专利名称：：一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片，属于基因
技术领域：
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背景技术：
：我国是全球肝癌高发区，每年约20万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的一半左右。现代医学对肝癌进行科学研究一百多年，虽然取得了不少成绩，但肝癌人群的总体5年生存率至今仍只有3%左右，而提高肝癌预后的最大障碍是其极高的复发率，即使是根治性手术切除，仍有50%的病人会在5年内出现转移或复发。因此，预测肝癌病人术后复发以便早期进行必要的干预是进一步改善肝癌预后的关键。目前临床上虽然有一些预测肝癌预后的标志物，但对于早期肝癌(TNM分期I期)及甲胎蛋白(AFP)阴性肝癌病人仍缺乏有效的预测手段。我们前期研究表明，利用基因芯片技术筛选癌中的差异表达基因可以来预测肝癌术后复发。大量研究表明肿瘤干细胞是肿瘤转移和复发的根本来源。我们前期研究表明肝癌中侧群细胞具有肿瘤干细胞样细胞的特性，并且发现侧群细胞和主群细胞之间基因差异表达谱和肝癌的转移复发关系密切。但是，由于芯片技术操作过于繁复，技术要求高，费用昂贵，涉及基因数目庞大从而限制其在临床上的应用，而利用定量聚合酶链式反应(PCR)技术来联合检测数个关键基因，为肝癌的分子分型提供了一种在临床上易于实施的方案。因此，我们从肝癌干细胞样细胞的差异基因表达谱中进一步筛选，从中挑选出5个关键基因能够较好的预测肝癌病人转移和复发。到目前为止，从肝癌肿瘤干细胞样细胞的差异基因表达谱中筛选预后相关基因的类似研究在国内外未见报道。
发明内容本发明的目的一种能够方便运用于临床、能够预测肝细胞肝癌术后复发的基因芯片。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片，其特征在于，所述芯片以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因为检测位点，以e_肌动蛋白为内参，以EPAS1基因上游引物5'TGCTACGCCACCCAGTACCA3'和下游引物5'CAGTTCGGGCAGCAGGTAGG3，、JMJD1C基因上游引物5'CAGCGGGAGCACTTCATCAG3，和下游引物5，TTCCTTCAAAAGTCTCAGTTCCTGTG3'、NEDD9基因上游引物5，CCCAAACCGAAGTCATAGCC3，和下游引物5，CAGGAACAGCCACCAATAAGC3，、EPC2基因上游引物5，CATTTGGGAGACTATGGTGGT3，和下游引物CTCTGCTTTAGGCTTCTTTGG3，、USP36基因上游引物5，CGAAGAGTTTGACCGAGGGAAG3'和下游引物5'GCAGCCTTTGCTGGGTGAGT3，、以及e-肌动蛋白上游引物5'AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'和下游引物5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'作为检测探针。本发明的原理如下本发明采用流式细胞分选技术筛选肝细胞肝癌细胞株中侧群细胞，利用基因芯片技术筛选出侧群细胞和主群细胞之间的差异基因表达谱，而后在临床病人组织标本基因表达谱中筛选出一组能够较好地预测肝细胞肝癌术后复发的5个基因。这五个基因是EPAS1，JMJD1C，NEDD9，USP36和EPC2。如图1所示，为获得5个基因标签的分析流程图，利用基因芯片技术筛选出侧群细胞和主群细胞之间的差异基因表达谱。我们发现在268例临床病人中，基因表达和差异基因表达谱相似的病人预后较差。为了便于临床应用，对于差异基因表达谱进行进一步筛选，从中挑选出一组能够预测病人预后的基因组合。将268例临床病人组织标本随机分成训练集和测试集，从训练集中筛选能够预测病人术后复发的基因组合，并且在测试集中进行验证。我们从中挑选出一组能够较好地预测肝细胞肝癌术后复发的含有5个基因的预测模型，并且最终采用实时荧光定量PCR在另一组100例临床病人中进行验证。图2为五个基因标签在训练集中对肝癌病人术后总体生存的生存曲线，如图2所示含有5个基因的预测模型能够预测训练集肝癌病人术后总体生存，模型预测为高风险组的生存时间明显缩短(p=0.014)。图3为五个基因标签在训练集中对肝癌病人术后复发的生存曲线；如图3所示含有5个基因的预测模型能够预测训练集肝癌病人术后复发，模型预测为高风险组的复发时间明显提前(p=0.002)。图4为五个基因标签在测试集中对肝癌病人术后总体生存的生存曲线；如图4所示含有5个基因的预测模型能够预测测试集中肝癌病人术后总体生存，模型预测为高风险组的生存时间明显缩短(pO.OOOl)。图5为五个基因标签在测试集中对肝癌病人术后复发的生存曲线；如图5所示含有5个基因的预测模型能够预测测试集中肝癌病人术后复发，模型预测为高风险组的复发时间明显提前(p<0.0001)。图6为五个基因标签在验证集中对肝癌病人术后总体生存的生存曲线；如图6所示含有5个基因的预测模型能够预测验证集中肝癌病人术后总体生存，模型预测为高风险组的生存时间明显縮短(p=0.009)。图7为五个基因标签在验证集中对肝癌病人术后复发的生存曲线。如图7所示含有5个基因的预测模型能够预测验证集中肝癌病人术后复发，模型预测为高风险组的复发时间明显提前(p=0.003)。本发明可通过利用定量PCR的方法来检测这5个基因在肝癌组织标本中的表达情况，筛选出高复发风险的肝癌病人。本发明具有诊断预测准确、快速，方法简单、易于推广应用等特点。可用于临床指导肝癌术后的辅助治疗，降低高危肝癌患者术后复发率，从而改善肝癌患者的预后。这组基因标签对于甲胎蛋白阴性及早期肝癌病人预后的判断具有重要的临床意义。图1为获得5个基因标签的分析流程图2为五个基因标签在训练集中对肝癌病人术后总体生存的生存曲线；图3为五个基因标签在训练集中对肝癌病人术后复发的生存曲线；图4为五个基因标签在测试集中对肝癌病人术后总体生存的生存曲线；图5为五个基因标签在测试集中对肝癌病人术后复发的生存曲线；图6为五个基因标签在验证集中对肝癌病人术后总体生存的生存曲线；图7为五个基因标签在验证集中对肝癌病人术后复发的生存曲线。具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片，以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因为检测位点，以e-肌动蛋白为内参，以下表所示引物为检测探针，其计算机可读形式副本见附件<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述PCR芯片的制备方法如下采用预制PCR芯片的形式，将RT2SY服Green/R0XqPCRmastermix(SABiosciences，catalognumber:PA-122)[lOtilmastermix,7ul重蒸馏水(ddH20)，上述上、下游引物各lul(lOuM)]，预点于96孔实时定量PCR板(ABI公司生产)，于-2(TC保存。96孔实时定量PCR板，每排12L，每个基因设复孔，共12孔，每排检测一个病人，可以同时检测8个病人。上述基因芯片的使用方法如下1、收集肝细胞肝癌病人术后肿瘤组织和癌旁组织，利用Trizol试剂盒分别抽提其中的总腿，取500ng总RNA用SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisS叩erMix逆转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。2、定量PCR，检测时PCR芯片中加入相应的cDNA模板lul，共20wl反应体系，在ABIPRISM7900荧光定量PCR仪中进行检测，e-肌动蛋白(0-actin)作为内参。反应条件为95°C，10min;40个PCR循环(95°C，15秒；60°C，60秒(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，(95°C，2min;60°C，20秒；99°C，10秒，并从6(TC缓慢加热到99r(8分钟)。各个基因表达值的计算方式采用相对定量-AACT[AACT=((CT(瘤内,耙細)-CT滩内，e—actin))_(CT鹏，！g鋼-CT(癌旁，P—actin)))]，取重复两个点的平均值。e-actin是内参，CT是指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3、病人的复发风险预测值计算采用如下公式风险系数=(-0.490XEPAS1)+(0.598XEPC2)+(0.258XNEDD9)+(0.302XJMJD1C)+(0.393XUSP36)，基因名称代表每个基因最终检测到的平均-AACT。如果风险系数大于0.392则为高复发风险，小于等于0.392则为低复发风险。SEQUENCELISTING<110>复旦大学附属中山医院〈120〉一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片〈140〉2009100471901〈141>2009-03-06<160>12<170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211>20〈212>DNA〈213>人体<400>1tgctacgccacccagtacca20〈210〉2<211〉20〈212>DNA〈213〉人体〈400〉2cagttcgggcagcaggtagg20〈210>3〈211>20〈212>DNA<213>人体〈400>3cagcgggagcacttcatcag20〈210>4〈211〉26〈212〉DNA〈213〉人体<400>4ttccttcaaaagtctcagttcctgtg26<210>5〈211>20<212>DNA<213>人体〈400〉5cccaaaccgaagtcatagcc20〈210>6<211>21〈212>DNA<213>人体<400>6caggaacagccaccaataagc21〈210〉7〈211>22〈212>DNA〈213>人体<■>7cgaagagtttgaccgagggaag22<210>8<211>20〈212>腿〈213>人体〈400>8gcagcctttgctgggtgagt20〈210>9〈211>21<212>DNA〈213>人体〈400>9catttgggagactatggtggt21〈210〉10<211>21〈212>DNA<213〉人体〈400〉10ctctgctttaggcttctttgg21<210>11〈211>20〈212>DNA〈213〉人体<400>11aagaaggtggtgaagcaggc20〈210〉12〈211>20<212>DNA<213>人体〈400>12tccaccaccctgttgctgta20权利要求1、一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片，其特征在于，所述芯片以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、USP36、和USP36基因为检测位点，以β-肌动蛋白为内参，以EPAS1基因上游引物5’TGCTACGCCACCCAGTACCA3’和下游引物5’CAGTTCGGGCAGCAGGTAGG3’、JMJD1C基因上游引物5’CAGCGGGAGCACTTCATCAG3’和下游引物5’TTCCTTCAAAAGTCTCAGTTCCTGTG3’、NEDD9基因上游引物5’CCCAAACCGAAGTCATAGCC3’和下游引物5’CAGGAACAGCCACCAATAAGC3’、EPC2基因上游引物5’CATTTGGGAGACTATGGTGGT3’和下游引物CTCTGCTTTAGGCTTCTTTGG3’、USP36基因上游引物5’CGAAGAGTTTGACCGAGGGAAG3’和下游引物5’GCAGCCTTTGCTGGGTGAGT3’、以及β-肌动蛋白上游引物5’AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3’和下游引物5’TCCACCACCCTGTTGCTGTA3’作为检测探针。全文摘要本发明提供了一种肝细胞肝癌术后复发预测基因芯片，其特征在于，所述芯片以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因为检测位点，以β-肌动蛋白为内参，以EPAS1、JMJD1C、NEDD9、EPC2和USP36基因的上游引物和下游引物作为检测探针。本发明具有诊断预测准确、快速，方法简单、易于推广应用等特点。可用于临床指导肝癌术后的辅助治疗，降低高危肝癌患者术后复发率，从而改善肝癌患者的预后。这组基因标签对于甲胎蛋白阴性及早期肝癌病人预后的判断具有重要的临床意义。文档编号C40B40/04GK101560554SQ200910047190公开日2009年10月21日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者俭周,泱徐,杨欣荣,嘉樊,邱双健申请人:复旦大学附属中山医院