专利名称：基于kringle域结构的蛋白质骨架库及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建基于Kringle域结构的蛋白质骨架库，结合各种靶分子以调节其 生物活性的来源于Kringle域库的蛋白质骨架变体，构建同源/异源低聚物的方法，其中所 述低聚物通过Kringle域结构变体单体的串联装配，提供多特异性结合与多个靶。此外，本 发明涉及通过将Kringle域结构变体的靶结合环(target-binding loop)嫁接入另一个具 有相同或不同靶结合特异性的Kringle域结构变体的其它非结合环而制备多特异性单体 和多价单体的方法。进一步地，本发明提供了用于预防、检测、诊断、治疗或缓解疾病或紊 乱，特别是癌症以及其它免疫相关疾病的Kringle域结构变体的方法和组合物，以及给动 物施用有效量的Kringle域结构变体。
背景技术：
通过蛋白质氨基酸序列以及二级结构和三级结构的分析，很多蛋白质由分隔开 的域(或模块)组成。对于蛋白质，域是指一个单独的功能和/或结构单元。至少，一个 相同的域可分布于各种蛋白质中，并且一个蛋白质可由各种不同的域组成。域的具体信息 可在生物信息学的网站，如 Prosite (Hulo N 等，Nucleic Acids Res，36 拟45-249，2008 ； Website :http//kr. expasy. orR/prosite/)、SMART(Letunic I 等，Nucleic Acids Res., 34 :D257-D260,2006 ；Website :http://smart, embl-heidelberg. de/)上搜索到，域的代表 性例子包括免疫球蛋白样、纤连蛋白II和III、Kringle等等。生物分子间的相互作用(例如，蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸相互作用)在各 种生命现象如细胞的生长、分化和发育，细胞间/细胞外信号转导，以及质量运输中发挥 重要作用。作为已知的特异性结合靶分子以控制靶分子生物活性的分子，抗体(全长抗体 或其片段)的开发处于领先。然而，因为抗体在纯化的表达和低溶解度的各种问题，其应 当在动物细胞-表达细胞株中表达，纯化的费用非常昂贵，并且在还原细胞内环境下其稳 定性非常低。为解决上述问题，已尝试开发除抗体之外的特异性结合靶分子的蛋白质，例 如能解决关于抗体问题的抗体(Review Article :Hey，et al.，Trends in Biotech. 23 514-522,2005 ；Skerra, Current Opin. Biotech. , 18 :295-304, 2007) 这些蛋白被称为蛋 白质骨架，替换(alternative)蛋白质骨架，替换骨架，非抗体蛋白质骨架，或替换结合蛋 白(在下文中，被称为“蛋白质骨架”)(Skerra A，FEBS J,275 =2677-2683,2008 ；Skerra, Current Opin. Biotech. ，18 :295-304,2007 ；Nygren P. ， et al. ， J. Immunol Method, 290 3- ，2004)。蛋白质骨架的模型通过构建蛋白质库制备，所述库通过在蛋白质表面暴露的 残基或环结构诱导随机或设计的诱变、由此保留赋予结构稳定性的氨基酸序列以保留其结 构骨架而构建，分离特异性结合至靶分子的变体。Kringle域在包括人的不同物种的蛋白质中作为分隔开的模块出现，并且，在一 个蛋白中存在几十个或数百Kringle域(参见表lMCastellino，et al.，J Mol Evol, 26 :358-369,1987 ；Ikeo, et al.，J Mol Evol,40 :331-336,1995 ；Cao, et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2 :667_681，2002)。对于自然界中存在的多种生物体，从893种蛋白质中发现了 1663种不同的Kringle域，并39种Kringle域其氨基酸序列彼此不同的分 布于31 种人类蛋白质(参见=Prosite (Hulo N, et al. ,Nucleic Acids Res, 36 :D245-249, 2008 ·Μ ± :http://kr. expasy. org/prosite/ ；SMART (Letunic I， et al. ，Nucleic Acids Res, 34 :D257-D260,2006 ；网址http://smart, embl-heidelberg. de/) (Castellino, et al. , J Mol Evol，26 :358-369,1987 ;Ikeo，et al. , J Mol Evol，40 :331-336,1995)。在 Kringle域之间存在有包括约20个氨基酸的环(间-Kringle域)。Kringle域的确切功 能未知，但Kringle域在结合各种生物分子(例如蛋白、肽、碳水化合物、细胞膜、磷脂等 等)以赋予相应蛋白质结合活性并控制相应蛋白质的各种生物活性中起重要作用(Cao， et al. , Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2 :667-681，2002) 。 Kringle 于生长因子、蛋白酶、凝血因子、横跨膜受体等等(Castellino，et al. , J Mol Evol, 26 358-369,1987)。特别地，Kringle域独立于其它蛋白质而存在，或与其它蛋白质(例如内 皮抑素、血管抑素)一同存在，还可以用于抑制血管生成(抗血管生成)。血管抑素具有4 个Kringle域，并且血管抑素的这种结构是用于抑制血管生成所必需的(Cao，et al. ,Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2 :667_681，200 。与纤维蛋白溶解相关的血纤维蛋白溶 酶原和血纤维蛋白溶酶中Kringle域的赖氨酸结合位点，已被认定为两个蛋白的细胞外基 质分子和细胞受体之间的结合位点，并且Kringle域的赖氨酸结合位点因而被认为对于两 个蛋白的纤维蛋白溶解功能重要(Cao，et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2 667-681，2002)。表 权利要求
1.制备基于Kringle域结构的蛋白质骨架库的方法，所述方法包括在除了对保持 Kringle域的结构骨架重要的保守氨基酸残基外的氨基酸残基上导入人工突变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对保持Kringle域的骨架结构重要的保守 氨基酸残基包含至少一个选自 C1、G6、Y9、D10、G11、T16、G19、C22、Q23、W25、P30、H31、H33、 G34、K48、N49、Y50、C51、R52、N53、P54、D55、P61、W62、C63、F64、T65、E73、L74、C75、P78、 R79和C80中的残基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，人工突变在至少一个选自氨基酸残基2、 3、4、5、7、8、12、13、14、15、17、18、20、21、24、26、27、28、29、32、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、56、57、58、59、66、67、68、69、70、71、72、76 和 77 中的残基上发生，并且所述氨基酸残基被缺失或被一个选自丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、 天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸中的残基取代。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包含通过应用作为模板和引物的存在于自然 界的Kringle域基因上进行PCR，在除了对保持Kringle域的结构骨架重要的保守氨基酸残 基外的氨基酸残基上导入人工突变，使得所述Kringle域具有不存在于自然界的氨基酸序 列其中来源于蛋白质骨架库的变体是基于Kringle域结构的蛋白变体，具有以下氨基酸 序列CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELC XxPRC (序列号19)其中X代表一个选自丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸或天 冬氨酸中的残基，并且X代表谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述引物选自序列号1至序列号8所组 成的组。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Kringle域是人类血纤维蛋白溶酶原 Kringle 域。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Kringle域的人类血纤维蛋白溶酶原 具有序列号49所述的氨基酸序列。
8.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述人类血纤维蛋白溶酶原Kringle域具有序 列号50所述的DNA序列。
9.基于Kringle域结构构建的蛋白质骨架库，通过根据权利要求1至8中任一项所述 的方法制备。
10.根据权利要求9所述的蛋白质骨架库，包含序列号13所述的库。
11.根据权利要求10所述的蛋白质骨架库，包含选自序列号14至序列号18所组成 的库组中的库。
12.基于Kringle域结构分离和选择对靶分子具有高特异亲和力的蛋白质骨架变体的 方法，所述方法包括从根据权利要求9至11中任一项所述的蛋白质骨架库分离靶特异性 结合Kringle域变体。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，靶分子包括至少一个选自死亡受体 (DR)4、死亡受体(DR)5、肿瘤坏死因子α、糖蛋白II β IIIa受体或糖蛋白II β IIIa、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、酪氨酸激酶抑制剂、表皮生长因 子受体、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、干细胞因子受体 (c-kit) ,Fms样酪氨酸激酶3 (Flt-3)、白细胞介素1、白细胞介素6、白细胞介素32、白细胞 介素 2 受体、CD3、CDlla, CD14、CD15、CD16、CD20、CD32、CD64 和 Raf 的分子。
14.基于Kringle域结构的具有对靶分子有高特异亲和力的蛋白质骨架变体，根据权 利要求12或13所述的方法制备。
15.根据权利要求14的蛋白质骨架变体，其特征在于，所述变体具有至少一个选自序 列号20至序列号32的氨基酸序列。
16.根据权利要求14的蛋白质骨架变体，其特征在于，所述变体具有至少一个选自序 列号33至序列号43的氨基酸序列。
17.根据权利要求14的蛋白质骨架变体，其特征在于，所述变体具有至少一个选自序 列号44至序列号48的氨基酸序列。
18.利用权利要求12或13所述的方法制备的蛋白质骨架变体单体来制备同源低聚物 或异源低聚物的方法，所述蛋白质骨架变体单体结合相同或不同的靶分子。
19.制备能同时结合多个靶分子的同源或异源低聚物的方法，所述方法包括分离根 据权利要求12或13所述的方法制备的蛋白质骨架单体，所述蛋白质骨架单体分别结合两 个或多个不同靶分子，并通过连接子组合所述单体以制备低聚物。
20.制备多价单体或多特异性单体的方法，所述方法包括将来源于根据权利要求12 或13所述的方法制备的蛋白质骨架变体单体的靶结合环，嫁接入具有相同或不同单体的 另一单体的其它环，其中所述蛋白质骨架变体单体结合相同靶分子或两个或多个不同靶分 子的不同位点。
21.用于治疗或预防癌症的组合物，包含根据权利要求15或16所述的方法制备的蛋白 质骨架变体以作为活性成分。
22.用于治疗或预防TNFa过表达或过量所导致的自身免疫疾病的组合物，包含权利 要求17所述的蛋白质骨架变体以作为活性成分。
全文摘要
本发明提供了Kringle域结构，包括除对保持Kringle域的骨架构造重要的保守氨基酸残基，在氨基酸残基上诱导人工突变；基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体，通过特异性结合靶分子，调节来源于Kringle域库的蛋白质骨架靶分子的生物活性。本发明而且还提供了构建同源/异源低聚物的方法，其用连接子通过Kringle域变体单体的串联装配，提供多特异性结合与多个靶。另外，本发明提供通过将Kringle域变体的靶结合环嫁接入另一个具有相同或不同靶结合特异性的Kringle域变体的其它非结合环而制备多特异性单体和多价单体的方法。此外，基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体特异性结合靶分子，DNA编码蛋白质骨架变体，或用于预防、检测、诊断、治疗或缓解疾病或紊乱，特别是癌症以及其它免疫相关疾病的方法和组合物，包括给动物更优选给人类施用有效量的相关分子。
文档编号C40B40/10GK102149858SQ200980131306
公开日2011年8月10日 申请日期2009年8月7日 优先权日2008年8月11日
发明者权明姬, 李昌翰, 金容星 申请人:亚州大学校产学协力团