单点去卷积显微系统与成像方法
【技术领域】
[0001] 本发明单点去卷积显微系统与成像方法属于光学显微测量领域。
【背景技术】
[0002] 在纳米技术和生物技术的研究当中，高分辨显微成像技术起到了至关重要的作 用。特别是在生命科学领域，为了更好地理解人体生命的作用过程和疾病的产生机理，需要 观察细胞（细胞内器官）、病毒等在三维细胞内的三维空间位置和分布，需要在细胞内精确 定位特定的蛋白质以研究其位置与功能的关系。而反映这些体系性质的特征尺度都在纳米 量级。光学显微技术可以通过非接触的方式实现快速成像、长时间监控成像，同时不会影响 生物体系的活性。近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，光学显微镜的分辨率得以 突破光学衍射极限，达到可以与电子显微镜相媲美的精度，并可以在活细胞上看到纳米尺 度的蛋白质。这些分辨率突破光学衍射极限的显微技术被称为超分辨显微术。其中，最著 名的当属获得2014年诺贝尔奖的受激福射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED) 显微技术。
[0003] STED 技术由 Stefan W. Hell 提出（Hell, S. W. and Wichmann, J. (1994)，'Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission:Stimulated-emission-de pletion fluorescence microscopy'，Optics Letters，19 (11) :780 - 782)，其基本思想是 同时照射两束具有不同波长的皮秒脉冲激光光束，其中一束皮秒脉冲激光光束在样品表面 会聚成面包圈状的第一聚焦光斑，另外一束皮秒脉冲激光光束在样品表面会聚成第二聚焦 光斑，将两个光斑中心重合，其中位于光斑中心区域的荧光物质激发出荧光，位于光斑内但 不在光斑中心区域中的荧光物质发生退激发，不发出荧光，从而实现超分辨成像。
【发明内容】
[0004] 本发明在传统STED技术的基础上，在不同时刻照射两束具有相同波长的激光束， 同时采用了去卷积算法，进一步提高显微系统的分辨率。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：
[0006] 单点去卷积显微系统，包括螺旋相位板、分光棱镜、偏振分束器、四分之一波片、聚 焦物镜、长波通滤光片、收集物镜和光电探测器；
[0007] 第一平行光经过螺旋相位板调制后，依次经过分光棱镜、偏振分束器和四分之一 波片透射，由聚焦物镜汇聚在荧光样品上，形成环形光斑；所述的螺旋相位板使第一平行光 附加螺旋相位因子e Xp(il9);其中，i为虚数单位，1为螺旋相位板的拓扑荷数，Θ为旋转 方位角；
[0008] 第二平行光经过分光棱镜反射后，依次经过偏振分束器和四分之一波片透射，由 聚焦物镜汇聚在荧光样品上，形成圆形光斑；
[0009] 所述第一平行光与第二平行光波长相同，在经过分光棱镜后同轴传递，将荧光样 品表面激发出焚光，所述焚光依次经过聚焦物镜和四分之一波片透射，偏振分束器反射，长 波通滤光片透射，由收集物镜汇聚到光电探测器上进行成像。
[0010] 上述单点去卷积显微系统，所述的偏振分束器替换为二向色镜。
[0011] 上述单点去卷积显微系统，所述的长波通滤光片（10)替换为带通滤光片。
[0012] 上述单点去卷积显微系统，所述长波通滤光片的截止波长λ选取应满足A1 < λ < λ2，其中，A1S激发光波长，λ 2为焚光样品表面激发出的焚光波长。
[0013] -种在上述单点去卷积显微系统上实现的成像方法，首先得到坐标为（i，j)的物 点的灰度值Sum li ,，再通过移动荧光样品，遍历i和j的所有取值，利用所有物点的灰度值信 息，构造完整的二维图像。
[0014] 上述成像方法，所述的坐标为（i，j)的物点的灰度值信息，通过以下步骤得到：
[0015] 步骤a、在只照射第一平行光，不照射第二平行光的条件下，光电探测器（12)以坐 标（i，j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为mXn的第一图像Imagel n^
[0016] 步骤b、在只照射第二平行光，不照射第一平行光的条件下，光电探测器（12)以坐 标（i，j)为中心对荧光样品进行成像，得到分辨率为mXn的第二图像Imagd niin;
[0017] 步骤c、按照以下公式对第一图像Imagelm,n和第二图像Image2 m,n进行运算：
[0018] Templni n= deconv (Imagel m n)
[0019] Temp2m n= deconv (Image2 m n)
[0020] 式中，deconv表示去卷积运算；
[0021] 步骤d、按照以下公式计算得到中心感兴趣区域信息Temp111
[0023] 式中，η大于0;
[0024] 步骤e、按照以下公式对中心感兴趣区域信息Tempn^n进行求和运算：
[0026] 式中，sumu表示坐标为（i, j)的物点的灰度值。
[0027] 上述成像方法，构造完整的二维图像通过以下步骤得到：
[0028] 步骤a、构造一个空白矩阵；
[0029] 步骤b、将SumiJ依次填到对应元素位置。
[0030] 有益效果：
[0031] 第一、传统STED技术要求两个激光束波长不相同，并且同时照射，而本发明要求 两个激光束波长相同，并且不同时照射，并利用两幅图像求差来缩小感兴趣区域的范围，这 些区别技术特征可以提高成像系统的分辨率。
[0032] 第二、本发明采用了去卷积运算，进而可以去除非焦平面上的模糊，减少探测器的 卷积效应带来的测量误差，该技术特征可以进一步提高成像系统的分辨率。
【附图说明】
[0033] 图1是本发明单点去卷积显微系统的结构示意图。
[0034] 图2是将Sumii 依次填到对应元素位置后的示意图。
[0035] 图中：1螺旋相位板、2分光棱镜、3偏振分束器、4四分之一波片、5聚焦物镜、6长 波通滤光片、7收集物镜、8光电探测器。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图对本发明【具体实施方式】作进一步详细描述。
[0037] 具体实施例一
[0038] 本实施例为单点去卷积显微系统实施例。
[0039] 本实施例的单点去卷积显微系统，结构示意图如图1所示。该单点去卷积显微系 统包括螺旋相位板1、分光棱镜2、偏振分束器3、四分之一波片4、聚焦物镜5、长波通滤光片 6、收集物镜7和光电探测器8 ;
[0040] 第一平行光经过螺旋相位板1调制后，依次经过分光棱镜2、偏振分束器3和四分 之一波片4透射，由聚焦物镜5汇聚在荧光样品上，形成环形光斑；所述的螺旋相位板1使 第一平行光附加螺旋相位因子exp (il Θ );其中，i为虚数单位，1为螺旋相位板1的拓扑荷 数，Θ为旋转方位角；螺旋相位板1的上述螺旋相位特性，使光束波前变为螺旋形结构，光 束的中心出现相位奇点，光强变为零，这种光场即为涡旋光场，进而形成环形光斑。
[0041] 第二平行光经过分光棱镜2反射后，依次经过偏振分束器3和四分之一波片4透 射，由聚焦物镜5汇聚在荧光样品上，形成圆形光斑；