白免疫印迹法(Western blotting或I匪noblotting)检测 C57BL/6J_4. 1R-/-小鼠永生化MEF中4. 1R、4. 1B、4. 1G、4. 1N、 Paxillin(桩蛋白)、 P lintegrin(CD29)、 P-Actin ( P -肌动蛋白)的表达。 与C57BL/6J_4. 1R+/+MEF相比，C57BL/6J_4. 1R-/-MEF中分子量为135kDa、80kDa 的蛋白4. 1R分子表达缺失，而4. 1蛋白家族的其他成员4. 1B、4. 1N、4. 1G及Paxillin表达 正常，|3 lintegrin表达上调。见图2。
3. 3流式细胞术检测细胞表面CD29的活化 纤维粘连蛋白(Fibronectin，FN)包被的MatTek(聚焦显微镜专用玻底培养皿)6 孔细胞培养板分别接种C57BL/6J_4. 1R-/-和C57BL/6J_4. 1R+/+永生化MEF细胞，细胞长 至单层，细胞消化后用BD Fc BlockTM试剂(BD Pharmingen公司)封闭lOmin，PBS洗涤后分 别用CD29活化和非活化一抗孵育lh，PBS洗3次，聚乙烯(PE)标记的二抗孵育30min，PBS 洗涤，流式细胞仪(FACS-CANTO ，BD Biosciences公司)检测，Diva软件(BD Biosciences 公司)分析，实验结果表明4. 1R表达缺失抑制了 MEF细胞表面CD29的活化。见图3。
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权利要求
一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)原代培养①取C57BL/6J_4.1R-/-小鼠胚胎，去除头、心脏和肝脏，其余部分用PBS洗涤3次，充分去除红细胞后，剪成组织块，每个胚胎加0.25％冷胰蛋白酶，4℃过夜；②6-12h后，吸去多余的胰蛋白酶，留下2倍于组织体积的胰蛋白酶，37℃水浴30min，加含10％胎牛血清的DMEM培养基，充分混匀，沉淀1min，将上清移到一只新的无菌离心管中，而沉淀加入新的DMEM培养基，重复该分离步骤；③将上清合并，以1000rpm/min离心10min，收集细胞，用10mlDMEM培养基重新悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度接种于75cm培养瓶中，于37℃5％CO2培养箱内培养过夜；④6-12h后，弃培养基，PBS洗2次，加入新的DMEM培养基至长成单层，1∶5传代；(2)小鼠胚胎成纤维细胞永生化①865细胞(ATCC NumberCRL-7601)在MDEM培养基中培养48h后，以1000rpm/min离心10min，收集上清后，进行滤膜过滤，滤液按1∶5000加入聚凝胺备用；②将5×105个传至第3代的MEF细胞加入5ml上述含聚凝胺的SV40病毒大T抗原滤液中，培养24h后弃培养液，换成DMEM正常培养基进行传代培养；③培养至10代后，液氮罐中冻存。
2. —种权利要求1所述的以4. 1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的应用，为以蛋 白4. IR和CD29为药靶的新药筛选制备和基因治疗提供离体细胞模型。
全文摘要
一种以4.1R、CD29为靶点的抗肿瘤药物筛选模型的制备方法及其应用，以蛋白4.1R基因敲除小鼠为实验材料制备C57BL/6J_4.1R-/-MEF原代细胞，用SV40大T抗原转化法得到的永生化C57BL/6J_4.1R-/-MEF。本发明的目的是为以蛋白4.1R和CD29为药靶的新药筛选和基因治疗提供离体细胞筛选模型。其优点在于避免了因基因敲除动物饲养成本高，原代细胞在体外传代受限等对以4.1R为治疗靶的药物筛选和生产产生的局限。降低靶向新药生产成本。本发明所建立的C57BL/6J_4.1R-/-MEF，细胞表面CD29活化由于4.1R的缺失而被抑制，可以成为生产以CD29为靶向，研究与细胞增殖和迁移、细胞因子分泌、细胞信号转导调控及肿瘤耐药等相关的抗肿瘤新药的筛选模型。
文档编号C12N5/073GK101787357SQ20101011958
公开日2010年7月28日 申请日期2010年3月9日 优先权日2010年3月9日
发明者周晴晴, 安秀丽, 康巧珍, 汲振余, 王婷, 阎红霞, 陈鲤翔 申请人:郑州大学