专利名称：一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法
技术领域：
本发明涉及一种显微成像技术，特别涉及一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法。
背景技术：
共焦显微技术最初的主要目的是消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多种散射光。激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的分子生物学和细胞生物学研究仪器。它在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，结合数据化图像处理技术，采集组织和细胞内荧光标记图像，在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化，并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。激光扫描共聚焦显微镜对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好的会聚，可以全部通过针孔被探测器接收。而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。而且随着距离物镜焦平面的距离越大，样品所产生的杂散光在针孔处的弥散斑就越大， 能透过针孔的能量就越少，因而在探测器上产生的信号就越小，影响也越小。由于它的应用范围较广泛，已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学和药理学等研究领域中很重要的研究技术。共焦显微镜从产生至今获得了巨大的发展，扫描方式从最初的狭缝扫描方式(扫描速度较快，图像分辨率不高)，到阶梯式扫描技术(提高了图像分辨率，标本制备要求太高)，再到驱动式光束扫描器(扫描速度较快，符合共聚焦原理)，又出现使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜、三维数字共焦拉曼显微镜以及光纤耦合多路复用共焦显微镜等新型共焦显微镜。频分复用荧光共焦显微成像的概念和构想诞生于2006 年，当时只能通过马赫曾德光路和机械斩波器实现双路频分复用荧光共焦系统，系统的体积很大。为了真正实现多路频分复用系统，发明人曾提出采用离轴全息透镜阵列实现多路频分复用荧光共焦成像系统，但是由于离轴系统对角度要求很高，造成了系统实现的麻烦。 为此，我们又提出了采用同轴电控变焦聚合物分散液晶的多通道频分复用荧光共焦实现方法。该系统的关键器件是同轴液晶透镜，具有集成式设计，易于操作，通过面型和电场调控实现共焦和离焦控制。这样使得频分复用荧光共焦的概念具体的实现成为容易操作，易于实现的系统，同时该系统具有体积小，无运动部件等优点。
发明内容
本发明是针对现有传统的共焦显微镜和离轴多路频分复用荧光共焦显微系统存在的问题，提出了一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，系统采用NXN 式透镜阵列来实现斩波，能够实现多点荧光信号的并行实时高速探测，并且具有高的空间分辨率和时间分辨率等特点。本发明的技术方案为一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，骤
O搭建NXN通道多频调制激光光路将激光器、扩束镜、同轴H-PDLC透镜阵列、滤波板、透镜同轴依次搭建，并与平台始终保持水平，30mw准直半导体激光器发出的波长为 405nm的光束耦合进扩束镜，扩束镜出射的光束到达NX N式同轴H-PDLC透镜阵列上进行分光和不同频率的斩波调制，使得通过NXN式同轴H-PDLC透镜阵列上的液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板上的小孔位置；
2)搭建NXN路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发光路通过焦平面也在同轴 H-PDLC透镜阵列的焦平面F的透镜，将经H-PDLC透镜阵列出射的聚焦的NXN束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组中，经二向色镜组激发的405nm的激光将耦合射入到放大倍率为40倍、数值孔径为O. 65的无限远油浸显微物镜，将生物样品摆放于三维调整架之上，调整三维调整架使生物样品恰好处于显微物镜焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品上聚焦为η2个光点，激发出荧光；
3)搭建η2路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像由生物样品表面激发的 520nm-540nm绿色突光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜，成为平行光束，入射到二向色镜组上，荧光全部从二向色镜组透射出去，透射出的荧光入射分光棱镜进行第二次分光，分成两部分，其中一部分由消色差透镜会聚聚到CCD摄像机由CCD采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像，另一部分荧光经一透镜由光纤耦合器阵列耦合并通过光纤输送到光电倍增管PMT中，该信号属于共焦扫描显微信号；
4)信号采集与处理部分的实现光电倍增管PMT将根据生物样品中激发得到的η2个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出， 将光电倍增管的输出端接电压放大电路，电压放大电路将PMT采集到的微弱信号进行电压放大，接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机，计算机通过Matlab软件， 编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。所述同轴H-PDLC透镜阵列由NXN个液晶盒，液晶盒的输入导线，各个液晶盒之间的绝缘带组成。所述液晶盒包括四部分半球型玻璃盖、固定极板、绝缘环、金属导线，首先将绝缘环和半球型玻璃盖组合起来，在他们之间插一根金属导线，确认金属导线和半球型玻璃盖内表面的ITO膜相交，引出的导线通过绝缘带引出来施加电压，再注入H-PDLC材料， 再将固定极板与上述整体装配起来，固定极板上涂有ITO膜，面积和绝缘环内环面积相等， 为了加电压方便，将固定极板上的ITO膜延伸出来，绝缘带上的导线与单个液晶盒的两个电极相连，两个电极为金属导线和固定极板上涂有ITO膜。所述步骤4)中共焦显微镜的横向分辨率
Ar和轴向分辨率分别表示为Δγ =，、ΔΖ =，，其中为所激发出的荧光的 a Γa 6NANAΛ
波长，J/ Λ表示显微物镜的数值孔径，T为所探测样品的有效折射率，样品中70%是水，可以设定值为1.3。所述步骤4)中解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。
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本发明的有益效果在于本发明同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，由于通过驱动电路驱动聚合物分散液晶同轴透镜阵列，来控制焦点的位置，从而实现斩波，通过控制施加在不同液晶盒上的电压，可以达到单点控制的效果，同时还具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高等特点，由于控制的是NXN式透镜阵列，可以实现多点并行实时探测。在荧光共焦探测和生物方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，比目前一般的共焦显微探测系统更加便捷、闻效。
图I为本发明NXN路频分复用突光共焦显微镜的光路7]^意图2为本发明NXN式同轴H-PDLC透镜阵列示意图3为本发明单个液晶盒立体示意图4为本发明单个半球型玻璃盖剖面图5为本发明单个液晶盒对应的绝缘环立体示意图6为本发明单个液晶盒对应的固定极板意图7为本发明透镜加电及未加电时通过透镜的光线焦点变化示意图8为本发明小孔阵列滤波板示意图。
具体实施例方式同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法实现步骤如下
A:搭建NXN通道多频调制激光光路如图I所示光路示意图，将激光器I、扩束镜2、同轴H-PDLC透镜阵列3、滤波板4、透镜5依次搭建起来。在此过程中需注意光束应尽量从各器件的中心通过并与平台始终保持水平。首先将由30mw准直半导体激光器I发出的波长为405nm的光束稱合进扩束镜2 (用何种波长激光器取决于生物样品中的突光标签,在本实验中生物样本对蓝紫光的敏感度较高，能激发出波长范围在520nm-540nm的绿色荧光)。使扩束镜2出射的光束到达NXN式同轴H-PDLC透镜阵列3上进行分光和不同频率的斩波调制，调节电压，使得通过液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板4上的小孔位置，小孔光阑尺寸越接近理想点，则分辨率越高，成像质量越好。理论计算证明当小孔的直径等于艾利斑大小时既能保证共焦成像的高分辨率和层析能力，又有足够的光能通过小孔被探测器接收。 调节透镜阵列，确定透镜阵列的焦平面在位置F上。如图2所示NXN式同轴H-PDLC透镜阵列示意图，其中18为液晶盒，规格为外直径为5mm，内直径为3mm，19为导线，20为绝缘带， 宽度为4_，同轴H-PDLC透镜阵列3的斩波器作用是通过驱动电路驱动填充了 H-PDLC材料的半球型液晶盒18，也就是利用液晶在电压驱动下的定向移动，使液晶盒的折射率变化， 从而使经过液晶盒的光线焦点位置变化，由小孔的滤波作用来实现斩波。可以调节驱动电路将连续强度的光信号调制为方波信号，正弦波信号，三角波信号或其他形状波形信号。通常将连续强度的光信号调制为方波信号。本实验中，经过调制的激发光能从生物样品8的荧光标签激发出经过同样载波频率调制的荧光，从而使荧光信号具有了一定的频率特征， η2个斩波通道分别设定一定的载波频率值。每个频率值均应满足奈奎斯特抽样定理，不得高于采样频率的一半，如上文所述即不得高于125ΚΗΖ。同时，任意两个信号的载波频率及它们之差必须要大于或等于最高信号频率的两倍以确保解调的两路信号能够解调开。B:搭建NXN路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路通过焦平面也在同轴H-PDLC透镜阵列3的焦平面F的透镜5，将从透镜阵列出射的聚焦的NXN束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组6中，经二向色镜组6激发的405nm的激光将耦合射入放大倍率为40倍、数值孔径为O. 65的无限远油浸显微物镜7。耦合过程中需要注意将光束的传播方向与显微物镜的中心轴方向调整得尽量一致，以确保激发光束垂直入射显微物镜
7。将生物样品8摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品8与显微物镜7间的距离，使样品8恰好处于显微物镜7焦平面上。光束将在物镜的作用下在生物样品8上聚焦为η2个光点，激发出荧光。此时，经同轴H-PDLC透镜聚焦在焦平面的405nm 激光点光源和生物样本就形成了一对共焦关系。C:搭建η2路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像由生物样品8表面激发的 520nm-540nm绿色突光在样品与显微物镜7相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜7，成为平行光束，打到二向色镜组6。荧光全部从二向色镜组6透射出去。 将这束荧光入射分光棱镜9进行第二次分光，得到强度等各性相同的两部分。其中一部分由消色差透镜10会聚聚到CCD摄像机11由CCD采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像。另一部分荧光经一透镜12由光纤耦合器阵列13耦合并通过光纤14输送到光电倍增管PMT15中，该信号属于共焦扫描显微信号。该共焦显微镜的横向分辨率Ar
和轴向分辨率Λ 分别表示为Δτ =其中，，为所激发出的荧光的波长，
Δ ZMANAΛ
iV. j表示显微物镜的数值孔径，P为所探测样品的有效折射率，样品中70%是水，可以设定值为I. 3。假定激发出的荧光波长为530nm，显微物镜的数值孔径汉.』为O. 65，则横向分辨率Ar为0.5 μ m，轴向分辨率Δ Z为0.55 μ m左右。时间分辨率受数据采集卡的采样频率和所选用的斩波频率的限制。D:基于聚合物分散液晶同轴透镜阵列斩光调制的制作和特性作为共焦斩波调制的关键部件，NXN式同轴H-PDLC透镜阵列3，能同时实现分光，聚焦，调频功能。如图3 所示单个液晶盒立体示意图，该液晶盒由四部分组成半球型玻璃盖22、固定极板25、绝缘环23、导线24。此处采用透镜聚焦的目的就是使光源与放置样品的无限远显微物镜的焦平面满足共轭关系，实现共焦，这样就可以滤去焦外杂散信号，以提高系统整体探测能力。同时通过电源控制系统能分别给光束调制不同的斩波频率，实现频率调制功能。液晶盒18中绝缘环23和半球型玻璃盖22组合起来，在其中插一根金属导线24，确认金属导线24和半球型玻璃盖内表面的ITO膜26相交。注入H-PDLC材料21，单个半球形玻璃盖剖面图如图
4。本发明单个液晶盒对应的绝缘环23如图5所示,夕卜直径为5mm、内直径为3mm、厚O. 5mm。 图6为本发明单个液晶盒对应的固定极板示意图，待半球型玻璃盖22和绝缘环23装配好， 并在其中插入一根金属导线24，保证金属导线24与半球型玻璃盖22内表面ITO膜26相交并注入H-PDLC后，将固定极板与上述整体装配起来，固定极板上涂有ITO膜27，其面积为绝缘环23内环面积，为了加电压方便，将固定极板上的ITO膜27延伸出来(延伸长度与单个液晶盒的具体位置有关)，并用导线引出。每个固定极板由绝缘带20隔开，绝缘带20上的导线19与单个液晶盒的两个电极相连(一个为绝缘环和半球型玻璃盖间的金属导线24， 另一个为固定极板上的ITO膜27)。改变电压电压导致液晶盒阵列的焦点发生变化，如图7所示。其中加电压后，焦点在滤波板的小孔上，撤去电压，焦点不在滤波板的小孔上，根据这个特性，就可以用此液晶盒阵列进行斩波。图8展示的是小孔阵列滤波器的结构，小孔半径大小为i = 1.22私/D。其中u为照射光波长，/为液晶盒此时的焦距，D为液晶盒的直径。E:信号采集与处理部分的实现光电倍增管PMT15将根据生物样品中激发得到的 η2个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出。将光电倍增管的输出端接电压放大电路16。电压放大电路由LH05-10A05交流/直流转换器和0Ρ07低偏移电压动态放大器组成，其作用在于将PMT采集到的微弱信号进行电压放大。随后，再将电压放大电路16的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机17。通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离。按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘，再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。频分复用多路荧光共焦显微成像系统由多路频分复用荧光共焦显微镜和采集信号处理系统构成。多路频分复用荧光共焦显微镜是结合了频分复用技术的共焦显微镜。本发明采用 NXN式透镜阵列，其特点是可以做到对η2个不同位置的点进行同时扫描并处理成像，更加快捷、高效，同时还具有较高的横向分辨率、纵向分辨率以及信噪比，还有较高的时间分辨率等特点。本专利构建了 NXN阵列的η2路频分复用荧光共焦显微成像系统。系统的主要构成包括激发光源采用的是出射405nm蓝紫色光束的30mw准直半导体激光器(上海梦激光科技有限公司产品)，聚合物分散液晶透镜阵列NXN的斩光调频器件，该H-PDLC的透镜阵列采用聚合物分散液晶填充的半球型的透明玻璃制得，无限远显微物镜(放大倍率为40X， 数值孔径为O. 65)、能分离405nm蓝紫光和520_540nm绿光的紫波段二向色镜组(上海长方光学仪器有限公司提供)、CR186型高速光电倍增管(简称PMT，响应时间4 μ S，光谱响应范围是300nm 650nm，峰值波长为420nm，阳极增益为I. 88 X 106，北京滨松光子提供)和高分辨率彩色CXD摄像机(最高分辨率1280 X 1024像素，大恒图像提供的DH-M1300UC)。此外，还包括光纤和光纤耦合器组、光电倍增管(PMT )和电压放大电路以及数据采集卡等，分别完成荧光信号共焦、信号采集、信号放大和模数、数模转换等功能。所构建的NXN通道共焦显微成像系统结构如附图I所示，激光光束首先通过扩束镜2后经H-PDLC透镜阵列3被分成η2个部分，用驱动电压通过同轴H-PDLC透镜阵列3对每束光进行不同频率的调制，然后经过共焦透镜系统变成平行光束，平行光束通过二向色镜组6DM(经过二向色镜组DM，405nm的蓝紫波段的激发光和绿色的荧光信号都具有单方向的传输特性)。405nm的η2束激发光分别聚焦到生物样品8的η2个不同位置，并产生了波长为520nm-540nm的荧光；这η2束荧光随后通过显微物镜聚光，通过二向色镜组6滤去除绿荧光外的杂光，再进入分光棱镜9BS，分为强度均等相同的两部分。其中一部分通过消色差成像物镜10，成像于C⑶摄像机。而另一部分荧光经聚焦透镜12聚焦后，经棱镜将每通道的荧光信号分开，再通过光纤耦合器组13耦合到光纤14后输入光电倍增管ΡΜΤ15。对于荧光共焦显微镜光路中的同轴H-PDLC透镜阵列3的斩波器的实现，要通过实现同轴H-PDLC透镜阵列3电控调频的控制，其η2路的调制信号频率必需满足一定的要求。首先，为满足奈奎斯特抽样定理，数据采集卡的采样频率必需大于等于调制频率的两倍，实验系统中数据采集卡采样频率为250KHz，即应小于等于125KHz。其次，为防止各路光信号的频率出现重叠的现象致使各路信号相互串扰，两个相邻信号的载波频率及它们之差必须要大于或等于最高荧光信号变化频率的两倍。在信号收集处理部分，实验系统中，电压放大电路16由LH05-10A05交流/直流转换器和0P07低偏移电压动态放大器组成，其作用在于将PMT采集到的微弱数据进行电压放大。随后，采用USB2816型数据采集卡(采样频率为250KHz，北京阿尔泰公司提供)将放大电路的输出信号由USB接口送入计算机。再通过Matlab软件，将调制荧光信号进行滤波和解调后获取原始荧光信号，得到每个荧光点荧光强度随时间变化信息。
权利要求
1.一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，具体包括如下步骤1)搭建NXN通道多频调制激光光路将激光器(I)、扩束镜(2)、同轴H-PDLC透镜阵列(3)、滤波板(4)、透镜(5)同轴依次搭建，并与平台始终保持水平，30mw准直半导体激光器 (O发出的波长为405nm的光束耦合进扩束镜(2)，扩束镜(2)出射的光束到达NXN式同轴H-PDLC透镜阵列(3)上进行分光和不同频率的斩波调制，使得通过NXN式同轴H-PDLC 透镜阵列(3)上的液晶盒阵列的激光的焦点处在滤波板(4)上的小孔位置；2)搭建NXN路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发光路通过焦平面也在同轴 H-PDLC透镜阵列(3)的焦平面F的透镜(5)，将经H-PDLC透镜阵列(3)出射的聚焦的NXN 束光调整为平行光束射出，耦合进入二向色镜组(6 )中，经二向色镜组(6 )激发的405nm的激光将耦合射入到放大倍率为40倍、数值孔径为O. 65的无限远油浸显微物镜(7)，将生物样品(8)摆放于三维调整架之上，调整三维调整架使生物样品(8)恰好处于显微物镜(7)焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品(8)上聚焦为η2个光点，激发出荧光；3)搭建η2路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像由生物样品(8)表面激发的 520nm-540nm绿色荧光在样品与显微物镜(7)相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线， 反向通过显微物镜(7)，成为平行光束，入射到二向色镜组(6)上，荧光全部从二向色镜组(6)透射出去，透射出的荧光入射分光棱镜(9)进行第二次分光，分成两部分，其中一部分由消色差透镜(10)会聚聚到CXD摄像机(11)由C⑶采集样品的信号最后在计算机中软件中得到样品细胞图像，另一部分荧光经一透镜(12)由光纤耦合器阵列(13)耦合并通过光纤(14)输送到光电倍增管PMT(15)中，该信号属于共焦扫描显微信号；4)信号采集与处理部分的实现光电倍增管PMT(15)将根据生物样品中激发得到的η2 个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管的输出端接电压放大电路(16)，电压放大电路(16)将PMT (15)采集到的微弱信号进行电压放大，接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机(17 )，计算机(17)通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。
2.根据权利要求I所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述同轴H-PDLC透镜阵列(3)由NXN个液晶盒(18)，液晶盒(18)的输入导线(19)，各个液晶盒(18)之间的绝缘带(20)组成。
3.根据权利要求2所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述液晶盒(18)包括四部分半球型玻璃盖(22)、固定极板(25)、绝缘环(23)、金属导线(24)，首先将绝缘环(23)和半球型玻璃盖(22)组合起来，在他们之间插一根金属导线(24)，确认金属导线(24)和半球型玻璃盖内表面的ITO膜(26)相交，引出的导线通过绝缘带引出来施加电压，再注入H-PDLC材料(21)，再将固定极板(25)与上述整体装配起来，固定极板(25)上涂有ITO膜(27)，面积和绝缘环(23)内环面积相等，为了加电压方便，将固定极板(25)上的ITO膜(27)延伸出来，绝缘带(20)上的导线(19)与单个液晶盒的两个电极相连，两个电极为金属导线(24)和固定极板(25)上涂有ITO膜(27)。
4.根据权利要求I所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述步骤4)中共焦显微镜的横向分辨率△r和轴向分辨率△z分别表示为
5.根据权利要求I所述同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，其特征在于，所述步骤4)中解调的具体过程为，先将调制信号与具有相同载波频率的余弦信号相乘， 再通过低通滤波器滤去多余的频谱，即可得到原始信号。
全文摘要
本发明涉及一种同轴光路实现多路频分复用荧光共焦显微成像方法，由于通过驱动电路驱动聚合物分散液晶同轴透镜阵列，来控制焦点的位置，从而实现斩波，通过控制施加在不同液晶盒上的电压，可以达到单点控制的效果，同时还具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高等特点，由于控制的是N×N式透镜阵列，可以实现多点并行实时探测。在荧光共焦探测和生物方面有诸多应用，如可对活体细胞进行实时观测，获取活细胞内的信息，并对所获得的信息进行定量分析，比目前一般的共焦显微探测系统更加便捷、高效。
文档编号G02B27/09GK102608748SQ20121010386
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者周增军, 唐平玉, 张梦华, 桂坤, 郑继红, 郭彩虹 申请人:上海理工大学