专利名称：：检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于检测牛乳质量的标志物、检测方法、相关生物芯片和试验盒，它是一种通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸来建立唯一指向原始牛乳含量的标准，其意义在于从根本上杜绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可能。
背景技术：
：近来年，相当数量的不法商贩通过向牛乳中掺水的方法来牟取不正当利益。由于牛乳中加水后会导致除水以外的各项指标降低。为了提高各项检测指标，不法商家在牛乳中掺水后又通过采用向牛乳里加入各种添加剂、并反复勾兑的办法来使牛乳达标。不法商贩最常用的有以下5种添加剂脂肪油(提高脂肪指数)、蛋白(提高蛋白指数)、糊精(音)和乳清粉(提高各项指数)、二合一(也可相应提高各项指数，对蛋白指数最有效)。前述‘二合一’就是三聚氰胺，而在牛乳中添加三聚氰氨会导致小儿肾结石，三鹿奶粉事件就是不法商贩在牛乳中兑水后又添加三聚氰胺的典型案例。现有的检测蛋白的方法主要是检测含氮量，由于三聚氰胺是一种含氮化合物，所以在现有的检测方法下，添加后可冒充蛋白含量。此外，如果不法分子添加豆粉，动物毛发等物品，现有的任何方法在上述违法添加物导致严重后果之前，都无法检测出。因此，最根本的牛乳质量检测方法是能够检测一种在牛乳中稳定存在，稀释后其成分就降低或变化，且不受添加剂影响的物质。微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子，它们在进化上高度保守，广泛存在于动植物细胞中，目前已在人类、小鼠、大鼠等多种生物物种中鉴别出数百种微小核糖核酸。微小核糖核酸在基因表达调控领域中起着超乎想象的重要作用，其序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使之成为信使RNA强有力的调控因子。微小核糖核酸的发现丰富了人们对蛋白质合成控制的认识，补充了在RNA水平对分子进行更迅速更有效调节的新方式，展现了细胞内基因表达调控全方位多层次的网络系统。微小核糖核酸的发现也是对中心法则中RNA次要的中介角色的重要补充，它将促使生物学家重新思考细胞遗传调控及其生长发育等方面的重要问题。微小核糖核酸与动物的许多正常生理活动密切相关，如生长发育、细胞调亡以及脂肪代谢等等。申请人经过研究发现，微小核糖核酸在血清中稳定存在，能够对抗RNA酶的切割，并对高温、高压、强酸、强碱及反复冻融有抵抗。因此，基于微小核糖核酸的生物学特性，完成有可能通过微小核糖核酸来检测牛乳质量。
发明内容本发明的目的是提供一种用于检测牛乳乳液质量的标志物及其检测方法、相关生物芯片和试验盒。申请人:经过研究发现，微小核糖核酸存在于原乳，商品的液态乳及奶粉中，牛乳中的特异性微小核糖核酸图谱不受任何添加剂的影响，且与牛血清、牛尿的成分有区别，并与其它动物中的微小核糖核酸图谱也不相同。所以牛乳中的特异性微小核糖核酸图谱是一种完美的生物标志物，可以用来检测牛乳质量。基于上述研究，申请人首先提出一种牛乳质量检测标记物，该检测标记物是在牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸任意一种或一种以上hsa_let_7a、hsa_let_7b、hsa_let_7c、hsa_let_7d、hsa_let_7e、hsa_let_7f、hsa_miR-15a、hsa—miR-16、hsa—miR-17、hsa_miR-19b、hsa_miR-20a、hsa—miR-21、hsa—miR-22、hsa_miR-23a、hsa—miR-24、hsa—miR-25、hsa_miR-26a、hsa_miR-26b、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-30a、hsa—miR-31、hsa_miR-33a、hsa_miR-92a、hsa—miR-93、hsa—miR-98、hsa_miR-99a、hsa—miR-101、hsa_miR-29b、hsa—miR-103、hsa_miR-106a、hsa—miR-107、hsa—miR-192、hsa_miR-196a、hsa—miR-197、hsa_miR-148a、hsa_miR-30c、hsa_miR-30d、hsa_miR-7、hsa_miR-181a、hsa_miR-181b、hsa_miR-203、hsa-miR-210、hsa_miR_221、hsa_miR_222、hsa_miR_223、hsa_miR-200b、hsa_let_7g、hsa_let_7i、hsa_miR-15b、hsa_miR-23b、hsa_miR-27b、hsa_miR-30b、hsa_miR-125b、hsa-miR-128、hsa_miR-138、hsa-miR-140_3p、hsa_miR_141、hsa-miR-142_5p、hsa-miR-142_3p、hsa—miR-152、hsa—miR-191、hsa-miR-125a_5p、hsa—miR-150、hsa—miR-185、hsa—miR-186、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-193a_3p、hsa—miR-194、hsa_miR-320a、hsa_miR-200c、hsa—miR-155、hsa_miR-106b、hsa_miR-29c、hsa_miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151_5p、hsa-miR-151_3p、hsa_miR-148b、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-423_3p、hsa_miR_425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-181d、hsa-miR-532_5p、hsa_miR-5323p、hsa_miR-92b、hsa-miR-574_5p、hsa-miR-574_3p、hsa_miR-652、hsa_miR-320b、hsa_miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885_3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa—miR-1306、hsa—miR-1307本发明还提供一种检测牛乳中的上述109种微小核糖核酸的方法，通过该方法可以确定原乳含量和质量。上述测定牛乳中稳定存在且可检测109种微小核糖核酸的方法包括=RT-PCR方法、Real-timePCR方法、Northernblotting方法、RNaseprotectionassay方法、Solexasequencingtechnology方法以及生物芯片方法。所述RT-PCR方法包括以下步骤(1)提取牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；(2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；(3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；(4)EB染色后在紫外灯下观察结果.RT-PCR方法。收集牛乳样本；将牛乳浆进行逆转录反应制备cDNA样品或使用Trizol试剂提取牛乳总RNA再进行逆转录反应制备cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；EB染色后在紫外灯下观察结果并拍照。所述Real-timePCR方法包括以下步骤(1)提取受试的牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；(2)用微小核糖核酸设计引物；(3)加入荧光探针进行PCR反应；(4)检测并比较牛乳样本相对于正常牛乳中微小核糖核酸的量的变化。Real-timePCR方法。收集牛乳样本；将牛乳进行逆转录反应制备cDNA样品或使用Trizol试剂提取牛乳总RNA再进行逆转录反应制备cDNA样品；通过成熟体微小核糖核酸设计PCR的引物并加入荧光探针EVAGREEN进行PCR反应；分析处理数据并比较结果。所述Northernblotting方法包括以下步骤1、收集牛乳样本；2、通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；3、进行变性PAGE电泳和膜转移实验；4、制备同位素标记微小核糖核酸探针；5、进行膜杂交反应；6、同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。上述RNaseprotectionassay方法包括如下步骤1、进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；2、收集牛乳样本并提取RNA；3、将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；4、加入RNase消化液进行反应；5、进行电泳与放射自显影；6、分析结果。上述Solexasequencingtechnology方法包括如下步骤1、收集牛乳样本；2、通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；3、进行PAGE电泳回收17_27ntRNA分子；4、将adaptorprime酶联在小RNA分子的3，与5，端；5、进行RT-PCR反应后并进行测序；6、数据分析与处理。所述生物芯片方法包括如下步骤1、将全部五百多个成熟体微小核糖核酸库点阵并制备生物芯片；2、收集牛乳样本；3、提取牛乳总RNA；4、通过柱分离来分离微小核糖核酸；5、利用T4RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；6、与生物芯片进行杂交反应；7、数据检测与分析。本发明通过上述的RT-PCR，Real-timePCR,Northernblotting，RNaseprotectionassay,Solexasequencingtechnology或生物芯片等方法分析在牛乳微小核糖核酸的变化趋势及变化量，以及它们与原乳含量的相关性。其中，首先检测t/fhsa_let一7a、hsa_let一7b、hsa_let一7c、hsa_let一7d、hsa_let一7e、hsa-let~7fΛhsa_miR-15a、hsa—miR-16、hsa—miR-17、hsa_miR-19b、hsa_miR-20a、hsa—miR-21、hsa—miR-22、hsa_miR-23a、hsa—miR-24、hsa—miR-25、hsa_miR-26a、hsa_miR-26b、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-30a、hsa—miR-31、hsa_miR-33a、hsa_miR-92a、hsa—miR-93、hsa—miR-98、hsa_miR-99a、hsa—miR-101、hsa_miR-29b、hsa—miR-103、hsa_miR-106a、hsa—miR-107、hsa—miR-192、hsa_miR-196a、hsa—miR-197、hsa_miR-148a、hsa_miR-30c、hsa_miR-30d、hsa—miR-7、hsa_miR-181a、hsa_miR-181b、hsa—miR-203、hsa-miR-210、hsa_miR_221、hsa_miR_222、hsa_miR_223、hsa_miR-200b、hsa_let_7g、hsa_let_7i、hsa_miR-15b、hsa_miR-23b、hsa_miR-27b、hsa_miR-30b、hsa_miR-125b、hsa-miR-128、hsa_miR-138、hsa-miR-140_3p、hsa_miR_141、hsa-miR-142_5p、hsa-miR-142_3p、hsa—miR-152、hsa—miR-191、hsa-miR-125a_5p、hsa—miR-150、hsa—miR-185、hsa—miR-186、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-193a_3p、hsa—miR-194、hsa_miR-320a、hsa_miR-200c、hsa—miR-155、hsa_miR-106b、hsa_miR-29c、hsa_miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151_5p、hsa-miR-151_3p、hsa_miR-148b、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-339-5p、hsa_miR_4235p、hsa-miR-423_3p、hsa_miR_425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-181d、hsa-miR-532_5p、hsa-miR-532_3p、hsa_miR-92b、hsa-miR-574_5p、hsa-miR-574_3p、hsa—miR-652、hsa_miR-320b、hsa_miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885_3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307在牛乳中的变化，制备牛乳微小核糖核酸生物芯片测定不同样本中牛乳微小核糖核酸的变化，同时对不同牛乳样本中微小核糖核酸进行Solexa测序分析。本发明还提供一种用于检测原乳含量与质量的试剂盒，该试剂盒包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的工具。所述试剂盒可以包含牛乳中的109种成熟体微小核糖核酸中任意一种或一种以上的引物，具体包括hSa-let-7a、hsa_let_7b、hsa_let_7c、hsa-let_7d、hsa_let_7e、hsa_let_7f、hsa_miR-15a、hsa—miR-16、hsa—miR-17、hsa_miR-19b、hsa_miR-20a、hsa—miR-21、hsa—miR-22、hsa_miR-23a、hsa—miR-24、hsa—miR-25、hsa_miR-26a、hsa_miR-26b、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-30a、hsa—miR-31、hsa_miR-33a、hsa_miR-92a、hsa—miR-93、hsa—miR-98、hsa_miR-99a、hsa—miR-101、hsa_miR-29b、hsa—miR-103、hsa_miR-106a、hsa—miR-107、hsa—miR-192、hsa_miR-196a、hsa—miR-197、hsa_miR-148a、hsa_miR-30c、hsa_miR-30d、hsa_miR-7、hsa_miR-181a、hsa_miR-181b、hsa_miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa_miR-222、hsa_miR-223、hsa_miR-200b、hsa_let_7g、hsa_let_7i、hsa_miR-15b、hsa_miR-23b、hsa_miR-27b、hsa_miR-30b、hsa_miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140_3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142_5p、hsa-miR-142_3p、hsa—miR-152、hsa—miR-191、hsa-miR-125a_5p、hsa—miR-150、hsa—miR-185、hsa—miR-186、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-193a_3p、hsa—miR-194、hsa_miR-320a、hsa_miR-200c、hsa—miR-155、hsa_miR-106b、hsa_miR-29c、hsa_miR-200a、hsa_miR-99b、hsa_miR-130b、hsa_miR-30e、hsa_miR-36l_5p、hsa_miR-374a、hsa_miR-375、hsa_miR-378、hsa-miR-151_5p、hsa-miR-151_3p、hsa_miR-148b、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-339_5p、hsa-miR-423-5p、hsa_miR_4233p、hsa_miR_425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-181d、hsa_miR-5325p、hsa-miR-532_3p、hsa_miR-92b、hsa-miR-574_5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa_miR-8853p、hsa—miR-760、hsa—miR-935、hsa—miR-1308、hsa—miR-1306、hsa—miR-1307的引物。将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来，将它们的引物收集到PCR试剂盒(RT-PCR或Real-timePCR)中即可制备检测牛乳质量的试剂盒。本发明还提供一种评价受试者的牛乳质量的生物芯片，该生物芯片包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的元件。所述生物芯片可以包含牛乳中的109种成熟体微小核糖核酸中的任意一种或一种以上的探针，所述探针具体包括表1所示的探针表1<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>probe—曰iR—138曰iR—138GATTCACMCACCAGCTpr。be—miR—14〇曰iR—14〇CTACCATAGGGTMMCCACTprobe—曰iR—141曰iR—141CCATCTTTACCAGACAGTGTTAprobe—曰iR—142—3p曰iR—142—3pTCCATAMGTAGGAMCACTACAprobe—曰iR—142—5p曰iR—142—5pGTAGTGCTTTCTACTTTATGprobe—曰iR—146b曰iR—146bAGCCTATGGMTTCAGTTCTCAprobe—曰iR—148a曰iR—148aACMAGTTCTGTAGTGCACTGAprobe—曰iR—148b曰iR—148bACMAGTTCTGTGATGCACTGAprobe—曰iR—15〇曰iR—15〇CACTGGTACMGGGTTGGGAGApr。be—miR—151曰iR—151CCTCMGGAGCTTCAGTCTAGTprobe—曰iR—152曰iR—152CCCMGTTCTGTCATGCACTGAprobe—曰iR—155曰iR—155CCCCTATCASATTAGCATTMprobe—曰iR—15a曰iR—15aCACAMCCATTATGTGCTGCTAprobe—曰iR—15bΒ^ι^σTGTAMCCATGATGTGCTGCTApr。be—曰iR—16曰iR—16CGCCMTATTTASTGCTGCTApr〇be—miR—17—3p曰iR—17—3pACMGTGCCTTCACTGCAGT<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来，将其反向互补序列作为探针点在芯片，就制成了专门针对牛乳微小核糖核酸检测生物芯片。本发明所使用的牛乳来源于待测的原乳，商品化的液态奶及各种配方的奶粉。具体而言，在上述组合(组合是指任何含有以上1种到109种的微小核糖核酸标志物变化的集合)、方法、试剂盒或生物芯片中，所述评价受试的原乳，商品化的液态奶及各种配方的奶粉为测定受试样本给予待测物后的原乳含量，具体用于检测待测物的质量；所述评价受试样本的原乳含量为测试标准；所述评价受试样本的原乳含量为评价对受试样本的质量标准。本发明具有如下优点本发明利用通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸可以建立唯一指向原始牛乳含量的标准，简单易行，成本低廉，特别适用于原乳含量的检测(如果有稀释的情况下)，输出的结果简单明了。本发明的意义在于可以从根本上断绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可能，同时推动这一科学的评价方法，也有利于采用这一方法的企业尽快在公众心中建立新的质控形象，安定消费者的担心.帮助企业尽快走出目前的困境。附图1为高温高压处理后的牛乳中部分微小核糖核酸的表达谱附图2为七种微小核糖核酸在原乳中的特性研究附图3为七种微小核糖核酸在商品化液态奶中的特性研究附图4为七种微小核糖核酸在商品化奶粉中的特性研究具体实施例方式1、牛乳中的微小核糖核酸的RT-PCR首先必须确定微小核糖核酸在牛乳中能检测到，我们使用了RT-PCR技术证明牛乳中不仅能检测到微小核糖核酸，而且其表达量相当丰富。具体步骤为收集正常原始牛乳；之后的操作有两种方案，一种方案为将ομ1牛乳作为buffer直接逆转录，另一种为提取牛乳的总RNA，使用的试剂是TRIzolreagent(invitrogen),IOml牛乳通常能富集约IOyg左右的RNA;之后为逆转录，加入4μ15XAMVbuffer,2μ1IOmMeachdNTPmixture(Takara),0.5μ1RNaseInhibitor(Takara)，2μ1AMV(Takara)VXR1.5μ1基因特异性反向引物混和物，将混合液16°C孵育15min，42°C反应60min以进行逆转录，85°C孵育5min使AMV酶失活；最后为PCR及电泳将cDNA按1/50稀释，取1μ1稀释后的cDNA，加入0.3μ1Taq酶(Takara)，0.2μ110μM正向引物，0.2μ1ΙΟμΜ通用反向弓I物，1·2μ125mMMgC12,1.6μ12.5mMeachdNTPmixture(Takara),2μ110XPCRbuffer，13.5μ1H20，20μ1体系进行PCR。PCR的反应条件是95°C5min进行1个循环—950C15sec，60°CImin进行40个循环。PCR产物取10μ1在3%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，UV下观察。具体实验结果见附图1。2、牛乳中的微小核糖核酸的real-timePCR微小核糖核酸的定量PCR实验原理及实验步骤同RT-PCR—样，唯一不同是在PCR的时候加入了荧光染料EVAGREEN。仪器使用的是ABIPrism7300荧光定量PCR仪(AppiedBiosystems)，反应条件为95°C5min进行1个循环—95°C15sec，60°CImin进行40个循环。数据处理方法为△ACT法，CT设为反应达到域值时的循环数，则每个微小核糖核酸相对于标准内参的表达量可以用方程2-ACT表示，其中ΔCT=CT样品-CT内参。所以微小核糖核酸可以作为一种新牛乳质量控制的标志物。3、专门用于牛乳质量监控的微小核糖核酸试剂盒的制作专门用于牛乳质量监控的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于定量PCR技术的，试剂包括常用的Taq酶、dNTP等。此试剂盒的价值在于，用最精简的探针库检测在牛乳中微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势监控牛乳质量，所以，将此芯片投入实践，可以建立唯一指向原始牛乳含量的标准，其意义在于从根本上断绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的动机，同时推动这一科学的评价方法。权利要求一种用于检测牛乳质量的标志物，其特征在于该检测标记物是以下在牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸中的一种或任意一种以上的组合hsa-let-7a、hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7d、hsa-let-7e、hsa-let-7f、hsa-miR-15a、hsa-miR-16、hsa-miR-17、hsa-miR-19b、hsa-miR-20a、hsa-miR-21、hsa-miR-22、hsa-miR-23a、hsa-miR-24、hsa-miR-25、hsa-miR-26a、hsa-miR-26b、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-30a、hsa-miR-31、hsa-miR-33a、hsa-miR-92a、hsa-miR-93、hsa-miR-98、hsa-miR-99a、hsa-miR-101、hsa-miR-29b、hsa-miR-103、hsa-miR-106a、hsa-miR-107、hsa-miR-192、hsa-miR-196a、hsa-miR-197、hsa-miR-148a、hsa-miR-30c、hsa-miR-30d、hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa-miR-200b、hsa-let-7g、hsa-let-7i、hsa-miR-15b、hsa-miR-23b、hsa-miR-27b、hsa-miR-30b、hsa-miR-125b、hsa-miR-128、hsa-miR-138、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-141、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-152、hsa-miR-191、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-150、hsa-miR-185、hsa-miR-186、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-193a-3p、hsa-miR-194、hsa-miR-320a、hsa-miR-200c、hsa-miR-155、hsa-miR-106b、hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-148b、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-423-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-181d、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-532-3p、hsa-miR-92b、hsa-miR-574-5p、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307。2.一种用于检测牛乳质量的方法，其特征在于检测以下在牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸hsa一let一7a、hsa一let一7b、hsa一let一7c、hsa一let一7d、hsa一let一7e、hsa一let一7f、hsa_miR-15a、hsa—miR-16、hsa—miR-17、hsa_miR-19b、hsa_miR-20a、hsa—miR-21、hsa—miR-22、hsa_miR-23a、hsa—miR-24、hsa—miR-25、hsa_miR-26a、hsa_miR-26b、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-30a、hsa—miR-31、hsa_miR-33a、hsa_miR-92a、hsa—miR-93、hsa—miR-98、hsa_miR-99a、hsa—miR-101、hsa_miR-29b、hsa—miR-103、hsa_miR-106a、hsa_miR-107、hsa_miR-192、hsa_miR-196a、hsa_miR-197、hsa_miR-148a、hsa_miR-30c、hsa_miR-30d、hsa_miR-7、hsa_miR-181a、hsa_miR-181b、hsa-miR-203、hsa-miR-210、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-223、hsa_miR-200b、hsa_let_7g、hsa-let_7i、hsa_miR-15b、hsa_miR-23b、hsa_miR-27b、hsa_miR-30b、hsa_miR-125b、hsa-miR-128、hsa_miR-138、hsa-miR-140_3p、hsa_miR-141、hsa-miR-142_5p、hsa-miR-142_3p、hsa—miR-152、hsa—miR-191、hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-150、hsa_miR-185、hsa_miR-186、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-193a_3p、hsa—miR-194、hsa_miR-320a、hsa_miR-200c、hsa—miR-155、hsa_miR-106b、hsa_miR-29c、hsa_miR-200a、hsa_miR-99b、hsa_miR-130b、hsa_miR-30e、hsa_miR-36l_5p、hsa_miR-374a、hsa—miR-375、hsa—miR-378、hsa-miR-151_5p、hsa-miR-151_3p、hsa_miR-148b、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-339_5p、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-423_3p、hsa-miR-425、hsa_miR-484、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-181d、hsa-miR-532_5p、hsa_miR-5323p、hsa_miR-92b、hsa-miR-574_5p、hsa-miR-574_3p、hsa—miR-652、hsa-miR-320b、hsa-miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-760、hsa—miR-935、hsa—miR-1308、hsa—miR-1306、hsa_miR-1307o3.如权利要求2所述检测牛乳质量的方法，其特征在于测定牛乳中稳定存在且可检测109种微小核糖核酸的方法选自RT-PCR方法、Real-timePCR方法、Northernblotting方法、RNaseprotectionassay方法、Solexasequencingtechnology方法或生物芯片方法。4.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述RT-PCR方法包括以下步骤1)提取牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试者的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物进行PCR反应；3)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；4)EB染色后在紫外灯下观察结果。5.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述Real-timePCR方法包括以下步骤1)提取受试的牛乳总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；或者收集受试的牛乳样本，以牛乳作为缓冲液进行逆转录反应来制备cDNA样品；2)用微小核糖核酸设计引物；3)加入荧光探针进行PCR反应；4)检测并比较牛乳样本相对于正常牛乳中微小核糖核酸的量的变化。6.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述Northernblotting方法包括以下步骤1)收集牛乳样本；2)通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；3)进行变性PAGE电泳和膜转移实验；4)制备同位素标记微小核糖核酸探针；5)进行膜杂交反应；6)同位素信号检测，如磷屏扫描检测结果。7.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于上述RNas印rotectionassay方法包括如下步骤1)进行反义RNA探针的合成，同位素标记与纯化；2)收集牛乳样本并提取RNA；3)将提取后的RNA溶解在杂交缓冲液中并加入反义RNA探针进行杂交反应；4)加入RNase消化液进行反应；5)进行电泳与放射自显影；6)分析结果。8.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于上述Solexasequencingtechnology方法包括如下步骤1)收集牛乳样本；2)通过Trizol试剂提取牛乳总RNA；3)进行PAGE电泳回收17-27ntRNA分子；4)将adaptorprime酶联在小RNA分子的3’与5’端；5)进行RT-PCR反应后并进行测序；6)数据分析与处理。9.如权利要求3所述检测牛乳质量的方法，其特征在于所述生物芯片方法包括如下步骤1)将全部五百多个成熟体微小核糖核酸库点阵并制备生物芯片；2)收集牛乳样本；3)提取牛乳总RNA；4)通过柱分离来分离微小核糖核酸；5)利用T4RNA连接酶进行微小核糖核酸荧光标记；6)与生物芯片进行杂交反应；7)数据检测与分析。10.一种用于检测原乳含量与质量的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的工具，前述工具可以是以下在牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的一种或任意一种以上的引物hsa一let一7a、hsa一let一7b、hsa一let一7c、hsa一let一7d、hsa一let一7e、hsa一let一7f、hsa_miR-15a、hsa—miR-16、hsa—miR-17、hsa_miR-19b、hsa_miR-20a、hsa—miR-21、hsa—miR-22、hsa_miR-23a、hsa—miR-24、hsa—miR-25、hsa_miR-26a、hsa_miR-26b、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-30a、hsa—miR-31、hsa_miR-33a、hsa_miR-92a、hsa—miR-93、hsa—miR-98、hsa_miR-99a、hsa—miR-101、hsa_miR-29b、hsa—miR-103、hsa_miR-106a、hsa—miR-107、hsa—miR-192、hsa_miR-196a、hsa—miR-197、hsa_miR-148a、hsa_miR-30c、hsa_miR-30d、hsa_miR-7、hsa_miR-181a、hsa_miR-181b、hsa_miR-203、hsa-miR-210、hsa_miR_221、hsa_miR_222、hsa_miR_223、hsa_miR-200b、hsa_let_7g、hsa_let_7i、hsa_miR-15b、hsa_miR-23b、hsa_miR-27b、hsa_miR-30b、hsa_miR-125b、hsa-miR-128、hsa_miR-138、hsa_miR-1403p、hsa_miR_141、hsa-miR-142_5p、hsa-miR-142_3p、hsa—miR-152、hsa—miR-191、hsa—miR—l25a_5p、hsa—miR-150、hsa—miR-185、hsa—miR-186、hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-193a_3p、hsa—miR-194、hsa_miR-320a、hsa_miR-200c、hsa—miR-155、hsa_miR-106b、hsa_miR-29c、hsa_miR-200a、hsa-miR-99b、hsa-miR-130b、hsa-miR-30e、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-374a、hsa-miR-375、hsa-miR-378、hsa-miR-151_5p、hsa-miR-151_3p、hsa_miR-148b、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423_5p、hsa-miR-423_3p、hsa_miR_425、hsa-miR-484、hsa-miR-146b_5p、hsa_miR-181d、hsa-miR-532_5p、hsa-miR-532_3p、hsa_miR-92b、hsa-miR-574_5p、hsa-miR-574_3p、hsa_miR-652、hsa_miR-320b、hsa_miR-320c、hsa-miR-874、hsa-miR-744、hsa-miR-885_3p、hsa-miR-760、hsa-miR-935、hsa-miR-1308、hsa-miR-1306、hsa-miR-1307的引物。11.一种评价牛乳质量的生物芯片，其特征在于该生物芯片包含测定受试牛乳中稳定存在且可检测的109种微小核糖核酸的元件，即可以包含牛乳中的109种成熟体微小核糖核酸的探针中的任意一种或一种以上，前述述探针具体如下探针<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>Sif对应microRNA探针序歹ljprobe-miR-98miR-98AACAATACAACTTACTACCTCAprobe-miR-99amiR—99aCACAAGATCGGATCTACGGGTTprobe-miR-99bmiR—99bCGCAAGGTCGGTTCTACGGGTG将上述在牛乳中稳定存在的微小核糖核酸筛选出来，将其反向互补序列作为探针点在芯片，就制成了专门针对牛乳微小核糖核酸检测生物芯片。全文摘要本发明涉及一种检测牛乳质量的标志物、检测方法、生物芯片和试验盒，以牛乳中稳定存在且可检测的109种成熟体微小核糖核酸中的一种或任意一种以上的组合作为检测标志物。本发明通过检测牛乳中特定的微小核糖核酸来建立唯一指向原始牛乳含量的标准，其意义在于从根本上杜绝不法分子向牛乳中掺入其他物质的可能。文档编号C40B40/06GK101798594SQ20091030966公开日2010年8月11日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者张俊峰,张辰宇,曾科,李海进,田春亮申请人:北京命码生科科技有限公司