专利名称：肽核酸探针生物芯片及其表面等离子体共振的检测方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片领域及基于其的检测方法，尤其是涉及肽核酸探针生 物芯片及其表面等离子体共振的检测方法。
背景技术：
随着分子生物学在医学领域的广泛应用，芯片技术必将成为未来临床疾病 诊断中不可缺少的一个新内容。芯片技术是伴随人类基因组计划而产生的，是 近年来分子生物学及医学诊断技术的重要逸艮，其突出特点在于高速度、高通 量、高并行性及多样化、微型化、自动化等，已经成为当今生物医学技术研究 的热点，在基因诊断、药物开发和毒性分析、病原检测等多个领域显示出巨大 的发展潜力和应用价值。
目前，尽管芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但是仍然 存在着许多的问题，而且价格昂贵，从而严重地制约了芯片技术的广泛应用和 进一步发展。如在标记方法上，荧光法是目前使用最多的方法，但它的灵敏度 不高、需要避光，杂交完成后要快速检测以免荧光淬灭，另外结果检测需用价
格极其昂贵的激光扫描仪等特殊设备；同位素标记法由于需要同位素和放射自 显影，有使用不便，操作复杂，耗时较长、有污染的缺点。尤其是在基因芯片
的检测中，由用荧光标记会影响PCR扩增效率，同位素标记常用的如"P和"P 半衰期又太短，均不易推广使用，而且PCR扩增既需要设计引物，又要PCR仪， 需要对各检测对象的耙序列建立不同的扩增体系、扩增方法和扩增条件，这显 然大大增加了工作量和工作难度。总之，芯片技术在样品的制备、探针合成与 固定、分子的标记、^t据的读取与分析等几个方面仍然存在着许多难以解决的 问题。特别是技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较 狭窄等问题限制了该技术在生物检测中的应用。
肽核酸(Peptide Nucleic Acid, PNA)是借助计算机辅助设计的一种DM 模拟物，与DNA—样也是由ATCG四种碱基的单体聚合而成，只是两者的骨架 结构不同DNA是由磷酸二酯键连接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺键 连接的重复的N-2-氨乙基苷氨酸单位构成的。PNA不易被蛋白酶、核酸酶等降 解，也不与血清中蛋白结合，但可以通过ATCG四种碱基的互补配对原则和DNA 杂交结合。由于PNA的假肽骨架是电中性的，PNA与DNA或RNA间的杂交不存在静电斥力，因而具有更强的亲和性，其结合的稳定性和特异性都大大提高。
虽然目前还未有以PNA作为探针用于基因或蛋白芯片检测方面的报道，但 我们的分析认为，与传统的DNA探针相比，PM做为核酸杂交探针在理论上可 能更具有优势。因为传统DNA探针只能与单链的DM杂交结合，我们知道PCR 产物都是双链的，因此在杂交前必须通过变性过程使双链的PCR产物解体为单 链的DNA片段，而且在杂交过程中必须保持低温以防止产物DNA复性而影响杂 交效率，产生假阴性结果。但PNA作为探针其不仅仅可以与单链的DNA杂交高 效杂交，甚至还可以直接与双链DNA以链侵袭模式结合形成稳定的 MA-PNA-DNA的三链复合物，因此大大增加了对DNA的检测能力，且可降低标 本处理的复杂性，简化前期标本的准备时间和操作过程，从而为临床快速基因 检测提供了可能。
基于上迷理论，我们开创性地以PNA为探针，对PM与DNA、蛋白质的结合 活性，^t其做为芯片检测的探针特性和杂交特性等系统地进行了研究，并与 现行的芯片检测探针进行比较；在此^il上，并首次将PNA芯片引X^面等离 子体共振传感器，对其做为检测探针的芯片的特异性、敏感性，及实际检测应 用的方法与特性进行了详细的研究。
表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)传感器是近年迅 速发M来的新型光学传感器装置，其突出特点是可以实时(real time)、在 线(on line)地检测生物分子之间的相互作用，而且不需要标记及純化，是 当前国际传感器领域的研究热点之一。其基本原理是当入射光以一定的角度经 一组光学器件一一通常为一高折射率的棱镜上顺序放置一层低折射率的耦合 层(多为金属薄膜)耦合激发后，在金属膜界面上发生表面等离子体共振，即 入射光与界表面的自由电子会发生相互作用，其中部分入射光波被电荷密度波 吸收，则入射光线不能发生全反射，从而导致反射光的强度大大减弱，反射角 也发生明显的偏差，而且这种反射光的强度和角度的变化与界面上吸附的生物 物质分子数量的多少成一定的比例关系。
作为探针固定的硫醇化合物表面单分子层自组装层(Self- assembled Monolayer, SAM)技术自20世纪80年代初报道以来，由于其满足了作为模型 界面的几个主要要求，包括和基底的牢固结合，可控制的分子取向有序排列， 可控制的外表面性质及可控制的厚度等方面，因此很快地得到了各方的关注。 总的来说，SAM是基于g化合物与基底材料(如金、银、铂等)的强烈化学 结合而形成的。如在金膜表面，巯基被氧化而生成石危金化合键。其化学反应式 如下2Au+2RSH—2Au-SR+H2。 Au-S之间的化学键合力;f艮强，其键能高达184k J/mol，很少有其他基团可以与其竟争，这就保证了结合的选择性。同时，SAM的排列紧密有序，对酸、碱、离子渗透等有较强的抵抗力。应用此方法固定探 针可以使探针结合牢固，且排列有序、分布均匀。我们基于巯基与金属表面的
这种强烈化学结合的特性，在本发明中将巯基修饰的PNA探针与SPR设备的金 属薄膜结合，制成PNA探针阵列的芯片，从而完成对各种把基因、蛋白的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供肽核酸(PNA )作为探针的生物芯片及其相应的SPR 检测方法。通过本发明，可以绕过对样品进行扩增，简化样本处理步骤，提高 检测的灵敏度和特异性；且以光学信号作为检测信号，既稳定，又易于检测， 使结果检测、分析的设备和技术大为简化。从而可以充分利用生物芯片技术的 高通量、高敏感、高特异的特性，克服目前检测芯片存在的主要缺点。并且为 了进一步提高芯片检测的效率。我们还在传统SPR传感器的基础上，研究开发 了一种更简单的、易实施的、价廉的纳米金属膜的镀制方法，自行设计编制了 相应的的信息处理和操作控制软件，设计装配了小型的流动样本注入系统，及 适用于芯片预杂交、杂交及漂洗的温控测试池，从而使该传感器更具有了适用 于芯片检测的高自动化及智能化。由于本发明研究提供的这种生物芯片及其快 速检测的方法具有杂交、检测设备简单，技术稳定易于掌握，灵敏度高，重复 性好，应用范围广等的特性，其必将成为可广泛应用于普通实验室，甚至野外 环境的新一代生物芯片。
本发明的目的是这样实现的本发明检测系统的生物芯片固相栽体上连接 的是肽核酸(PNA)检测探针，肽核酸(PNA)探针所附着的具有表面等离子体 共振(SPR)响应特性的金属薄膜是金膜，采用化学还原法制备纳米金胶体液，在
芯片片基表面直接铺制二维的纳米金膜层，应用探针的固化-自组装单分子层 技术在纳米金膜表面点制探针阵列；基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体 共振的检测方法，其检测步骤如下
(1) 在芯片片M面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜(厚度 为10nm~ 150mn),在纳米金膜表面点制肽核酸(PNA )探4十阵列制备芯
片；
(2) 处理标本，并与生物芯片上的探针进行杂交反应；
(3) 利用等离子体共振(SPR)设备对^:针杂交区进行偏振it^测，利用等 离子体共振(SPR)原理分析阵列探针杂交反应，获取结果。
在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜和在纳米 金膜表面点制肽核酸(PNA)探针阵列方法的步骤包括
(1) 按Frens法(柠檬酸三钠还原法)制备纳米金溶液；
(2) 以(氨乙基)-Y氨丙基三价氧M烷UPTMS)为核心铺制性质均一的SPR纳米金膜；
(3) 所铺纳米金膜氮气干燥后密封备用；
(4) 清洁处理制备好的钠米金膜；
(5) 以表面自组装单分子层4支术点制肽核酸(PNA )探针阵列，生成揮:4十 的自组装阵列；
(6) 清洗芯片，去除未组装的探针，干燥后封闭备用。 标本的处理方法及生物芯片上的探针进行杂交反应步骤包括
(1)提取细菌、细胞及组织的DNA或RM;由PCR或RT-PCR反应生成的核 酸物质，如DNA、 cDNA;
(2) 提取细菌、细胞及组织的蛋白质，以及分泌液体中的蛋白质；
(3) 将处理好的标本注入微流动反应池中进行杂交反应；
(4) 清洗去除未杂交结合的标本。 等离子体共振(SPR)检测步骤包括
(1) 对芯片杂交反应区进行等离子体共振(SPR)扫描；
(2) 对扫描结果分析，获得芯片检测结果。
本发明所使用的术语"生物芯片"是由生物大分子或组织附着于玻璃、陶 资、金属片或尼龙膜、硝酸纤维素膜等基片物质上构建而成的阵列。生物芯片 的实例包括基因(核酸)芯片、细胞芯片、蛋白芯片、抗体芯片或组织芯片等。
本发明所述的核酸包括DNA、 RNA、 cDNA或PM。
本发明所使用的术语"肽核酸"是核酸的一种DNA模拟物，与DNA —样也 是由ATCG四种碱基的单体聚合而成，只是两者的骨架结构不同DNA是由磷酸 二酯键连接而成的磷酸戊糖骨架；而PNA是由酰胺键连接的重复的N-2-氨乙基 苷氨酸单位构成的。
本发明所述的蛋白包括各种抗体、抗原、核酸功能相关酶等。
本发明所使用的术语"纳米金属膜"是指由直径在10nm"150咖之间的纳米 金颗粒形成的厚度为IO咖-150咖金膜层。本发明使用的优选的納米金属膜层 为厚度为50咖的纳米金膜。
本技术发明的优点与效果如下
(1) 本发明采用PM做为杂交探针，较之普通DNA或PNA探针具有更高的灵 敏度和特异性；
(2) 本发明采用PNA做为杂交探针，不M免了PCR反应，而且降低了样品 的处理要求，简化了操作步骤，缩短了检测时间；
(3) 本发明采用PM做为杂交探针，并应用SPR技术进行信号检测，不需要 昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件。总之，该技术的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异性、敏感性 以及快速等特点。既可对病原微生物进行快速而准确的检测和鉴定，也可以进 行某一或多个特定基因、或与其相关的表达产物的研究，还可以进行基因和蛋 白质与疾病关系的研究、疾病相关基因的验证以及新药物的开发与筛选，疾病 的分子诊断，治疗过程的追踪和预后等方面，为临床疾病的预防和治疗提供重
要的指导作用；同时该技术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实施战 场病原体分布的调查、战伤感染的早期"^断、生物战剂的早期发现等方面，将 会产生较好的经济效益和社会效益。
图1为本发明设计PM探针基本结构模式图 图2为本发明SPR传感器基本结构模式图 图3为本发明SPR芯片系统模式图 图4为本发明芯片点样模式
具体实施例方式
具体实施例方式
在玻璃栽玻片上铺制50咖厚度的具有SPR感应性的纳米金膜方法，步骤如
下
(1) 、按Frens法(柠檬酸三钠还原法)制4^r溶胶取0. 01%氯金酸水溶 液100ml加热煮沸，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠水溶液0. 75ml，金黄色的 氯金酸水溶液在2分钟内变为紫红色，继续煮沸15分钟，冷却后以蒸馏水恢 复到原体积；
(2) 、金膜铺制
A、 玻片ll酸洗清洁千净后，i"N-e-(氨乙基)-Y氨丙基三价M^ 烷(APTMS) /甲苯溶液中回流12小时后洗净，取出，氮气吹千，置于清洁千 燥处备用；
B、 处理好的玻片11置纳米金溶液中浸泡12小时后，浸入O. 01 mol/L， 的PDM7JC溶液中10—20min,取出用超纯水清洗。烘干后移入羟胺/氯金酸溶 液中，浸泡0.5小时，玻片11表面既形成光亮的金膜12。
表面自组装单分子层技术在金膜表面点制PRA探针阵列方法，步稞如下
(1) 、制备好的钠米金金膜12在piranha液(30MHA:浓H2S04=1: 3)中浸泡清 洗，然后用双蒸水反复清洗，氮气吹干；
(2) 、滴加500nM浓度的SH-PNAs/PBS緩冲液与纳米金膜12上自组装反应， 100%湿度反应24小时，生成探针的自组装阵列13;(3)、分别吸干緩冲液，6-巯基己醇封闭，双蒸水清洗，氮气吹干。 通过Chelex-IOO—步法快速处理标本，提取细菌DNA，步躁如下
(1) 、用无菌接种环收集纯培养菌落一环，置于1.5ml灭菌Eppendorf管中；
(2) 、加入5。/。Chelex悬浊液50u 1,混匀，加入20mg/ml蛋白酶K, 56°C 水浴消化2h以上，再经沸水浴7. 5min，随后立即置入冰浴3min， 12000r/min 离心5min,取上清液作DM样本。
细胞裂解液裂解细胞，粗提细胞核蛋白质，步驟是
(1) 、将组织剪成小块，按每20mg组织加入200 ~ 300 u 1均浆液加入均浆 液，4'C低温均浆；
(2) 、静置IO min后加入90ul 10%NP-40，剧烈震荡30 s， 4。C 800g离 心15 min，弃去上清；
(3) 、沉淀再溶于裂解液5ml中，4 。C震摇孵育30 min， 4°C 13000g离心 15 min，取上清为胞核蛋白提取液；
DNA标本与基因芯片上的PM探针进行杂交反应，步猓是
(1) 、将制备好的芯片1组装到所制作的SPR传感器棱镜3表面，流动^^应 池中注入20mM磷酸钠緩冲液(PH7，0) 20u 1,预热(45°C) 30分钟，并读取 此时反射光4反射角度初始数值；
(2) 、将处理好的标本上清液注入20u 1流动反应池中，45-C循环流动杂交 3小时，并读取M针13点样点反射光4反射角度数值；
(3) 、流动反应池14中充入20ul 20mM磷酸钠緩冲液(PH7. 0)， 37。C清洗 芯片1小时，重复3次。
蛋白质标本与蛋白芯片上的PNA探针进行杂交反应，步骤是
(1) 、将制备好的芯片1組装到所制作的SPR传感器棱镜3表面，流动反应 池14中注入10mMTE緩冲液20ul，预热(37°C ) 30分钟，读取此时反射光4 反射角度初始数值；
(2) 、将处理好的蛋白质标本上清液注入20ul流动反应池中，37。C杂交2 小时，并读取^^针点样点反射光反射角度数值；
(3) 、流动反应池14中充入20ul lOmMTE緩冲液，37。C清洗芯片1小时， 重复3次。
实施例1利用PNA探针实施DNA芯片检测步骤为
淋球菌由大碎医院检验科细菌室提供，鉴定标准 《全国临床检验操作规 程》；Chelex-100购自BioRad公司，制备5%Chelex緩冲液，含"/oNP-40， 1% Tween-20， 0. 03%SDS;
淋球菌PNA探针13: HS-线)6-5， — TCGC TT C T CGG T CGCT -3，;美国 Applied Biosystems公司合成；
TCEPHCL: Tis (2-carboxyethyl)-Phosphine Hydrochloride,美国Pierce， 0. 287mg TCEP溶于1000ul水中制备lmmol/L TCEP;
(1) 、用无菌接种环收集纯培养淋球菌菌落一环，置于1. 5ml灭菌 Eppendorf管中；
(2) 、加入5%Chelex悬浊液50ix l，混匀，加入蛋白酶K ( 20mg/ml) 2 y 1， 56。C水浴消4匕6h,再经沸水浴7. 5min,随后立即置入冰浴3min， 12000r/min 离心5min，取上清液作DNA样本；
(3) 、制备好的钠米金金膜在piranha (30%H2O2:浓H2S04=4: 3)液中浸泡清洗， 然后用双蒸水反复清洗，氮气吹干；
(4) 、 25uM的SH-PNA中加等体积l咖ol/L TCEP， 37 。C还原30分钟，加 入PBS緩冲液(1.44 g薩氛8 g NaCL、 0.2 g KCL、 0.24 g K跳,加入 800mL去离子水溶解后，用HCL调pH为6. 5，定溶至1L，高压灭菌)，SH-PNA 终浓度500nM;
(5) 、滴加500nM浓度的SH-PNA/PBS緩冲液与纳米金膜上自组装反应，100% 湿M应24小时，生成探针的自组装阵列；
(6) 、将制备好的芯片组装到所制作的SPR传感器棱镜表面，流动>^应池中 注入20mM磷酸钠緩沖液(PH7. 0) 20ul (10ul/min)，预热30min x 45°C， 并读取此时反射光反射角度初始数值；
(7) 、将处理好的标本上清液注入20y 1流动反应池中(5iil/min), 45°C 循环杂交3小时，并读取^^针点样点反射光反射角度数值；
(8) 、流动反应池中充入20y 1 20mM磷酸钠緩冲液(PH7. 0) (10y 1/min), 37t:清洗芯片l小时，重复3次。
实施例2利用PM探针实施蛋白芯片检測，步樣为
根据NF- k B的核酸结合位点(GGGACTTTCC )设计PNA探针， HS-(CH》6-5， -AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3，;
蛋白芯片杂交緩沖液20mMHEPES, lmMDTT， 0. lmMEDTA, 50qjMKC1， 5%甘油，200 Pg/ml牛血清白蛋白；
(1)、将肝组织剪成小块，加入均浆液A(咖ol/L: H印eslO、 Na3V04 1、 MgCl2 1.5、 KC1 10、 NaF 50、 EDTAO. 1、 EGTAO. 1、 phenylmethylsulfonyl fluoride0.5、 dithiothreitol 1和0. 02% protease inhibitors cocktail ， pH7. 9 ) 固，4。C低温均浆;
(2) 、静置10 min后加入90 li 1 10%NP-40，剧烈震荡30 s, 4 °C 800 g离 心15 min，弃去上清；
(3) 、沉淀再溶于裂解液B(咖ol/L: H印es 20、 NaCl 420、 MgCl2 1.5、 EDTA1、 EGTA 1、 dithiothreitol 1、 phenylmethylsulfonyl fluoride 0.5、 glycerol 20%和() 02% protease inhibitors cocktail, pH 7-9) 5ml中，4。C 震摇孵育30min， 4°C 13000 g离心15rain，取上清为胞核蛋白提取液；
(4) 、制备好的钠米金金膜在piranha (30%H2O2:浓H2S04=1: 3)液中浸泡清洗， 然后用双蒸水反复清洗，氮气吹干；
(5) 、 25 w M的SH-PNA中加等体积l咖ol/L TCEP， 37。C还原30分钟，加入 PBS緩冲液(1. 44 g Na戰、8 g NaCL、 0. 2 g KCL、 0. 24 g KH氛加入800mL 去离子水溶解后，用HCL调pH为6.5，定溶至1L，高压灭菌)，SH-PM终浓度 500nM;
(6) 、滴加500nM浓度的SH-PNA/PBS緩冲液与纳米金膜上自组装反应，100% 湿度反应24小时，生成探针的自组装阵列；
(7) 、将制备好的芯片组装到所制作的SPR传感器棱镜表面，流动反应池中 注入蛋白芯片杂交緩冲液20y 1 (10ii l/min), (TC静置30分钟，并读取此时 反射光反射角度初始数值；
(8) 、将处理好的标本上清液30u 1注入20 ix 1流动反应池中(5 u 1/min )， 25r循环杂交3小时，并读取M针点样点反射光反射角度数值；
(9) 、流动反应池中^X20iU蛋白芯片杂交緩冲液(10u 1/min)， 0。C清 洗芯片1小时，重复3次。
杂交检测和结果分析 实验检测采用折射光角度调制方式，角度调制范围从40度到70度角；角 分辨率精度高于0. 001度；检测最小浓度小于1X1(T"M。根据设计芯片探针的 检测靶DNA/蛋白质，利用标准品浓度梯度分别测量相应角度响应改变值绘制靶 DM/蛋白质浓度/角度反应曲线。实验结束后根据实验结果角度变化值与曲线 相应位置对比检测靶DNA/蛋白质的存在与否以及浓度。
权利要求
1、肽核酸探针生物芯片，其特征在于检测系统的生物芯片固相载体上连接的是肽核酸(PNA)检测探针。
2、 根据权利要求l所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于肽核酸(PNA)探 针所附着的具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是金膜。
3、 根据权利要求l所迷的肽核酸探针生物芯片，其特征在于肽核酸(PNA) ^:针所附着的具有具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是厚度为 iO咖~ i50nm的纳米金膜。
4、 根据权利要求1所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于采用化学还原 法制备纳米金胶体液，在芯片片基表面直接铺制二维的纳米金膜层。
5、 根据权利要求1所述的肽核酸探针生物芯片，其特征在于应用探针的固化-自组装单分子层技术在纳米金膜表面点制探针阵列。
6、 基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检测方法，其检测步骤如 下(1) 在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜(厚度 为10nm~150nm)，在纳米金膜表面点制肽核酸(PNA )探针阵列制备 芯片；(2) 处理标本，并与生物芯片上的探针进行杂交反应；(3) 利用等离子体共振(SPR)设备对^^针杂交区进行偏振ib险测，利用等 离子体共振(SPR)原理分析阵列探针杂交反应，获取结果。
7、 根据权利要求6所述的基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检 测方法，在芯片片基表面铺制具有等离子体共振(SPR)感应性的纳米金膜和在 納米金膜表面点制肽核酸(PNA )探针阵列方法的步骤包括(1) 按Frens法(柠檬酸三钠还原法)制备纳米金溶液；(2) 以(氨乙基)-Y氨丙基三价^J^烷UPTMS)为核心铺制性 质均一的SPR纳米金膜；(3) 所铺纳米金膜氮气千燥后密封备用；(4) 清洁处理制备好的钠米金膜；(5) 以表面自组装单分子层技术点制肽核酸(PNA )探针阵列，生成探针 的自组装阵列；(6) 清洗芯片，去除未组装的探针，干燥后封闭备用。
8、根据权利要求6所述的基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检 测方法，标本的处理方法及生物芯片上的探针进行杂交反应步骤包括(1)提取细菌、细胞及组织的DNA或RNA;由PCR或RT-PCR反应生成的核 酸物质，如DM、 cDNA;(2) 提取细菌、细胞及组织的蛋白质，以及分泌液体中的蛋白质；(3) 将处理好的标本注入微流动反应池中进行杂交反应；(4) 清洗去除未杂交结合的标本。
9.森据权利要求6所述的基于肽核酸探针生物芯片的表面等离子体共振的检 ^方法，等离子体共振(SPR)检测步骤包括(1) 对芯片杂交反应区进行等离子体共振(SPR)扫描；(2) 对扫描结果分析，获得芯片检测结果。
全文摘要
本发明公开了一种肽核酸探针生物芯片及其表面等离子体共振的检测方法，本发明检测系统的生物芯片固相载体上连接的是肽核酸(PNA)检测探针，肽核酸(PNA)探针所附着的具有表面等离子体共振(SPR)响应特性的金属薄膜是金膜。该技术的研制成功将真正实现芯片技术的高通量、特异性、敏感性以及快速等特点。既可对病原微生物进行快速而准确的检测和鉴定，同时该技术也可以应用到在野战条件下由基层检验人员实施战场病原体分布的调查、战伤感染的早期诊断、生物战剂的早期发现等方面，将会产生较好的经济效益和社会效益。
文档编号C40B40/04GK101591711SQ20091010575
公开日2009年12月2日 申请日期2009年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者唐国林, 赵为武, 顾大勇 申请人:唐国林;赵为武;顾大勇